WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Ханова Елена Анатольевна

МЕХАНИЗМ ПОДАВЛЕНИЯ АГРЕГАЦИИ БЕЛКОВ -КРИСТАЛЛИНОМ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2006

Работа выполнена в лаборатории ферментных систем Института биохимии им. А.Н. Баха РАН доктор биологических наук К.А. Маркосян

Научный руководитель:

доктор биологических наук Н.П. Юрина

Официальные оппоненты:

кандидат биологических наук Л.В. Белоусова ГОУ ВПО Российский университет дружбы народов

Ведущая организация:

Защита состоится «19» декабря 2006 г. в 1400 час. на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н.

Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «18» ноября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Неправильный фолдинг и агрегация белков сопровождаются образованием нерастворимых внутриклеточных структур. В связи с тем, что в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных, так называемых «конформационных» заболеваний человека, лежат изменения вторичной и/или третичной структуры белков, приводящие к формированию нерастворимых агрегатов с различной надмолекулярной организацией, изучению агрегации белков уделяется большое внимание.

Проблему агрегации белков приходится учитывать не только в медицине, но и при решении биотехнологических задач, поскольку рекомбинантные белки также часто агрегируют. В физиологических условиях белковые агрегаты не накапливаются в клетках благодаря существованию внутриклеточного механизма «контроля качества» (“quality control”) белков, который осуществляется в результате совместного действия шаперонов и протеиназ.





-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока, обладает шапероноподобной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет их агрегацию. В хрусталике -кристаллин обеспечивает защиту - и -кристаллинов от ультрафиолетового облучения и окислительного стресса, повреждающих эти кристаллины и приводящих к развитию катаракты. Образование / и / комплексов в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании его прозрачности и светопреломляющих свойств. Повышенная экспрессия -кристаллина обнаруживается также во многих тканях в условиях стресса и при различных патологиях. В связи с обнаружением того, что -кристаллин in vitro обладает шапероноподобной активностью, появились многочисленные работы по изучению его влияния на денатурацию и агрегацию различных белков и ферментов. Было установлено, что шапероноподобная активность -кристаллина зависит от многих факторов, включая температуру инкубации, скорость нагревания и концентрацию. Показано также, что подавление тепловой агрегации белков -кристаллином является результатом гидрофобных взаимодействий и при повышении температуры шапероноподобная активность -кристаллина возрастает. Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования по взаимодействию -кристаллина с белковыми субстратами при нагревании, механизм подавления тепловой агрегации белков -кристаллином остается невыясненным.

Цель работы. Целью настоящей работы является изучение механизма тепловой денатурации и агрегации белков и изучение механизма подавления агрегации белков -кристаллином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить кинетику тепловой агрегации L-кристаллина из хрусталика глаза быка при 60 C и агрегацию УФ-облученного L-кристаллина при 37 C.

2. Изучить кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из 3. Изучить кинетику тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces 4. Изучить и провести сравнительный анализ влияния -кристаллина на кинетику тепловой агрегации L-кристаллина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы I.

5. Исследовать агрегацию магниевой и кальциевой холоформ транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae в процессе нагревания.

Научная новизна. При анализе данных по кинетике агрегации белков, полученных методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) впервые проведено систематическое рассмотрение графиков зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Rh). Установлен линейный характер начальных участков этих зависимостей, что обеспечивает простой способ оценки размера стартовых агрегатов. Разработан метод определения длительности лаг-периода, на протяжении которого происходит формирование стартовых агрегатов.





На основании изучения кинетики агрегации белков методом ДЛС сформулирован новый механизм агрегации белков, включающий стадии разворачивания белковой молекулы, формирования стартовых агрегатов и роста фрактального агрегата путем слипания стартовых агрегатов.

Установлен механизм подавления агрегации белков в присутствии -кристаллина.

Показано, что агрегация белков подавляется в результате уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы.

Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность и, таким образом, защищают себя от агрегации. Примером может служить алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae.

Результаты, полученные методами ДЛС и ДСК при нагревании ГАФД с постоянной скоростью, позволили установить корреляцию между тепловой агрегацией и денатурацией белков (ГАФД). Методом седиментационного анализа показана диссоциация тетрамерного фермента ГАФД при повышенных температурах.

Практическое значение работы. Понимание процессов формирования белковых агрегатов в клетке открывает новые перспективы в исследовании и лечении так называемых “конформационных” заболеваний. Исследование шапероноподобной активности -кристаллина может способствовать выяснению его разнообразных функций в различных тканях в норме, в условиях стресса и при различных патологических нарушениях.

Результаты исследований механизма агрегации белков и механизма шапероноподобной активности -кристаллина можно использовать в работах по поиску химических агентов, которые блокируют агрегацию и модулируют защитное действие -кристаллина.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XVII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2005), ХII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005), на конкурсе аспирантов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на соискание стипендии имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича (2006). Присуждена стипендия имени члена-корреспондента РАН В.Л. Кретовича (2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ.

Объем и структура работы. Работа изложена на 182 страницах, содержит 79 рисунков и 13 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (8 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (5 глав), выводов и списка цитируемой литературы (328 источников).

Сокращения, принятые в тексте. АДГ – алкогольдегидрогеназа; ГАФД - глицеральдегидфосфат-дегидрогеназа; ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние; ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия; ДСН – додецилсульфат натрия; ПААГ – полиакриламидный гель; ТК – транскетолаза; DLCA - diffusion-limited cluster-cluster aggregation; RLCA - reaction-limited cluster-cluster aggregation.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Кристаллины (- и L-) выделяли из хрусталиков глаза быка согласно методике, описанной ранее [Chiou et al., 1979] совместно с к.б.н. К.О. Мурановым (лаборатория физико-химических основ рецепции, Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН). Глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа из мышц кролика была любезно предоставлена к.б.н. Р.А. Асриянц (отдел биохимии животной клетки НИИ физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ). Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae была любезно предоставлена к.б.н. О.Н. Соловьевой (отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ). Лиофилизованный препарат дрожжевой АДГ I («Sigma», США), содержащий, по данным ДСК, примесь термолабильной формы фермента, прогревали при 52 °C в течение 13 мин. При повторном сканировании прогретого образца на кривой теплопоглощения ДСК получали один пик.

Степень чистоты белков, используемых в работе, анализировали методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН.

Калориметрические исследования проводили совместно с к.б.н. С.Ю. Клейменовым (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им.

А.Н. Баха РАН) на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «ДАСМ-4М» (ИБП РАН) при постоянном избыточном давлении 2.2 атм, со скоростью нагревания 1 К/мин. Обратимость теплового перехода проверяли путем сравнения остаточной теплоемкости при повторном прогреве образца.

Кинетику агрегации белков изучали методом ДЛС. Измерения проводили на установке Photocor Complex (Photocor Instruments Inc., США) с He-Ne лазером (Coherent, USA, Model 31-2082, 632,8 нм, 10 мВ) в качестве источника света. Температура образцов поддерживалась при помощи PID temperature controller в пределах ± 0.1 °C. Автокорреляционные функции измеряли при помощи Photocor-FC в режиме multiple-tau с использованием 288 каналов и логарифмической шкалой времени. Обработку автокорреляционных функций и расчёт размеров гидродинамического радиуса Rh проводили при помощи программы DynaLS (Alango, Израиль).

Эксперименты по скоростной седиментации выполняли совместно с д.б.н. Н.А.

Чеботаревой (лаборатория молекулярной организации биологических структур, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН) на аналитической ультрацентрифуге «Spinco E» (Beckman, США), с использованием абсорбционной сканирующей оптической системы при длине волны 280 нм, при 20-45 °С и скоростях вращения ротора от 1000 до 40000 об/мин.

Коэффициенты седиментации определяли с использованием программы SEDFIT [Schuck, 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Исследование стабильности –кристаллина в процессе нагревания Все эксперименты по испытанию шапероноподобной активности –кристаллина предварительно было изучено олигомерное состояние –кристаллина при повышенных регистрировали методом ДЛС. В физиологических условиях -кристаллин является высокомолекулярным комплексом (825 кДа) с размером гидродинамического радиуса 10. нм. На рис. 1A и Б показана зависимость интенсивности светорассеяния (I) и гидродинамического радиуса (Rh) –кристаллина от температуры в интервале от 24 до 76 °C.

Нагревание проводили с постоянной скоростью 1 K/мин. Увеличение температуры приводило к небольшому уменьшению интенсивности светорассеяния (кривая 1, рис. 1A) и одновременному уменьшению величины Rh (кривая 1, рис. 1Б), связанному с диссоциацией I (фотоотсчет/с) светорассеяния и увеличением Rh до 15 нм. Данные по ДСК для -кристаллина показали, что белок начинает денатурировать при температуре выше 48 °C (кривая 1, рис. 3В). Удельная теплоемкость (Cex) достигала максимальной величины при T = 63.7 °C. Повторное нагревание образца сразу после его охлаждения (кривая 2 на рис. 1В) показало, что процесс денатурации –кристаллина обратим на 86%. Таким образом, -кристаллин обладает самовосстанавливающейся структурой, а присутствие остаточных агрегатов в системе после охлаждения (см. рис. 1A и Б) связано с частичной необратимостью его денатурации.

-Кристаллин стабилен при длительном нагревании и при повышении температуры образуется более динамичная структура белка.

2. Тепловая денатурация и агрегация L-кристаллина в отсутствие и в присутствии Теплопоглощение (мкВт) Рис. 2. Кривые ДСК для L-кристаллина (1.5 мг/мл) (кривая 1) и -кристаллина 3). Условия эксперимента: 40 мM Na-фосфатный буфер, pH 6.8, 100 мM Скорость нагревания 1 K/мин.

интенсивности светорассеяния (I), и значение гидродинамического радиуса (Rh) агрегатов, кинетику агрегации L-кристаллина можно охарактеризовать в следующих координатах:

время, гидродинамический радиус и интенсивность светорассеяния. На рис. 3 представлен график, полученный для агрегации L-кристаллина при концентрации 0.4 мг/мл. При значениях времени выше 63 мин, происходит падение интенсивности светорассеяния (данные не показаны) вследствие преципитации агрегатов крупных размеров. Проекции Рис. 3. Трехмерный график, демонстри- светорассеяния в системе присутствуют рующий изменение интенсивности светорассеяния и гидродинамического радиуса (Rh) во времени на примере агрегации назвали стартовыми агрегатами. Их L-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 °C.

Ось X размер легко определяется по точке время, ось Y - Rh, и ось Z - интенсивность светорассеяния. Проекция графика на пересечения кривой с осью абсцисс. Такой плоскость XY показывает зависимость Rh от времени, на плоскость XZ – зависимость интенсивности светорассеяния от времени и концентраций L-кристаллина в интервале на плоскость YZ - зависимость интенсивности светорассеяния от Rh. Кривая на проекции XY рассчитана по уравнению (1). представлены зависимости I от Rh для указанных концентраций L-кристаллина. Эти зависимости имеют линейные участки для выбранного диапазона значений Rh. Размер стартовых агрегатов Rh,0 остается постоянным и не зависит от концентрации L-кристаллина. Продолжительность латентной стадии (t0), во время которой происходит образование стартовых агрегатов, определили из графика зависимости Rh от времени (рис. 4Б). В начальном интервале времени зависимости Rh от t для всех концентраций L-кристаллина имеют линейный участок. Точка пересечения прямой линии с горизонтальной линией (уровень Rh,0 = 84 нм) соответствует времени латентной стадии (t0). Величина t0 возрастает от 9.5 до 16.7 мин с уменьшением концентрации L-кристаллина от 0.4 до 0.025 мг/мл. Линейное соотношение зависимостей Rh от времени выполняется до определенного значения времени (t). При t t мин зависимость Rh от времени описывается степенной функцией:

I (фотоотсчет/с) L-кристаллина. Зависимости гидродинамического радиуса (Rh) (A) и Rh от времени (Б), полученные L-кристаллина: (1) 0.025, (2) 0.05, (3) 0.1, (4) 0.2 и (5) 0.4 мг/мл.

соответствует Rh,0 = 84 нм.

данном случае для объяснения механизма агрегации белков мы не можем использовать начальные участки зависимостей Rh от времени, так как полный процесс агрегации включает стадию разворачивания молекулы белка и стадию формирования стартового агрегата.

Экспериментально полученное увеличение интенсивности светорассеяния связано со вторым этапом агрегации, когда происходит слипание стартовых агрегатов и агрегатов более высокого порядка. Мы предполагаем, что область значений, наблюдаемая после завершения линейной зависимости Rh от времени (а именно, при t t), является наиболее важной для объяснения механизма агрегации. Согласно имеющимся данным, степенная зависимость соблюдается также в кинетике тепловой агрегации гликогенфосфорилазы b из скелетных мышц кролика и белка оболочки вируса табачной мозаики [Markossian et al., 2006].

переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц. В дополнение к базовым агрегатам (кривая 1) в системе образуются агрегаты более крупного размера - суперагрегаты (кривая 2). Суперагрегаты появляются при t tcrit. В присутствии двукратного избытка -кристаллина (0.8 мг/мл) расщепления агрегатов на две популяции не происходит и гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению 18.7 ± 0.1 нм (рис. 5Д). Начальные участки зависимостей Rh от времени, полученные в присутствие различных концентраций -кристаллина в интервале от t = t0 до t = tcrit, описываются уравнением (2) (сплошные линии на рис. 5А-Г):

(параметр t2R соответствует интервалу времени, на протяжении которого радиус увеличивается от значения Rh,0 до значения 2Rh,0). Повышение концентрации -кристаллина приводит к уменьшению величины Rh,0 и одновременному увеличению параметров t0 и t2R.

Свободный -кристаллин при этом в системе не обнаруживается. Следовательно, при всех исследуемых концентрациях -кристаллин включается в состав растущих агрегатов.

Уменьшение размера стартовых агрегатов является результатом включения в них -кристаллина. Такие модифицированные стартовые агрегаты проявляют меньшую -кристаллина связано с переходом процесса агрегации из режима «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation» (RLCA) столкновении становится меньше единицы). На основании этого можно заключить, что защитное действие шаперонов заключается в формировании белковых агрегатов меньшего размера.

2.1. Тепловая агрегация УФ-облученного L-кристаллина Кинетика агрегации УФ-облученного L-кристаллина (0.5 мг/мл) при 37 С показана на рис. 6 Начальный участок зависимости гидродинамического радиуса (Rh) от времени I (фотоотсчет/с) столкновении таких стартовых агрегатов вероятность слипания меньше единицы (не каждое столкновение ведет к слипанию). Этот вывод можно сделать только по результатам метода ДЛС. Таким образом, показано, что при фотооблучении L-кристаллина происходит уменьшение его стабильности по сравнению с нативным белком, который в данных условиях не агрегирует. Однако агрегация фотооблученного L-кристаллина в присутствии -кристаллина полностью подавляется при 37 С.

C p (кДж моль K ) Рис 7. Температурная зависимость избыточной теплоемкости (Cex) ГАФДp (10 мM Na-фосфатный буфер, pH 7.5) получены в расчете на тетрамер ГАФД.

Скорость нагревания 1 K/мин.

et al., 2000; Sanchez-Ruiz, 1992]. Возможно, в процессе нагревания тетрамер молекулы ГАФД (так называемый "димер димеров") диссоциирует до димеров (и далее, вероятно, до седиментационное поведение фермента при повышенных температурах. Прежде всего, мы провели седиментационный анализ препарата ГАФД при 20 °C (рис. 8). Нормированное значение коэффициента седиментации для основного пика распределения c(s) составило s20,w = 8.19 ± 0.49 S, что соответствует тетрамерной форме ГАФД. Молекулярная масса тетрамера, полученная из распределения c(M) (см. вставку на рис. 8), равна 165 ± 17 кДа.

Инкубация ГАФД при 45 °C приводит к диссоциации белка (рис. 9). На рис. 9A и Б показано, что при 80 и 90 мин инкубации ГАФД образуются диссоциированные формы фермента со значениями коэффициентов седиментации s20,w = 3.3 S ± 0.1 и 5.40 ± 0.08 S, соответственно.

(61% или 73%) с коэффициентом s20,w = 4.9 ± 0.2 S, соответствующий димерной форме. При увеличении периода инкубации ГАФД при 45 °С до 14 ч образование агрегатов белка I (фототсчет/с) температур от 37 до 55 °C (Rh,0 21 нм; 10 мM Na-фосфатный буфер, pH 7.5). Как видно из вставки на рис. 10Б, начальные участки зависимостей Rh от времени линейны. Пунктирная горизонтальная линия на вставке рис. 9Б соответствует значению Rh,0. Значение t уменьшается с 50.5 до 2 мин с повышением температуры от 37 до 55 °C.

Показано, что при 55 °C величина Rh,0 не зависит от концентрации белка. Зависимость Rh от времени для тепловой агрегации ГАФД при 55 °C при длительной инкубации подчиняется степенному закону со значением df 1.8, что указывает на выполнение режима агрегации предложенный в данной работе [Khanova et al., 2005; Markossian et al., 2006]. Этот механизм включает стадию формирования стартовых агрегатов, и последующее их слипание. Можно предположить, что механизм агрегации ГАФД, включающий образование стартовых агрегатов, реализуется и в физиологических условиях. Интересно отметить, что при 37 °C стартовые агрегаты появляются уже спустя 50 мин от начала инкубации (рис. 10Б).

Поскольку стабильность белковой молекулы возрастает в условиях краудинга [Chebotareva et I (фотоотсчет/с) I (фотоотсчет/с) зависимость интенсивности светорассеяния от соотношения Q/Qt дает предельную величину интенсивности светорассеяния при Q/Qt = 1, которая была бы достигнута при отсутствии преципитации (Ilim = 148000 фотоотсчетов/с).

3.1. Влияние –кристаллина на тепловую денатурацию и агрегацию ГАФД -кристаллина методом ДСК показало, что положение максимума на кривых ДСК (Tm) смещается в область более низких температур по мере увеличения концентрации -кристаллина. Денатурация ГАФД (0.4 мг/мл), зарегистрированная методом ДСК, характеризуется острым пиком температурного перехода с максимумом при 61.6 °C (рис. 12, кривая 1). При концентрации -кристаллина, равной 0.4 мг/мл, величина Tm снижается до 58.0 °C (рис. 12, кривая 4). Возможно, продукты диссоциации молекулы ГАФД, образующиеся при нагревании белка, взаимодействуют с -кристаллином, что приводит к Теплопоглощение (мкВт) -кристаллина. Процесс подавления тепловой агрегации ГАФД -кристаллином был изучен методом ДЛС. На рис. 13 показано влияние -кристаллина на кинетику агрегации ГАФД при 45 °C. Расчеты гидродинамического радиуса показывают, что в присутствии -кристаллина формируются агрегаты меньшего размера по сравнению с контролем (рис. 13A-Г; 45 °C).

Анализ зависимости Rh от времени, полученные в присутствии -кристаллина, позволил оценить размер частиц, образующихся в системе в начальный момент времени. Значения Рис. 13. Влияние -кристаллина на размер агрегатов, сформировавшихся при нагревании ГАФД (0.4 мг/мл) при 45 °C. Зависимости Rh от времени, полученные в присутствии различных концентраций -кристаллина: (A) 0.025, (Б) 0.05, (В) 0.1 и (Г) 0.4 мг/мл.

Пунктирные линии соответствуют контролю (агрегация в отсутствие -кристаллина).

Вставки показывают начальные участки зависимостей Rh от времени. Сплошные кривые построены согласно уравнению (2).

Rh,0, полученные при агрегации ГАФД в присутствии трех концентраций -кристаллина (0.025, 0.05 и 0.1 мг/мл), составляли 9.0–9.3 нм. Такие значения Rh,0 близки к значению Rh, для самого -кристаллина при 45 °C (10.1 ± 0.05 нм). Таким образом, при указанных денатурированные молекулы ГАФД образуют комплексы с -кристаллином. Начальные участки зависимостей Rh от времени, полученные в присутствии различных концентраций -кристаллина 0.025, 0.05 и 0.1 мг/мл, описываются экспоненциальным уравнением (2).

Аппроксимация начальных участков зависимостей Rh от времени с помощью уравнения (2) показана на вставках рис. 13A-В. Увеличение параметра t2R характеризует снижение скорости агрегации. Так же как и в случае тепловой агрегации L-кристаллина, агрегация ГАФД в присутствии -кристаллина при концентрациях 0.025-0.1 мг/мл, сопровождается расщеплением популяции агрегатов на два компонента при довольно высоких значениях времени (t tcrit). При более высоких концентрациях -кристаллина распределение агрегатов по размерам остается унимодальным на протяжении всего эксперимента (рис. 13Г).

Тепловую агрегацию ГАФД в присутствии –кристаллина изучали также методом ДЛС в режиме нагревания с постоянной скоростью. Кинетика агрегации исследуемых белков не зависела от режима измерения. Агрегация ГАФД в присутствии -кристаллина приводит к уменьшению размера стартового агрегата. Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от Rh позволило оценить величину стартовых агрегатов (Rh,0) в присутствии различных концентраций –кристаллина при нагревании фермента с постоянной скоростью.

Для агрегации ГАФД в отсутствие –кристаллина значение Rh,0 составляло 22.5 ± 0.8 нм (рис. 14A). С повышением концентрации -кристаллина от 0.1 до 0.4 мг/мл величина Rh, уменьшалась от 19.1 ± 0.2 нм до 13.1 ± 0.2 нм (рис. 14Б-Г).

I (отоотсчет/с) Рис. 14. Графики зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса, построенные для агрегации ГАФД (0.4 мг/мл), при различных концентрациях -кристаллина: (A) 0, (Б) 0.1, (В) 0.2 и (Г) 0.4 мг/мл.

Изучение влияния -кристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД показало, что подавление агрегации ГАФД в присутствии -кристаллина происходит в результате формирования агрегатов белка меньшего размера. Уменьшение скорости агрегации происходит вследствие включения -кристаллина в состав стартового агрегата. Вероятность обстоятельство объясняет переход кинетического режима агрегации ГАФД от режима DLCA (где зависимость Rh от времени следует степенному закону) к режиму RLCA (где зависимость Rh от времени подчиняется экспоненциальному закону).

4. Тепловая агрегация транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae Тепловую агрегацию ТК изучали методом ДЛС в интервале температур от 30 до 80 °C при постоянной скорости нагревания 1 K/мин. На рис. 14А представлена зависимость реконструированной из апоформы ТК и кофермента в присутствии ионов магния (кривая 1) I (фотоотсчет/с) ТК. В обоих случаях на начальных участках зависимости наблюдается линейный рост агрегатов при увеличении температуры. При высоких значениях температуры, 55 °C для магниевой формы фермента и 60 °C для кальциевой формы, в системе появляются крупные агрегаты, вызванные слипанием исходных частиц (базовых агрегатов).

Построение графика зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса позволило определить размеры стартовых агрегатов. В случае агрегации магниевой формы холофермента ТК, значение Rh,0 составило 47.6 ± 2.5 нм. При агрегации кальциевой формы величина Rh,0 = 33.3 ± 2.3 нм. Возможно, образование более крупных стартовых агрегатов для магниевой формы можно объяснить более низкой ее стабильностью по сравнению с кальциевой формой.

Из полученных данных видно, что агрегация ТК начинается при T 45 °C. По данным ДСК [Esakova et al., 2005] денатурация холофермента ТК начинается при более высоких значениях температуры, 57 – 58 °C, с максимумом теплового перехода 61.8 °C для магниевой формы белка и 64 °C для кальциевой формы. Таким образом, можно предположить, что агрегация ТК опережает денатурацию.

5. Тепловая денатурация и агрегация алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae. Влияние -кристаллина Теплопоглощение (мкВт) Рис. 16. Кривые ДСК для АДГ I отсутствие (кривая 1) и в присутствии -кристаллина (0. Na-фосфатный буфер, pH 7.4, мM NaCl, скорость нагревания Rh (нм) Rh (нм) Rh (нм) Rh (нм) Rh (нм) уравнения (2). Величина t0, характеризующая длительность латентного периода (время, за которое происходит формирование стартовых агрегатов), практически не изменяется при увеличении концентрации белка. Параметр t2R, который можно рассматривать как меру скорости агрегации, уменьшается с повышением концентрации АДГ I.

Добавление -кристаллина приводит к подавлению тепловой агрегации АДГ I (0. мг/мл) при 56 °C. Как видно из рисунка 19, в присутствии -кристаллина образуются агрегаты меньшего размера. Экспоненциальная зависимость, описываемая уравнением (2) на I (фотоотсчет/с) Рис. 18. Зависимость интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Rh), полученная для разных агрегации при 56 °C. Концентрация АДГ аминокислотной последовательности дрожжевой АДГ I содержится гидрофобный участок Рис. 19. Влияние -кристаллина на размер агрегатов, образующихся при нагревании АДГ I (0.2 мг/мл) при 56 °C. Зависимость гидродинамического радиуса Rh от времени, полученная в отсутствие -кристаллина (A) и в присутствии 0.015, 0.03 и 0.045 мг/мл -кристаллина (Б, В и Г, соответственно). Начальные участки зависимости Rh от времени описаны кривыми, рассчитанными с помощью уравнения (2).

нагреванием, способен связываться с -кристаллином [Santhoshkumar and Sharma, 2002]. У выделенного пептида 40-60 была обнаружена шапероноподобная активность [Bhattacharyya et al., 2003]. На рис. 20 показана модель пептида Y40-K60, отвечающего за шапероноподобную активность, расположенного в составе субъединицы. Из данных по агрегации АДГ I, приведенных выше, можно заключить, что АДГ I довольно устойчива к нагреванию при 56 °C. Кинетика тепловой агрегации АДГ I характеризуется длительным лаг-периодом. Помимо этого, унимодальное распределение агрегатов по мере нагревания переходит в бимодальное (расщепление агрегатов на два компонента). Можно предположить, что АДГ I предотвращает собственную агрегацию при нагревании или при воздействии какого-либо денатурирующего агента вследствие экспонирования в субъединицы АДГ I из Saccharomyces меньшим размером по сравнению с тем, cerevisiae. Красным цветом обозначен пептидный участок (Y40-K60), обладающий свойствами шаперона. внутримолекулярного шаперона. Стартовые Модель получена Де Болле (X. De Bolle, Departement de Biologie, Facultes Universitaires Notre-Dame de la Paix, ведут себя так же, как и стартовые агрегаты, Namur, Belgium).

взаимодействующих частиц при соударении меньше единицы.

На основании полученных данных сформулирован новый механизм агрегации белков и механизм подавления агрегации белков -кристаллином. На рис. 21 показан механизм агрегации денатурированного белка, включающий стадию формирования стартовых агрегатов, стадию слипания стартовых агрегатов (первичных кластеров) и агрегатов более высокого порядка (рост фрактального агрегата). Такой путь агрегации происходит в режиме DLCA (каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц) и, в конечном итоге, приводит к появлению структур огромных размеров, склонных к преципитации. В присутствии -кристаллина агрегация белка подавляется за счет уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы. Таким образом в присутствии -кристаллина происходит переход процесса агрегации из режима DLCA в режим RLCA.

Рис. 21. Модель, описывающая механизм агрегации белков через стадию образования стартовых агрегатов.

ВЫВОДЫ

1. С использованием метода динамического лазерного светорассеяния изучена кинетика тепловой агрегации L-кристаллина из хрусталика глаза быка, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц кролика, транскетолазы и алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae. Контроль за стадией денатурации белков осуществляли при помощи метода дифференциальной сканирующей калориметрии.

2. Предложен новый механизм агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов. Этот механизм включает стадию образования стартовых агрегатов и следующую за ней стадию слипания стартовых агрегатов, ведущую к образованию крупных агрегатов, склонных к преципитации. Предложен метод оценки размеров стартовых агрегатов. Метод основан на построении графика зависимости интенсивности светорассеянии (I) от гидродинамического радиуса (Rh). Гидродинамический радиус стартовых агрегатов определяется как отрезок, отсекаемый на оси абсцисс линейной зависимостью I от Rh.

3. Проанализирован характер зависимости гидродинамического радиуса от времени для Распределение частиц по размерам остается унимодальным в ходе агрегации. Начальные участки зависимостей Rh от времени являются линейными. При достаточно больших временах зависимости Rh от времени подчиняются степенной функции с величиной фрактальной размерности агрегатов (df), близкой к 1.8. Сделан вывод, что агрегация протекает в режиме «diffusion-limited cluster-cluster aggregation» (кинетический режим, при котором каждое столкновение приводит к слипанию взаимодействующих частиц).

4. С использованием метода аналитического ультрацентрифугирования установлен диссоциативный механизм тепловой денатурации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.

5. На примере -кристаллина (белка, обладающего шапероноподобной активностью) предложен новый механизм подавления агрегации белков шаперонами. Включение -кристаллина в стартовые агрегаты приводит к уменьшению их размера и снижению вероятности слипания взаимодействующих частиц при их столкновении (переход процесса агрегации в режим «reaction-limited cluster-cluster aggregation»).

6. Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность (т.е. защищают себя от агрегации). Примером может служить дрожжевая алкогольдегидрогеназа I.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантами РФФИ, Программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и международным фондом INTAS.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. H.A. Khanova, K.A. Markossian, B.I. Kurganov, A.M. Samoilov, S.Yu. Kleimenov, D.I.

Levitsky, I.K.Yudin, A.C. Timofeeva, K.O. Muranov, and M.A. Ostrovsky. Mechanism of chaperone-like activity. Suppression of thermal aggregation of L-crystallin by -crystallin.

Biochemistry, 2005, v. 44, p. 15480-15487.

2. О.А. Есакова, Е.А. Ханова, Л.Е. Мешалкина, Р. Голбик, Г. Хюбнер, Г.А. Кочетов. Влияние субстратов транскетолазы на реконструкцию и стабильность холофермента. Биохимия 2005, т. 70, N 7, 770-776.

3. K.A. Markossian, B.I. Kurganov, D.I. Levitsky, H.A. Khanova, N.A. Chebotareva, A.M.

Samoilov, T.B. Eronina, N.V. Fedurkina, L.G. Mitskevich, A.V. Merem’yanin, S.Yu.

Kleymenov, V.F. Makeeva, V.I. Muronetz, I.N. Naletova, I.N. Shalova, R.A. Asryants, E.V.

Schmalhausen, L. Saso, Yu.V. Panyukov, E.N. Dobrov, I.K. Yudin, A.C. Timofeeva, K.O.

Muranov, and M.A.Ostrovsky. Mechanism of chaperone-like activity. «Protein Folding: New Research». Nova Science Publishers, Inc., New York, USA (Obalinsky, T.R., Ed.), 2006, p. 89K.A. Markossian, H.A. Khanova, S.Yu. Kleimenov, D.I. Levitsky, N.A. Chebotareva, R.A.

Asryants, V.I. Muronetz, L. Saso, I.K. Yudin, B.I. Kurganov. Mechanism of thermal aggregation of rabbit muscle glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry, 2006, v. 45, p.

13375-13384.

5. Е.А. Ханова, А.K.Тимофеева, А.М. Самойлов, К.А. Маркосян, К.О. Муранов,М.А.

Островский, Д.И. Левицкий, Б.И. Курганов. Кинетика тепловой агрегации дрожжевой алкогольдегидрогеназы в присутствии -кристаллина. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 2005 г., стр.

80-82.

6. А.К Тимофеева, Е. А. Ханова, К.А. Маркосян, К.О. Муранов, М.А. Островский, Б.И.

Курганов. Кинетика тепловой агрегации -кристаллина хрусталика глаза быка в присутствии -кристаллина. Материалы Международного симпозиума «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки». Тюмень, 2005 г., стр. 29-32.

7. Е.А. Ханова. Тепловая агрегация дрожжевой алкогольдегидрогеназы. XVII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2005. Тезисы докладов, стр. 86.

8. Е.А. Ханова, А.K.Тимофеева, А.М. Самойлов. Влияние -кристаллина на кинетику аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005», Москва, 2005. Тезисы докладов, стр.

239-240.



 
Похожие работы:

«Казарникова Анна Владимировна СТРУКТУРА И ВЗАИМООТНОШЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ЭКОСИСТЕМЫ ОСЕТРОВЫЕ РЫБЫ – ПАРАЗИТИЧЕСКИЕ ГИДРОБИОНТЫ – СРЕДА В ИХТИОПАТОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ ВОДОЕМОВ ЮГА РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Южный научный центр РАН Научный консультант : Академик Национальной академии наук Республики...»

«Остроумова Ольга Сергеевна МНОГОУРОВНЕВАЯ ПРОВОДИМОСТЬ ИОННЫХ КАНАЛОВ, ОБРАЗОВАННЫХ ЦИКЛИЧЕСКИМИ ЛИПОДЕПСИПЕПТИДАМИ PSEUDOMONAS SYRINGAE В ЛИПИДНЫХ БИСЛОЯХ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научные руководители: доктор биологических наук Людмила Владимировна Щагина, Институт цитологии РАН,...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Петухова Дарья Юрьевна БИОМОРФОЛОГИЯ СТОЛОННО-РОЗЕТОЧНЫХ ГИДРОФИТОВ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар, 2008 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Вятский государственный гуманитарный университет (г. Киров) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Савиных Наталья Павловна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Загирова Светлана...»

«СОРОКАНЬ АНТОНИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА РЕГУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА Phytophthora infestans (MONT.) DE BARY САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТАМИ 03.01.04. – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2013 1 Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Научный...»

«Морозова Инна Ивановна СТРУКТУРА ЗООПЕРИФИТОНА И ЕГО ИНФОРМАТИВНОСТЬ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА ВОДЫ РАЗНОТИПНЫХ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ БАССЕЙНА ЕНИСЕЯ Специальность 03.02.10 - гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск - 2010 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет на кафедре водных и наземных экосистем Института фундаментальной биологии и биотехнологии Научный руководитель : кандидат биологических наук,...»

«Ташлыкова Наталия Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ФИТОПЛАНКТОНА ДЕЛЬТОВЫХ ПРОТОК РЕКИ СЕЛЕНГИ И СОРА ЧЕРКАЛОВО (ОЗ. БАЙКАЛ) 03.00.16 – экология 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2009 Работа выполнена в Институте природных ресурсов, экологии и криологии Сибирского отделения Российской Академии наук, г. Чита доктор биологических наук, Научные руководители: Г.И. Поповская кандидат...»

«Илюшкина Любовь Николаевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВ УРБОЛАНДШАФТОВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ И Г. АЗОВА 03.00.27 – почвоведение 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета Научныe руководители: доктор биологических наук, профессор Внуков В.В. кандидат биологических наук, доцент Полякова А.В. Официальные оппоненты :...»

«ТОРШИЛОВА АЛЛА АНАТОЛЬЕВНА РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ Dioscorea nipponica Makino (Dioscoreaceae) 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в Лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Батыгина Татьяна Борисовна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«ДЁМИН Сергей Сергеевич КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ ФАКТОРОВ НЕКРОЗА ОПУХОЛИ И ИХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ КАЛЬКУЛЁЗНОМ ХОЛЕЦИСТИТЕ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2011 1 Работа выполнена на кафедре медико-биологических дисциплин медицинского факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Белгородский государственный университет...»

«ФИЛИППОВ Дмитрий Андреевич СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЭКОСИСТЕМ ПОЙМЕННЫХ БОЛОТ БАССЕЙНА ОНЕЖСКОГО ОЗЕРА (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.16 – экология 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор БОЛОТОВА Наталья Львовна доктор биологических наук,...»

«Французов Павел Александрович АТОМНО-СИЛОВЫЕ ЧИПЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МАРКЕРОВ ЗАБОЛЕВАНИЙ ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ В И С 03.01.04. Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научноисследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН (ИБМХ РАМН) Научный руководитель : доктор биологических наук Иванов Юрий Дмитриевич Официальные оппоненты...»

«ПАНИНА Яна Сергеевна МОДУЛИРОВАНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И ВОСПРИИМЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ 03.00.04 – биологическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическпих наук Москва 2005 2 Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ Ольга Леонидовна Официальные оппоненты...»

«Татаринова Ольга Николаевна Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научноисследовательском институте физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России Научные руководители: доктор химических наук, доцент Позмогова...»

«Климова Ольга Владимировна Разработка новой наносомальной лекарственной формы ломефлоксацина на основе биодеградируемых полимеров. 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 www.sp-department.ru Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М....»

«БИЗИКОВ Вячеслав Александрович ЭВОЛЮЦИЯ ФОРМЫ И ФУНКЦИИ РАКОВИНЫ ГОЛОВОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ ПОДКЛАССА COLEOIDEA 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2008 1 Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор; член-корреспондент РАН Малахов Владимир Васильевич, Московский государственный университет имени...»

«ГРУДИНКИН Павел Сергеевич РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА И ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК ЭПИДЕРМОИДНОЙ КАРЦИНОМЫ A431 ПРИ ДЕЙСТВИИ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор биологических наук, академик Никольский Николай Николаевич, Институт цитологии РАН,...»

«Кухарская Елена Владимировна ЗООПЛАНКТОН БАССЕЙНА РЕКИ ЧУЛЫМ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре общей биологии и экологии Томского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Долгин Владимир Николаевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Бабенко Андрей Сергеевич кандидат биологических...»

«БЕРНИКОВ Кирилл Александрович Фауна и экология рукокрылых (Chiroptera) равнинной тайги Западной Сибири (на примере Ханты-Мансийского автономного округа) Специальность 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии ГОУ ВПО Сургутский государственный университет ХМАО – Югры. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Стариков Владимир Павлович...»

«ПАВЛОВА НАДЕЖДА НИКОЛАЕВНА ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ГОРОДСКИХ ПОЧВ (НА ПРИМЕРЕ Г. ОБНИНСКА) 03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2008 Работа в Обнинском государственном техническом выполнена университете атомной энергетики (ИАТЭ) Научные доктор биологических наук, доцент руководители: Азовский Андрей Игоревич, кандидат биологических наук, доцент...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.