WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЯВМЕТДИНОВ ИЛЬДАР САМИУЛЛОВИЧ

ЛАККАЗА И Mn-ПЕРОКСИДАЗА БАЗИДИОМИЦЕТА

CERRENA MAXIMA: ХАРАКТЕРИСТИКА И РОЛЬ В

БИОСИНТЕЗЕ ГУМИНОПОДОБНЫХ ВЕЩЕСТВ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва –2003 1

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (временный научный коллектив “Ферментативные основы биодеградации”).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук О.В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.Н. Островский доктор биологических наук, профессор Н.Б. Градова

Ведущая организация:

МГУ им. М.В. Ломоносова, факультет почвоведения

Защита диссертации состоится «03» июня 2003 г. в «13» часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан «»_2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

Общая характеристика работы

.

Актуальность проблемы. В настоящее время во всем мире ведется интенсивная разработка биотехнологий на основе лигнолитических грибов и ферментов как для обработки лигноцеллюлозных материалов, так и для утилизации лигнинсодержащих отходов. Лигнин - полимер ароматической природы, составляющий 25% сухого веса фотосинтезирующей биомассы. Для него насчитывается не менее десяти типов связей между фенилпропановыми структурными единицами, которые обуславливают высокую степень разветвленности молекулы и недоступность для действия большинства микроорганизмов.





Базидиальные грибы, возбудители белой гнили древесины, принадлежат к немногочисленной группе микроорганизмов, способных разрушать лигнин и обладающих уникальной системой лигнолитических ферментов: лигнинпероксидазы, лакказы и Mn-пероксидазы. Несмотря на то, что проблемой биоконверсии лигнина последние 20-25 лет активно занимаются многие научные коллективы, окончательного решения данного вопроса еще не найдено. Это связано со значительной сложностью строения лигноцеллюлозного субстрата, а также с недостаточной изученностью метаболизма грибов-лигнолитиков, в том числе механизма действия разлагающих лигнин ферментов. Для эффективного использования биотехнологических подходов весьма актуальным представляется изучение лигнолитического потенциала грибов белой гнили и физиологических функций основных лигнолитических ферментов. Известно, что некоторые виды высших базидиальных грибов, деструкторов древесины, обладают уникальными механизмами детоксификации как продуктов деградации лигнина, так и ксенобиотиков. Для грибов белой гнили некоторыми исследователями (Шиврина и др., 1969) показано образование из продуктов деструкции лигноуглеводного комплекса гуминоподобных веществ (ГПВ), обладающих физиологической активностью. Однако до настоящего времени практически отсутствуют данные о механизме образования, структуре и биологических свойствах ГПВ; поэтому представляется актуальным исследование особенностей синтеза подобных полимеров и их характеристика, а также выяснение функций лигнолитического комплекса в этом процессе.

Понимание роли лигнолитических ферментов в процессе деградации лигнина открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера и сопутствующий синтез на основе продуктов его деструкции таких соединений, как гуминоподобные вещества. Исследование ГПВ представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данных микроорганизмов для получения препаратов, которые могут использоваться в медицине.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось: изучение смешанной культуры грибов белой гнили Cerrena maxima и Coriolus hirsutus, синтезирующих различные доминирующие лигнолитические ферменты, и исследование лигнолитического потенциала данной культуры по сравнению с индивидуальными штаммами грибов при росте на различных лигноцеллюлозных субстратах; характеристика ферментов лигнолитической системы Cer. maxima и их физиологической роли в процессе деградации лигнина и образовании ГПВ;

исследование структуры полученных ГПВ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучение лигнолитического потенциала индивидуальных штаммов грибов белой гнили Cer. maxima и C. hirsutus, а также их смешанной культуры в процессе деградации основных компонентов растительного сырья, в том числе лигнина.

лигнолитического комплекса базидиомицета Cer. maxima – лакказы и Mnпероксидазы.

3. Исследование физиологической роли лакказы и Mn-пероксидазы Cer. maxima и C. hirsutus в процессе деградации лигнина и биосинтезе ГПВ.





4. Характеристика ГПВ, образованных данными грибами при росте на растительном субстрате и полученых ферментативным синтезом, а также установление общности их структурной организации с природными гуминовыми веществами.

Научная новизна.

Показаны возможность совместного культивирования двух штаммов грибов белой гнили Cer. maxima и C. hirsutus и возникающий при этом эффект синергизма деградации лигнина березовых опилок. Проведенные исследования позволили впервые получить и исследовать внеклеточные ферменты (лакказу и Mn-пероксидазу) базидиомицета Cer. maxima. Подобраны оптимальные условия культивирования изучаемого продуцента для максимального биосинтеза данных ферментов. Впервые детально охарактеризована структура ГПВ, образовавшихся при росте на овсяной соломе как индивидуальных штаммов грибов Cer. maxima и C. hirsutus, так и их смешанной культуры. Впервые путем прямого ферментативного синтеза показана ключевая роль лакказы в процессе синтеза ГПВ.

Практическая ценность работы. Исследованные культуры грибов могут быть с успехом использованы для утилизации растительных отходов и получения ГПВ.

Изучение физико-химических свойств лакказы Cer. maxima и ее субстратной специфичности позволяет говорить о возможности применения данного фермента в различных отраслях биотехнологии: при детоксификации, обесцвечивании бумажной пульпы, в органическом синтезе, в том числе в синтезе ГПВ.

Объем работы. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, содержит 7 таблиц, рисунков. Список использованной литературы включает 162 наименования.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-ой школе-конференции “Горизонты физической и химической биологии” (Россия, Пущино, 2000 г.), 8-ой международной конференции по биотехнологии в бумажной промышленности (Финляндия, Хельсинки, 2001 г.), 7-ом международном съезде микологов (Норвегия, Осло, 2002), 3-ем съезде биохимического общества Российской Академии наук (Россия, Санкт-Петербург, 2002 г.), научно-практическом семинаре NATO-ARW “Использование гуматов для рекультивации загрязненных сред: от теории к практике” (Россия, Звенигород, 2002 г.), конкурсе на стипендию имени чл.корр. РАН В. Л. Кретовича (Россия, Москва, ИНБИ РАН, 2002 г.), 2-ой международной конференции ”Гуминовые вещества в биосфере” (Россия, Москва, 2003 г.).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 5 статей и 5 тезисов.

Изучение совместного культивирование Cer. maxima и C. hirsutus.

Общепринятым является положение о том, что открытие механизма функционирования лигнолитических ферментов и их взаимодействия в составе лигнолитического комплекса – это ключ для создания эффективных биотехнологий, моделирующих высокоэффективные и селективные природные процессы. На основании анализа литературных данных о физиологических особенностях грибных культур и участии ферментов в процессах деградации лигнина было выдвинуто предположение, что грибные культуры, синтезирующие различные доминантные лигнолитические ферменты (лакказу и Mn-пероксидазу) и способные к совместному культивированию, деградируют лигнин более эффективно. Предыдущими исследованиями было показано, что штамм гриба белой гнили Coriolus hirsutus семейства Polyporaceae является активным продуцентом лакказы (Степанова, 1999).

Поэтому среди культур базидиальных грибов был проведен скрининг штаммов, синтезирующих Mn-пероксидазу в качестве основного лигнолитического фермента.

Критерием скрининга являлась совместимость культур при поверхностном культивировании на агаризованной среде.

Основываясь на результатах изучения кинетики роста и биосинтетической активности (синтез внеклеточных ферментов) различных базидиомицетов, был отобран новый штамм Cer. maxima 0275 семейства Polyporaceae порядка Polyporales, как активный продуцент внеклеточной Mn-пероксидазы. При поверхностном совместном культивировании на агаризованной среде Cer. maxima и C. hirsutus не только имели одинаковые скорости роста, но и образовывали в зоне контакта колоний достаточно хорошо развитый мицелий (рис. 1). Для сравнения использовали культуру гриба белой гнили Coriolus zonatus. Исследование показало, что, несмотря на общую родовую принадлежность (с C. hirsutus), данный штамм неспособен к сосуществованию с культурами Cer. maxima и C. hirsutus и образует хорошо заметную границу раздела между мицелиями.

Рис. 1. Культивирование штаммов C. zonatus, Сer. maxima, C. hirsutus на агаризованной среде Чапека-Докса.

Феномен совместимости у базидиальных грибов наблюдается крайне редко, в литературе практически нет сведений о его механизме. Взаимное сосуществование Cer. maxima и C. hirsutus можно объяснить тем, что оба микроорганизма способны образовывать взаимодополняющие ферментные системы: Cer. maxima – преимущественно Mn-пероксидазу, а C. hirsutus – лакказу. Возможно также, что эти два микроорганизма, несмотря на обитание в различных почвенно-климатических условиях (Cer. maxima – в тропическом климате острова Кубы, C. hirsutus – в умеренно-континентальном климате), имеют близкую морфологию и физиологобиохимические свойства, что позволяет им сосуществовать.

Для изучения молекулярных основ биосинтеза лигнолитических ферментов в смешанной культуре необходимо исследовать физико-химические свойства и структурные особенности ферментов лигнолитических комплеков индивидуальных культур. Лигнолитический комплекс C. hirsutus хорошо изучен, поэтому следующий этап работы был посвящен выделению и исследованию лигнолитического комплекса Cer. maxima, содержащего Mn-пероксидазу и лакказу.

Характеристика физико-химических свойств лакказы и Mn-пероксидазы Cer. maxima.

Изучение динамики синтеза внеклеточных лакказы и Mn-пероксидазы при различных условиях культивирования Cer. maxima показало, что максимальное накопление ферментов происходит при глубинном культивировании. Были оптимизированы условия биосинтеза лакказы путем подбора концентрации ионов меди (3,9 мМ) и рН среды роста (5,8). Для биосинтеза Mn-пероксидазы оптимальными условиями являлись концентрация ионов марганца в среде роста - 0, мМ и рН среды - 5,2. Таким образом, штамм Cer. maxima может синтезировать в качестве основного лигнолитического фермента как лакказу, так и Mn-пероксидазу в зависимости от состава среды культивирования.

Штамм Cer. maxima синтезировал 3 изоформы лакказы, изоэлектрические точки (ИЭТ) которых, определенные методом изоэлектрофокусирования, составляли 3,5, 3,9 и 4,3 (табл. 1). По данным электрофореза в денатурирующих условиях фермент являлся одноцепочечной молекулой. Молекулярные массы всех изоформ лежали в диапазоне 57 + 2 кДа.

Изоформа с ИЭТ 3,5 составляла 92,5% от общего количества лакказы, рассчитанного по белку, и 95% от общей лакказной активности; поэтому для дальнейших исследований использовали данную изоформу. Углеводная часть фермента составляла 13% от молекулярной массы белка и состояла из маннозы и Nацетил-глюкозамина. Лакказа содержала 4 иона меди. Оптический спектр поглощения показал наличие иона меди первого типа (поглощение при 610 нм) и бинарного комплекса меди третьего типа (“плечо” при 330 нм), как видно из рис. 2. Согласно ЭПР спектрам, лакказа содержит ионы меди первого и второго типов (рис. 3).

Параметры сверхтонкого расщепления для меди первого типа составляли: g=1, mT, g||=2,19 mT, А||=9,10х10-3 см-1, а для меди второго типа - g=2,01 mT, g||=2,20 mT, А||=20,10х10-3 см-1. Указанные значения g|| и g были близки к таковым для других лакказ грибного происхождения, описанным в литературе: лакказам из Polyporus (Coriolus) pinsitus, Scytalidium thermophila, C. hirsutus и C. zonatus. Таким образом, проведенные исследования показали, что в составе молекулы исследуемой лакказы находятся четыре иона меди трех различных типов, что согласуется с данными о содержании меди в других лакказах.

А, ед Окислительно-восстановительный потенциал иона меди первого типа, определенный методом потенциометрического титрования, составлял 750 ± 5 мВ.

Таким образом, фермент относится к высоко редокс-потенциальным лакказам.

Скорость окисления ферментом пирокатехина в 0,1 М буфере БриттонРобинсона достигала максимального значения при рН 4,0. Наибольшая активность фермента при окислении того же субстрата наблюдалась при 50° С. Период полуинактивации лакказы составлял 27 ч в 0,1 М ацетатном буфере, рН 4,5 при 400 С.

При 600 С фермент полностью терял активность только после 40 мин инкубации.

Полученные данные свидетельствуют о довольно высокой стабильности исследуемой лакказы, сравнимой со стабильностью других лакказ мезофильных штаммов грибов белой гнили (Koroljova et al., 1998, 1999).

Табл. 1. Характеристика лакказы и Mn-пероксидазы Сer. maxima.

Спектральные характеристики 4 иона меди 3 типов (Т): гемовое * – доминантная изоформа.

Выделенный препарат Mn-пероксидазы Cer. maxima содержал две изоформы, ИЭТ которых составляли 3,2 и 3,4 (табл. 1).

Фермент являлся одноцепочечной молекулой, как следует из данных электрофореза в денатурирующих условиях. Найденные молекулярные массы всех изоформ лежали в диапазоне 45 + 2 кДа. Ввиду того, что вторая изоформа была доминантной, и активность ее составляла 89% от всей ферментативной активности Mn-пероксидазы, для дальнейших исследований использовали только основную изоформу Mn-пероксидазы с ИЭТ 3,4.

Оптический спектр нативного фермента имел пик поглощения при 410 нм и два “плеча” при 500 нм и при 638 нм (рис. 4). Спектр Mn-пероксидазы Cer. maxima был аналогичен спектрам других Mn-пероксидаз, содержащих гемовое железо, что позволило предположить наличие гема в структуре изучаемого фермента (Lankinen et al., 2001).

Максимум активности фермента при окислении Mn2+ наблюдался при рН 5,0.

Зависимость активности Mn-пероксидазы от температуры исследовали по окислению ионов Mn2+ в 0,1 М тартратном буфере, рН 5,0. Окислительная способность фермента была максимальна при 55° С.

Период полуинактивации фермента в 0,1 М тартратном буфере, рН 5,0, при 40° С составлял 20 ч. Следует отметить, что при температуре выше 400 С фермент быстро инактивировался, теряя полностью активность в течение 5 минут при 600 С.

Изучаемая Mn-пероксидаза обладает стабильностью, сравнимой со стабильностью других Mn-пероксидаз грибного происхождения (Беккер и др., 1992).

Субстратная специфичность лакказы и Mn-пероксидазы Cer. maxima.

Для изучения способности лакказы Cer. maxima окислять органические и неорганические субстраты определялись константы Михаэлиса (Кm) и каталитические константы (kcat) для различных субстратов (табл. 2). Принимая во внимание предположение о том, что эффективность катализа лакказами пропорциональна разнице одноэлектронных редокс-потенциалов меди первого типа и окисляемого субстрата (Xu, 1996), полученные высокие значения каталитических констант можно объяснить высоким значением окислительно-восстановительного потенциала меди первого типа в активном центре лакказы Cer. maxima.

Табл. 2. Кинетические характеристики лакказы Cer. maxima.

* - стандартная погрешность измерений не превышала 10%.

Известно, что окисление субстратов лакказой происходит по радикальному механизму. В связи с этим, уменьшение значений Км и увеличение эффективности катализа в ряду пирокатехин – синапиновая кислота могут быть объяснены, исходя из теории об индуктивных и мезомерных эффектах заместителей в ароматическом кольце. Ферулловая и синапиновая кислоты отличаются от пирокатехина и гидрохинона наличием заместителя в пара-положении бензольного кольца.

Взаимодействие двойных связей алкилкарбоксильного фрагмента с фенольным кольцом стабилизирует образующийся при окислении радикал путем делокализации неспаренного электрона. Это может быть причиной увеличения эффективности катализа. Влияние положительного мезомерного эффекта дополнительной метоксильной группы синапиновой кислоты в орто-положении бензольного кольца также может быть причиной высокой эффективности катализа по сравнению с ферулловой кислотой.

При исследовании каталитической активности Mn-пероксидазы определяли константы Михаэлиса. Изучалась зависимость начальной скорости реакции окисления Mn2+ от концентраций Mn2+ и Н2О2. На основании полученных зависимостей начальной скорости реакции от концентрации ионов марганца и перекиси водорода были определены Кm. Они составили 66 мкМ и 26 мкМ по Mn2+ и Н2О2, соответственно. Полученные данные показывают, что данная Mn-пероксидаза по каталитическим параметрам сравнима с другими грибными Mn-пероксидазами (Беккер и др., 1992).

Таким образом, в результате проведенных исследований охарактеризованы ферменты лигнолитического комплекса C. maxima - лакказа и Mn-пероксидаза.

Лакказа является термостабильным ферментом, обладающим высоким редокспотенциалом иона меди первого типа и, как следствие, высокой эффективностью катализа. Mn-пероксидаза является типичным представителем Mn-зависимых грибных пероксидаз. Сравнивая компоненты лигнолитического комплекса Cer.

maxima, следует отметить, что по стабильности Mn-пероксидаза значительно уступает лакказе, особенно при высоких температурах ( 400 С).

Изучение лигнолитических потенциалов C. hirsutus, Cer. maxima и смешанной культуры при росте на растительных субстратах и роли лакказы и Mn-пероксидазы в процессе деградации лигнина.

Для понимания процессов биодеструкции лигноуглеводного комплекса грибами белой гнили необходимо изучение физиолого-биохимической активности гриба в условиях, максимально приближенных к природным. Поэтому исследование лигнолитических потенциалов индивидуальных культур и смешанной культуры Cer.

maxima и C. hirsutus проводили в условиях твердофазной ферментации на березовых опилках и овсяной соломе.

Деградация лигнина при культивировании базидиомицетов на березовых опилках.

В процессе ферментации в течение 45 суток при 280 С как для индивидуальных штаммов базидиомицетов, так и для их смешанной культуры происходила активная деградация лигнина, убыль которого достигала максимума в случае смешанной культуры – 68%. Потери лигнина для Cer. maxima и C. hirsutus составили 45% и 58% соответственно. Деградация лигнина грибами белой гнили также сопровождалась его модификацией. Согласно данным ИК спектроскопии, в структуре лигнина увеличивалось число карбоксильных и уменьшалось число метоксильных групп.

Таким образом, при совместном культивировании Cer. maxima и C. hirsutus наблюдался эффект синергизма при деградации лигнина березовых опилок.

Изучение динамики лигнолитических ферментов в ходе ферментации Cer.

maxima показало высокий уровень активности Mn-пероксидазы и низкий уровень активности лакказы (рис. 5). При культивировании C. hirsutus наблюдалось обратное соотношение ферментативных активностей: высокий уровень лакказной и низкий уровень Mn-пероксидазой активности. Рост смешанной культуры сопровождался высокими уровнями активности изучаемых ферментов лигнолитического комплекса.

Возможно, что данные штаммы грибов, синтезирующие разные доминирующие лигнолитические ферменты, а при совместном культивировании активно накапливающие оба фермента, более эффективно разрушают лигнин благодаря одновременному действию на субстрат сразу двух мощных оксидоредуктаз.

Полученные данные согласуются с литературными сведениями о синергетическом действии на лигнин лакказы и Mn-пероксидазы Rigidoporus lignosus (Galliano et al, 1991).

Активность лакказы, ед./мл Рис. 5. Активность лакказы (а) и Mn-пероксидазы (б) при твердофазном культивировании на березовых опилках C. hirsutus 072 (1), Cer. maxima 0275 (2) и C.

hirsutus&Cer. maxima (3).

Деградация лигноцеллюлозного комплекса при культивировании базидиомицетов на овсяной соломе.

Для сравнения эффективности делигнификации и особенностей биосинтеза окислительных ферментов данными культурами использовали другой источник углерода и энергии – овсяную солому. Этот субстрат содержит меньше лигнина (19%), чем березовые опилки (30%); кроме того, лигнин овсяной соломы, как и многих других злаковых, представлен в большей степени гваяцильными структурами, чем сирингильными (соотношение их составляет 1:0,72) и, как следствие, обладает невысоким уровнем метоксилированности по сравнению с березовым лигнином, где соотношение гваяцильных и сирингильных структур составляет 1:2,17.

Как известно, процессы деградации лигнина и гумификации при компостировании происходят наиболее эффективно при повышенной температуре. В связи с этим было проведено сравнительное изучение процессов деградации растительного сырья (овсяной соломы) при умеренной (28° С) и повышенной (37° С) температурах мезофильным (C. hirsutus) и термотолерантным (Cer. maxima) штаммами. Оба штамма: Cer. maxima, обитающий в тропическом климатическом поясе, и C. hirsutus, встречающийся в умеренном климате, хорошо росли на растительном субстрате при 37°С, утилизируя как целлюлозу, так и лигнин.

Полученные данные представлены на рис. 6.

В процессе культивирования при 280 С как индивидуальные штаммы базидиомицетов, так и их смешанная культура деградировали растительный субстрат практически в одинаковой степени. По истечении 45 суток убыль субстрата составила 31,8% для C. hirsutus, 32,7% для Cer. maxima и 29,7% для совместного культивирования. Деградация растительного субстрата происходила более активно при повышенной температуре (37° С). Потери массы соломы составили для Cer.

maxima – 51,8%, для C. hirsutus - 52,8% и для смешанной культуры - 41,3%.

Потери лигнина за этот же период при 280 С для C. hirsutus составили 38,9%, для Cer. maxima - 35,4% и для совместного культивирования - 34,4% (см. рис. 6, а).

Полученные данные свидетельствуют о более низкой степени деградации лигнина овсяной соломы, чем лигнина березовых опилок для изучаемых штаммов грибов. При 37° С деструкция лигнина происходила значительно более активно, достигая 59,5% для Cer. maxima, 52,4% для C. hirsutus и 32,8% для смешанной культуры.

Убыль лигнина,% В ходе культивирования при 28 С и 37° С убыль целлюлозы составила: 27,6% и 52,5% для Cer. maxima, 28,1% и 53,7% для C. hirsutus, 28,3% и 43,1% для смешанной культуры соответственно. Индекс Ic (индекс селективности) является важной характеристикой грибов - разрушителей древесины, который позволяет судить об избирательной способности данного микроорганизма деградировать либо лигнин, либо целлюлозу. Исходя из рассчитанных значений Ic (от 0,42 до 0,45), можно сказать, что при температуре выращивания 280 С все культуры деградировали как лигнин, так и целлюлозу примерно в равной степени, отдавая некоторое предпочтение лигнину (рис. 6). При повышении температуры культура Cer. maxima в большей степени минерализовала лигнин (Ic = 0,47), для культуры C. hirsutus утилизация целлюлозы и лигнина происходила приблизительно в равном соотношении (Ic = 0,51), однако при совместном культивировании наблюдалось более активное потребление целлюлозы (Ic = 0,57). Полученные результаты показывают, что данные штаммы-продуценты являются активными делигнификаторами растительного субстрата и степень утилизации лигнина и целлюлозы существенно возрастает при повышении температуры культивирования до 370 С.

В обоих температурных режимах смешанная культура Cer. maxima и C. hirsutus активно разлагала и лигнин, и целлюлозу, однако в меньшей степени, чем индивидуальные штаммы (см. рис. 6, 3). Таким образом, синергетического эффекта при деградации растительного субстрата в данных условиях ферментации как при С, так и при 37° С не наблюдалось.

Активность лакказы, ед./мл Рис. 7. Изменение активности лакказы при твердофазном культивировании на овсяной соломе при 280 С (а), при 370 С (б). 1 – Cer. maxima, 2 – C. hirsutus, 3 – смешанная культура.

При культивировании в обоих температурных режимах наблюдали высокую активность лакказы в ходе роста грибов (рис. 7). Образование лакказы при 37° С увеличивалось в 1,5 - 2 раза по сравнению с 28° С как у индивидуальных культур, так и при совместном культивировании штаммов. Это свидетельствует об активном участии лакказы в деградации растительного сырья.

Уровень активности Mn-пероксидазы в ходе всего культивирования при 280 С был незначительным (рис. 8). Активность Mn-зависимой пероксидазы в процессе культивирования базидиомицетов при 370 С зарегистрировать не удалось. Это может быть связано с отсутствием ее синтеза грибами при данных условиях. Возможно также, что Mn-зависимая пероксидаза быстро инактивируется при 370 С, в силу своей невысокой термостабильности. Полученные данные свидетельствуют о ключевой роли внеклеточной лакказы C. hirsutus и Cer. maxima в процессе деградации лигноуглеводного комплекса овсяной соломы.

Анализируя данные по степени деградации компонентов лигноцеллюлозного комплекса соломы и березовых опилок, а также по синтезу лигнолитических ферментов грибами белой гнили, можно предположить значительное влияние источника питания на особенности биосинтеза ферментов и лигнолитические свойства исследуемых грибов. Так, в условиях культивирования на овсяной соломе ключевым лигнолитическим ферментом являлась лакказа, тогда как при выращивании на березовых опилках деградация лигнина осуществлялась комплексом лакказы и Mn-пероксидазы, что обуславливало большую степень разложения субстрата. Таким образом, при действии только лакказы на субстрат наблюдалась меньшая степень деструкции лигнина, чем при одновременном действии двух оксидоредуктаз.

Активность Mn-пероксидазы, ед./мл Можно сделать вывод, что природа лигноцеллюлозного субстрата оказывает заметное влияние на биосинтез ферментов лигнолитической системы грибов белой гнили, а также на синергизм деградации лигнина смешанной культурой исследованных базидиомицетов. Культуры грибов белой гнили хорошо адаптированы к древесине лиственных деревьев, к которым принадлежит береза, тогда как овсяная солома не является характерным природным субстратом для данных штаммов, о чем также свидетельствует более низкая степень делигнификации для овсяной соломы по сравнению с березовыми опилками. Данные штаммы-продуценты являются активными делигнификаторами растительного субстрата и интенсивнее утилизируют лигнин и целлюлозу при повышении температуры культивирования до 370 С.

Процессы разрушения и минерализации растительного сырья грибами белой гнили сопровождаются реакциями образования темноокрашенных веществ. Рядом исследователей зафиксирован феномен образования таких соединений, получивших название гуминоподобных (Шиврина и др., 1969). Однако в настоящее время практически отсутствуют данные о механизме их образования, структуре и функциях;

поэтому следующим этапом работы было исследование особенностей синтеза подобных полимеров, их характеристика, а также изучение роли лигнолитического комплекса в этом процессе.

Структурная характеристика и исследование роли лигнолитического комплекса в биосинтезе ГПВ.

Известно, что продукты деградации как лигнина, так и целлюлозы могут рассматриваться как предшественники гуминовых кислот (ГК). ГК – кислотонерастворимая часть гуминовых веществ, которые по химической природе представляют собой нерегулярные сополимеры ароматических оксиполикарбоновых кислот с включениями азотсодержащих и углеводных фрагментов. Образование гуминовых веществ в природе - сложный и многофакторный процесс, в котором важное значение имеют микроорганизмы, деградирующие биополимеры и обладающие высокой биосинтетической активностью. Грибы белой гнили, разрушающие лигнин и синтезирующие комплекс лигнолитических ферментов, образуют ГПВ в ограниченные сроки, однако механизм данного процесса и его значение для жизнедеятельности грибов, а также структура и биологическая роль синтезированных ГПВ практически не изучены. Поэтому изучение процесса образования ГПВ и характеристика их структурной организации являлись первым этапом проведенной работы.

В процессе культивирования на соломе индивидуальных и смешанной культур базидиомицетов образовывались темноокрашенные высокомолекулярные соединения предположительно гуминовой природы, которые были выделены из среды культивирования после окончания ферментации. Полученный водный экстракт подкисляли до рН 2,0, выпавший осадок отделяли. Выход ГПВ составлял от 1,28 до 2,36% от массы утилизированного субстрата (овсяной соломы). При этом максимальные выходы ГПВ наблюдались при культивировании штамма Cer. maxima и смешанной культуры.

Как следует из широкого спектра физиологических функций лакказы, данный фермент не только принимает активное участие в деградации лигнина, но и способен катализировать процессы полимеризации, удаляя токсичные для грибной культуры метаболиты (детоксифицирующая функция). Наблюдаемая динамика активности лигнолитических ферментов при деструкции овсяной соломы в обоих изученных температурных режимах позволила выдвинуть предположение об участии лакказы в процессах образования ГПВ из продуктов деградации лигноуглеводного комплекса.

Следует отметить, что рН среды культивирования на протяжении всего роста культур не превышал 4,5, что позволяет исключить возможность автоокисления пропилфенольных метаболитов, образующихся при деградации лигнина. Кроме того, данное значение рН является оптимальным для действия большинства грибных лакказ, что обеспечивает высокую эффективность катализа этими ферментами реакций конденсации.

Для подтверждения ключевой роли лакказы в образовании ГПВ грибами возбудителями белой гнили был проведен ферментативный синтез ГПВ из низкомолекулярных веществ, производных кониферилового и синапового альдегидов, а также аминокислот и восстановленного глютатиона. Такие соединения, как пирокатехин, ванилин, ванилиновая кислота, ванилиновый спирт, ферулловая кислота, сиреневая кислота, синапиновая кислота, были использованы нами в силу преобладания в лигнине соломы гваяцильных и сирингильных структур (53% и 38% соответственно). Присутствие мономеров лигнина и близких к ним соединений в продуктах метаболизма дереворазрушающих грибов отмечалось рядом исследователей (Шиврина, и др., 1969, Shimada and Higuchi, 1991). Показано также наличие аминокислот гистидина, глицина, метионина и восстановленного глютатиона в мицелии дереворазрушающих грибов.

Три препарата ГПВ, образовавшиеся при росте C. hirsutus, Cer. maxima и смешанной культуры, и ГПВ, полученные ферментативным синтезом, характеризовали по следующим показателям: растворимость в щелочах и кислотах, элементный и молекулярно-массовый составы, спектральные характеристики.

Все исследованные ГПВ полностью растворялись в слабых щелочных растворах при рН 12,0, а также осаждались из раствора при его подкислении до рН 2,0, при этом ГПВ выпадали в виде осадков бурого цвета, демонстрируя качества, присущие природным гуминовым кислотам (ГК).

Данные по элементному составу ГПВ базидиомицетов и синтезированных ГПВ приведены в табл. 3. Все препараты ГПВ грибов характеризовались высоким содержанием углерода (от 59,5 до 60,0%) и водорода (от 5,8 до 6,3%). Содержание углерода и водорода в синтезированных ГПВ было несколько ниже: 57,3 и 4,2% соответственно. Обращает на себя внимание высокое содержание азота в препаратах ГПВ грибов (3,87–,16%), характерное только для почвенных ГК, и довольно низкое содержание кислорода (28,5–30,8%). В препаратах синтезированных ГПВ количество азота (1,96%) было меньше, чем в препаратах ГПВ базидиомицетов, а кислорода (33,7%) – больше. Сравнимое по величине содержание углерода в ГПВ грибов наблюдается в высокоароматичных препаратах природных ГК – угля, чернозема, низинного торфа, тогда как столь высокий вклад водорода в элементный состав не характерен для природных ГК (Rice and MacCarthy, 1991).

Табл. 3. Элементный состав, атомные соотношения и коэффициенты цветности Источник Содержание элементов, % масс* Атомные соотношения Е4/Е Cer. maxima C. hirsutus Cer. maxima& C. hirsutus * - стандартная погрешность измерений не превышала 0,01%.

В публикациях, посвященных классификации гумусовых кислот, неоднократно указывалось на гораздо более высокую дискриминирующую способность атомных соотношений по сравнению с абсолютным содержанием элементов (Visser, 1983).

Поэтому значения Н/C, O/C и C/N, рассчитанные для изучаемых ГПВ, сравнивали с таковыми для ГК из различных природных источников (Перминова, 2000).

Как видно из табл. 3, для ГПВ базидиальных культур характерны высокие значения Н/С (1,18 – 1,25) и низкие – О/С (0,36 – 0,39). Это обеспечивает особое положение группы ГПВ на диаграмме Ван-Кревелена (рис. 9) при ее максимальной близости группе почвенных ГК. Наиболее близки почвенным ГК и значения С/N (13, – 17,9). Высокие значения Н/С могут быть связаны с низкой степенью гумификации полученных ГПВ, т.е. высоким содержанием в них алифатических фрагментов, вклад которых в структуру природных ГК значительно ниже.

Сопоставляя значения Н/C, O/C и C/N, рассчитанные для синтезированных ГПВ, с таковыми для ГК из различных природных источников, можно сказать, что по положению на диаграмме Ван-Кревелена синтезированные ГПВ попадают в область почвенных и торфяных ГК, а по содержанию азота они ближе к торфяным ГК.

Большое сходство ГПВ, полученных ферментативным синтезом, с природными ГК может объясняться тем, что преобладающим субстратом при синтезе были ароматические соединения пропилфенольного характера.

Рис. 9. Распределение препаратов гумусовых кислот по соотношению основных элементов С, О, Н (диаграмма Ван-Кревелена). ГПВ исследованных базидиальных грибов вынесены в отдельную заштрихованную область, синтезированные ГПВ обозначены заштрихованным квадратом (среднестатистическое из 3-х значений).

На основании полученных экспериментальных данных рассчитывали коэффициенты цветности (“степень конденсации”, Е465/E665, т.е. отношение величин поглощения при длинах волн 465 и 665 нм). Коэффициенты цветности всех препаратов ГПВ базидиомицетов были равны 7,0 (табл. 3), что составляет предельную величину данного показателя для гуминовых кислот, у которых он варьирует от 3,0 до 7,0 (Орлов и др., 1969). Столь высокие значения коэффициентов цветности указывают на более значительный вклад алифатических фрагментов и, соответственно, низкую ароматичность структуры полученных ГПВ по сравнению с большинством препаратов природных ГК. Это свидетельствует о низкой степени гумификации выделенных ГПВ, что, вероятно, является следствием ограниченного времени их образования (45 суток), тогда как почвенные гуминовые вещества образуются годами. Для синтезированных ГПВ, как и для большинства гуминовых кислот, коэффициент цветности составлял 5,5 (см. табл. 3). Более низкое, чем у ГПВ грибов, значение коэффициента цветности объясняется использованием для синтеза преимущественно ароматических соединений с небольшими алифатическими фрагментами, а также может свидетельствовать о высокой активности грибной лакказы в реакциях полимеризации и конденсации.

На профилях элюции при гель-фильтрации всех препаратов ГПВ (рис. 10) наблюдался острый пик в области свободного объема колонки, свидетельствующий о наличии в их составе высокомолекулярной фракции. Аналогичный характер имел профиль элюции препарата почвенной ГК с известной молекулярной массой 23 кДа, использованного в качестве образца сравнения. Второй, более широкий диффузионный пик на кривых элюирования всех препаратов ГПВ находился в той же области, что и у ГК почвы, соответствуя фракции с молекулярной массой 23 кДа.

Полученные данные свидетельствуют о высокомолекулярной природе и полидисперсности препаратов ГПВ изученных культур базидиомицетов и синтезированных ГПВ и их близости по этим характеристикам к классу ГК (Perminova et al, 1998).

А Рис. 10. Профили элюции препаратов ГПВ и ГК дерново-подзолистой почвы при гель-фильтрации на Toyopearl HW-50 F (колонка 38 х 1,6 см). Подвижная фаза М фосфатный буфер, рН 6,8. Препарат ГПВ (20 мг/л) в том же буфере наносили на колонку в объеме 0,5 мл. 1 – ГК почвы, 2 – синтезированные ГПВ, 3 – ГПВ Cer.

maxima & C. hirsutus, 4 – ГПВ Cer. maxima, 4 – ГПВ C. hirsutus.

ИК спектры препаратов ГПВ грибных культур и ГК дерново-подзолистой почвы представлены на рис. 11. На основании спектров исследуемых ГПВ, образованных в процессе роста изученных базидиомицетов на растительном субстрате, можно сделать вывод, что состав функциональных групп данных ГПВ был практически идентичен. Это свидетельствует о сходстве путей образования ГПВ разными грибами белой гнили. На всех ИК спектрах наблюдается широкая интенсивная полоса поглощения в области 3300-3370 см-1, что соответствует валентным колебаниям ОН группы. Небольшие пики в области 2919 и 2850 см-1 могут вызываться колебаниями алифатических групп СН2 и СН3. Заметное плечо в области 1712-1722 см-1 соответствует колебаниям С=О групп в составе кислот, сложных эфиров и кетонов и является типичным для ГК. Сильно выраженная широкая полоса поглощения с максимумом при 1650-1659 см-1 характерна для двойных связей С=N.

Полоса при 1600 см-1, отвечающая колебаниям С=С в конденсированной ароматической системе, представлена на спектре в виде небольшого плеча. Четкий пик в области 1502-1505 см-1 может быть отнесен к колебаниям С=С связей в плоскости ароматического кольца. Поглощение в области 1460-1465 см-1 дают группы СН3 и СН2. За небольшой пик в области 1415-1420 см-1 могут быть ответственны группы СН, СОО-, ОН, присутствующие в ГК. Поглощение с максимумом в области 1268-1270 см-1 может быть отнесено к валентным колебаниям С-О первичных и вторичных спиртовых групп. Характерная область поглощения при 1226-1228 см- отражает колебания связей С-О в кислотных, сложноэфирных и фенольных группах.

По интенсивности поглощения в этой области можно судить о степени метоксилированности исследуемых препаратов. Следует заметить, что во всех исследованных ГПВ она была примерно одинаковой. Поглощение в области 1123см-1 может быть связано с колебаниями С-О углеводных и спиртовых групп (Stevenson, 1988). Наличие таких функциональных группировок, как алифатические, ароматические, карбоксильные, спиртовые, амидные, гидроксильные, свидетельствует о том, что препараты ГПВ базидиомицетов имеют большое сходство с природными ГК.

Рис. 11. ИК спектры ГПВ базидиальных грибов и ГК дерново-подзолистой почвы. 1 – Cer. maxima, 2 – Cer. maxima&C. hirsutus, 3 – C. hirsutus и 4 - ГК почв (в таблетках KBr).

Спектр синтезированных ГПВ представлен на рис. 12. Наличие острых пиков поглощения (по сравнению с ГПВ грибов белой гнили) свидетельствует о присутствии индивидуальных низкомолекулярных веществ, использованных для синтеза. Для ГПВ, полученных в результате лакказного синтеза, были характерны полосы поглощения в тех же областях спектра, что и для ГПВ базидиомицетов, образовавшихся в культуральной среде при высокой активности данного фермента.

Можно сделать вывод о значительном сходстве функционально-группового состава ГПВ грибов и синтезированных ГПВ.

Рис. 12. ИК спектры синтезированных ГПВ (в таблетках KBr).

Метод ЯМР 13С, позволяющий оценить распределение атомов углерода по основным структурным фрагментам, был использован для изучения количественного состава препаратов синтезированных ГПВ и ГПВ грибов. Учитывая значительное сходство препаратов ГПВ базидиомицетов между собой по качественному составу, только один из них (ГПВ, образованные смешанной культурой) был охарактеризован методом ЯМР 13С спектрометрии. Полученные спектры ГПВ сравнивали со спектрами ГК почв и ГФК торфа (рис. 13).

Условия проведения эксперимента (интервал между импульсами (Тd) равен 4 с) позволяли количественно оценить содержание углерода с различным химическим окружением. Процентное содержание каждого типа атомов углерода от общего содержания С для препаратов ГПВ базидиомицетов, синтезированных ГПВ и ГФК торфа представлено в табл. 4. Содержание углерода в составе ароматических фрагментов (38%) и карбоксильных групп (12%), а также большое сходство со спектрами почвенных и торфяных гуминовых кислот позволяют говорить о близости ГПВ базидиомицетов классу гуминовых кислот. Наличие резонансов в области 50- ppm, обусловленных присутствующими в лигнине метоксильными группировками, указывает на растительный источник происхождения гуминоподобного комплекса.

Таким образом, на основании данных о структурно-групповом составе (ароматические и метоксильные группировки) показано, что предшественниками ГПВ являются продукты деструкции лигнина.

OCO C O CH

Рис. 13. Спектры ЯМР 13С исследованных ГПВ (жирные линии) и природных ГК (по Перминовой, 2000). а - ГФК торфа, б – синтезированные ГПВ, в - ГК почвы, г – ГПВ базидиомицетов (100 МГц, Тd - 4 с).

Как видно из приведенных данных, алифатические атомы углерода присутствуют в меньшем количестве в составе синтезированных ГПВ (27%) по сравнению с грибными ГПВ (48%), что, вероятно, обусловлено особенностями ферментативного синтеза. В свою очередь, высокое содержание алифатических структур в случае ГПВ грибных культур может быть обусловлено вкладом углеводной части разрушенного растительного субстрата, тогда как при проведении ферментативного синтеза не были использованы моносахариды и их производные.

Количество ароматических фрагментов в структуре синтезированных ГПВ (49%) значительно превышает их число в структуре ГПВ грибов белой гнили (38%), что также объясняется условиями ферментативного синтеза, где были использованы преимущественно пропилфенольные соединения. Полученные данные свидетельствуют также о некоторой “недозрелости” ГПВ грибов, то есть о низкой степени гумификации, как уже отмечалось выше. Количество С карбоксильных, сложноэфирных и амидных групп почти одинаково у синтезированных ГПВ (13%) и ГПВ, образовавшихся в результате роста грибных культур (12%). Кетонные и хинонные группировки в гораздо большем количестве содержатся в структуре синтезированных ГПВ (9%), чем в структуре ГПВ грибных культур (1%), что может быть прямым следствием мощного окислительного воздействия лакказы на восстановленные пропилфенольные соединения, использованные для синтеза. В этом отношении ГПВ грибов ближе к ГК, чем синтезированные.

Табл. 4. Распределение углерода по основным структурным фрагментам исследованных ГПВ по сравнению с природными ГК согласно данным ЯМР 13С.

Типы атомов область, ррm * - по Ковалевскому и др., 1998.

На основании полученных данных рассчитывали общее содержание алифатических (СALK = CALK-O+CALK-H,R) и ароматических (СAR = CAR-O+CAR-H,R) фрагментов, а также отношение СAR/СALK, характеризующее степень ароматичности гумусовых кислот. Как следует из полученных данных (табл. 5), по степени ароматичности ГПВ базидиомицетов были наиболее близки к ГК дерновоподзолистых почв, а синтезированные ГПВ были в одном ряду с ГК черноземов.

Табл. 5. Сравнение структурных характеристик исследованных ГПВ (выделены жирным шрифтом) и природных ГК согласно данным ЯМР 13С.

* - по Куликовой, 1999.

Таким образом, показано, что по поведению в щелочах и кислотах, элементному и структурно-групповому составу, молекулярно-массовым, спектрофотометрическим и спектроскопическим характеристикам гуминоподобные вещества, синтезируемые различными базидиомицетами при росте на растительном субстрате, и ГПВ, полученные ферментативным синтезом, инициированным лакказой, имеют сходную структурную организацию с почвенными ГК. Полученные данные подтверждают ключевую роль лакказы в биосинтезе ГПВ грибными культурами. Возможно, образование ГПВ является одним из механизмов детоксификации внеклеточных низкомолекулярных пропилфенольных метаболитов путем полимеризации их внеклеточной лакказой.

1. Показана возможность совместного культивирования штаммов Cerrena maxima (активный продуцент Mn-пероксидазы) и Coriolus hirsutus (активный продуцент лакказы). Впервые выделены и охарактеризованы по физико-химическим свойствам лигнолитические ферменты базидиомицета Cer. maxima – Mn-пероксидаза и лакказа. Установлено, что при различных условиях культивирования Cer. maxima может синтезировать в качестве основного лигнолитического фермента или Mnпероксидазу или лакказу.

2. Показано, что грибы белой гнили Cer. maxima и C. hirsutus являются активными делигнификаторами при культивировании на растительном сырье – овсяной соломе и березовом лигнине. Эффект синергизма деградации лигнина смешанной культурой Cer. maxima и C. hirsutus наблюдался только при твердофазном культивировании на березовых опилках.

3. Твердофазное культивирование индивидуальных и смешанной культур на березовых опилках сопровождалось высокой активностью ферментов лигнолитического комплекса: лакказы и Mn-пероксидазы. Установлено, что ключевым ферментом при разложении лигноцеллюлозного комплекса овсяной соломы являлась лакказа при обоих температурных режимах культивирования (28° С и 370 С). Повышение температуры культивирования до 370 С приводило к полному исчезновению Mn-пероксидазной активности.

4. Впервые проведена комплексная характеристика гуминоподобных веществ, образованных грибами белой гнили, при культивировании на растительном субстрате (овсяной соломе). Установлено, что по элементному, структурно-групповому и молекулярно-массовому составу изученные ГПВ близки к почвенным ГК. Показано, что предшественниками ГПВ являются продукты деструкции лигнина.

5. Путем ферментативного синтеза, инициированного лакказой Cer. maxima из низкомолекулярных соединений - продуктов деструкции лигнина, а также аминокислот, синтезированы гуминоподобные вещества. По своим характеристикам данные ГПВ были близки природным ГК и ГПВ грибов белой гнили. Таким образом, установлена новая физиологическая функция лакказы грибов белой гнили – участие в образовании гуминоподобных веществ.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Королева О.В., Явметдинов И.С, Шлеев С.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П. Выделение и изучение некоторых свойств лакказы базидиомицета Cerrena maxima. Биохимия. 2001. Т. 66. N 6, с. 618-622.

2. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P., Yakovleva N.S., Landesman E.O., Yavmetdinov I.S., Yaropolov A.I. Laccase and Mn-peroxidase production by Coriolus hirsutus strain 075 in a jar fermenter. J. of Bioscience and Bioengineering. 2002. V. 93. N 5, pp. 449-455.

3. Koroleva O.V., Gavrilova V.P., Stepanova E.V., Lebedeva N.I., Sverdlova V.I., Landesman E.O., Yavmetdinov I.S., Yaropolov A.I. Production of lignin modifying enzymes by co-cultivated white-rot fungi Cerrena maxima and Coriolus hirsutus and characterization of laccase from Cerrena maxima. Enzyme and Microbiol. Technology.

2002. V. 30. N 4, pp. 573-580.

4. Степанова Е.В., Королева О.В., Васильченко Л.Г., Карапетян К.Н., Ландесман Е.О., Явметдинов И.С., Козлов Ю.П., Рабинович М.Л. Разложение овсяной соломы грибами при жидкофазном и твердофазном культивировании. Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. N 1, с. 74-84.

5. Явметдинов И.С., Степанова Е.В., Гаврилова В.П., Локшин Б.В., Перминова И.В., Королева О.В. Получение и характеристика гуминоподобных веществ, синтезируемых дереворазрушающими грибами, возбудителями белой гнили.

Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. N 3, с. 293–301.

6. Степанова Е.В., Явметдинов И.С., Гаврилова В.П., Королева О.В.

Выделение, очистка и некоторые физико-химические свойства лакказ из Coriolopsis fulvocenerea и Cerrena maxima. 2000. Пущино, 5-я школа-конференция “Горизонты физической и химической биологии”. Т. 1, с. 153.

7. Koroleva O.V., Gavrilova V.P., Stepanova E.V., Lebedeva, N.I. Sverdlova V.I., Landesman E.O., Yavmetdinov I.S., Yaropolov A.I. Characterization of laccases produced by white-rot fungi Cerrena maxima and Coriolus hirsutus and their role in lignin biodegradation. 2001. Хельсинки, Финляндия, 8-ая международная конференция по биотехнологии в бумажной промышленности, с. 46-47.

8. Koroleva O.V., Gavrilova V.P., Stepanova E.V., Yavmetdinov I.S., Antipov A.N.

The pecularieties of laccases biosynthesis by cocultivated white-rot fungi Cerrena maxima and Coriolus hirsutus. 2002. Осло, Норвегия, 7-й международный съезд микологов, с.

342.

9. Yavmetdinov I.S., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P. Biochemistry of humic-like substances formation. 2002. Звенигород, научно-практический семинар NATO ARW “Использование гуматов для рекультивации загрязненных сред: от теории к практике”, с. 34.

10. Королева О.В., Явметдинов И.С., Степанова Е.В., Ландесман Е.О.

Гуминовые вещества как объект биохимического изучения. 2003. Москва, 2-я международная конференция ”Гуминовые вещества в биосфере”, с. 112-113.



 
Похожие работы:

«Каплан Игорь Борисович Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов 03.02.02 – Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и на кафедре фитопатологии Корнельского университета (г. Итака, США) Научный консультант : доктор биологических наук, профессор, академик РАН...»

«ОВАНЕСОВ Михаил Владимирович Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка 03.00.02 - биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2002 2 Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук. Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов Официальные оппоненты - доктор медицинских...»

«Спангенберг Виктор Евгеньевич Динамика структурной организации хромосом в профазе I мейоза у мыши и человека 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории цитогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Коломиец...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«БЛАГОВЕЩЕНСКАЯ Екатерина Юрьевна ЭНДОФИТНЫЕ ГРИБЫ ЗЛАКОВ Специальность 03.00.24 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и в лаборатории иммунитета ГНУ ВНИИ кормов им. В.Р. Вильямса Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Безина Ольга Вячеславовна Экологические особенности распределения наземных моллюсков в разнотипных биоценозах лесостепи Правобережного Поволжья 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов - 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского на кафедре зоологии и экологии Научный...»

«Казарникова Анна Владимировна СТРУКТУРА И ВЗАИМООТНОШЕНИЯ КОМПОНЕНТОВ ЭКОСИСТЕМЫ ОСЕТРОВЫЕ РЫБЫ – ПАРАЗИТИЧЕСКИЕ ГИДРОБИОНТЫ – СРЕДА В ИХТИОПАТОЛОГИЧЕСКОМ МОНИТОРИНГЕ ВОДОЕМОВ ЮГА РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Южный научный центр РАН Научный консультант : Академик Национальной академии наук Республики...»

«ДЕМИНА Татьяна Степановна БИОЭКОЛОГИЯ РОСОМАХИ (Gulo gulo L.) И ОСОБЕННОСТИ ЕЕ РАЗВЕДЕНИЯ В НЕВОЛЕ 03.02.08 – экология, 06.02.09 – звероводство и охотоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Балашиха - 2011 1 Работа выполнена на кафедре экологии и охотоведения ФГОУ ВПО Российс кий г суд арственн ы й аг ар ны й з н ы й унив рситет ао Научные руководители: доктор биологических наук Новиков Борис Владимирович, доктор биологических...»

«ЧЕРНЫХ Оксана АЛЕКСАНДРОВНА ФЛОРА ГОРОДА БИЙСКА И ЕГО ОКРЕСТНОСТЕЙ 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул 2012 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Терехина Татьяна Александровна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ревякина Надежда Васильевна кандидат биологических наук...»

«ПУРЯЕВ АЙНУР СУЛТАНГАЛИЕВИЧ ПОЧВЕННО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ЗАЩИТНЫХ ЛЕСНЫХ НАСАЖДЕНИЙ ПРЕДВОЛЖЬЯ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН 03.00.16 – Экология 03.00.27 – Почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2006 2 Диссертация выполнена на кафедре лесоводства и экономики лесной отрасли Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанская государственная сельскохозяйственная...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«Благодатский Сергей Александрович МИКРОБНАЯ БИОМАССА И МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦИКЛА АЗОТА В ПОЧВЕ Специальность 03.02.03 – микробиология 03.02.13 – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино – 2011 Работа выполнена в лаборатории почвенных циклов азота и углерода Учреждения Российской академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино, Московская обл. Научный консультант : д.б.н.,...»

«Лобуничева Екатерина Валентиновна ЗООПЛАНКТОН МАЛЫХ ВОДОЕМОВ РАЗНЫХ ЛАНДШАФТОВ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.00.16 – экология 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук БОРОК – 2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет и Вологодской лаборатории ФГНУ ГосНИОРХ Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Болотова Наталья Львовна кандидат биологических наук, доцент...»

«НЕВЗОРОВ Илья Анатольевич Изменения структуры и свойств тропомиозина при стабилизации и дестабилизации различных участков его молекулы 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской Академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий...»

«Гордеева Татьяна Валерьевна ФАУНА И БИОНОМИЯ ВЫСШИХ РАЗНОУСЫХ ЧЕШУЕКРЫЛЫХ (LEPIDOPTERA, METAHETEROCERA) БУРЯТИИ 03.00.09 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена в лаборатории экологии животных Института общей и экспериментальной биологии Сибирского отделения Российской академии наук Научный руководитель - д.б.н. Дубатолов Владимир Викторович Научный консультант - к.б.н. Василенко Сергей...»

«ГРИГОРЬЕВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ МИКРООРГАНИЗМОВ В ФИТОРЕМЕДИАЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ УГЛЕВОДОРОДНЫХ ШЛАМОВ 03.00.07 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2009 Работа выполнена на кафедре микробиологии ГОУ ВПО Казанский государственный университет им. В. И. Ульянова-Ленина Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Наумова Римма Павловна Официальные оппоненты : доктор...»

«БУРЦЕВ Игорь Александрович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛНОЦИКЛОВОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОСЕТРОВЫХ РЫБ И СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПОРОД МЕТОДАМИ ГИБРИДИЗАЦИИ И СЕЛЕКЦИИ 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО), г. Москва Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Яржамбек Александр...»

«ЧЕРВЯКОВА ДАРЬЯ БОРИСОВНА ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ХИМЕРНЫХ БЕЛКОВ RecAX21 И RecAX53 (Pseudomonas aeruginosa/Escherichia coli), ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ РЕКОМБИНОГЕННОСТЬЮ 03.00.03 молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург Работа выполнена в Отделении молекулярной и радиационной биофизики Учреждения Российской академии наук Петербургский институт ядерной физики им. Б. П. Константинова РАН. Научные...»

«НАСИБОВ Шаиг Насир оглы ГЕНЕТИЧЕСКИЕ И БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ГИБРИДИЗАЦИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ И ДИКИХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ Специальность: 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Дубровицы - 2010 2 Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук. доктор...»

«МОРАЧЕВСКАЯ Елена Алексеевна МЕХАНИЗМЫ РЕГУЛЯЦИИ КАТИОННЫХ КАНАЛОВ В ЭУКАРИОТИЧЕСКОЙ КЛЕТКЕ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты : Зоя Иринарховна Крутецкая Санкт-Петербургский государственный университет доктор биологических...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.