WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

МОЛОДЦОВ Максим Игоревич

ИЗУЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

МИКРОТРУБОЧЕК И РАЗВИВАЕМЫХ ИМИ СИЛ

03.00.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2007

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор биологических наук, профессор И.А. Воробьев доктор физико-математических наук, профессор В.В. Смолянинов Ведущее учреждение – институт физико-химической биологии имени А.Н.

Белозерского.

Защита состоится « 14 » февраля 2007 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук (Москва, 125167, Новый Зыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан « 10 » января 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Микротрубочки являются важнейшими компонентами цитоскелета эукариотических клеток. Они участвуют в поддержании клеточной формы, движении, а также перемещении органелл, включая митотические хромосомы. Микротрубочки не только взаимодействуют с моторными белками, выполняющими работу по перемещению, но и сами способны совершать работу.

Хромосомы расходятся по дочерним клеткам во время митоза, взаимодействуя с микротрубочками митотического веретена. Плюс концы микротрубочек связывают кинетохоры – специальные образования на хромосомах, соответствующие центромерному участку. Во время прометафазы хромосомы, связанные с микротрубочками, перемещаются в сторону к полюсу, или от него, а затем, во время метафазы, выстраиваются в метафазную пластинку. Сестринские хроматиды расщепляются во время анафазы и хромосомы движутся к полюсам. Во время всех этих перемещений связанные с кинетохорами микротрубочки изменяют свою длину, добавляя или теряя субъединицы на их плюс конце в месте соединения с кинетохором, в том же самом месте, где кинетохор скользит по поверхности микротрубочки. Хотя в последние годы был достигнут существенный прогресс, и многие белки, входящие в состав кинетохоров теперь известны, молекулярные основы генерации сил в митозе до сих пор не ясны. Каким образом развиваются силы, которые перемещают хромосомы на молекулярном уровне – старейший вопрос исследователей митоза по-прежнему не имеет однозначного ответа.





Полимеризующиеся и деполимеризующиеся микротрубочки можно рассматривать как молекулярные машины, которые выполняют работу, толкая или таща за собой объекты, благодаря выделяемой во время полимеризации энергии гидролиза Гуанозин-трифосфата (ГТФ). По сравнению с полимеризацией, где теоретические представление весьма хорошо разработаны, механизм развития тянущей силы при деполимеризации, остается по большей части не ясным. Отчасти это связано с принципиальной трудностью представления устройства, которое бы позволило объекту следовать за концом деполимеризующейся микротрубочки, не теряя механического контакта.

Существует две принципиальных модели, описывающие подобное сочленение, и у обоих отсутствует количественное описание. Что касается величин развиваемых сил, то существующие оценки, основанные на энергии ГТФ гидоролиза или константах скорости полимеризации-деполимеризации тубулина, чрезвычайно грубы. Из-за такой неопределенности вклад динамики микротрубочек в движения хромосом до сих пор был не ясен.

рассчитывать силу, развиваемую в процессе деполимеризации микротрубочки и ее экспериментальная проверка.

Задачи исследования.

1. Создать количественную модель микротрубочки, основываясь на последних данных о ее структуре, кинетики деполимеризации и свойствах составляющих мономеров.

микротрубочкой в процессе деполимеризации.

необходимого для наиболее эффективного развития силы.

4. Экспериментально измерить силу и сравнить результат с теорией.

Научная новизна.

В работе была разработана молекулярно-механическая математическая модель микротрубочки. Согласно расчетам концы стабильных растущих микротрубочек слегка изогнуты. Такого изгиба достаточно, чтобы конец такой микротрубочки могли узнавать специализированные белки, однако не достаточно для того, чтобы это можно было зарегистрировать при помощи электронной микроскопии. Стабильность микротрубочки определяется слоем тубулина на ее конце еще не успевшим гидролизовать ГТФ. Мы показали, что баланс продольных взаимодействий в протофиламентах ответственен за стабильность основной части микротрубочки, а не наличие латеральных связей, как это было принято считать. Был проанализирован размер ГТФ шапки и было найдено, что двух слоев ГТФ тубулина достаточно, чтобы стабилизировать микротрубочку любой длины в большинстве случаев. Усовершенствованная модель, которая описывает взаимодействие с сопрягающим устройством, позволила рассчитать максимальную силу, которую может развивать микротрубочка. Было показано, что вся энергия, выделяемая в результате гидролиза молекул ГТФ во время полимеризации, может быть запасена в стенке микротрубочки и использована для генерации сил. Максимальное использование запасенной энергии достигается при развитии силы по механизму удара (power-stroke mechanism). Максимальная сила составляет пН для полной микротрубочки и достигается только при полной диссоциации латеральных связей димеров, развивающих усилие. Для того чтобы эта сила была утилизирована для перемещения хромосом наиболее эффективным образом, необходимо наличие специального устройства, сопрягающего энергию, выделяемую при деполимеризации микротрубочки, с перемещением.





Если бы таким сопрягающим устройством, было кольцо, которое может скользить по ее поверхности, то в диаметре оно должно быть на 10 нм больше внешнего диаметра микротрубочки, для того, чтобы развиваемое усилие было максимально.

Была разработана и построена специальная установка для того, чтобы непосредственно измерить величину силы развиваемой микротрубочкой во время деполимеризации. Максимальная развиваемая сила оказалась в точности равной рассчитанной теоретически. Энергия, запасенная в микротрубочке в «напряженном» состоянии тубулина, высвобождаясь в процессе деполимеризации микротрубочки, может развивать значительные силы и совершать работу по движению хромосом, если разбирающийся конец микротрубочки соединен с хромосомой соответствующим устройством сопряжения. Измеренная сила велика и примерно в десять раз больше сил, развиваемых единичным моторным белком кинезином. Из этого следует, что данный механизм может быть основным в движении хромосом во время митоза.

В некоторых из наших экспериментов, в результате наличия натяжения, продольные связи в протофиламентах существовали дольше, чем обычно при разборке микротрубочек, т.к. были им стабилизированы. Это может означать наличие специального механизма, который бы позволял сохранять соединение кинетохора с микротрубочкой в то время, когда сила, приложенная к хромосоме в сторону противоположенного полюса, велика.

Научно-практическое значение.

Исследование механизмов деления клеток имеет принципиальное значение для исследования развития раковых заболеваний. Понимание процессов, протекающих во время митоза, и их механизмов может помочь в создании антираковых препаратов и методик лечения. Результатом данной работы является вклад в понимание важности и существенности динамики микротрубочек в движении хромосом во время деления.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Построена оригинальная молекулярно-механическая модель 2. С помощью модели рассчитана сила, развиваемая микротрубочкой в процессе деполимеризации. Рассмотрены различные механизмы сопряжения с передающим устройством.

3. Сила, развиваемая микротрубочкой, измерена экспериментально.

Ее величина составила 60 пН, что находится в прекрасном согласии 4. Механизм развития силы уникален и являет собой новый тип биомеханического движителя.

Апробация работы состоялась 25-ого апреля 2006 г. на заседании проблемной комиссии «Биохимия, биофизика и реология крови» в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на международной конференции 49th Annual Meeting of the Biophysical Society (Long Beach, California, США, февраль 2005 г.); международной конференции "Biological Motility: Basic Research and Practice" (Пущино, май 2006 г.); 45-ой и 44-ой конференциях annual ASCB meeting (December 10-14б 2005. San Francisco, CA. и December 4-8, Washington, DC.);

Публикации. По материалам диссертации опубликованы тезисы в сборниках 6-и конференций и 5 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, шести глав, библиографического указателя, включающего 80 источников, и приложения.

Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф.

Атауллаханов Ф.И.) и в Университете штата Колорадо (зав лабораторией проф.

Ричард Макинтош).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

По вопросам клеточной и молекулярной биологии работу консультировали:

Современные представления.

Микротрубочки – это полые линейные полимеры, образующиеся в результате полимеризации -гетеродимеров тубулина. Схематически кончик разбирающейся микротрубочки представлен на Рис 1 (см. также Рис 2).

Продольные взаимодействия между молекулами тубулина образуют линейные протофиламенты, которые, в свою очередь, взаимодействуя латерально, образуют стенку микротрубочки.

Вскоре после присоединения димера связанная с -мономером молекула ГТФ гидролизуется; основная часть микротрубочки состоит из ГДФ-тубулина.

При этом гидролиз ГТФ не нужен для полимеризации. Тубулин полимеризуется в присутствии негидролизуемых аналогов ГТФ, самый известный из которых GMPCPP. Такие микротрубочки являются устойчивыми и не деполимеризуются – гидролиз нужен для того, чтобы дестабилизировать стенку микротрубочки.

Гидролиз молекулы ГТФ влияет на конформацию молекулы тубулина: ГДФтубулин является более искривленным. Принять естественную конформацию ГДФ-тубулин в стенке микротрубочки не может и находится там под напряжением. Такая микротрубочка является неустойчивой. Ее стабильность определяется наличием на конце небольшого участка молекул еще не гидролизовавших ГТФ. Когда такая «ГТФ-шапка» потеряна, микротрубочка деполимеризуется. При этом, начиная с конца, димеры тубулина принимают свою естественную «искривленную» форму, разрывая связи между протофиламентами. Энергия гидролиза ГТФ, запасенная в стенке микротрубочки в виде механического напряжения, высвобождается.

Деполимеризующиеся микротрубочки могут совершать работу, перемещая объекты. Это было показано экспериментально (Coue et al., 1991; Lombillo et al., 1995). Для того, чтобы высвобождаемая при деполимеризации энергия была использована для перемещения хромосом в митозе, необходимо наличие подходящего сопрягающего устройства, т.е. такого устройства, которое будет способно следовать за разбирающимся концом микротрубочки оставаясь все время с ней связанным и эффективно утилизируя выделяемую энергию. Дизайн такого устройства впервые был предложен в работе (Hill and Kirschner, 1982).

Он представляет собой кольцо, одетое на конец деполимеризующейся микротрубочки (Рис 1).

На данный момент существует две основные модели, принципиально объясняющие развитие силы деполимеризующейся микротрубочкой. Модель Хилла (Hill, 1985) получила название модели направленной диффузии (biased diffusion). Стенки рукава в модели связывают молекулы тубулина в микротрубочке. Движение внутри рукава происходит благодаря термическим флуктуациям энергии и является «направленным» благодаря тому, что энергия взаимодействия микротрубочки с рукавом тем меньше, чем больше сайтов связывания занято. Таким образом, отсоединение тубулинов от конца МТ освободит некоторые сайты в рукаве, которые система будет стремиться занять, передвинув весь рукав. Главным недостатком модели является полное деполимеризацией микротрубочки. Очевидно, что изгибание димеров в рукаве, узком настолько, чтобы действовали белок-белковые взаимодействия между тубулинами и внутренней поверхностью рукава, не возможно.

Гипотеза, выдвинутая в работе (Koshland et al., 1988), основана на более поздних данных о структуре разбирающегося конца микротрубочки, ее называют моделью «конформационной волны» (conformational wave model).

Согласно этой модели сила развивается благодаря изгибанию протофиламентов, которые при этом давят на внутреннюю кромку кольца, вызывая, таким образом, его скольжение по направлению к противоположенному концу (так называемый “power stroke” механизм). При этом связывание между микротрубочкой и кольцом отсутствует. Величина развиваемой при этом силы была оценена нами в данной работе. Мы показали, что если диаметр кольца оптимален, развиваемая сила может составлять 100% от максимально возможной. Таким образом, данный механизм является возможным механизмом, имеющим место в реальности. Стоит, однако, заметить, что согласно нашим расчетам развитие максимальной силы возможно только, если она развивается уже потерявшими латеральные связи тубулинами. Такие димеры остаются слабо связанными с микротрубочкой и возможно, что данный вид соединения будет являться неустойчивым.

Материалы и методы исследований Подход, используемый для описания микротрубочки. Модель микротрубочки, разработанная в данной работе, основана на механическом описании димеров тубулина, входящих в состав микротрубочки, а также потенциалов взаимодействия между ними. Для простоты мы моделировали димеры как твердые недеформируемые объекты так, что конформационные изменения, сопровождающие гидролиз ГТФ, приводили только к изменению равновесного угла между димерами. Исходя на известных данных о структуре и поведении микротрубочки, для упрощения расчетов, мы ограничили число степеней свободы, которые имеет димер в микротрубочке до одной, соответствующей изгибу димера в плоскости проходящей через центральную ось микротрубочки и ось протофиламента (Рис 2).

Каждый димер имеет 6 точек взаимодействия с другими димерами (Рис 2).

Две из них расположены вдоль оси димера и служат для продольного взаимодействия между димерами в протофиламенте. Они выбраны таким образом, что пара димеров в отсутствии других взаимодействий стремится образовать угол o в плоскости P, которая образована осями микротрубочки и данного протофиламента. Предположение, состоящее в том, что димеры одного протофиламента могут изгибаться только в одной плоскости, значительно упрощает расчеты, и отчасти оправдано симметрией микротрубочки. Сумма сил, действующих на димер, находящийся в теле микротрубочки, почти строго лежит в плоскости P. Латеральные взаимодействия симметричны практически для всех димеров.

взаимодействий между димерами в соседних протофиламентах – по две связи на мономер. Одна для соседа справа, другая для соседа слева. Соответствующие им силы, действующие между протофиламентами, зависят только от расстояний r, между взаимодействующими точками. Все эти силы совместно удерживают протофиламенты вместе.

Форма и положение i-ого протофиламента полностью определены, когда заданы координаты одного зафиксированного в пространстве димера и углов k(i ) между осью z и осью каждого димера в протофиламенте (k = 1..N, N – число димеров в протофиламенте i). Продольное взаимодействие между двумя димерами в протофиламенте описываются при помощи потенциала вида:

взаимодействия; - равновесная длина связи; ro - параметр, характеризующий длину латеральной связи. После того, как полная потенциальная энергия микротрубочки вычислена как сумма вкладов каждого взаимодействия, ее ближайший локальный минимум, соответствующий устойчивой конформации, может быть найден при помощи одной из вариаций метода сопряженных градиентов.

Для того чтобы рассчитать силу, развиваемую одним протофиламентом, мы находили минимум потенциальной энергии при дополнительном условии ~ = w, где ~ - координата в плоскости P верхнего края верхнего димера. Т.е.

при изгибании протофиламент упирается в упор, не дающий ему изгибаться дальше. Развиваемую силу можно рассчитать по формуле F = U / z, где U – изменение потенциальной энергии при смещении точки приложения силы по димеру на некоторую небольшую величину вниз. При этом по вертикали ее координата изменяется на z.

Экспериментальная установка. Для экспериментального измерения силы, развиваемой деполимеризующейся микротрубочкой, нами была собрана установка «лазерный пинцет». Основными компонентами установки являются:

флуоресцентный микроскоп (ZEISS AxioPlan 2), оборудованный также для DIC микроскопии и мощный лазер, дающий непрерывный гауссов пучок (модель BL-106C, Spectra Physics). Сфокусированный объективом микроскопа лазерный луч создает трехмерный градиент света, который работает как ловушка, захватывая объекты микронного размера с диэлектрической проницаемостью, большей, чем проницаемость среды. При отклонении шарика от центра луча возникает сила, направленная к центру, пропорциональная его отклонению. С помощью квадрантного фотодетектора (специально сделанного на физическом факультете Университета штата Колорадо) отклонение шарика от центра луча можно измерить с точностью до нескольких нанометров по изменению интерференционной картины проходящего и преломленного на шарике света.

Реагенты и белки. Большинство реагентов были куплены у Sigma и Molecular Probes. Негидролизуемый аналог ГТФ, GMPCPP, был приобретен у Jena Bioscience. Тубулин был получен из коровьих мозгов путем поэтапной полимеризации – деполимеризации и очистке на фосфоцеллюлозной колонке (Weingarten et al., 1975). Мечение тубулина родамином и биотином было выполнено по стандартному протоколу (Hyman et al., 1991. Preparation of modified tubulins). В качестве центров нуклеации тубулина использовались лизированные в стандартном буфере (0.1 M PIPES, 1mM EGTA, 1mM MgCl2, pH 6.9 с KOH) с добавлением 0.5 % детергента (p-40, Sigma) шкурки тетрахимены.

Стеклянные микро-шарики были приобретены у Bangs Laboratories, Inc.

Эксперимент по измерению силы. Эксперимент проводился в термостатируемой (32°С) проточной камере, основой которой служили предметное и покровное стекла, разделенные слоем двустороннего скотча.

Схема эксперимента представлена на рис 3А. До начала эксперимента шкурки тетрахимены помещались на покровное стекло, после чего камера заполнялась буфером, собиралась и запечатывалась силантом (Kwik-cast, WPI, Inc). После этого в камеру в присутствии ГТФ (1мМ) добавлялся тубулин (1.4 мг/мл), 1/ часть которого была мечена биотином, После этого камера промывалась 4-мя объемами тубулина (0.4 мг/мл), содержащего 1/3 часть меченного родамином в присутствии GMPCPP и без ГТФ, и инкубировалась 2 – 3 минуты. В результате биотинилированного тубулина длиной в несколько микрон, кончики которых стабилизированы от деполимеризации небольшой стабильной шапкой родамин меченого тубулина. После промывки в камеру были добавлены стеклянные шарики микронного размера, покрытые стрептавидином (Hunt and McIntosh, 1998), которые произвольно прилипали к биотинилированным микротрубочкам.

После того, как был выбран шарик для проведения измерения, он был захвачен ловушкой (рис 3В). Деполимеризация микротрубочки вызывалась разрушением GMPCPP стабилизированного кончика трубки, светом в полосе поглощения родамина. Нами было показано, что, наряду с сильным фотообесцвечиванием родамина, разрушались и связи между молекулами тубулина, связанного с этим родамином. Тем самым, шапочка, стабилизирующая микротрубочку, разрушалась, и микротрубочка начинала деполимеризоваться.

Результаты шапкой и без нее. Минимизация энергии для спиральной микротрубочки дает ее устойчивую конформацию. В широком диапазоне параметров микротрубочка с ГТФ шапкой является устойчивой (рис 4А). Рисунок 3В показывает профиль одного из протофиламентов в микротрубочке с двумя ГТФ тубулинами на конце. Его конец слегка изогнут, но максимальное отклонения димеров не превышают 2-х ангстрем и очень быстро затухают при удалении от конца протофиламента.

Конформация микротрубочки, состоящей только из ГДФ тубулина является неустойчивой. Есть только одно равновесное состояние такой микротрубочки, соответствующее полностью закрученным протофиламентам с разорвавшимися латеральными связями. Таким образом, модель описывает основное свойство микротрубочек: быть стабильными при наличии ГТФ шапки и способность быстро разбираться в результате закручивания протофиламентов в ее отсутствии. При нормальных условиях после того, как разрушились связи между протофиламентами, разрушаются и продольные связи в протофиламентах – микротрубочка разбирается на отдельные димеры. Однако продольные связи являются более устойчивыми, и процесс отделения димеров мы в модели не рассматриваем.

Баланс изгибающих сил и локальность взаимодействий внутри стенки микротрубочки. Для того чтобы димер находился в покое, сумма действующих на него сил должна быть равна нулю. Димеры, находящиеся в стенке микротрубочки не у самого ее конца, практически не отклонены. Это связано с тем, что силы, действующие со стороны нижнего и верхнего димеров, компенсируют друг друга таким образом, что полная сумма сил и моментов сил, приложенных к данному димеру, равны нулю. Основная часть микротрубочки является выпрямленной благодаря компенсации изгибающих моментов, а не удерживающему характеру латеральных сил.

Кривизна ГТФ и ГДФ димеров различна, поэтому изгибающие силы, которые они прикладывают к своим соседям, тоже различны. Если внутрь стенки ГДФ микротрубочки вставлен ГТФ димер, это приведет к нарушению формы протофиламента, т.к. моменты сил, приложенные к концам димера, отличаются. Анализ сил показывает, что положение данного димера зависит только от ближайших соседей и не сказывается на положениях димеров, отстоящих хоть сколько-нибудь далеко. Это приводит к тому, что неровность формы, вызванная нарушением типа димера, не будет распространяться далеко, а будет локализована в непосредственной его близости. Локальность взаимодействий в стенке микротрубочки сильно облегчает анализ ее свойств.

Его непосредственным следствием является то, что структура и стабильность конца микротрубочки не зависят от ее длины и определяются всего 5-6ю последними слоями.

некотором расстоянии w от поверхности протофиламента находится внутренняя поверхность кольца, охватывающего микротрубочку. В результате разрушения латеральных связей протофиламент начинает закручиваться и поверхность одного из его димеров приходит в контакт с внутренней кромкой кольца (рис 5А,В).

точка приложения силы смещается по поверхности димера на d – d’, и на z вниз.

Максимальная развиваемая при этом сила равна F = U / z, где U - изменение потенциальной энергии протофиламента.

На рис 6С представлена зависимость максимальной развиваемой силы, приложенной со стороны верхней части последнего димера к внутренней кромке кольца, от его диаметра. Когда w 0.5 нм, составляющая силы, параллельная оси микротрубочки, крайне мала. Отчасти это результат геометрии системы. Когда димер вертикален, большая часть силы приложена в направлении, перпендикулярном оси микротрубочки. Однако более значительным оказывается другое обстоятельство. Когда димер, развивающий силу, наклонен всего немного, его латеральные связи уже натянуты, но еще не порваны. На кривой потенциала латеральных сил мы находимся на возрастающем участке, и сильное латеральное взаимодействие между димерами препятствует развитию больших сил.

рвется. С. Равновесная сила, развиваемая единичным протофиламентом на расстоянии w от его поверхности.

Вся энергия уходит на то, чтобы преодолеть барьер латеральных связей.

После того, как это барьер преодолен, возникает дополнительное отталкивание между димерами, наоборот, способствующее развитию сил. Но это происходит только при больших диаметрах кольца. Далее в игру вступают нижележащие связи, и общее поведение дает сложную нелинейную зависимость развиваемой силы от величины кольца. Максимум силы достигается, когда обе латеральные связи работающего димера разорваны и отчасти работают силы отталкивания.

При дальнейшем увеличении w сила начинает падать, т.к. энергия расходуется на растяжение связей нижележащего димера. Эти небольшие модуляции силы происходят регулярно с ростом диаметра кольца, но, чем больше кольцо, тем меньше эти изменения, потому что более отдаленные от точки приложения силы димеры дают в нее меньший вклад. При w10 нм сила начинает падать изза значительного удаления димеров, развивающих силу, от точки ее приложения. Таким образом, максимальное развитие силы возможно на расстоянии 5-7 нм от поверхности протофиламентов. Именно настолько должно отстоять кольцо от стенки микротрубочки, чтобы энергия изгибающихся протофиламентов могла быть эффективно использована для развития механического усилия.

Максимальная сила, развиваемая микротрубочкой. Оказывается, что точные расчеты силы зависят от конкретной формы димера. Во всех вышеприведенных расчетах предполагалось, что сила развивается верхним краем димера. Если димеры моделировать как жесткие цилиндры, то при попадании кромки кольца, где приложена сила, на место стыка между димерами возникает сингулярность. Для того чтобы оценить среднюю силу, развиваемую микротрубочкой при скольжении по ней кольца, мы упростили задачу и рассмотрели ее аналитически.

Рассмотрим кольцо, которое скользит вдоль оси Oz микротрубочки при постоянном w, и рассмотрим два состояния. Первое, когда N-ый димер касается кромки кольца какой-то своей точкой, и второе, когда N-1-ый димер касается кромки кольца точкой, расположенной так же, как и на N-ом димере в состоянии 1. Поскольку конформация крайних димеров не зависит от длины всего протофиламента, в состоянии 2 (N-1)-ый димер и димеры, лежащие под ним, будут иметь точно такую же конформацию, как и N-ый димер и лежащие под ним в состоянии 1. Следовательно:

Верхние индексы при углах обозначают состояния 1 или 2. Максимальная работа, которая может быть произведена протофиламентом по перемещению кольца из состояния 1 в состояние 2, есть:

Здесть U i( ) - потенциальная энергия всех взаимодействий i-ого димера.

В силу (1) W = U N2 ) U 1(1), или W = U 1(1), т.к. вклад в потенциальную энергию N-ого димера в состоянии 2 равен нулю – все его латеральные связи нижний димер стоит вертикально, то, при условии, что глубина потенциальной ямы равна нулю, имеем:

Максимальная сила, развиваемая протофиламентом, есть F = U 1(1) / l, где l – длина димера. Ровно настолько сместится кольцо вдоль оси Oz при переходе из состояния 1 в состояние 2. Уравнение (3) показывает, что вся энергия, запасенная в продольной связи испрямленного димера, может быть, в принципе, использована для совершения работы.

Используя экспериментальные данные по скоростям деполимеризации микротрубочек (Walker et al., 1988; Fygenson et al., 1994), мы оценили энергию активации разрыва латеральной связи. Она составила 4.8 ± 0.6 ккал/моль. Для того чтобы ГДФ димер, изгибаясь, мог преодолеть этот барьер, минимальная энергия, запасенная в испрямленной конформации ГДФ-тубулина, должна составить U i(1) = 6.7 ккал/моль (основано на расчетах по нашей модели).

Максимальная сила, развиваемая протофиламентом при этом, - 5.8 пН.

максимально возможная развиваемая при деполимеризации сила составит пН. Оценка максимальной силы на основе гидролиза молекулы ГТФ при условии, что вся энергия пошла на работу, дает 82 пН на микротрубочку (если считать энергию гидролиза ГТФ = 7.3 ккал/моль). Для сравнения сила, развиваемая по механизму Хила, составляет 15 пН (Joglekar and Hunt, 2002). Это протофиламента.

Наша оценка в 75 пН составляет значительную часть 700 пН, необходимых, чтобы остановить анафазное движение хромосомы (Nicklas, 1983). Это означает, что порядка десяти микротрубочек участвуют в перемещении хромосомы для данного вида организма, в то время как по сделанным оценкам их должно быть около 40-ка. Однако не известно, как много из этих сорока доходят до полюса или развивают силу. Анафазное движение может быть зависимо только от нескольких микротрубочек в данный конкретный момент времени. Возможно, некоторые другие феномены, такие, как процессивность (способность совершать несколько шагов, непрерывно развивая силу, без отрыва от субстрата) играют важную роль. Большее число микротрубочек может увеличить шансы успешного завершения анафазного движения.

микротрубочкам (см. «Материалы и методы»), не являются жестко закрепленными, а по-прежнему участвуют в броуновском движении (рис 7B).

После того, как запущена деполимеризация трубок, через некоторое время (как правило, 0.5 - 2 мин) наблюдаемый шарик, бывший прикрепленным к микротрубочкам, становится свободным.

Рис 7. Примеры сигналов - необработанные данные квадрантного детектора. По оси абсцисс отложено время. А – захваченный ловушкой свободный шарик, с которым проделаны разные операции. Стрелки – открытие и закрытие освещения, разрушающего родаминовые концы микротрубочек, вытянутые треугольнички – перемещения подставки – держателя объекта, вместе с объектом. Ни освещение, ни движения объекта не влияют на регистрируемое, чисто броуновское движение. В – Броуновское движение уменьшено для шарика под натяжением, прикрепленного к нескольким микротрубочкам. Несколько событий отрыва от разных микротрубочек произошло после открытия иллюминации и до полного освобождения шарика. С – F – примеры сигналов. Сплошная кривая – аппроксимация гладкой функцией. С, D – типичные сигналы силы; F – сигнал без силы, релаксация; Е – сложный сигнал.

Наблюдавшиеся нами движения шарика, вызванные деполимеризацией микротрубочки, варьировали от эксперимента к эксперименту очень сильно:

некоторые шарики отрывались быстро, с характерным временем в сотые доли секунды, тогда как другие совершали довольно сложные движения, длившиеся 5 – 40 сек. Но, в конце концов, шарик всегда оказывался в центре ловушки, освободожденным от трубки. Об этом можно было судить по увеличению броуновского движения шарика после серии событий, что хорошо видно на рис 7В. Сложное поведения шарика мы объясняем тем, что в этих экспериментах шарик был исходно связан сразу с несколькими трубочками, и отсоединение его от разных трубочек происходило в разные моменты времени. Дошедшая до шарика волна деполимеризации каждой из этих трубок вызывала некоторое движение. Поскольку мы никогда не знаем наверняка, сколько трубок было изначально прикреплено к тому или иному шарику, мы анализировали только последнее событие на полученных данных. Это гарантировало нам анализ отсоединения одной, последней микротрубочки. В том, что шарик свободен, мы убеждались, перемещая подставку и следя за положением шарика: он должен все время оставаться в центре ловушки, если шарик действительно свободен (рис 7В).

В 61-ом из 144-х экспериментов перед последним отрывом шарик немного двинулся от центра, прежде чем в него перейти (рис 7 C-E). Смещение в перпендикулярном направлении, как правило, составляло не более 20% от смещения вдоль микротрубочки.

Средняя величина развиваемой силы в наших экспериментах составила 0.24 ± 0.02 пН. Чтобы проверить, не зависит ли развиваемая сила от способа прикрепления к шарикам, в качестве альтернативного линкера между шариком и микротрубочкой мы использовали MAP белки. При этом средняя развиваемая сила не изменилась и составила 0.22 ± 0.04 пН. Величины развиваемых сил не зависят ни от длины микротрубочки, ни от изначально приложенного натяжения. Распределение сил резко падает практически до нуля на значении 0.45 пН (рис 8), предполагая тем самым, что это есть максимальная сила, которая может быть развита в нашей экспериментальной системе.

Перемещение шарика вызвано изгибанием протофиламентов. Радиус шарика составляет 500 нм, в то время как размер области прикрепления 20 – нм. Это означает, что сила, приложенная к центру шарика, уменьшена в ~ раз, поскольку таково отношение плеч рычагов в нашей постановке эксперимента. Следовательно, максимальная сила, развиваемая вблизи поверхности микротрубочки, составляет 4.5-5.0 пН, что по величине равно силе, развиваемой моторным белком. Если бы энергия всех 13-ти протофиламентом могла утилизироваться подходящим устройством для совершения работы по перемещению, можно было бы ожидать, что развиваемая при этом сила составит 30 – 60 пН.

деполимеризации. Распределение времен нарастания является довольно широким (рис 9А), времена колеблются от 0.03 до 9.5 сек, что отчасти может быть объяснено различными скоростями деполимеризации микротрубочек. Эту гипотезу мы проверили, проварьировав концентрацию ионов Mg2+ в растворе.

Известно, что с ростом концентрации Mg2+ скорость деполимеризации растет (O’Brien et al., 1990). На рис 9В видно, что уменьшение концентрации этих ионов приводит к увеличенным временам релаксации, что указывает на хорошую обратную корреляцию этих времен со скоростью деполимеризации.

Для физиологических значений концентрации Mg2+ (1 – 4 мМ) среднее время развития силы в наших экспериментах составляет 1.3 сек.

аналогичную описанной в разделе «развитие силы деполимеризцющейся микротрубочкой», в которую было включено взаимодействие с шариком радиуса 1мкм. Модель позволила количественно рассчитать силу, приложенную к центру масс шарика, основываясь на оценках энергий связей приведенных выше, а также понять природу возникновения разных амплитуд сил и сигналов типа медленных релаксаций (рис 6C,D,F).

Рис 9. Характеристики развиваемых сил. А. Гистограмма длительностей развиваемых сил; В. Характеристики сил для различных значений концентрации (физиологические значения 1 – 4мМ). Длительности сил и релаксаций больше для медленнее деполимеризующихся микротрубочек, в то время как амплитуды сил неизменны.

Из полученных зависимостей и анализа модели был сделан вывод, что причиной возникновения различных величин развиваемых сил и различных времен релаксации является стохастический характер разрушения связей между зависимости от того, какие протофиламенты на уровне закрепления отщепятся первыми: те, за которые закреплен шарик, или протофиламенты, находящиеся с другой стороны закрепления. Наша модель показывает, что если первыми отщепятся протофиламенты, за которые закреплен шарик, то в этом случае будет развита наибольшая сила (рис 10B). Величина силы, полученная в расчетах, составила 0.4 пН - это прекрасно согласуется с максимальной силой измеренной экспериментально.

протофиламенты, не связанные с шариком, то возникнет ситуация, в которой шарик связан со связкой из более, чем 2-х протофиламентов (рис 10С). Чем больше протофиламентов в этой связке, тем меньше они могут изогнуться как целое из-за того, что им мешают по-прежнему существующие между ними латеральные связи. Их общая кривизна меньше, чем кривизна одного протофиламента, и поэтому развиваемая сила меньше.

GMPCPP тубулина (более темная); В. Сценарий 1. Протофиламенты, закрепленные за шарик отваливаются раньше других. Они толкают шарик дальше от центра ловушки, развивая максимальную силу. С. Сценарий 2. Протофиламенты, закрепленные за шарик отваливаются самыми последними. При этом шарик долгое время закреплен за структуру из многих протофиламентов, гораздо менее жесткую, чем вся микротрубочка. Приложенное к шарику натяжение вынуждает ее изгибаться, приводя шарик ближе к центру ловушки.

Если их в связке более 6-ти, то сила вообще не будет развиваться, а будет иметь место другой эффект. Жесткость такой связки из нескольких протофиламентом намного меньше, чем все микротрубочки целиком. Если шарик находится под натяжением, то поскольку жесткость закрепления уменьшилась по сравнению с той, которая была до полимеризации, шарик начнет медленно смещаться к центру ловушки. Именно это и есть причина наблюдаемых нами медленных релаксаций (Рис 7F).

неожиданными - согласно полученным цифрам шарик может оставаться связанным с частично разобранной микротрубочкой в течение нескольких секунд, в то время как за одну секунду латеральные связи должны потерять от до 65 димеров. В течение всего этого времени продольные связи в протофиламентах остаются не разорвавшимися, поскольку шарик не является свободным. Более того, согласно нашим данным большие времена релаксации соответствовали большим натяжениям. Таким образом, время жизни продольной связи в протофиламенте увеличено приложенным натяжением, которое противодействует выгибанию протофиламентов. Этот результат может оказаться ключом к пониманию важного свойства кинетохоров. Если натяжение присоединенных к кинетохору микротрубочек велико из-за сил, действующих с другой стороны хромосомы, они не отрываются, а наоборот переходят в состояние полимеризации. В наших экспериментах приложенное к микротрубочкам натяжение замедлило изгибание протофиламентов, тем самым, затормозив их разборку.

ВЫВОДЫ

1. Разработана молекулярно-механическая модель микротрубочки, которая позволила проанализировать стабильность и форму микротрубочки и деполимеризации.

2. Рассчитана максимальная сила, развиваемая микротрубочкой. Она составила 75 пН. Показано, что вся запасенная в стенке микротрубочки энергия гидролиза ГТФ может быть использована для генерации сил, т.е.

микротрубочка может действовать, как молекулярная машина с КПД 3. Экспериментально измерена сила, развиваемая при деполимеризации одиночной микротрубочки. Ее величина составляет 30 – 60 пН, что в раз больше силы, развиваемой моторным белком кинезином, и, следовательно, деполимеризация микротрубочек может служить основной силой, движущей хромосомы в митозе.

стабилизирует ее от деполимеризации.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., Efremov A.K., McIntosh J.R., and Ataullakhanov F.I. Force production by depolymerizing microtubules: a theoretical study, Proc Natl Acad Sci USA. 2005, v.102, n. 12, p. 4353-4358.

2. Molodtsov M.I., Ermakova E.A., Shnol E.E., Grishchuk E.L., McIntosh J.R., and Ataullakhanov F.I. A molecular-mecanical model of the microtubule.

Biophys J. 2005, v. 88, n. 5, p. 3167 – 3179.

3. Grishchuk E.L., Molodtsov M.I., McIntosh J.R., and Ataullakhanov F.I. Force production by disassembling microtubules. Nature. 2005, v. 438(7066), p.

4. М.И. Молодцов, Е.Л. Грищук, Д.Р. Макинтош, Ф.И. Атауллаханов.

Измерение силы, развиваемой разбирающейся микротрубочкой в ходе деполимеризации, вызванной ионами Ca. Доклады Академии Наук. 2007.

5. М.И. Молодцов, Е.Л. Грищук, Д.Р. Макинтош, Ф.И. Атауллаханов.

Новый тип биомеханического движителя. Российский химический журнал. В печати.

6. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., McIntosh J.R., and Ataullakhanov F.I. 2005.

Force Production by Depolymerizing Microtubules.

Abstract

book of the 49th Biophysical Society Meeting, February 12-16, 2005, Long Beach, California, 7. Molodtsov M.I., Grishchuk E.L., McIntosh J.R., and Ataullakhanov F.I. 2006.

New type of biomechanical motor. International symposium: “Biological motility: research and practice”. Pushchino, May 11-15, 2006, Moscow region, Russia 8. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, F.I. Ataullakhanov, J.R. McIntosh. Force production by disassembling microtubules. 2005. 45th annual ASCB meeting.

December 10-14. San Francisco, CA. p. 476a.

9. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, F.I. Ataullakhanov, J.R. McIntosh. The Force Produced by Depolymerizing Microtubules. 2004. 44th annual ASCB meeting. December 4-8. Washington, DC.

10. E.L. Grishchuk, M.I. Molodtsov, A.K.Yefremov, I.S. Spiridonov, F.I.

Ataullakhanov and J.R. McIntosh. 2006. Mechanisms of poleward chromosome movement. Biophysical society discussion group. Molecular motors: Point Counterpoint. October 19 – 22. California.

11. K.V. Zhudenkov, M.I.Molodtsov, F.I. Ataullakhanov. Mathematical modeling of the mitotic spindle formation and mechanics of the microtubule end. 2006. 1st International Conference on Mathematical Biology and Bioinformatics. October 9-15. Pushchino region, Russia.



 
Похожие работы:

«ШАХТАМИРОВ Иса Янарсаевич КАРИОПАТОЛОГИЯ У ЖИВОТНЫХ В ЗОНАХ СТОЙКИХ ОРГАНИЧЕСКИХ ЗАГРЯЗНИТЕЛЕЙ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении высшего профессионального образования Чеченский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Кравцов Вячеслав Юрьевич Официальные оппоненты :...»

«Визер Александр Михайлович АККЛИМАТИЗАЦИЯ БАЙКАЛЬСКИХ ГАММАРИД И ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ МИЗИД В НОВОСИБИРСКОМ ВОДОХРАНИЛИЩЕ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск - 2006 Работа выполнена в Новосибирском филиале ФГУП Госрыбцентр Западно-Сибирском научно-исследовательском институте водных биоресурсов и аквакультуры (ЗапСибНИИВБАК). Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук Ростовцев Александр Алексеевич...»

«Ефремов Андрей Николаевич ТЕЛОРЕЗ АЛОЭВИДНЫЙ STRATIOTES ALOIDES L. (HYDROCHARITACEAE) В ЮЖНОЙ ЧАСТИ ЗАПАДНО-СИБИРСКОЙ РАВНИНЫ (АНАТОМО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ, ЦЕНОТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ, ПРОДУКТИВНОСТЬ) Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2010 1 Работа выполнена на кафедре ботаники, цитологии и генетики ГОУ ВПО Омский государственный педагогический университет Научный руководитель: доктор...»

«Подсвирова Ирина Александровна Микробиологический мониторинг патогенов гнойновоспалительных заболеваний в хирургических отделениях и отделении реанимации и интенсивной терапии в многопрофильном стационаре 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Москва — 2014 Работа выполнена в ГБОУ ВПО Ставропольский государственный медицинский университет Минздрава Российской Федерации Научные руководители: Миронов Андрей...»

«Красногорова Анастасия Николаевна ДВУСТВОРЧАТЫЕ МОЛЛЮСКИ СЕМЕЙСТВА SPHAERIIDAE ЮЖНОГО, СРЕДНЕГО УРАЛА И ЮГА ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.04. – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск - 2011 Работа выполнена на кафедре медицинской биологии с основами генетики и экологии ГОУ ВПО Омская государственная медицинская академия и кафедре экологии и природопользования ГОУ ВПО Омский государственный педагогический университет Научный...»

«ЗАКС Михаил Михайлович ЭКОЛОГИЯ ЗЕЛЕНЫХ ЛЯГУШЕК (Rana esculenta complex) ПЕНЗЕНСКОЙ ОБЛАСТИ: РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ПОПУЛЯЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ, ВЛИЯНИЕ АНТРОПОГЕННЫХ ФАКТОРОВ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный университет на...»

«ПРОВОРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты Специальность 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации, представленной в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт...»

«Чудаев Дмитрий Алексеевич ДИАТОМОВЫЕ ВОДОРОСЛИ ОЗЕРА ГЛУБОКОГО (МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2014 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Благодаря более чем столетней истории существования одноименной гидробиологической станции, оз. Глубокое считается модельным водоемом для...»

«ХОРОШИХ ЮЛИЯ ИГОРЕВНА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ ИНВОЛЮЦИОННОЙ ХОРИОРЕТИНАЛЬНОЙ ДЕГЕНЕРАЦИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-КЛИНИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ) 14.00.08 – глазные болезни 03.00.25 – гистология, цитология и клеточная биология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук Красноярск - 2007 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Сибирский государственный медицинский...»

«КОЛЕСОВА Мария Анатольевна ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ ОБРАЗЦОВ D-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА AEGILOPS L. К ЛИСТОВЫМ БОЛЕЗНЯМ (ЛИСТОВАЯ РЖАВЧИНА, СЕПТОРИОЗ, ТЕМНО-БУРАЯ ЛИСТОВАЯ ПЯТНИСТОСТЬ) Специальности: 03.00.15 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург - 2007 Диссертационная работа выполнена в отделе иммунитета Государственного научного центра Российской Федерации...»

«ЖУРАВЛЁВА НАТАЛИЯ ИВАНОВНА ИСТОЧНИКИ И СТОКИ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ В АНТРОПОГЕННО ИЗМЕНЕННЫХ ЭКОСИСТЕМАХ (НА ПРИМЕРЕ ИВАНОВСКОЙ И КОСТРОМСКОЙ ОБЛАСТЕЙ) Специальность 03.02.08 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Иваново 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования “Ивановский государственный химико-технологический университет” на кафедре...»

«Федосова Светлана Игоревна ЭКОЛОГО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ВИЗУАЛЬНОЙ СРЕДЫ КРУПНОГО ГОРОДА Специальность: 03.00.16 - Экология 18.00.04 - Градостроительство, планировка сельских населенных пунктов АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва 2008 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Брянская государственная инженернотехнологическая академия Научный...»

«Доманов Трофим Андреевич ЭКОЛОГИЯ КАБАРГИ MOSCHUS MOSCHIFERUS (LINNAEUS, 1758) ХРЕБТА ТУКУРИНГРА 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Иркутск – 2013 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и туризма Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения ВПО Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент, Медведев Дмитрий...»

«ЕГОРОВ Александр Владимирович ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ -МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2004 2 Работа выполнена в лаборатории Инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Долгополова Анастасия Александровна ФИКСАЦИЯ УГЛЕРОДА, НАКОПЛЕНИЕ КРАХМАЛА, ТРАНСПОРТ САХАРОЗЫ И НЕОРГАНИЧЕКОГО ФОСФАТА И ПЕРВИЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ ФОТОСИНТЕЗА Специальность 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. МОСКВА 2004 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор физико-математических наук, Кукушкин профессор Александр Константинович...»

«Непряхина Ольга Константиновна Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : директор НИИ ФХБ им....»

«Галанина Анна Петровна ЭКОЛОГО-ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАСЕЛЕНИЯ ПТИЦ (на примере района ГПКЗ Свияжский) 03.00.16. – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2008 Работа выполнена в Казанском государственном университете на кафедре зоологии позвоночных Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Гаранин Валериан Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Рахимов Ильгизар...»

«ЦИБУЛЬКИНА Елена Арнольдовна ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В КЛЕТКИ-МИШЕНИ 03.00.23 – биотехнология 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова и в лаборатории иммунохимии отдела биологической психиатрии ФГУ Государственного научного...»

«Головина Екатерина Олеговна Петрофитные степи западной части Ононской Даурии 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в Лаборатории географии и картографии растительности Учреждения Российской академии наук Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Сафронова Ирина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«Левицкая Наталья Николаевна Критерии и индикаторы для оценки состояния лесов Московской области Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН Научный руководитель : Черненькова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.