WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

БОЧАРОВА Наталья Александровна

Исследование причин токсичности удлиненного полиглутаминового

фрагмента хантингтина в дрожжах Saccharomyces cerevisiae

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2008 3

Работа выполнена в лаборатории программируемой смерти одноклеточных эукариот Научно-Исследовательского Института Физико-Химической Биологии имени А.Н. Белозерского при Московском Государственном Университете имени М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: академик РАН, доктор биологических наук, профессор Скулачев Владимир Петрович Официальные доктор биологических наук, оппоненты: профессор Звягильская Рената Александровна доктор биологических наук, профессор Калебина Татьяна Сергеевна

Ведущая организация:

Федеральное Государственное унитарное предприятие Государственный научный центр Российской Федерации Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика»)

Защита состоится « 11 » _ 2008 года в часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071 Москва, Ленинский проспект, 33, корпус 1.

Автореферат разослан « » 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Существует целый класс заболеваний человека, которые вызваны дисфункцией или гибелью клеток нервной системы. Эти заболевания, называемые нейродегенеративными, проявляются в нарушении функций организма, связанных с деятельностью головного мозга. Появление внутриклеточных белковых агрегатов является общим свойством многих нейродегенеративных заболеваний, таких, как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и Хантингтона (Taylor et al., 2002). До сих пор неясно, является ли образование таких агрегатов ключевым фактором, необходимым для развития патологического процесса, или же оно представляет собой клеточный ответ, направленный на противодействие накоплению неправильно собранных белков.





Агрегация и токсичность полиглутаминов в настоящее время широко исследуется на различных клеточных культурах и организмах. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae являются весьма удобной в экспериментальном плане моделью для изучения заболеваний, связанных с образованием белковых агрегатов, в частности, болезни Хантингтона (Outeiro and Giorgini, 2006).

Первая дрожжевая модель для изучения патофизиологических эффектов хантингтина была предложена в 2002 году: было показано, что экспрессия Nконцевой части удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae приводит к замедлению роста, нарушению клеточного цикла, образованию агрегатов в цитоплазме и ядре (Meriin et al., 2002).

возможность проведения скрининга по поиску генов, вовлеченных в развитие патологического процесса, вызванного удлинением полиглутаминового фрагмента хантингтина. Легкость генетических манипуляций позволяет активирующие клеточные механизмы ответа на стрессовые факторы, и затем использовать полученные результаты для лучшего понимания генной регуляции старения и дегенерации нейронов.

Показано, что клеточные и молекулярные признаки токсичности удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина у дрожжей и нейронов во многом схожи (Sokolov et al., 2006), поэтому есть основания полагать, что полученные данные позволят выявить общие закономерности развития патологии и будут способствовать поиску новых методов лечения болезни Хантингтона.

Цель и задачи исследования удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина человека в дрожжах Saccharomyces cerevisiae, а также поиск генов, кодирующих белки, которые вовлечены в агрегацию полиглутаминов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Установить патофизиологические последствия экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах.

полиглутаминового фрагмента хантингтина играет дрожжевая метакаспаза Yca1.

3. Провести поиск генов, кодирующих белки, которые участвуют в развитии патологии при экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.

4. Определить роль идентифицированных генов в механизме клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина.

Научная новизна работы Показано, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина сопровождается некоторыми признаками программированной клеточной гибели: образованием активных форм кислорода (АФК), фрагментацией митохондрий, деградацией ядерной ДНК. При этом нарушение гена дрожжевой метакаспазы влияло как на локализацию полиглутаминовых агрегатов, так и на выживание клеток.

В ходе дрожжевого скрининга установлено, что нарушение гена ASE1, который кодирует белок, являющийся субстратом для АРС-комплекса, снижает токсичность полиглутаминового фрагмента хантингтина. В то же время показано, что гиперэкспрессия гена CDH1, являющегося активатором АРСкомплекса, и нарушение гена CLB2, кодирующего циклин В, также повышает выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих мутантный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.





На основании этих данных разработана модель механизма токсичности полиглутаминового фрагмента хантингтина для дрожжей, включающая взаимодействие мутантного хантингтина с ядерными белками – факторами транскрипции, нарушение функционирования убиквитин-протеасомной системы и систем, ответственных за регуляцию клеточного цикла.

Научно-практическая ценность исследования Работа имеет теоретическое значение для понимания механизмов развития патофизиологических процессов в клетках, связанных с агрегацией полиглутаминсодержащих белков. Полученные результаты могут косвенно свидетельствовать о процессах, приводящих к патологии клеток при болезни Хантингтона и других полиглутаминзависимых нейродегенеративных заболеваниях, и, возможно, в дальнейшем могут быть использованы при разработке новых способов лечения таких болезней.

Апробация работы Диссертация апробирована и рекомендована к защите на семинаре Института биохимии имени А.Н. Баха. Материалы диссертации были представлены на XIV международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2007), международной конференции международной конференции по апоптозу дрожжей (Левен, Бельгия, 2008).

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, обзора литературы (4 главы), раздела «Материалы и методы исследования» (6 глав), результатов (7 глав), обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 147 страницах, содержит 46 рисунков и таблиц. Список литературы включает 189 работ, из них 183 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В обзоре литературы дана общая характеристика наследственных нейродегенеративных заболеваний, детально рассмотрены патогенез и клинические проявления болезни Хантингтона, а также структура и функции белка хантингтина, отвечающего за возникновение заболевания. Обсуждаются основные потенциальные механизмы проявления токсичности хантингтина и роль его агрегации. Дано описание «дрожжевой» модели токсичности полиглутаминов.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы штаммы дрожжей Saccharomyces cerevisiae W303-1A (дикий тип), W303-1A 25Q (штамм, несущий конструкцию с полиглутаминовым фрагментом нормальной длины, сшитым с циановым флуоресцентным белком), W303-1A 103Q (штамм, несущий конструкцию с удлиненным полиглутаминовым фрагментом, сшитым с циановым флуоресцентным белком). Кроме этого, в ходе работы были получены штаммы, предположительно устойчивые к токсичности полиглутаминов, в том числе W303-1A 103Q yca1, W303-1A 103Q ase1, W303-1A 103Q clb2, W303-1A 103Q CDH1, W303-1A 103Q yca1 CDH1. В работе использовали стандартные методики генетики дрожжей (Sherman, 1986), Дрожжи выращивали на синтетической среде с добавлением требуемых аминокислот или на полных средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу (YPD) или раффинозу (YPRaf), для индукции экспрессии полиглутаминового фрагмента хантингтина добавляли галактозу (YPRafGal).

Для амплификации фрагментов ДНК с помощью ПЦР, для выделения и анализа плазмид и геномной ДНК использовали стандартные протоколы (Maniatis at al., 1982; Sambrook at al,, 1989). Для проведения генетического библиотекой, содержащей маркеры LEU и AMP, и высевали на чашки с синтетической средой без лейцина, содержащие раффинозу и галактозу.

Наиболее крупные колонии повторно проверяли на синтетической среде без лейцина и на богатой среде, содержащей раффинозу и галактозу. Таким образом отбирали мутантные линии, способные нормально расти в условиях экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина. Мутанты, экспрессирующие удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина и при этом имеющие морфологию и скорость роста, характерные для здоровых клеток, подвергались дальнейшему анализу с целью установить, какие гены или участки генов были случайным образом нарушены. Для этого из дрожжей выделяли геномную ДНК и расщепляли ее рестриктазой HindIII. В транспозоне содержался единственный сайт для данной рестриктазы, поэтому в результате рестрикции получали смесь фрагментов геномной ДНК, среди которых был фрагмент, содержащий участок транспозона до сайта рестрикции HindIII.

Полученную смесь фрагментов лигировали с плазмидой pBC SK+, предварительно обработанной той же рестриктазой. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки бактерии E. coli линий XL1 Blue или MC методом электропорации, затем выращивали их на твердой среде с антибиотиками хлорамфениколом и ампициллином. В этих условиях вырастали только те бактерии, в которые была интегрирована плазмида, содержащая фрагмент транспозона и геномной ДНК дрожжей. Из полученных клонов бактерий выделяли плазмидную ДНК и секвенировали ее. Полученные последовательности сравнивали с помощью программы для выравнивания последовательностей BLAST с геномной ДНК дрожжей и идентифицировали гены или участки генов, нарушенные в результате встраивания транспозона.

Наличие экспрессии данной конструкции во всех мутантных штаммах проверяли с помощью методов флуоресцентной микроскопии. Дополнительно уровень экспрессии оценивали с использованием белкового электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (Laemmli, иммунодетекции использовали ECLTM system (Towbin, 1979). Детекция карбонилированных белков проводилась посредством реакции с 2,4динитрофенилгидразином и окрашивания антителами, для чего использовали OxyblotTM Protein Oxidation Detection Kit (Levine at al., 1994). Дыхание клеток измеряли полярографическим методом с использованием электрода типа Кларка.

3.1. Экспрессия мутантного хантингтина токсична для дрожжей Экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина (в отличие от фрагмента нормальной длины) является токсичной для клеток дрожжей, что проявлялось в уменьшении размера колоний на твердой среде, содержащей галактозу (рис. 1), а также в снижении скорости удвоения на жидкой среде (рис. 2) и увеличении процентного содержания мертвых клеток.

В течение первых 6 часов контрольный и мутантный штаммы росли с одинаковой скоростью, однако уже через 8-12 часов инкубации мутантный штамм заметно отставал в росте от контроля.

Рисунок 1. Распределение размера колоний штаммов, экспрессирующих нормальный и удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (24 часа, галактоза).

Рисунок 2. Скорость роста штаммов, экспрессирующих нормальный и удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (галактоза, жидкая среда, OD540).

С помощью методов флуоресцентной микроскопии наблюдали за локализацией и агрегацией полиглутаминового фрагмента хантингтина, сшитого с циановым флуоресцентным белком (CFP). В клетках дрожжей, экспрессирующих фрагмент хантингтина, содержащий 25 остатков глутамина (25Q-CFP), CFP был диффузно распределен в цитоплазме. В то же время в клетках, экспрессирующих удлиненный фрагмент хантингтина, содержащий 103 остатка глутамина (103Q-CFP), наблюдали образование агрегатов CFP.

Интересно отметить, что через 6 часов экспрессии эти клеточные включения были преимущественно локализованы в цитоплазме, а на более поздних стадиях экспрессии (после 12 часов) возрастало количество клеток, у которых агрегаты находились в ядре. Таким образом, замечено, что токсичность удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина коррелирует с его накоплением в ядре.

3.2 Антиоксиданты частично снижают токсичность хантингтина В нашей лаборатории было показано, что токсический эффект экспрессии удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина сопровождался такими признаками программируемой клеточной гибели, как: фрагментация митохондрий, деградация ядерной ДНК, активация каспаз, образование активных форм кислорода (АФК) (Sokolov et al., 2006). Поэтому мы попытались предотвратить гибель клеток, используя антиоксиданты: водорастворимый Nацетилцистеин (50 мМ) и жирорастворимый альфа-токоферол (30 мкМ).

Выживаемость клеток дрожжей, определяемая по количеству КОЕ, при добавлении этих антиоксидантов существенно не увеличилась, однако добавление альфа-токоферола положительно влияло на размер колоний и морфологию митохондрий дрожжей (рис. 3).

При измерении скорости дыхания клеток в присутствии разобщителя (FCCP) не было выявлено существенных отличий для штаммов 25Q и 103Q (данные не показаны). Мы предполагаем, что образование активных форм кислорода происходит на заключительных этапах патологического процесса, а основной вклад в проявление токсичности полиглутаминового фрагмента хантингтина дают другие клеточные события.

Рисунок 3. Влияние альфа-токоферола (30 мкМ) на размер колоний (слева) и морфологию митохондрий (справа) дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

мутантного хантингтина программированную гибель, является активация каспаз. Было показано, что дрожжевая метакаспаза Yca1 играет важную роль в индукции каскада апоптоза у дрожжей, вызванного различными факторами (Madeo et al., 2002). В нашей модели нарушение гена дрожжевой метакаспазы YCA1 приводило к изменению внутриклеточной локализации агрегатов хантингтина. Появление включений, образованных хантингтином с удлиненным полиглутаминовым доменом, в ядре практически не происходило в клетках, лишенных гена дрожжевой метакаспазы YCA1 (рис. 4). При этом существенно увеличилась выживаемость и колониеобразующие свойства клеток, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина (рис. 5).

Рисунок 4. Влияние дрожжевой метакаспазы Yса1 на внутриклеточную локализацию мутантного хантингтина. Показана степень ко-локализации ядерного ДНК-сигнала и 103QCFP-сигнала. В клетках с нарушенным геном дрожжевой метакаспазы YCA1 эти сигналы практически не перекрываются.

Рисунок 5. Влияние дрожжевой метакаспазы Yca1 на колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина ( суток, галактоза).

Тем самым была подтверждена гипотеза о том, что токсичность хантингтина непосредственно связана с его накоплением в ядре, а также о том, что гибель клеток при экспрессии мутантного хантингтина является запрограммированной.

Одним из способов определить степень повреждения клетки является оценка уровня карбонилированных белков. Карбонилирование представляет собой химическое взаимодействие белков с альдегидами и ведет к потере функциональных свойств и деградации белка. Было установлено, что уровень карбонилирования у штамма, экспрессирующего удлиненный полиглутаминовый фрагмент, несколько выше, чем у контрольного штамма, при этом нарушение гена дрожжевой метакаспазы не оказывало существенного влияния на количество карбонилированных белков в клетке (данные не показаны).

токсичности мутантного хантингтина В ходе дальнейшего изучения механизмов программированной клеточной гибели дрожжей, вызванной экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина, был проведен генетический скрининг. Мы рассчитывали обнаружить другие гены, нарушение которых будет снижать чувствительность дрожжей к экспрессии хантингтина. Для этого штамм W303A 103Q мы трансформировали транспозоном, который замещал случайный участок последовательности геномной ДНК, и полученную смесь мутантов высевали на твердую среду, содержащую галактозу для индукции экспрессии.

Затем отбирали наиболее крупные колонии и подвергали их повторной проверке на способность быстро расти на среде, содержащей галактозу, и на наличие конструкции с хантингтином. В конечном итоге мы получили ряд мутантных штаммов, имеющих такой же фенотип (по скорости роста и морфологии клеток), как и у дрожжей, экспрессирующих хантингтин с нормальным полиглутаминовым фрагментом (25Q-CFP). При этом клетки сохранили способность экспрессировать хантингтин с удлиненным полиглутаминовым фрагментом (103Q-СFP), который образует агрегаты в цитоплазме и ядре (рис. 6).

Рисунок 6. Морфология клеток, экспрессирующих полиглутаминовый фрагмент хантингтина, и флуоресценция CFP, связанного с полиглутаминовым фрагментом.

Это доказывает, что увеличение скорости роста на среде с галактозой этих штаммов достигалось не за счет репрессии синтеза полиглутаминового фрагмента или ускорения скорости его деградации. Это дает нам основание полагать, что идентифицированные гены (список и краткая характеристика см.

табл. 1) играют роль в каком-либо активном процессе, усиливающем токсический эффект полиглутаминовых фрагментов, например, активации каскада программируемой клеточной смерти. Интересно, что некоторые из этих генов оказались вовлечены в регуляцию клеточного цикла и МАР-киназный каскад. Обсуждение роли каждого конкретного гена, обнаруженного в результате скрининга, выходит за рамки работы. Для наиболее заинтересовавших нас генов PTP2, NPT1, ASE1, VPS36, TUS1, ICY1 были получены мутанты с полностью инактивированным геном, экспрессирующие удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина. Мы проверили, как инактивация некоторых генов, полученных в ходе скрининга, влияет на выживаемость дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

Таблица 1. Краткая характеристика генов, идентифицированных в ходе скрининга.

Название гена основании данных доступных из базы данных Штаммы с полностью нарушенными генами PTP2 и NPT1 росли несколько медленнее, чем контроль, как на среде, содержащей галактозу, так и в условиях отсутствия экспрессии полиглутаминового фрагмента, что жизнедеятельности клетки. Штаммы с полностью нарушенными генами VPS36, TUS1 и ICY1, в которых также экспрессировали мутантный фрагмент хантингтина, показывали высокую степень выживаемости по сравнению с контрольным штаммом W303-1A ade2 103Q как по размеру колоний и количеству КОЕ на твердой среде, так и по соотношению оптической плотности в жидкой среде, содержащей галактозу. Однако было установлено, что устойчивость клеток в этих случаях достигается, по всей видимости, за счет активного выведения конструкции с полиглутамином за пределы ядра и клетки в целом. В то же время штамм с полностью инактивированным геном ASE оказался устойчивым к экспрессии мутантного хантингтина, не теряя при этом конструкцию. Этот штамм показывал большую, чем в контроле, скорость удвоения на жидкой среде, содержащей галактозу, а также лучшую выживаемость и колониеобразующую способность на твердой среде (рис. 7).

Рисунок 7. Влияние гена ASE1 на колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих удлиненный полиглутаминовый фрагмент хантингтина.

Ген ASE1 кодирует белок митотического веретена, который является субстратом АРС-комплекса (циклосомы) – основного регулятора клеточного цикла. Главная активность этого ферментативного комплекса – убиквитинилирование циклинов, что опосредует их последующую деградацию протеасомой (Juang et al., 1997; Schuyler, Liu, and Pellman, 2003). Мы предполагаем, что экспрессированный в дрожжах мутантный хантингтин перегружает протеасому, что замедляет протеолиз циклинов и таким образом тормозит фазу деления клеточного цикла. Возможно, инактивация гена ASE уменьшает загруженность АРС-комплекса, таким образом ускоряя деградацию циклинов в клетках, экспрессирующих мутантный хантингтин.

Это согласуется с данными, полученными в нашей лаборатории, которые свидетельствуют о том, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина частично спасает дрожжевые клетки от гиперактивации АРС (Sokolov et al., 2006). Было показано, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина приводит к нарушениям клеточного цикла. Предположили, что экспрессия 103Q ингибирует АРСкомплекс, таким образом препятствуя выходу из митоза. Чтобы проверить это предположение, в клетках проэкспрессировали ген СDC20, кодирующий субъединицу АРС-комплекса, под галактозным промотором. Клетки со сверхэкспрессией Cdc20 не могли расти на среде с галактозой, потому что АРСкомплекс индуцировал арест в G1 фазе клеточного цикла. Однако экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина (в отличие от фрагмента нормальной длины) позволяла этим клеткам расти и формировать микроколонии (рис. 8). Поэтому был сделан вывод, что экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина задерживает клетки в митотической фазе деления.

Рисунок 8. Экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина (103Q) снижает токсический эффект сверхэкспрессии субъединицы АРС-комплекса Cdc20.

Если увеличить активность работы АРС-комплекса или нейтрализовать избыток циклинов, можно будет избежать перегрузки протеасомы, вызванной образованием агрегатов хантингтина. Для проверки этого предположения были получены мутантные штаммы W303-1A 103Q clb2, W303-1A 103Q CDH1, W303-1A 103Q yca1 CDH1.

Было установлено, что гиперэкспрессия гена CDH1, являющегося активатором АРС-комплекса, и нарушение гена CLB2, кодирующего циклин В, также повышали выживаемость и колониеобразующую способность клеток, экспрессирующих мутантный фрагмент хантингтина (рис. 9 и 10). При этом клетки практически не теряли конструкцию 103Q-CFP (данные не показаны) и показывали приблизительно одинаковый уровень экспрессии полиглутаминового фрагмента (рис. 11 и 12). Таким образом, мы получили свидетельства в пользу нашей гипотезы о том, что экспрессия мутантного полиглутаминового фрагмента хантингтина ведет к перегрузке протеасомы, что в свою очередь приводит к накоплению субстратов АРС-комплекса, замедлению протеолиза циклинов и, как следствие, задержкам клеточного цикла и гибели клеток.

Рисунок 9. Влияние генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, на колониеобразующую способность дрожжей, экспрессирующих мутантный хантингтин (YPRafGal, 24 часа).

Рисунок 10. Отношение размера колоний штаммов в условиях экспрессии полиглутаминового фрагмента к размеру колоний при отсутствии экспрессии, %.

Рисунок 11. Оценка уровня экспрессии полиглутаминового фрагмента с помощью белкового электрофореза в ПААГ Рисунок 12. Оценка уровня экспрессии полиглутаминового фрагмента с помощью дотблоттинга.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ На основании полученных данных мы предлагаем следующую схему событий, вызываемых экспрессией удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в дрожжах (рис. 13). Мутантный хантингтин накапливается в ядре и взаимодействует с белками, содержащими полиглутаминовые домены, в частности, транскрипционными факторами и эндоцитозными белками, способствуя их инактивации. Помимо этого, экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента в дрожжах перегружает убиквитинпротеасомный комплекс, что замедляет протеолиз циклинов и таким образом тормозит фазу деления клеточного цикла. В конечном итоге эти события приводят к клеточной гибели, сопровождающейся некоторыми маркерами апоптоза.

Считается, что основная роль дрожжевой метакаспазы – участие в программируемой гибели клеток. Однако в последнее время появляются неапоптотические события, например, в регуляцию G2/M чекпоинта клеточного цикла (Lee at al,, 2008). Возможно, участие в гибели клеток, вызванной экспрессией мутантного полиглутаминового фрагмента хантингтина, генов, вовлеченных в регуляцию клеточного цикла, и дрожжевой метакаспазы не является независимым друг от друга, о чем косвенно свидетельствуют результаты, полученные в данной работе.

Рисунок 13. Предполагаемая схема событий, происходящих в клетках при экспрессии хантингтина с удлиненным полиглутаминовым фрагментом.

Мы считаем, что влияние мутантного полиглутаминового фрагмента хантингтина на компоненты клеточного цикла имеет важное значение не только для дрожжевой модели болезни Хантингтона. Известно, что циклины – не единственные субстраты АРС-комплекса. Было показано, что деградация факторов дифференцировки нейронов Id2 (Lasorella et al., 2006) и SnoN (Stegmller et al., 2006) катализируется АРС/C(CDH1). Также имеются данные о том, что белок Cdh1 необходим для нормального функционирования мозга, в частности, процессов, связанных с памятью и обучаемостью (Li at al,, 2008).

Мы предполагаем, что в нейронах удлиненные полиглутамины могут привести к патологическому накоплению Id2 и SnoN. Если это предположение окажется верным, то белки Cdh1, Id2 и SnoN станут потенциальными мишенями при лечении полиглутамин-зависимых заболеваний.

5.

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ 1. Токсичность удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина коррелирует с его накоплением в ядре, что подтверждает гипотезу об инактивации транскрипционных факторов и других полиглутаминсодержащих ядерных белков.

2. Экспрессия удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина в клетках дрожжей сопровождается признаками программированной клеточной гибели. В тоже время нарушение гена дрожжевой метакаспазы YCA1 влияет на локализацию агрегатов полиглутаминового фрагмента хантингтина и снижает его токсичность для клеток.

3. Добавление антиоксидантов несколько снижает, но не устраняет полиглутаминового фрагмента хантингтина в клетках дрожжей, это свидетельствует о том, что образование активных форм кислорода не является основным вкладом в механизм патогенеза.

полиглутаминового фрагмента хантингтина.

5. Показано, что нарушение генов ASE1, СLB2, а также гиперэкспрессия гена CDH1 снижает токсичность удлиненного полиглутаминового фрагмента хантингтина. Это свидетельствует в пользу того, что в дрожжах агрегаты полиглутаминов токсичны не напрямую, а опосредованно: попытка клетки деградировать агрегаты приводит к перегрузке протеасом, накоплению субстратов АРС-комплекса и, как следствие, патологическим последствиям для клетки.

6. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Sokolov, S., Pozniakovsky, A., Bocharova, N., Knorre, D., Severin, F. (2006) Expression of an expanded polyglutamine domain in yeast causes death with apoptotic markers. Biochim Biophys Acta 1757 (56): 660-666.

2. Кнорре, Д.А., Смирнова, Е.А., Бочарова, Н.А., Филонов, Н.А., Соколов, С.С., Северин, Ф.Ф. (2006) Поиск регуляторов программируемой клеточной смерти в дрожжах Saccharomyces cerevisiae. Международная конференция "Физико-химическая биология", Новосибирск, Россия, с.43.

3. Бочарова Н.А. (2007) Дрожжи Saccharomyces cerevisiae как модель для изучения болезни Хантингтона. Материалы XIV Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», Москва, Россия, с. 21.

4. Бочарова, Н.А., Соколов, С.С., Кнорре, Д.А., Северин, Ф.Ф. (2007) Программированная клеточная гибель дрожжей Saccharomyces cerevisiae, полиглутаминовым фрагментом. Материалы международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, Россия, с. 169-171.

5. Bocharova, N., Knorre, D., Sokolov, S., Severin, F. (2008) Genetic screening for genes associated with huntingtin expanded polyglutamine domain cytotoxicity in yeast Saccharomyces cerevisiae. Proceeding of 6th International Meeting on Yeast Apoptosis, Leuven, Belgium, р. 82.

6. Кнорре, Д.А., Бочарова, Н.А., Ожован, С.М., Соколов, С.С., Северин, Ф.Ф.

(2008) Saccharomyces cerevisiae в условиях стресса. IV съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, Россия, с. 332.



 
Похожие работы:

«БОНДАРЕНКО Алексей Викторович ДНЕВНЫЕ БАБОЧКИ (LEPIDOPTERA, DIURNA) ЗАСУШЛИВЫХ ТЕРРИТОРИЙ СЕВЕРО-ЗАПАДА АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ГОРНОЙ СТРАНЫ: ФАУНА И НАСЕЛЕНИЕ 03.02.05 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Новосибирск – 2011 Работа выполнена на кафедре зоологии, экологии и генетики в лаборатории биомониторинга Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Горно-Алтайский государственный...»

«ЮНУСОВ Руслан Рауфович Математическое моделирование процесса фототрансдукции в палочках сетчатки (Специальность: 03.00.02. – биофизика) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2006 2 Работа выполнена в Институте биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН Научный руководитель : Доктор биологических наук Каламкаров Григорий Рафаэльевич Официальные оппоненты Доктор химических наук, профессор Комиссаров Геннадий Германович...»

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«КИРИЛЮК Ольга Кузьминична ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ СЕТИ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ ЭКОРЕГИОНА ДАУРСКАЯ СТЕПЬ Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Хабаровск – 2011 Работа выполнена в лаборатории эколого-экономических исследований Института природных ресурсов, экологии и криологии СО РАН и Государственном природном биосферном заповеднике Даурский...»

«МАНУХОВ Илья Владимирович СТРУКТУРА LUX-ОПЕРОНОВ И МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ ТИПА QUORUM SENSING У МОРСКИХ БАКТЕРИЙ. (03.02.07 – Генетика) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2011 2 Работа выполнена в лаборатории генетики бактерий ФГУП Государственного научноисследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ФГУП ГосНИИгенетика) Научный консультант доктор биологических наук, профессор Завильгельский...»

«СКВОРЦОВ Алексей Николаевич МЕХАНИЗМ ПОСТУПЛЕНИЯ ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С УЧАСТИЕМ СИСТЕМЫ ТРАНСПОРТА МЕДИ 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Учреждении Российской академии наук Институт...»

«Вокин Алексей Иннокентьевич ЭКОЛОГИЯ ХАРИУСОВЫХ РЫБ (THYMALLIDAE) ГОРНЫХ ВОДОЕМОВ БАЙКАЛЬСКОЙ РИФТОВОЙ ЗОНЫ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2008 3 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных и экологии и кафедре водных ресурсов ЮНЕСКО Иркутского государственного университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Самусёнок Виталий Петрович Официальные оппоненты : доктор...»

«Кузьменко Александр Анатольевич РАСТИТЕЛЬНОСТЬ МОРЕННЫХ И ВОДНО-ЛЕДНИКОВЫХ РАВНИН ЮЖНОЙ ОКРАИНЫ СМОЛЕНСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Брянск 2014 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Брянский государственный университет имени академика И.Г. Петровского доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Булохов Алексей Данилович Официальные оппоненты :...»

«ЦИБУЛЬКИНА Елена Арнольдовна ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В КЛЕТКИ-МИШЕНИ 03.00.23 – биотехнология 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова и в лаборатории иммунохимии отдела биологической психиатрии ФГУ Государственного научного...»

«ШАТИЛОВ ДЕНИС ВАЛЕРЬЕВИЧ ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ ПЕРЕХОДА МРНК ИЗ ИНФОРМОСОМ В ПОЛИРИБОСОМЫ У РАЗНЫХ ВИДОВ АМФИБИЙ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва –2003 1 Работа выполнена в лаборатории регуляции биосинтеза белка Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук А. С. Воронина Официальные оппоненты : доктор биологических наук В.П. Божкова доктор биологических наук...»

«КАЛИШЬЯН Михаил Сергеевич Неоадьювантная комбинированная химиотерапия рака молочной железы животных с использованием адриамицина, циклофосфамида и бинарной каталитической системы Терафтал+аскорбиновая кислота 03.00.04 - биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА, 2009 г. 1 Работа выполнена в лаборатории комбинированной терапии опухолей НИИ ЭД и ТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (г.Москва) Научные руководители: профессор, доктор...»

«БАШМАНОВ Александр Геннадьевич ПЕЛАГИЧЕСКИЕ ОСТРАКОДЫ (OSTRACODA: MYODOCOPA) СЕВЕРНОГО ЛЕДОВИТОГО ОКЕАНА (СОСТАВ, РАСПРЕДЕЛЕНИЕ) 03.00.18 – гидробиология (Биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток PDF created with pdfFactory trial version www.pdffactory.com Работа выполнена в Лаборатории планктонологии Института биологии моря имени А.В. Жирмунского ДВО РАН Научный руководитель доктор биологических наук,...»

«СТЕПАНОВА Мария Сергеевна окислительного стресса мозга с помощью Коррекция природных и синтетических антиоксидантов 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 2 Работа выполнена в лаборатории клинической и экспериментальной нейрохимии Научного Центра неврологии РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ДОРОФЕЮК Надежда Ивановна Реконструкция природных условий Внутренней Азии в позднеледниковье и голоцене (по материалам диатомового и палинологического анализов озерных осадков Монголии) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2008 3 Работа выполнена в лаборатории экологии аридных территорий Института проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН Официальные оппоненты : доктор биологических наук Савинецкий...»

«Титков Александр Сергеевич АЭРОДРОМНАЯ ЭКОЛОГИЯ ПТИЦ Специальность 03.00.16 Экология Автореферат Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Оборотная сторона обложки автореферата Работа выполнена на кафедре системной экологии Российского университета дружбы народов (наименование организации) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ильичев Валерий Дмитриевич (ученая степень, ученое звание, фамилия, имя, отчество)...»

«Молодых Евгения Сергеевна Влияние профиля латеральной организации мозга на успешность адаптации к образовательному процессу лиц подросткового и юношеского возраста 03.00.13 - физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск - 2005 Работа выполнена на базе Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования “Алтайский государственный университет Министерства образования и науки РФ ” Научный...»

«КРАВЦОВА Людмила Павловна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ PANZERINA LANATA (L.) SOJAK SUBSP. ARGYRACEA (KUPRIAN.) KRESTOVSK. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В ХАКАСИИ 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2006 Работа выполнена в НИИ аграрных проблем Хакасии СО РАСХН (г. Абакан) и в Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН (г. Новосибирск). Научный руководитель — доктор биологических наук, с.н.с. Высочина Галина...»

«Круглик Ольга Витальевна Реакция организма здоровых животных и животных с асцитной карциномой Эрлиха на воздействие сверхвысокочастотного электромагнитного излучения Специальность – 03.02.08 (экология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск, 2014 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет и ФГБУН Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук,...»

«КОРЕНЬКОВ Даниил Анатольевич ОЦЕНКА ЖИВОЙ РЕАССОРТАНТНОЙ ГРИППОЗНОЙ ВАКЦИНЫ ПО ИНДУКЦИИ В- И Т-КЛЕТОЧНОЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ПАМЯТИ 14.00.36 – Аллергология и иммунология 03.00.06 – Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Санкт-Петербург 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук научноисследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН Научный руководитель :...»

«ТРЕТЬЯКОВА СВЕТЛАНА ЭДУАРДОВНА СОЗДАНИЕ БИОПРЕПАРАТОВ НА ОСНОВЕ ШТАММОВ–ДЕСТРУКТОРОВ ПЕСТИЦИДОВ ПРОМЕТРИНА И ПАРАТИОН–МЕТИЛА И ИСПЫТАНИЕ ТЕХНОЛОГИИ РЕМЕДИАЦИИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2013 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.