WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ВОЛОСНИКОВА

Екатерина Александровна

ПОЛУЧЕНИЕ КОМПОНЕНТОВ ПОЛИЭПИТОПНОЙ

ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ВИЧ/СПИД

03.01.06 -биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Кольцово-2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Лебедев Леонид Рудольфович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Белявская Валентина Александровна доктор биологических наук Жуков Владимир Александрович

Ведущая организация:

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск).

Защита состоится « 22 » февраля 2012 г. в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел. 8(383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Автореферат разослан « » 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Г.П. Трошкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Уровень заболеваемости СПИДом в мире неуклонно растет. По данным ВОЗ, общее количество заболевших превысило 40 млн.

человек, более 22 млн. уже умерли от СПИДа. Согласно данным Федерального центра по профилактике и борьбе со СПИДом число ВИЧ-инфицированных в России на 2010 г. оценивалось в человек, в том числе 5 227 детей в возрасте до 15 лет. (офиц.сайт Федерального центра СПИД http://www.hivrussia.ru/stat/2010.shtml).

Россия входит в "тройку лидеров" по скорости заражения ранее неинфицированных граждан.

Наиболее подвержены ВИЧ-инфекции дети и молодые люди до лет, которые составляют примерно четвертую часть от общего числа людей, живущих со СПИДом. Поэтому разработка новых подходов для создания эффективной профилактической и терапевтической вакцины против ВИЧ является чрезвычайно актуальной задачей.





Создание эффективной и безопасной вакцины против ВИЧ/СПИД является одной из приоритетных задач современной вакцинологии, что связано с неуклонным ростом заболеваемости СПИД в разных странах мира и РФ. В России важность работ по созданию вакцины против ВИЧ/СПИД подчеркивается Постановлением правительства РФ от 25 декабря 2007 г. № 1905-Р.

К сожалению, многочисленные исследования в области создания высокоэффективной и безопасной вакцины против ВИЧ в мире до сих не увенчались успехом. Разработка анти-ВИЧ-1 вакцины – несомненно, лучший способ контроля за распространением эпидемии ВИЧ-инфекции путем формирования стойкого иммунитета у вакцинированного населения (Fauci A.S., 2008).

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» А.М. Ерошкиным (Eroshkin A.M. et al, 1995) была предложена модель белка-антигена – кандидата для создания вакцины против ВИЧ. Белок TBI содержит четыре Тклеточных эпитопа и пять В-клеточных эпитопов из белков ВИЧ- Env и Gag. Позднее на его основе был создан оригинальный искусственный иммуноген в виде вирусоподобных частиц с дсРНК в центре и белком на поверхности – кандидат в вакцины против HIV-I (Лебедев Л.Р. и др. 2000). Его конструкция являлась по сути субъединичной, сочетая в себе и иммуноген и стимулятор иммунного ответа (индуктор интерферонов – дсРНК). Она обладала хорошей иммуногенностью, вызывала наработку высоких титров антител против ВИЧ с вирус-нейтрализующей активностью.

Дальнейшее совершенствование конструкции привело к идее об использовании в качестве второго компонента ДНК-вакцины (рекомбинантной плазмиды pcDNA-TCI для центрального ядра частиц вместо дсРНК), который бы обеспечивал формирование Т-клеточного иммунного ответа. Т-клеточный иммуноген был разработан С.И.

Бажаном (Bazhan S.I., et al., 2004). Ген TCI кодирует искусственный поли-CTL-эпитопный Т-клеточный иммуноген (TCI, T Cell Immunogen), содержащий более 80 Т-клеточных эпитопов из основных вирусных белков Eng, Gag, Pol, Nef.

Использование данного подхода позволило создать в ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» кандидатную вакцину против ВИЧ/СПИД, названную КомбиВИЧвак. Она не имеет аналогов по структуре белкового и ДНКиммуногенов, составу вакцинной конструкции. Доклинические исследования вакцины КомбиВИЧвак показали ее высокую специфическую активность и безвредность при испытании на животных, и в настоящее время завершена первая стадия клинических испытаний (Разрешение Росздравнадзора МЗиСР РФ на проведение первой фазы клинических испытаний вакцины «КомбиВИЧвак» №133 от 30 марта 2010г.).

Следует отметить, что как белок TBI, так и ДНК-TCI не имеют природных аналогов, являются результатом теоретических исследований и расчетов, проводимых с целью конструирования новых наиболее активных компонентов белковой и нуклеиновой природы, которые при попадании в организм могут сформировать специфический антиВИЧ иммунитет. Информация об их физикохимических свойствах практически отсутствует. Вместе с тем, изучение физико-химических свойств новых рекомбинантных веществ, используемых в вакцине, предоставляет необходимую информацию о молекулярной массе, спектральных характеристиках, об устойчивости активных в иммуногеном отношении компонентов к биодеградации, условиях хранения и т.д. Часть характеристик как для белка TBI, так и для ДНК-TCI были исследованы, но не в полном объеме. Получение новых данных о физико-химических свойствах компонетов (белка TBI и ДНК-TCI) является важной задачей для конструирования вакцины КомбиВИЧвак.





Важной составляющей всего комплекса работ по созданию вакцин на основе биотехнологических компонентов, является разработка способов их получения, очистки, которые должны обеспечить воспроизводимость процесса и высокое качество этих субстанций. От этого зависят специфические иммуногенные свойства вакцины, ее пирогенность и токсичность. Все это, в равной степени, относится к разработке технологических приемов получения высококачественных компонентов: белка TBI и ДНК-TCI, соответствующих требованиям, предъявляемым к генно-инженерных препаратам. Разработанные технологические схемы и способы получения активных компонентов должны быть хорошо воспроизводимы и масштабируемы.

Цель и задачи исследования Цель - усовершенствование и масштабирование технологий выделения и очистки компонентов полиэпитопной кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД. Исследование и оптимизация условий, обеспечивающих воспроизводимость биотехнологических процессов.

В связи с целью исследования необходимо было решить следующие задачи:

Определить оптимальные условия выделения и очистки белка TBI из клеток с целью увеличения выхода целевого белка и его чистоты от примесных компонентов.

2. Исследовать возможности масштабирования процесса получения рекомбинантного белка TBI.

3. Подтвердить воспроизводимость выбранных технологических процессов выделения и очистки белка TBI и охарактеризовать серии белка.

4. Исследовать физико-химические свойства рекомбинантного белка TBI, его конъюгата и вакцинной конструкции.

5. Исследовать процесс конъюгирования. Эмпирически определить количественные соотношения и условия проведения процесса конъюгирования компонентов конструкции: декстрана, белка TBI и положительно заряженных молекул спермидина.

6. Оптимизировать процесс очистки субстанции ДНК плазмиды pcDNA-TCI с целью увеличения ее выхода и чистоты.

Научная новизна и практическая значимость работы усовершенствована схема получения рекомбинантного белка TBI, что позволило сократить количество стадий очистки и себестоимость процесса, а также достичь высокой чистоты и повысить выход целевого белка.

При проведении масштабирования процесса по оптимизированной технологии очистки рекомбинантного белка TBI показана полная идентичность получаемого продукта.

Впервые исследован процесс конъюгирования белка TBI с полимерами и показана возможность получения конъюгатов полисахаридов с белками-антигенами с заранее заданными свойствами и соотношением компонентов.

Впервые проведены физико-химические исследования вакцины и ее отдельных компонетов: изучена температурная и ферментативная устойчивость, сняты спектральные характеристики, показана стабильность вакцинного препарата при хранении. Полученные данные показали неизменность свойств белка при оптимизации и масштабировании процесса выделения.

Полученные сведения о свойствах белка, технологических приемах, контрольных точках и методах контроля вошли в раздел Инструкции по изготовлению и контролю «КомбиВИЧвак». В соответствии с данной инструкцией были наработаны серии белка TBI для изготовления 5 серий вакцины «КомбиВИЧвак», используемых для проведения доклинических и клинических испытаний.

Инструкция использовалась для получения серий белка TBI и для проведения доклинических и клинических испытаний.

Также на основании полученных данных были оформлены СОП:

СОП СТИ № 2.1-055/01-2011 Разрушение биомассы TBI; СОП СТИ № 2.1-057/01-2011 Отмывки, растворение осадка тел включения и восстановление белка TBI;

СОП СТИ № 2.1-056/01-2011 Хроматографическая очистка белка TBI;

СОП СТИ № 2.1-054/01-2011 Ренатурация и получение готовой субстанции белка TBI.

Положения, выносимые на защиту рекомбинантного белка TBI позволяет получать белок высокой чистоты (до 98%) с выходом белка (до 60% от его исходного содержания) и примесью эндотоксина менее 12,5 ЕЭ/дозу.

2. Масштабирование процесса получения рекомбинантного белка TBI позволяет сохранять качество и выход получаемой субстанции белка на высоком уровне.

3. Предложенные параметры процесса конъюгирования позволяют получать конъюгаты полисахаридов с белком TBI с заранее заданными соотношениями компонентов и зарядом.

4. Предложенная технология выделения и очистки субстанции pcDNA-TCI позволяет увеличить выход (до 1мг/1г клеток) и чистоту (до 97%) получаемого плазмидного материала.

Апробация работы Результаты исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: «Молекулярная медицина и биобезопасность». 6-я междунар.конф., 10-11 нояб. г., Москва» (Диплом 2 степени). «Биотехнология: состояние и перспективы развития» 5-й Московский междунар. конгресс, Москва, 16-20 марта 2009 г.». (Диплом 3 степени), Науч.-практ. конф. молодых учных и специалистов Роспотребнадзора, Оболенск, 21-22 апр. г.». «Биотехнология: состояние и перспективы развития: VI Московский междунар. конгресс, 21–25 марта 2011 г.».

Работа выполнена во ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор" Роспотребнадзора в 2009-2011гг. в рамках научных тем организации и по грантам государственных научно-технических программ "Новейшие методы биоинженерии", "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники, подраздел: «Защита от патогенов», по Федеральной Государственной программе “Вакцины нового поколения и диагностические системы будущего”, постановление правительства РФ от 25 декабря 2007 г. № 1905-Р.

Публикации По результатам, полученным в процессе работы, опубликовано статей (из них 4 в реферируемых журналах) и 3 тезисов в сборниках конференций и конгрессов.

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 133 страницах, состоит из разделов: «

Общая характеристика работы

», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Выводы», «Библиографический список» и «Приложения». Работа содержит рисунков, 10 таблиц. Библиография представлена 236 источниками отечественных и зарубежных авторов.

Личный вклад автора Лично соискателем были проведены теоретические расчеты (определение зарядов белка при различных значениях рН, расчет всех этапов процесса при масштабировании) и получена основная часть экспериментальных результатов: выделение и очистка рекомбинантного белка TBI, масштабирование процесса выделения белка, конъюгация белка TBI с полимерами, получение связанных частиц конъюгата белка TBI с дсРНК, выделение и очистка плазмидной ДНК TCI, физико-химические исследования белка TBI, его конъюгата и вакцинной конструкции. Кроме того, соискатель принимал участие в изготовлении 5 серий вакцины КомбиВИЧвак для доклинических и первой фазы клинических испытаний.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Целью исследования являлось усовершенствование и масштабирование технологий выделения и очистки компонентов полиэпитопной кандидатной вакцины против ВИЧ/СПИД, а также исследование и оптимизация условий, обеспечивающих воспроизводимость биотехнологических процессов.

1 Оптимизация способа получения рекомбинантного белка TBI Одним из рекомбинантных белков, созданных для использования в качестве антигена в составе вакцины от ВИЧ, является белок TBI. В обзоре литературы было указано, что он получается биосинтезом в рекомбинантных прокариотических клетках E.coli с последующим выделением и хроматографической очисткой.

Ранее в ГНЦ ВБ «Вектор» была разработана схема очистки белка TBI. Для выделения и очистки белка клетки суспендировали в буферном растворе, разрушали при помощи ультразвука. Было отмечено, что белок TBI при биосинтезе накапливается в клетках в основном в тельцах включения. Тельца включения осаждали центрифугированием и дважды промывали буфером.

В предварительных экспериментах по фракционированию полученного осадка растворами с возрастающими концентрациями мочевины было установлено, что белок TBI растворяется практически полностью при концентрации мочевины в растворе Моль/л.

Извлеченный из телец включения белок чистили хроматографиями на ДЕАЕ-целлюлозе, гель-фильтрацией на сефарозе CL-6B и рехроматографией на колонке с ДЕАЕ-целлюлозой.

Разработанная ранее схема имела ряд недостатков (недостаточная чистота получаемого препарата, отсутствие стандартной методики и т.д.) и требовала оптимизации для получения воспроизводимого и легко масштабируемого процесса.

Для разработки технологии его очистки в первую очередь следовало исследовать его способность растворяться в водных растворах, в растворах с хаотропными агентами. В зависимости от концентрации последних, значений рН и т.д. Кроме того, было необходимо разработать воспроизводимый процесс получения и провести эксперименты по его масштабированию. Для этих целей необходимо было исследовать физико-химические свойства белка: его температурную и ферментативную устойчивость, способность к конъюгации, спектральные характеристики и стабильность при хранении.

С помощью программы PROTEIN CALCULATOR v3. (http://www.scripps.edu/cgi-bin/cdputnam/protcalc3) по аминокислотной последовательности были определены изоэлектрическая точка молекулы белка ее заряд при различных значениях рН. Для белка TBI теоретически рассчитанное значение pI = 5.67, а данные по зарядам представлены в табл.1.

Заряд молекулы TBI при различных значениях рН рН 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 7,50 8,00 8,50 9,00 9,50 10, Заряд +16,6 +10,2 +4,5 +1,4 -0,2 -1,4 -2,3 -3,0 -3,5 -4,1 -5,0 -6,9 -10, Для разрушения клеток их суспендировали в буфере (10 мМ ТрисHCl, рН 8,0) в отношении 1 : 4 по объему и подвергали обработке ультразвуком (УЗДН-2Т, Россия, 22 кГц при максимальной амплитуде) циклами: 1 мин и 5 мин охлаждения в ледяной бане, контролируя чтобы температура суспензии не превышала 8 0С.

Отмывку телец включения проводили трехкратно раствором 20 мМ Триса, рН 8,0 с добавлением Тритона Х-100 до конечной концентрации 0,1 %. Отмытые тельца включения отделяли центрифугированием.

Ранее было отмечено, что белок TBI практически полностью переходил в раствор мочевины при концентрации последней Моль/л. Были проведены эксперименты по изучению распределения суммарных клеточных белков после разрушения клеток в буфере с М мочевиной при различных значениях рН. Из проведенных экспериментов был сделан вывод, что растворимость основной массы клеточных белков увеличивается при повышении значений рН выше 5,4 и при значении рН 9,5 материала в осадке практически не остается.

Тогда как при значениях рН 4,2-5,4 растворе наблюдается в основном полоса белка TBI (рис.1).

Рис.1. Электрофореграмма клеточных белков, растворенных в буфере с 6М мочевиной при различных значениях рН (13%-ный ПААГ, денатурирующие условия) Дорожки: 1-рН 4,2; 2- рН 4,8; 3- рН 5,4; 4- рН 6,0; 5- рН 6,6; 6- рН 7,8; 7рН 8,4; 8- рН 9, К – 5 мкг белка TBI, Л – лизоцим (контроль 14400Д) Из рис.1 видно, что основная масса клеточных белков переходит в раствор при значениях рН выше 5,4, тогда как при значениях рН ниже в растворе наблюдается в основном полоса белка TBI. В аналогичном эксперименте, при экстракции белка раствором мочевины при значении рН 4,8 из отмытых буферным раствором (10мМ Трис, рН 8,0) телец включения чистота его достигала 80% от суммы экстрагированных белков.

Основываясь на теоретически рассчитанных (табл.1) и экспериментальных данных, можно сделать заключение, что наиболее полно белок TBI извлекается из телец включения при рН 4,5 – 4,6 при концентрации мочевины 6 Моль/л. Клеточный дебрис и нерастворившиеся белки отделяли центрифугированием. Практически весь белок TBI при этом находился в растворе мочевины, минимально загрязненный примесными белками.

Таким образом, белок TBI извлекался из телец включения буфером с концентрацией мочевины 6 Моль/л при рН 4,5 – 4,6. Клеточный дебрис и нерастворившиеся белки отделяли центрифугированием.

Практически весь белок TBI при этом находился в растворе мочевины, минимально загрязненный примесными белками. Для освобождения липополисахаридов (эндотоксина) проводили хроматографическую очистку экстракта из телец включения на колонке с ДЕАЕцеллюлозой ДЕ-52 в присутствии мочевины при значении рН ниже изоэлектрической точки белка. После нанесения раствора сорбент промывали тем же буфером, содержащим мочевину (6 Моль/л). Белок TBI, имея положительный заряд (табл.4) при этих значениях рН, не сорбировался и находился в промывочном растворе. При последующей промывке колонки раствором 0,5 М NaCl, с нее элюируется материал, содержащий примеси нуклеиновых кислот и липополисахаридов. Проведение хроматографии при значении рН 5,2-5,4 позволяло получить конечный продукт с чистотой целевого белка до 90 %. Картины оптических профилей хроматографий при разных значения рН представлены на рис.2.

и промывка колонки 0,5 М NaCl и промывка колонки 0,5 М NaCl Профиль хроматографии при рН 4,6 Профиль хроматографии при рН 5, Рис. 2 Сравнение оптических профилей хроматографий (при 280 нм) экстракта телец включения при разных значения рН Как видно из рисунка 2, проведение хроматографии при значении рН 5,2 позволяет отделить более разнообразный пул примесей (нуклеиновые кислоты, фосфолипиды и др.), заряженных отрицательно при этом значении рН. В тоже время, приближение значения рН к изоэлектрической точке белка (pI=5.67) грозит выпадением белка на колонке в осадок. Поэтому для проведения первой хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе было выбрано значение рН 5,2.

Экстракт телец включения, полученный при значении рН 4, подтитровывали 1М раствором Трис до значения рН 5,2.

Для доочистки и концентрирования белка использовали также хроматографию на ДЕАЕ-целлюлозе, но выше изоэлектрической точки белка, при значении рН 8,0 в присутствии мочевины. При этом значении рН белок, имея отрицательный заряд молекулы (табл.1), сорбировался на ДЕАЕ-целлюлозе, и его элюция наблюдалась при концентрации 0,12 – 0,15 М NaCl (анализ фракций проводили при помощи ЭФ в ПААГ в денатурирующих условиях). Фракции, содержащие белок TBI, объединяли и проводили ренатурацию белка.

Для этого раствор разбавляли в два раза раствором NaCl 0,15 Моль/л и перемешивали в течение 3ч при температуре 4 оС. Далее раствор белка тщательно диализовали против физиологического раствора при температуре +4оС и стерилизовали фильтрацией (фильтр с диаметром пор 0,22 мкм).

Выход целевого продукта белка TBI в процессе очистки составлял около 60% от его исходного содержания, чистота белка – не менее 95%. Количественный анализ проводили с использованием компьютерной программы «Gel-pro analyzer, Ver. 3.1». В аналогичных экспериментах по хроматографической очистке белка с использованием катионообменного сорбента (КМ-сефароза) не удалось очистить белок TBI до чистоты выше 90%. Примеси эндотоксина, определенные по (ОФС 42-0062-07 Бактериальные эндотоксины, 2007) менее 25 ЭЕ/мг (менее 1,25 ЭЕ/дозу 50 мкг) (EU «endotoxin units”).

Анализ препарата представлен на рис.3.

Таким образом, в ходе оптимизации технологии получения рекомбинантного белка TBI применялась комбинация из двух хроматографий на ДЕАЕ-целлюлозе при разных значениях рН, что позволило получить высокоочищенный препарат белка. При первой, проводимой при рН 5,2 – 5,4, ниже изоэлектрической точки белка, сорбируются и удаляются примесные нуклеиновые кислоты, липополисахариды и белки, при второй, проводимой при рН 8,0, сорбируется целевой белок и удаляются остальные примеси.

В результате использования для теоретических расчетов компьютерных программ была рассчитана изоэлектрическая точка белка TBI pI (pI = 5,67). На основании экспериментальных данных предложен воспроизводимый способ получения рекомбинантного белка TBI, с помощью которого получены серии высокоочищенного препарата (табл.6). Изучение физических характеристик белка позволило оптимизировать процессы его солюбилизации из телец включения и ренатурации при выделении и очистке. Полученные образцы белка TBI, характеризовались высокой чистотой (более 95%) и гомогенностью, и удовлетворяли требованиям по содержанию эндотоксина для растворов, предназначенных для парентерального введения (5 ЭЕ/кг/час) (Афиногенова Г.Н., 2007).

Сравнительные схемы получения белка TBI по изначальной и оптимизированной технологиям представлены на рис.4.

Изначальная схема получения Оптимизированная схема получения Рис.4 Сравнительная характеристика изначальной и оптимизированной технологий получения рекомбинантного белка TBI Оптимизированная схема получения рекомбинантного белка TBI позволила сократить продолжительность процесса выделения (с 40 до 30 часов) и себестоимость процесса (за счет экономии сорбента Сефароза 6В).

При разработке оптимизированного процесса выделение белка TBI велось из (1±0,5) г клеток. После отработки методики количество биомассы было увеличено до 20 г клеток. Данные по выделению и очистке белка из (20±3) г клеток представлены в таблице 2.

Средние данные по процессу очистки 3-х cерий белка TBI телец включения 20± Содержание целевого белка в пробах определяли при помощи ЭФ в 12%-ном ПААГ (Laemmly W.H., 1970) с последующим сканированием дорожек с использованием компьютерной программы «Gel-pro analyzer, Ver. 3».Результаты анализа 3 серий, полученных по оптимизированной технологии, представлены в табл. 3.

гомогенность масса, кД белку, мг/мл Примеси липопо- LAL-тест, норма 25, 2 Масштабирование процесса получения рекомбинантного белка TBI В ходе разработки и внедрения оптимизированной технологии получения рекомбинантного белка TBI была увеличена загрузка биомассы с (1±0,5) до 23 г. Для отработки процесса масштабирования загрузка биомассы была увеличена до 57 г. В результате проведенного масштабирования показано, что при увеличении объема используемой для выделения биомассы качество и выход получаемого белка сохраняются на высоком уровне.

В результате масштабирования технологического процесса (при загрузке 57 г) получены две серии белка TBI, удовлетворяющие предъявляемым требованиям по содержанию бактериальных эндотоксинов (ГФ XII изд., часть 1, с. 128).

С целью подтверждения идентичности образцов белка TBI, полученных после масштабирования, образцам, выделенным по исходной и оптимизированной технологии, была определена молекулярная масса, проведены спектральные исследования (рис. 5), исследована их устойчивость к температурным (рис. 6) и ферментативным воздействиям.

Полученные результаты позволили установить полное соответствие характеристик образцов белка TBI, полученных по технологиям с различной загрузкой биомассы.

Образцы субстанций были проанализированы согласно методам контроля для медицинских и иммунобиологических препаратов (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996). Значения результатов, представленные в таблице 4, свидетельствуют о соответствии субстанций белка TBI по чистоте, по содержанию примесей клеточных белков и липополисахаридов требованиям для медицинских и иммунобиологических препаратов (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996).

Данные по примесям липополисахаридов и белков штаммапродуцента были получены независимым отделом контроля качества по соответствующим методикам по соответствующим методикам, приведенным в МУК 4.1./4.2.588-96 и ГФ XII изд., ч.1. Данные по пирогенности получены отделом биологических испытаний.

Характеристики образцов белка TBI, полученные по технологиям с исходного содержания целевого белка в клетках вакцины (1д: мкг белка) гомогенность 95% масса, кД тинг Mab к р ВИЧ- ков штамма- 200 нг/мг продуцента препарата липополисахари норма 25, 37С Таким образом, была оптимизирована и масштабирована эффективная технология получения высокоочищенного препарата белка TBI. Отработанный процесс является воспроизводимым и гарантирует получение чистого препарата согласно методам контроля для медицинских и иммунобиологических препаратов (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996).

3 Исследование процессов получения конъюгатов с полисахаридной матрицей биодеградируемый полимер – декстран с молекулярной массой Да (полиглюкин). Для придания молекуле конъюгата положительного заряда использовали спермидин (молекулярная масса 145 Да).

Для получения конъюгатов использовали реакцию Малапрада (М.

р.) (http://www.ximicat.com/info.php?id=3292), которую проводили при комнатной температуре (от 20°С до 25°С). Растворы декстрана и периодата натрия cмешивали в соотношении 1:25 (моль/моль). Через выбранные промежутки времени аликвоты раствора подвергали гельфильтрации на сефадексе G-25 и к активированному декстрану добавляли спермидин либо антиген – белок TBI. О полноте прохождения реакции судили, интерпретируя результаты, полученные с помощью методов гель-фильтрации (на колонке с сефадексом Gи денситометрически с помощью электрофореза (в 12%-ном ПААГ в денатурирующих условиях). Показатель полноты реакции (%) определяли как отношение количества спермидина/белка в составе конъюгата к исходному содержанию компонентов в реакционной смеси.

Было изучено действие основных факторов, оказывающих влияние на процесс образования конъюгатов:

- времени инкубации декстрана с окислителем - соотношения концентраций декстрана и периодата натрия - длительности реакции конъюгирования - количества спермидина, введенного в состав конъюгата Показано, что для получения конъюгата с соотношением на одну молекулу декстрана - одна молекула белка TBI и десять молекул спермидина:

1. оптимальное время активации полисахаридной матрицы (инкубации декстрана с окислителем) для последующего образования конъюгатов составляет 30-60 мин, оптимальное соотношение концентраций компонентов – на 1 декстрана – 20-25 молекул периодата натрия.

2. для образования вирусоподобных частиц с дсРНК соотношение спермидина в конъюгате должно быть не менее молекул на 1 молекулу декстрана.

3. так как скорость реакции конъюгирования спермидина с декстраном выше, чем молекул белка был разработан порядок внесения компонентов в реакционную смесь (для получения конъюгатов заданного состава: на одну молекулу полиглюкина – одна молекула белка TBI и 10 молекул спермидина). Для этого необходимо первоначально к активированной матрице добавлять белок, после мин инкубации вносить спермидин, продолжая инкубацию реакционной смеси еще 120 мин. Согласно выбранным параметрам процесс получения конъюгата белка TBI с полимерами может быть представлен в виде схемы (рис.7).

Рис. 7 Схема образования конъюгата белка TBI с полимерами Полученные конъюгаты по уровню примесей ЛПС соответствуют требованиям для медицинских и иммунобиологических препаратов, вводимых людям (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996).

4 Оптимизация метода получения плазмидной pcDNA-TCI Для извлечения и очистки плазмидного материала отмытые клетки бактерий суспендировали в буфере (50 мМ глюкоза, 25мМ Трис-НСl и 10мМ ЭДТА) в течение 30 мин и добавляли раствор, содержащий 1,5%-ный SDS и 0,4 М NaOH. Все операции лизиса во избежание деградации ДНК плазмиды проводили при 00 С. Полученный раствор содержал значительное количество примесей, особенно РНК. Для деполимеризации последней проводили обработку РНКазой, свободной от ДНКазы.

Был выбран метод фракционирования LiCl. Было исследовано влияние концентрации LiCl на распределение ДНК и РНК. Для этого к аликвотам осветленного лизата клеток, полученного на предыдущей стадии, добавляли LiCl до различных концентраций, инкубировали и суспензии центрифугировали. Надосадочные жидкости и осадки (растворенные в воде) анализировали электрофорезом в 1%-ом геле агарозы. Результаты анализа представлены на рис 8.

Рис.8 Электрофореграмма в 1%-ном геле агарозы образцов препаратов ДНК при высаливании LiCl, дорожки:

0 – исходный материал; 1 –препарат ДНК при 2М LiCl; 2 – препарат ДНК при 3 М LiCl; 3 – препарат ДНК при 4 M LiCl; 4 – препарат ДНК при 5M LiCl Из рис. 8 видно, что ДНК плазмиды наблюдается во всех надосадочных фракциях. Тогда как в осадке она обнаруживается при концентрациях LiCl 4 Моль/л и больше. В то же время пул низкомолекулярной РНК в надосадочной фракции при концентрации LiCl 3 Моль/л значительно снижается. В дальнейшем, для фракционирования, использовали концентрацию соли 3 Моль/л. На этом этапе можно достичь содержания плазмидной ДНК в препарате до 15-20 %.

Для тонкой очистки плазмидной ДНК использовали гельфильтрацию на колонке с сефарозой CL-2B. Причем препарат наносили в солевом растворе LiCl для предотвращения возможных «залипаний» положительно заряженных примесей на молекулы ДНК.

Типичный профиль хроматографии при длине волны 260 нм представлен на рис.9.

В результате был разработан процесс очистки плазмидной ДНК со следующими стадиями:

- лизис клеток щелочью с одновременной депротеинизацией ДСН, - низкоскоростное центрифугирование для удаления клеточных обломков и значительной части белков, - концентрирование нуклеотидного материала 67%-ным раствором этанола, - разрушение примесной РНК РНКазой, свободной от ДНКаз - осаждение РНК 3М раствором LiCl, - очистка хроматографией на колонке с сефарозой CL-2B.

Процесс позволяет получать препарат высокоочищенной плазмидной ДНК pcDNA-TCI с выходом 1-2 мг из г влажных клеток (в зависимости от исходного содержания плазмиды в клетках).

рестрикционного анализа очищенной плазмиды плазмиды, гидролизованные рестриктазой VspI; 3 – Как видно на рис. 10 полученный препарат плазмидной ДНК по данным рестрикционного анализа идентичен исходной ДНК pcDNATCI.

В процессе экспериментов была разработана технология получения фармацевтических целей. Наработаны образцы препарата pcDNA-TCI, которые использовались для проведения экспериментальных моделей сборки вакцинной конструкции.

Образцы препарата pcDNA-TCI, полученные по данной технологии, для изготовления серий вакцины «КомбиВИЧвак» не использовались. Препараты pcDNA-TCI, использованные для получения серий вакцины «КомбиВИЧвак» для доклинических и клинических испытаний, получены по технологии, приведенной в заявке на изобр. № 2009112677, от 06.04.2009 г.

5 Получение вакцинной конструкции Сбор вакцинной конструкции «КомбиВИЧвак» проводили в стерильном боксе. Объемы растворов конъюгата белка TBI и плазмидной ДНК TCI рассчитывали, исходя из значений на дозу препарата вакцины объемом 200 мкл: 50 мкг белка и 75 мкг ДНК.

Раствор конъюгата белка пропускали через стерильный фильтр, затем через этот же фильтр пропускали половину раствора хлорида натрия 0,9 %. Далее фильтрующую насадку меняли и через новую насадку по каплям в полученный раствор вносили плазмидную ДНК TCI. Затем через этот же фильтр пропускали оставшуюся часть раствора хлорида натрия 0,9 %. Раствор при смешивании компонентов постоянно перемешивали и затем добавляли 50 % от общего конечного объема раствора 10 %-ный раствор реополиглюкина. Отбирали аликвоты для определения стерильности препарата вакцины и содержания в нем белка TBI. Раствор вакцинного препарата передавали на стадию стерильного розлива в ампулы.

В предыдущих работах предлагалось для получения вакцинной конструкции использовать гель-фильтрацию на колонке с 6В Сефарозой, но исследование процесса образования вакцинной конструкции плазмидной ДНК TCI с белком TBI, по расчету вносимых компонентов и их соотношений, показали, что можно отказаться от этой стадии без ущерба для качества получаемой конструкции вакцины. При этом происходит экономия реактивов (сорбента 6В Сефарозы) и времени на проведение процесса сборки вакцины.

Полученные в ходе работы серии препаратов вакцины были использованы для доклинических испытаний. Все полученные серии удовлетворяли требованиям, предъявляемым к медицинским и иммунобиологическим препаратам (МУК 4.1./4.2.588-96, 1996).

6 Исследования физико-химических свойств рекомбинантного белка TBI в виде монопрепарата, в составе конъюгата и вакцинной конструкции Ранее в разделе 1 уже были рассмотрены основные физикохимические свойства белка TBI. При конъюгировании белка с полимерами и дальнейшей сборке вакцинной конструкции могли произойти изменения в структуре белка. Также необходимо было убедиться в том, что полученные препараты удовлетворяли требованиям НД.

Проведен ряд экспериментов по устойчивости к протеазам белка TBI, а также его конъюгата и вакцины. Показано, что при обработке образцов белка TBI, конъюгата и вакцины трипсином наблюдается идеинтичный трипсинолиз во всех образцах.

Проведены спектральные исследования:

рекомбинантного белка TBI, а также его конъюгата и вакцины образцов вакцины КомбиВИЧвак, смеси препаратов белка и ДНК, белка, ДНК и реополиглюкина (РПГ) в эквивалентных количествах.

В ходе проведенных спектральных исследований было установлено, что спектры вакцинной конструкции значительно отличаются от спектров белка TBI и его конъюгата, а также от спектров смеси белка и ДНК и реополиглюкина (РПГ), взятых в эквивалентных количествах. Это свидетельствует об образовании связей в вакцинной конструкции между компонентами.

По данным исследований структуры КомбиВИЧвак и ее компонентов методом КД-спектроскопии был сделан вывод о том, что спектры основных компонентов вакцины в ее составе остаются характерными для их свободного состояния, что свидетельствует о неизменности их структуры.

С целью подтверждения результатов полученных спектров образцы препаратов были исследованы в 1 %-ном геле агарозы (рис.12). О подвижности вакцинной конструкции судили по продвижению ДНК в 1 %-ном геле агарозы. На элетрофореграмме видно, что вакцинная конструкция имеет меньшую подвижность, чем pcDNA-TCI в смеси компонентов, что свидетельствует об образовании частиц вакцинной конструкции и их большей молекулярной массе по сравнению с исходной pcDNA-TCI.

Проведено исследование сохранности конструкции вакцины и плазмидной ДНК в ее составе после ее хранении в течение двух лет.

Для эксперимента были взяты серии вакцины, которые использовались для проведения доклинических испытаний. Было показано, что вакцина КомбиВИЧвак после хранения в течение 2-х лет сохраняет свою структуру.

Рис.12 Электрофореграмма в 1%-ном геле агарозы образцов вакцины КомбиВИЧвак, смеси препаратов белка и ДНК, М-маркеры молекулярных масс (1000-10000 п.н.) На электрофореграмме было видно, что ДНК в вакцинной конструкции была гомогенной и сохраняла меньшую подвижность, чем ДНК плазмиды pcDNA-TCI. Это свидетельствует о сохранении структуры частиц вакцинной конструкции и их большей молекулярной массе по сравнению с исходной pcDNA-TCI.

ВЫВОДЫ

1. Усовершенствован процесс очистки белка-антигена TBI.

Представленный способ очистки представляет собой две последовательные хроматографии на одном сорбенте при значениях рН ниже и выше изоэлектрической точки молекул белка. В усовершенствованном технологическом процессе сокращено количество хроматографических стадий (с 3-х до 2-х) и их продолжительность. Оптимизированный процесс позволил достичь высокой чистоты (до 96%) и выхода белка (до 60% от его исходного содержания).

2. Проведенное масштабирование технологического процесса показало, что при увеличении объема используемой для выделения биомассы, качество (чистота до 96%) и выход (до 60% от его исходного содержания) получаемой субстанции белка сохраняются на высоком уровне. Идентичность образцов белка TBI, полученных при масштабировании, образцам, полученным по исходной технологии, была подтверждена путем определения молекулярной массы, спектральных характеристик, устойчивости к температурным и ферментативным воздействиям.

3. При исследовании процесса образования трехкомпонентных конъюгатов впервые установлено, что, варьируя количеством образующихся активных групп при активации декстрана, последовательностью внесения компонентов (белка-антигена и спермидина), длительностью реакций конъюгирования, можно получать конъюгаты полисахаридов с белками-антигенами с заранее заданными свойствами по молярному соотношению и заряду.

4. Разработан процесс выделения и очистки субстанции pcDNATCI для центрального ядра молекулярной конструкции. В результате корректировки процесса удалось увеличить выход (до 1мг/1г клеток) и чистоту (до 97%) получаемого препарата pcDNA-TCI.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

По результатам, полученным в процессе работы, опубликовано статей (из них 4 в реферируемых журналах) и 3 тезисов в сборниках конференций и конгрессов.

1. E.A. Volosnikova, N.I. Akulova, Ya.S. Gogina, G.M. Levagina, Y.K. Mikhailova, L.R. Lebedev, V.F. Podgornyi, Yu.V. Telegina.

Development of technology for purification of plasmid DNAs for pharmaceutical purposes // Applied Biochemistry and Microbiology. – 2010.-№9. – pp.59 – 64.

2. Волосникова Е.А., Акулова Н.И., Гогина Я.С., Левагина Г.М., Михайлова В.К., Лебедев Л.Р., Подгорный В.Ф., Телегина Ю.В.

Разработка технологии очистки плазмидной ДНК для фармацевтических целей // Биотехнология.- 2010.-№2.- С.59-64.

3. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н.И. Очистка рекомбинантного белка TBI – антигена ВИЧ// Биотехнология. - 2010. С.65-68.

4. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Каплина О.Н., Карпенко Л.И., Акулова Н.И., Рослякова Е.Ю. Иммунологическая характеристика вакцины КомбиВИЧвак против ВИЧ/СПИД. Совершенствование способов получения // Вест. Урал. мед. академ. науки. - 2010. - №2\ (29). - С. 245. – (Тематич. вып. по аллергологии и иммунологии).

5. Волосникова Е.А. Исследование процесса образования конъюгатов для создания вакцинных конструкций// Бюллетень Сибирского отделения Российской академии медицинских наук. – 2011. – Т.31. - №6. – С.141-145.

6. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р., Акулова Н.И., Рослякова Е.Ю. Очистка рекомбинантного белка TBI как компонента ресурс]//Биотехнология и биомедицинская инженерия: Сб. тр. 3-й Всерос. науч.- практич. конф. с междунар. участием, посвящнной 75летию Курского мед. ун-та/под ред. проф. В.А. Лазаренко [и др.] – Курск, 2010.- С. 45-47.

7. Волосникова Е.А., Лебедев Л.Р. Усовершенствование процесса очистки рекомбинантного белка TBI – компонента вакцины против ВИЧ//Биотехнология в интересах экологии и экономики Сибири и Дальнего Востока: Сб. тр. 1-й Всерос. науч.- практич. конф.

– Улан-Удэ, 2010.- С. 170-172.

8. Волосникова Е.А., Карпенко Л.И., Бажан С.И., Лебедев Л.Р., Масычева В.И., Ильичев А.А., Нечаева Е.А., Дроздов И.Г., Онищенко Г.Г. Биотехнологические аспекты создания нановакцины против ВИЧ КомбиВИЧ вак.// Биотехнология: состояние и перспективы развития:

5-й Московский междунар. конгресс, Москва, 16-20 марта г.:Материалы конгресса.-М.,2009.-ч.1.- С.220-221.- На англ.яз.//Там же.- С.221.

Биотехнологические подходы к очистке рекомбинантного белка TBI// «Молекулярная медицина и биобезопасность». 6-я междунар.конф., 10-11 нояб. 2009г., Москва: Сб. материалов, науч. программа, тез.- М., 2009.- С.57-59.

Характеристика препарата рекомбинантного белка TBI - компонента //"Биотехнология: состояние и перспективы развития: VI Московский междунар. конгресс, 21 – 25 марта 2011г.: Материлы конгресса – М., 2011. – Ч.1. – С.437-438. – То же на англ. языке. – С. 438.

Список использованных сокращений АТ – антитела АГ – антиген а. о. – аминокислотный остаток ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВИЧ-1 – вирус иммунодефицита человека первого типа ВИО – вирус иммунодефицита обезьян ВОЗ – всемирная организация здравоохранения ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота дсРНК – двуспиральная рибонуклеиновая кислота ИФА – иммуноферментный анализ НД – научная документация ООН – организация объединенных наций п. н. – пар нуклеотидов ПЦР – полимеразная цепная реакция ПААГ – полиакриламидный гель СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита TBI – Т- и В-клеточный иммуноген TCI – Т-клеточный иммуноген ФСБ – фосфатно-солевой буфер ФСП - фармакопейная статья предприятия ЦТЛ – цитотоксические Т-лимфоциты ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота ЭФ – электрофорез MVA – Modified Vaccinia virus Ankara В работу вошли результаты совместных исследований с Акуловой Н.И., Даниленко Е.Д., Карпенко Л.И., Кашперовой Т.А., Лебедевым Л.Р., Левагиной Г.М., Масычевой В.И., Михайловой В.К., Орешковой С.Ф., Подгорным В.Ф., Росляковой Е.Ю., Телегиной Ю.В.

Автор выражает благодарность коллегам, принимавших участие в проведении данных исследований и внедрении их результатов.



 
Похожие работы:

«ДУХОВЛИНОВА Елена Николаевна ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНА env ШТАММОВ ВИЧ-1, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ГРУППАХ РИСКА В САНКТПЕТЕРБУРГЕ 03.01.04 – Биохимия 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена в лаборатории негосударственного научноисследовательского учреждения Биомедицинский центр, Санкт-Петербург. Научный руководитель - доктор...»

«ЕГОРОВ Александр Владимирович ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ -МАННАНОВ СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2004 2 Работа выполнена в лаборатории Инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ЛЕВЧЕНКО Тимофей Викторович ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ ПЧЕЛ (HYMENOPTERA: APOIDEA) МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.05 – энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Чернышев Владимир Борисович доктор биологических наук Песенко Юрий Андреевич...»

«ТРУШКОВА Марина Александровна СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЛАНДШАФТАХ РАЗЛИЧНОГО РАНГА (на примере Нижегородского Поволжья) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 2 Работа выполнена на кафедре зоологии и общей биологии естественно-географического факультета ГОУ ВПО Нижегородский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических...»

«Хутакова Светлана Владимировна ГИДРОМОРФНЫЕ ПОЧВЫ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА Специальность 03.00.27 - почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2007 Работа выполнена на кафедре почвоведения и агрохимии ФГОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Р. Филиппова Научный руководитель : доктор биологических наук Убугунова Вера Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Бадмаев...»

«СИТНИКОВА Татьяна Яковлевна ПЕРЕДНЕЖАБЕРНЫЕ БРЮХОНОГИЕ МОЛЛЮСКИ (GASTROPODA: PROSOBRANCHIA) БАЙКАЛА: МОРФОЛОГИЯ, ТАКСОНОМИЯ, БИОЛОГИЯ, ФОРМИРОВАНИЕ ФАУНЫ 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург - 2004 Работа выполнена в Лимнологическом институте Сибирского отделения РАН, г. Иркутск Научные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, зав. каф. Круглов...»

«Татаринова Ольга Николаевна Конструирование белок-нуклеиновых комплексов для направленного транспорта в клетки чужеродной ДНК 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научноисследовательском институте физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства России Научные руководители: доктор химических наук, доцент Позмогова...»

«Алексеева Анна Юрьевна ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научный руководитель : Вейко Наталья Николаевна доктор биологических наук Официальные...»

«ЕЛИЗАРЬЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИКА ЮЖНОГО УРАЛА OXYTROPIS GMELINII FISCH. EX BORISS. (FABACEAE) В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 2 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности в Учреждении РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный...»

«МИХАЙЛОВА Валерия Вадимовна Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Д. И.Левицкий Официальные оппоненты : доктор биологических наук С.Ю....»

«Непряхина Ольга Константиновна Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : директор НИИ ФХБ им....»

«Трошева Татьяна Дмитриевна АНТИФУНГАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА И ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ГРИБОВ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности Российской академии наук (НИЦЭБ РАН) в...»

«ФИЛИППЕНКО Дмитрий Павлович ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ МОЛЛЮСКОВ ЭСТУАРНЫХ ВОДОЕМОВ ЮГО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград – 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Калининградский государственный технический университет Научный руководитель : доктор биологических наук Науменко Елена Николаевна Официальные оппоненты : Никитина Светлана Михайловна доктор биологических...»

«СЛУЧАНКО Николай Николаевич ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ, ИМИТИРУЮЩИХ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ БЕЛКА 14-3-3, НА ЕГО СТРУКТУРУ И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель :...»

«ЕФРЕМЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 03.00.02 – биофизика 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный консультант : Варфоломеев Сергей Дмитриевич, доктор...»

«Цындыжапова Наталья Данзановна ПТИЦЫ ОЗЕРНО-БОЛОТНЫХ КОМПЛЕКСОВ АНТРОПОГЕННЫХ ЛАНДШАФТОВ ЮЖНОГО ПРЕДБАЙКАЛЬЯ 03.00.16. – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2009 1 Работа выполнена на кафедре биологии зверей и охраны природы Иркутской государственной сельскохозяйственной академии доктор биологических наук, доцент Научный руководитель Саловаров Виктор Олегович доктор биологических наук, профессор Официальные...»

«МАКАРИКОВА Татьяна Анатольевна ЦЕСТОДЫ СЕМЕЙСТВА HYMENOLEPIDIDAE PERRIER, 1897 (CYCLOPHYLLIDEA) РУКОКРЫЛЫХ ВОСТОЧНОЙ АЗИИ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории паразитологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Гуляев Владимир Дмитриевич...»

«Суханова Ирина Васильевна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНЫХ СООБЩЕСТВ ВОДОЕМОВ В УСЛОВИЯХ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ (НА ПРИМЕРЕ Г. ТОМСКА) 03.00.16. – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск - 2007 Работа выполнена на кафедре экологического менеджмента ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Адам Александр Мартынович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор...»

«Тимошкина Ольга Александровна ВЛИЯНИЕ ВЫРУБОК И КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫЖИГАНИЯ ПОРУБОЧНЫХ ОСТАТКОВ НА СООБЩЕСТВА ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ПТИЦ ВОСТОЧНОГО САЯНА) 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2004 Работа выполнена на кафедре охотничьего ресурсоведения и заповедного дела Красноярского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Соколов...»

«Емельянов Алексей Валерьевич ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ МОНИТОРИНГА И УПРАВЛЕНИЯ РЕСУРСАМИ ОБЫКНОВЕННОГО БОБРА (CASTOR FIBER LINNAEUS, 1758) В БАССЕЙНАХ СРЕДНИХ РЕК 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов – 2013 1 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского на кафедре морфологии и экологии животных и в ФГБОУ ВПО Тамбовский государственный...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.