WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Морозова Ольга Владимировна

ЛАККАЗЫ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ,

ЛАККАЗА-МЕДИАТОРНЫЕ СИСТЕМЫ И ВОЗМОЖНОСТИ

ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель доктор химических наук, профессор А.И.Ярополов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская доктор химических наук И.Н.Курочкин

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится «5» декабря 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « 2 » ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с ужесточением требований к экологической безопасности химических процессов все большие масштабы приобретает использование биокаталитических технологий в промышленности. Промышленное получение биокатализаторов на основе технических ферментов является экономически выгодным. Об этом свидетельствует возрастающий объем продаж технических препаратов ферментов на мировом рынке, который в 2004 году составил почти 1, миллиарда долларов.

В промышленных биокаталитических процессах широко используются различные ферменты. Особый интерес представляет лакказа, которая способна катализировать реакции окисления широкого круга органических веществ молекулярным кислородом. Каталитические и электрокаталитические свойства лакказы дают возможность ее широкого использования в целлюлозно-бумажной промышленности для делигнификации бумажной пульпы, в текстильной промышленности для отбеливания тканей, для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, для биодеградации ксенобиотиков, для создания антимикробных композиций, в пищевой и косметической промышленности, при получении древесноволокнистых плит без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств, при разработке катодов биотопливных элементов и других областях [Durn et al., 2002;





Mayer & Staples, 2002; Cuoto & Herrera, 2006]. Так, например, фирма «Novozymes»

(Дания) выпускает на основе лакказы коммерческие препараты для отбеливания и обработки текстильных изделий, делигнификации бумажной пульпы и обработки корковой пробки [http://www.novozymes.com].

Помимо использования лакказ в различных биотехнологических процессах этот фермент представляет большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований его структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра лакказ, в который входят четыре иона меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе ферментативного окисления субстратов позволяет осуществлять восстановление молекулярного кислорода до воды, минуя стадию образования пероксида водорода.

Интерес к практическому использованию лакказ возрос после открытия соединений «усиливающих» действия фермента, так называемых медиаторов [Bourbonnais, Paice, 1990]. Это позволило существенно расширить область их практического применения. Таким образом, создание высокоэффективных лакказа-медиаторных систем (ЛМС) для использования в биотехнологии является в настоящее время весьма актуальным.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в сравнении свойств лакказ, выделенных из различных базидиальных грибов, для установления сходства и различий их физико-химических характеристик, а также поиск редокс-медиаторов этих ферментов с целью создания эффективных ЛМС. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести в одинаковых условиях сравнение основных физико-химических характеристик лакказ базидиальных грибов Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima с целью выявления наиболее стабильного, высокопотенциального и каталитически активного фермента 3. Разработать схему отбора потенциальных редокс-медиаторов лакказ 4. Найти соединения, которые наиболее полно отвечали бы требованиям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам лакказ 5. Провести апробацию лакказа-медиаторных систем на примере делигнификации лигноцеллюлозы.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые сравнить в одинаковых условиях биохимические и электрокаталитические свойства лакказ, выделенных из культуральных жидкостей различных родов и видов базидиальных грибов.

Предложена схема отбора потенциальных медиаторов лакказ и экспериментальные методы их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента.





Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 и показана возможность использования сульфопроизводных 1-фенил-3метил-пиразолона-5 в процессе делигнификации лигноцеллюлозы.

Практическая ценность работы. Впервые в одинаковых условиях проведено комплексное сравнительное изучение лакказ, выделенных из различных источников. Показано, что все исследованные грибные лакказы относятся к высоко редокспотенциальным ферментам и являются высокоактивными как в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров, так и в гетерогенных электрохимических реакциях восстановления дикислорода. Разработана схема отбора органических соединений с целью выявления новых медиаторов лакказ. Найден новый класс соединений – 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые отвечают многим требованиям, предъявляемым в настоящее время к медиаторам (усилителям действия ферментов), а именно низкая стоимость, экологическая чистота и достаточно высокая эффективность. В работе показано, что сульфопроизводные 1-фенил-3-метилпиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ при ферментативной деградации ксенобиотиков, в частности лигниноподобных веществ. Группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма многочисленна, и введением того или иного заместителя можно добиться значительного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения. Проведены лабораторные испытания ЛМС для делигнификации бумажной пульпы.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на конференции «Biocatalysis-2002».

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 печатных работ, в том числе 7 статей в ведущих российских и международных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (278 наименований). Работа изложена на 139 страницах и содержит 40 рисунков и 11 таблиц.

Сокращения, принятые в тексте. ЛМС – лакказа-медиаторная система; ABTS – диаммониевая соль 2,2’-азино-бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновой) кислоты;

HABA – 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота; HBT – 1-гидроксибензотриазол;

HPI – N-гидроксифталеимид; PP – 1-фенил-3-метилпиразолон-5; PPA – 1-фенилдиметил-4-аминопиразолон-5; PPA-Na – 1-фенил-3-метил-4-метиламинопиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия; mSPP – 1-(3’-сульфофенил)-3-метилпиразолон-5; pSPP – 1-(4’-сульфофенил)-3-метил-пиразолон-5; VA – вератровый спирт.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из трех частей. В первой части рассматривается строение, свойства и каталитический механизм действия лакказ. Во второй части описаны основные усилители действия лакказ и лакказамедиаторные системы. В третьей части рассмотрены возможности использования лакказ и лакказа-медиаторных систем в биотехнологии.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

В работе использовали лакказы, выделенные из культуральных жидкостей базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Определение молекулярной массы лакказ проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные исследования лакказ проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman», Германия), спектрофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спектрометра ESC- («Bruker», Германия). Определение потенциала Т1 центра лакказ осуществляли методом окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве медиаторной пары октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978; Xu et al., 1996b]. Определение рН-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых лакказами, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Циклические вольтамперограммы записывали на анализаторе CV 50W («BAS», США) работающем в трехэлектродном режиме (рабочие электроды – стеклоуглерод и спектральный графит, электрод сравнения – хлорсеребряный электрод, вспомогательный электрод – платиновая проволока). Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) лакказа-медиаторными системами использовали метод гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления.

Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке; их количество в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия).

В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и основные физико-химические свойства лакказ Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima Из культуральных жидкостей базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima были выделены в гомогенном состоянии лакказы, основные биохимические характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы все изученные лакказы являются гликопротеинами, имеют оптимум рН (при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина) в интервале 3.5-5.2, значения их изоэлектрических точек находятся в кислой области рН. Как и большинство описанных в литературе лакказ, эти ферменты содержат иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все изученные лакказы обладают высокой термостабильностью (сохраняют до 50% первоначальной активности через 52-65 часов инкубации при 50оС), что является важным условием для их использования в биотехнологических процессах.

Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики лакказ C. fulvocinerea При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина Время полуинактивации при 50оС Были определены кинетические параметры реакций, катализируемых этими (Табл. 2). Как видно из таблицы, лакказа T. hirsuta обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к органическим субстратам.

В то же время, лакказа C. maxima показала наибольшее значение kкат при окислении ферроцианида калия.

Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами* Субстрат kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, kкат, Kм, kкат/ Kм, кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам Оптимум рН для всех изученных лакказ был приблизительно одинаков и находился в интервале рН 3.5–5.0 при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина (Рис. 1А), а кривая зависимости активности от рН раствора имела колоколообразную форму. При использовании ферроцианида калия активность ферментов монотонно падала при изменении рН раствора от 2.5 до 5.5 (Рис. 1Б). Таким образом, рН-профили активности всех изученных лакказ, при использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединения, не отличались от таковых для других лакказ, описанных в литературе.

V0, мМ О2 /(мин·мг) С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляет структура лакказ и механизма катализа. Активный центр лакказ содержит 4 иона меди, которые подразделяют на три типа по их спектроскопическим характеристикам: Т1 центр – характеризующийся полосой оптического поглощения в области 600 нм и слабым сверхтонким расщеплением в спектрах ЭПР; Т2 центр – не видимый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР сверхтонким расщеплением; Т3 центр – биядерный диамагнитный медный центр, который может быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.

Cпектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов (Рис. 2) оказались типичными для «голубых» лакказ, описанных в литературе и выделенных из других базидиальных грибов. В них присутствовали сигналы меди Т1 центра (пик поглощения на 610 нм) и биядерного комплекса меди Т3 (плечо в области 330 нм).

Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных лакказ, имели сходные характеристики (Рис. 3).

Поглощение, о.е.

На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения (II) флуоресценции исследованных лакказ, записанные при комнатной температуре. Возбуждение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438, 436 и 443 нм для лакказ T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima, соответственно. Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо согласуются с литературными данными [Shin et al., 2000].

Спектральные характеристики Т1, Т2 и Т3 центров лакказ, полученные на основании данных спектрофотометрии, ЭПР-спектроскопии и флуоресценции представлены в Таблице 3.

Таблица 3. Спектральные характеристики Т1, Т2 и Т3 центров лакказ T. hirsuta T.ochracea C. maxima C. fulvocinerea В результате проведенных исследований были определены основные физикохимические характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов меди, входящих в состав активного центра лакказ, выделенных из культуральных фильтратов базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Показано сходство биохимических и спектральных параметров исследованных ферментов.

Одной из основных характеристик лакказ является стандартный окислительновосстановительный потенциал Т1 центра ферментов. Значения этого потенциала варьируются у различных лакказ от 430 до 790 мВ отн. НВЭ [Solomon et al., 1996;

Shleev et al., 2005b]. T1 центр фермента является первичным акцептором электронов, поступающих от субстратов-восстановителей. Непосредственно лакказы окисляют только те соединения, окислительно-восстановительный потенциал которых не превышает или превышает незначительно редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента [Xu, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциала Т1 центра зависит эффективность катализа для большинства субстратов лакказ, что делает лакказы с высокими потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей, например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных ксенобиотиков. Определение редокс потенциалов ионов меди первого типа лакказ было необходимо для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что весьма важно при проведении биотехнологических процессов.

В качестве примера на Рис. 5 представлены спектры поглощения растворов Восстановление Т1 медного центра сопровождалось уменьшением пика поглощения в области 610 нм.

Поглощение, опт. ед.

Основные электрохимические характеристики Т1 центров изученных лаккказ представлены в Таблице 4. Как видно из таблицы, тангенс угла наклона прямой титрования составляет 49, 56 и 57 мВ для лакказ T. hirsuta, C. maxima и C. fulvocinerea, соответственно, что позволяет предположить факт одноступенчатого, одноэлектронного процесса восстановления иона меди первого типа. Это хорошо согласуется с литературными данными, полученными для лакказ из других источников.

Таблица 4. Электрохимические характеристики Т1 центра лакказ Примечание: потенциалы приведены относительно нормального водородного электрода В то же время тангенс угла наклона прямой титрования лакказы T. ochracea составляет 32 мВ, что формально указывает на возможность протекания двухэлектронного процесса восстановления фермента. Однако, даже в случае одноэлектронного редокс-процесса, уменьшение угла наклона линейного участка кривой титрования может быть связано с наличием в процессе реакции стадии, не относящейся непосредственно к восстановлению иона меди.

Таким образом, все изученные лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и благодаря высокому редокс потенциалу Т1 центра являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров. Электрохимические исследования лакказ представляют интерес для понимания механизма катализа и возможности использования этих ферментов в гетерогенных биоэлектрокаталитических системах.

Биоэлектрокаталитические свойства лакказ Методами циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиаторные) электрохимические реакции восстановления дикислорода с участием лакказ T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima, адсорбированных на электродах из спектрального графита. В аэробных условиях для всех исследованных лакказ показана возможность прямого электронного переноса с электрода на фермент с последующим восстановлением молекулярного кислорода. На Рис. 6 представлены циклические вольтамперограммы немодифицированных и модифицированных лакказами электродов из спектрального графита в насыщенных кислородом буферных растворах.

При адсорбции на электродах все лакказы сильно уменьшали перенапряжение реакции электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Необходимо отметить, что для лакказы C. fulvocinerea наблюдалась более низкая электрокаталитическая активность по сравнению с другими изученными ферментами, в то время как ее активность в гомогенном растворе (Табл. 2) сравнима с активностью других лакказ. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в лакказе C. fulvocinerea, что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности электрода, а также затруднять перенос электрона с электрода на Т1 центр фермента.

Как видно из Рис. 6, начало электровосстановления дикислорода на электродах, модифицированных лакказами, находится в области 800 мВ, то есть существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов (Табл. 4) и началом реакции электровосстановления дикислорода на электроде. Таким образом, все изученные в работе лакказы могут быть использованы в качестве катализаторов для создания катода биотопливного элемента.

Ток, мкА Первоначально медиаторами называли соединения – субстраты фермента, в результате окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные вступать в химические неферментативные реакции с другими соединениями. При этом окисленный медиатор восстанавливался до первоначальной формы и таким образом формировался замкнутый цикл. Простейшая схема функционирования лакказа-медиаторных систем представлена на Рис. 7.

Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом лакказы, его окисленная и восстановленная формы должны быть стабильны и не должны ингибировать ферментативную реакцию или инактивировать фермент, а процесс его редокс-превращения должен быть циклическим. Соединения, которые в литературе называют медиаторами лакказ, на самом деле ими вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь это связано с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «enhancer», то есть усилитель действия фермента.

Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора и экспериментальных методов тестирования органических соединений – потенциальных медиаторов лакказ, включающая 4 стадии:

1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также –OH и –NH2 групп.

2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных ферментативных реакциях, катализируемых лакказой.

3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина.

4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина системой медиатор/лакказа.

Первичный отбор соединений на основе их структурных формул Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений часто зависит от природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окисление этих соединений определяется как электронными эффектами, так и стерическими факторами. Наша задача состояла в том, чтобы выбрать соединения для использования в ЛМС с наилучшими каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными характеристиками электрохимической реакции на электроде (значение редокс потенциала, обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабильности образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в структуре которых присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов, способных к реакции конденсации, а наличие аминогруппы вызывает димеризацию/полимеризацию промежуточных форм соединения. Электрон-донорные заместители (алкильная, фенильная и аминогруппы), увеличивая скорость окисления соединения и обеспечивая при этом стабильность образующихся радикалов, уменьшают окислительно-восстановительный потенциал соединения. Электрон-акцепторные группы (например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный потенциал соединения [Xu et al., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах.

При отборе соединений в качестве усилителей действия лакказ необходимо принимать во внимание, что их редокс-потенциал должен быть выше 450 мВ [Bourbonnais et al., 2000], в противном случае они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.

В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. Поиск нетоксичных гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов органических соединений, которые могли бы использоваться в качестве медиаторов лакказ, являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся в промышленных масштабах и имеют низкую себестоимость. Одним из наиболее известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (PPA-Na), который используется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства.

1-Фенил-3-метил-пиразолоны-5 (в дальнейшем именуемые фенилметилпиразолоны) относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы – метильную и фенильную группы, и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).

Было исследовано около двадцати соединений различной структуры, в том числе гетероциклических, N-OH соединений и производных бензойной кислоты.

Исследования гомогенных реакций с участием лакказы T. hirsuta позволили отобрать соединения, которые могут являться усилителями действия фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по отношению к лакказе обнаружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и аминопроизводных (PPA и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6-гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на Рис. 9.

1-(4’-сульфофенил)- 1-(3’-сульфофенил)фенил-3метилпиразолон-5 3-метил-пиразолон-5 3-метил-пиразолон- 1-фенил-3-метил-4-метиламинофенил-2,3-диметиламинопиразолон-5 пиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия

HPI HABA

N-гидроксифталеимид 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота Исследование зависимостей начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реакций описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия лакказы с этими соединениями было проведено сравнение с одним из субстратов лакказ – гидрохиноном. Результаты представлены в Таблице 4.

Как видно из таблицы, производные фенилметилпиразолона с сульфогруппой в фенильном кольце (pSPP и mSPP), либо аминогруппой в гетероцикле (PPA), являются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с гидрохиноном. Эффективность процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его гидрофобностью.

Введение в гетероцикл фенилметилпиразолона электрон-донорных групп (аминогруппы в положение 4 и метильной группы в положение 2) увеличивает значение kкаж/Kм в случае PPA более чем в 18 раз. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей (метильной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости ферментативной реакции, но значение Км увеличивается более чем в 10 раз. Возможно, более слабое взаимодействие лакказы с PPA-Na объясняется проявлением стерического фактора.

Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ E1/2 – потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с);

Iдиф – анодный ток окисления медиатора;

I – прирост анодного тока при окислении медиатора (0.2 мМ) в присутствии VA (2 мМ).

Примечания:

Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта kкаж определяли по уменьшению концентрации кислорода без учета стехиометрии реакции Определение I и Iдиф проводили при потенциале 1000 мВ Взаимодействие лакказы с HPI характеризуется низким сродством этого субстрата к ферменту и низкой скоростью реакции, а HABA является субстратом лакказы, сравнимым по своим кинетическим параметрам с гидрохиноном.

Электрохимические исследования промежуточных соединений, Были проведены вольтамперометрические исследования отобранных соединений. В качестве примера на Рис. 10 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах mSPP и HPI.

Ток, мкА На вольтамперных кривых фенилметилпиразолона и его производных наблюдались ярко выраженные токи окисления этих соединений в области потенциалов 450-660 мВ. Для PP, РРА и рSPP реакции окисления были необратимы, что подтверждалось отсутствием реакции электровосстановления на катодной ветви циклических вольтамперограмм. На вольтамперных кривых, записанных в растворах mSPP (Рис. 10) и PPA-Na, проявлялись незначительные катодные токи, которые были в 4-6 раз меньше анодных. По-видимому, необратимость электродных реакций для фенилметилпиразолона и его производных связана с неустойчивостью продуктов окисления и включением их в химические реакции до того, как они успевали восстановиться на электроде.

В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях развертки потенциала система с HPI была квази-обратимой, что подтверждалось наличием на вольтамперограммах катодного пика (Рис.10). Потенциал средней точки между катодным и анодным пиками равен 870 мВ и его условно можно принять за редокс потенциал этой пары. По-видимому, при низких скоростях развертки потенциала продукт, образующийся при окислении, был недостаточно стабилен и не успевал восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом может быть NO• радикал, как это было показано для таких медиаторов лакказ как HBT, TEMPO [Fabbrini et al., 2002; Cantarella et al., 2003].

Образование описанных выше интермедиатов исследуемых соединений происходило за счет их неферментативного окисления на электродах. Зависимость максимального анодного тока от квадратного корня из скорости развертки потенциала имела линейный характер, что свидетельствовало о том, что для всех исследованных соединений электродный процесс протекал в диффузионно-контролируемом режиме.

Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных фенилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре фенилметилпиразолона. Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо (mSPP и pSPP) и уменьшался при введении в гетероцикл электрон-донорной аминогруппы (РРА).

Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомогенного окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов – PPA-Na и mSPP в присутствии лакказы T. hirsuta.

В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в результате ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиатора и фермента в растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование нескольких промежуточных продуктов окисления медиатора.

Оптическая плотность Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно предположить существование как минимум трех основных промежуточных продуктов ферментативного окисления данного субстрата (с потенциалами максимумов анодных пиков 290, 570, и 770 мВ).

При ферментативном окислении mSPP образовывалось, по-видимому, два интермедиата (Рис. 12). При этом продукт с полосой поглощения при 340 нм являлся более высоко редокспотенциальным, так как его формирование протекало на более поздней стадии ферментативной реакции. Можно предположить образование двух основных интермедиатов mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения при 270 и 340 нм, соответственно. При этом образование первого продукта являлось быстрым процессом, в то время как образование второго продукта – процесс более медленный. Похожее двухступенчатое поведение при ферментативном окислении было показано для ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного окисления обоих субстратов лакказы [Bourbonnais & Paice, 1990; Sols-Oba et al., 2005].

Оптическая плотность Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие отобранных соединений с модельным соединением лигнина – вератровым спиртом (VA). Этот метод позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические реакции.

В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах вератрового спирта, медиаторов (mSPP, PPA-Na, HPI), а также смеси VA-медиатор. Необходимо отметить, что до потенциала 1000 мВ вератровый спирт электрохимически не активен.

Ток, мкА Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, записанные в растворах (1) медиатора (0.2 мМ); (2) вератрового спирта (2 мМ) и (3) смеси медиатора Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; скорость развертки потенциала 5 мВ/с В присутствии mSPP (Рис. 13), а также pSPP и РРА, окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. На анодной ветви кривой наблюдалось увеличение тока окисления в области потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление к раствору PPA-Na вератрового спирта не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).

В присутствии вератрового спирта в растворах гидроксифталеимида наблюдалось значительное увеличение анодного тока в области потенциалов окисления HPI и полное исчезновение тока восстановления на катодной ветви кривой (Рис.

13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата электродного окисления HPI в процесс химического окисления вератрового спирта вблизи поверхности электрода. Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в присутствии вератрового спирта увеличивался в 2.5 раза по сравнению с током в отсутствии VA (Рис. 13), что указывало на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического окисления вератрового спирта и на повторное окисление HPI на электроде.

До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления вератрового спирта в присутствии низкопотенциального продукта электродного окисления HABA, редокс потенциал которого равен 390 мВ.

В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем вератровый спирт и медиатор, к диффузионному току окисления самого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления вератрового спирта возрастала с увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с вератровым спиртом эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше 500 мВ.

Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс-усилитель фермента Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации модельного соединения лигнина – вератрового спирта, были проведены прямые эксперименты по окислению VA в гомогенном растворе системой лакказа/медиатор.

Продукты окисления разделяли методом ВЭЖХ. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве маркеров использовали вератровый спирт, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия). Для оценки эффективности аналогичный эксперимент проводили с использованием ABTS в качестве медиатора. Количественные результаты экспериментов по окислению вератрового спирта в системе лакказа/медиатор представлены в Таблице 5.

Таблица 5. Окисление вератрового спирта системами лакказа/медиатор Примечание: значения были рассчитаны как среднее по трем измерениям При использовании системы лакказа/HPI была достигнута высокая степень превращения вератрового спирта, сравнимая со степенью окисления VA в присутствии ABTS. Взаимодействие лакказы с гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции (Табл. 4). Однако, как показали электрохимические исследования, образующийся при окислении катион-радикал способен с довольно высокой скоростью окислять вератровый спирт. Благодаря этому общая эффективность процесса деградации вератрового спирта системой лакказа/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов реакции.

Иначе обстоит дело с системами лакказа/производные фенилметилпиразолона.

Как показали кинетические исследования (Табл. 4), лакказа с высокой скоростью катализирует окисление сульфопроизводных данного класса. Электрохимическими экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений нестабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными для того, чтобы окислить вератровый спирт. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих производных общая эффективность окисления VA системой лакказа/pSPP или mSPP достаточно высока, в результате чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 30 и 35% за 48 часов реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации спирта объясняется, по-видимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.

Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе лакказа/PPA-Na скорость окисления вератрового спирта оказалась значительно ниже, чем при использовании сульфопроизводных фенилметилпиразолона. В то же время, при использовании PPA-Na окисление вератрового спирта идет до соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настоящему времени медиаторов окисляют вератровый спирт до альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому, несмотря на низкую скорость реакции окисления вератрового спирта, высокопотенциальные интермедиаты PPA-Na, образующиеся в присутствии лакказы, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спектральными результатами, полученными для PPA-Na.

Контрольные эксперименты показали, что в отсутствии лакказы исследуемые нами медиаторы практически не способны к окислению вератрового спирта, а лакказа в отсутствии медиаторов окисляет менее 2% VA.

Таким образом, производные 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 могут использоваться в качестве усилителей действия лакказы.

Использование лакказа-медиаторных систем для делигнификации В рамках выполнения гранта INCO-Copernicus совместно с Центральным научно-исследовательским институтом бумаги (ОАО «ЦНИИБ») были проведены прямые эксперименты по делигнификации лигноцеллюлозы лакказамедиаторными системами. Для этой цели была разработана лабораторная установка, схема которой представлена на Рис. 14.

Для делигнификации использовали сульфатную небеленую хвойную целлюлозу Марийского Целлюлозно-бумажного комбината, в качестве ферментного препарата – фильтрат культуральной жидкости базидиального гриба T. hirsuta, а в качестве медиаторов испытывали PPA-Na, mSPP, HPI и для сравнения HBT. В образцах определяли содержание остаточного лигнина (число Каппа). Результаты испытаний представлены в Таблице 6.

Таблица 6. Делигнификация лигноцеллюлозы системами лакказа-медиатор * По данным Cheng et al., 2003a Как видно из таблицы, хотя производные фенилметилпиразолона показали более низкие результаты по сравнению с известным медиатором лакказ HBT, они могут использоваться в качестве усилителей действия фермента для деградации лигниноподобных веществ. Коммерческая стоимость производных этого класса соединений на два-три порядка ниже стоимости ABTS, HBT и HPI. Учитывая, что все органические усилители действия лакказ расходуются в процессе ферментативной реакции, коммерческая стоимость препаратов на их основе имеет большое значение при разработке новых биокаталитических технологий. Необходимо отметить, что группа соединений класса 1-фенил-3-метил-пиразолон-5 весьма многочисленна, и включением того или иного заместителя можно добиться значительного улучшения медиаторных свойств конкретного соединения.

ВЫВОДЫ

1. Проведено комплексное сравнительное изучение в одинаковых условиях биохимических и спектральных характеристик лакказ, выделенных из культуральных жидкостей базидиальных грибов различных родов и видов – T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima. Показано, что все изученные лакказы имеют сходные физико-химические характеристики, а также являются термостабильными и высокоактивными ферментами.

2. Определены редокс потенциалы ионов меди Т1 центров изученных лакказ. Показано, что все лакказы относятся к высокопотенциальным ферментам и способны катализировать окисление ряда органических соединений с образованием высокопотенциальных интермедиатов.

3. На графитовых электродах, модифицированных лакказами T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima в атмосфере дикислорода устанавливается высокий окислительно-восстановительный потенциал, что позволяет использовать эти ферменты в качестве биокатализаторов при создании катода биотопливного элемента. Показано, что существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов и началом реакции электровосстановления дикислорода на электроде.

4. Предложена схема отбора органических соединений – потенциальных медиаторов лакказ, которая значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента, включающая 4 стадии: отбор соединений на основе их структурной формулы;

определение каталитических характеристик этих соединений в гомогенных реакциях, катализируемых лакказой; анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствии и в присутствии модельных соединений лигнина; прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения системой лакказа/медиатор.

5. Найден новый класс медиаторов с общим названием 1-фенил-3-метилпиразолоны-5. Показано, что сульфо- и аминопроизводные этого класса соединений могут использоваться в качестве усилителей действия лакказ для деградации нефенольных подструктур лигнина. Показана возможность использования этих производных 1-фенил-3-метил-пиразолона-5 для делигнификации лигноцеллюлозы.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. G.P. Shumakovich, S.V. Shleev, O.V. Morozova, P.S. Khohlov, I.G. Gazaryan, A.I. Yaropolov «Electrochemistry and kinetics of fungal laccase mediators» Bioelectrochemistry (2006) V. 69, № 1, Р. 16- 2. S. Shleev, A. Jarosz-Wilkolazka, A. Khalunina, O. Morozova, A. Yaropolov, T. Ruzgas, L. Gorton «Direct electron transfer reactions of laccases from different origins on carbon electrodes» Bioelectrochemistry (2005) V.67, № 1, P. 115-124.

3. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. «Comparison of physicochemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes». Biochimie (2004) V. 86, № 9-10, Р. 693-703.

4. С.В. Шлеев, Ир Гвон Хан, О.В. Морозова, Ю.М. Мажуго, А.С. Халунина, А.И.

Ярополов. «Фенил-пиразолоны – новый класс редокс-медиаторов оксидоредуктаз для деградации ксенобиотиков». Прикладная биохимия и микробиология.

(2004) Т. 40, № 2, С.165-172.

5. Shleev S.V., Gvon Khan I., Gazaryan I.G., Morozova O.V., Yaropolov A.I. «Novel laccase redox mediators. Spectral, electrochemical, and kinetic properties». Applied Biochemistry and Biotechnology (2003) V. 111, № 3, Р. 167- 6. Шлеев С.В., Газарян И.Г., Горшина Е.С., Кузнецов Б.А., Сереженков В.А.. Бурбаев Д.Ш., Морозова О.В., и Ярополов А.И.. «Спектральное и электрохимическое изучение активных сайтов лакказ базидиомицетов». Вестник Московского Университета (2003), Т. 44, № 1, С. 35-39.

7. O. Koroljova-Skorobogat’ko, E. Stepanova, V. Gavrilova, O. Morozova, N. Lubimova, A. Dzchafarova, A. Yaropolov, A. Makower. «Purification and characterization of the constitutive form of laccase from the basidiomycete Coriolus hirsutus and effect of inducers on laccase synthesis». Biotechnology and Applied Biochemistry (1998) V. 28, № 1, P. 47-54.

8. Shleev S.V., Gazaryan E.A., Gorshina E.S., Kuznetsov B.A., Serezhenkov V.A., Burbayev D.Sh., Morozova O.V. and Yaropolov A.I. «Spectral and electrochemical study of active sites laccases from basidiomycetes». Abstracts of International Conference «Biocatalysis-2002», June 22-27, 2002, Moscow, Russian Federation, P.133- 134.



 
Похожие работы:

«Крюкова Мария Викторовна ФЛОРА НИЖНЕГО ПРИАМУРЬЯ: СОСТАВ, ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ 03.02.01 - Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Владивосток 2013 Работа выполнена в лаборатории экологии растительности Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт водных и экологических проблем Дальневосточного отделения Российской академии наук Научный консультант : доктор биологических...»

«ИВОНИН АЛЕКСЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ШТАММА YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ НА МОДЕЛИ ЭРИТРОЦИТОВ 03.02.03 микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2010 2 Работа выполнена на кафедре морфологии и микробиологии ФГОУ ВПО Вятская государственная сельскохозяйственная академия Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Романов Владимир Евдокимович Официальные оппоненты : доктор медицинских наук,...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«Бобровский Максим Викторович БИОТИЧЕСКИЕ И АНТРОПОГЕННЫЕ ФАКТОРЫ ДОЛГОВРЕМЕННОЙ ДИНАМИКИ ЛЕСНЫХ ПОЧВ ЕВРОПЕЙСКОЙ РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Владимир – 2013 Работа выполнена в лаборатории моделирования экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук Официальные...»

«ВОЕВОДИН Владимир Александрович УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ СЕМЕНИ ДОМАШНИХ КОЗ И ИХ ГИБРИДОВ С СИБИРСКИМ КОЗЕРОГОМ 03.01.06 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Дубровицы – 2012 Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии. доктор биологических наук, член Научный...»

«СОЛОВЬЕВА СВЕТЛАНА ВЛАДИМИРОВНА СОСТОЯНИЕ АНТИГИПОКСИЧЕСКИХ И НЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЗАЩИТНЫХ МЕХАНИЗМОВ У ЖИТЕЛЕЙ СЕВЕРА ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ 03.00.13 - физиология 14.00.05 - внутренние болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук Тюмень - 2007 Работа выполнена в ГОУ ВПО Тюменский государственный университет МОН РФ и ГОУ ВПО Тюменская государственная медицинская академия Росздрава. Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор...»

«Мехтиев Ариф Раминович БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НОВЫХ ОКСИГЕНИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ СТИГМАСТАНА И ЭРГОСТАНА В КЛЕТКАХ HEP G2 И MCF-7 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук Научный руководитель : доктор биологических наук Мишарин Александр Юрьевич...»

«ПЛОТНИКОВА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНА ВЛИЯНИЕ МЕТИЛФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ОСНОВНЫЕ ЗВЕНЬЯ ГОМЕОСТАЗА БЕЛЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Российский научный центр Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова (РНЦ ВТО) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный...»

«СТЕПАНОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА ВОЗРАСТНЫЕ И ИНДИВИДУАЛЬНО-ТИПОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ ОРГАНИЗМА ШКОЛЬНИЦ К СКОРОСТНО-СИЛОВОЙ МЫШЕЧНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ 03.00.13 – физиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Челябинск – 2009 Работа выполнена в НИИ деятельности в экстремальных условиях, ФГОУ ВПО Сибирский государственный университет физической культуры и спорта Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор Харитонова...»

«Брежнева Ирина Николаевна МЕТОДИКА ОЦЕНКИ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФИТОСТРОМУ ПРИ СТРОИТЕЛЬСТВЕ СКВАЖИН (на примере Оренбургского Предуралья) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2010 2 Работа выполнена в Волго-Уральском научно-исследовательском и проектном институте нефти и газа, г. Оренбург доктор биологических наук, профессор, Научный Рябинина Зинаида Николаевна руководитель доктор...»

«Гусев Евгений Сергеевич ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ФИТОПЛАНКТОНА СТРАТИФИЦИРОВАННЫХ ОЗЕР КАРСТОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ (ВЛАДИМИРСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.18 –гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Борок – 2007 Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Корнева Людмила Генриховна Официальные...»

«УДК 579.852.11 КАЮМОВ АЙРАТ РАШИТОВИЧ СТРУКТУРА ГЕНА СУБТИЛИЗИНОПОДОБНОЙ ПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS И РЕГУЛЯЦИЯ ЕГО ЭКСПРЕССИИ 03.00.07 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2006 Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии ГОУВПО Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Шарипова...»

«Шаповалова Ирина Борисовна СОСТАВ И СТРУКТУРА ОРНИТОКОМПЛЕКСОВ ОСТРОВОВ ВОЛГОГРАДСКОГО ВОДОХРАНИЛИЩА Специальность 03.00.16. – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном научном учреждении Институт водных проблем РАН, г. Москва Научный руководитель : доктор географических наук Новикова Нина Максимовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Равкин Евгений...»

«Манаева Елизавета Сергеевна Влияние полевок (Microtus rossiaemeridionalis и Clethrionomys glareolus) на биологическую активность почв 03.02.08 – экология (биологические наук и) 03.02.13 – почвоведение (биологические науки) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2013 Работа выполнена в Лаборатории экологии и функциональной морфологии высших позвоночных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института проблем...»

«Гусева Ольга Геннадьевна НАПОЧВЕННЫЕ ХИЩНЫЕ ЖЕСТКОКРЫЛЫЕ И ПАУКИ В АГРОЛАНДШАФТАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА РОССИИ Шифр и наименование специальности: 03.02.05 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2014 2 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт защиты растений Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВИЗР Россельхозакадемии) Официальные оппоненты :...»

«ДЁМИН Сергей Сергеевич КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ КАЛЬКУЛЁЗНОМ ХОЛЕЦИСТИТЕ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 1 Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Белгородский государственный университет...»

«ЖУКОВА Ольга Валерьевна ПОПУЛЯЦИОННОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОВИДОВ МАНЖЕТКИ Alchemilla vulgaris L.s.l., Rosaceae 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2008 Диссертация выполнена на кафедре биологии растений ГОУВПО Марийский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Глотов Николай Васильевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Баранова Ольга...»

«ВЕРХУША Владислав Витальевич ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ТАЙМЕРЫ, ПОСТОЯННО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ И ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ БЕЛКИ 03.01.03 - молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН и в Медицинском колледже им. А. Эйнштейна в Нью-Йорке Научный консультант : доктор...»

«Бреннер Евгений Владиславович МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭПИДЕМИОЛОГИЯ И СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ГЕНОДИАГНОСТИКИ ФЕНИЛКЕТОНУРИИ В РЕГИОНАХ РОССИИ 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск, 2009 г. Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского Отделения РАН Научные руководители: кандидат биологических наук Морозов И.В. Официальные...»

«КУЛУЕВ БУЛАТ РАЗЯПОВИЧ НОВЫЕ ПРОМОТОРЫ КАУЛИМОВИРУСОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ИХ ХИМЕРНЫХ ФОРМ 03.00.04 - биохимия 03.00.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2007 Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета. Научные руководители Доктор биологических наук, профессор Р.И. Ибрагимов Доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.