WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«Эволюция высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) в экосистемах Северной Евразии (2005–2009 гг.) ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Щелканов Михаил Юрьевич

Эволюция высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1)

в экосистемах Северной Евразии (2005–2009 гг.)

Автореферат диссертации

на соискание учёной степени доктора биологических наук

03.02.02 – вирусология

Научный консультант:

академик РАМН, д.м.н., профессор Д.К. Львов Москва, 2010 2

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научноисследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.

Научный консультант: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Дмитрий Константинович Львов

Официальные оппоненты: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Николай Вениаминович Каверин академик РАМН, доктор биологических наук, профессор Олег Иванович Киселёв доктор медицинских наук, профессор Юрий Захарович Гендон

Ведущая организация: Учреждении Российской академии медицинских наук научноисследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф. Гамалеи РАМН

Защита состоится «_» _ 2010 г. в _ часов на заседании Диссертационного Совета Д 001.020.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: Москва, 123098, ул. Гамалеи, д. 16, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Автореферат разослан « » _ 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 001.020. Доктор медицинских наук Елена Ивановна Бурцева

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

1.1. Актуальность проблемы.

Вирусы гриппа А (Orthomyxoviridae 1, Influenza A virus), обладающие высокой степенью изменчивости генома, являются этиологическими агентами опасных инфекционных заболеваний человека и животных, способных протекать в форме обширных эпизоотий, эпидемий и пандемий с высокой смертностью [Львов Д.К., 1974, 2010; Сергеев В.А., 1983;

Киселёв О.И., 2003; Малеев В.В., 2006; Гендон Ю.З., 2008; Каверин Н.В., 2008].

Геном вируса гриппа А представлен 8 сегментами РНК негативной полярности:

[PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M, NS]. Описаны 16 типов НА (Н1–16) и 9 типов NA (N1–9). Из 144 теоретически возможных субтипов – комбинаций типов НА и NA – в настоящее время, известны 115 (79.9 %). Развитие молекулярно-генетических методов привело к накоплению большого количества полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома, классификация которых позволила выделить отдельные генотипы для каждого сегмента [Lu G., 2007] – PB2: A–C, E–L (11 генотипов); PB1: A–I (8 генотипов); PA: A–K (11 генотипов);





НА: Н1: A–D (4 генотипа); H2: A–I (9 генотипов); H3: A–D, F (5 генотипов); H4: A–C (3 генотипа); H5: A–C, E–K (10 генотипов); Н6: A–G (7 генотипов); H7: A–F (6 генотипов);

H8: A (1 генотип); H9: A–C, E–G, I, J (8 генотипов); H10: A–E (4 генотипа); H11: A–C (3 генотипа); Н12: A, B (2 генотипа); H13: А–C (3 генотипа); Н14: А (1 генотип); Н15: А (1 генотип); Н16: А, В, С (3 генотипа) (итого для НА: 16 подтипов, 70 генотипов); NP: A–H (8 генотипов); NA: N1: A–L (12 генотипов); N2: A–G (7 генотипов); N3: A–D, F (4 генотипа);

N4: A–C (3 генотипа); N5: B–D (3 генотипа); N6: A–E (5 генотипов); N7: A–G (7 генотипов);

N8: A–C (3 генотипа); N9: A, B (2 генотипа) (итого для NA: 9 подтипов, 46 генотипов); М: A–G (7 генотипов); NS: подтип 1: A–F (6 генотипов); подтип 2: A, B, D (3 генотипа) (итого для NS:

2 подтипа, 9 генотипов).

Природным резервуаром вируса гриппа А являются птицы водно-околоводного экологического комплекса – в первую очередь, подсем. речных уток (Anatinae Leach, 1820) сем. утиных (Anatidae Leach, 1820), а также сем. чайковых (Laridae Rafinesque, 1815) и крачковых (Sternidae Vigors, 1825). Из 115 известных, на сегодняшний день, субтипов вируса гриппа А, 114 (99.1 %) изолированы от диких птиц. Современные молекулярно-генетические методы предоставляют всё больше информации о механизмах адаптации птичьих вариантов вируса к новым хозяевам. Поэтому грипп А следует рассматривать как зооантропонозную инфекцию [Львов Д.К., 1974, 2006; Webster R.G., 1976, 1992; Laver W.G., 1979;

Lvov D.K., 1987, 2008]. Преодолевая межвидовые барьеры, вирусы гриппа А способны проникать в популяции новых потенциальных хозяев, адаптироваться и циркулировать среди них достаточно продолжительное время.

Варианты вирусов гриппа А птиц, имея аффинность рецептор-связывающего сайта НА к 2’-3’-сиаловым кислотам, поражают, главным образом, эпителий кишечника птиц [Гамбарян А.С., 2007]. Инфекция слабовирулентными (LPAI – low pathogenic avian influenza) Семейство Orthomyxoviridae, в настоящее время, включает 5 родов: Influenza A virus (прототип – вирус гриппа А);

Influenza B virus (вирус гриппа B); Influenza C virus (вирус гриппа C); Thogotovirus (вирус Тогото); Isavirus (вирус инфекционной анемии лососевых) [Kawaoka Y., 2005].

вариантами этого вируса может протекать инаппарантно, в форме энтерита.

Высоковирулентные (HPAI – highly pathogenic avian influenza) варианты, связанные с подтипами НА / Н5 и НА / Н7, вызывают системное заболевание – классическую чуму птиц (КЧП) – при котором ведущими симптомами являются поражение нервной и сосудистой систем [Perroncito E., 1878; Сюрин В.Н., 1998]. Молекулярным маркёром HPAI-фенотипа является обогащение сайта протеолитического нарезания НА базофильными аминокислотными остатками [Alexander D.J., 1986]. КЧП способна вызвать обширные эпизоотии с уровнем падежа, приближающимся к 100 %. По мере роста численности людей и поголовья сельскохозяйственных птиц, такие эпизоотии становятся всё более масштабными, увеличивая риск преодоления вирусом межвидового барьера и формирования нового пандемического варианта [Львов Д.К., 1972, 1974, 2005; Сюрин В.Н., 1972; Webster R.G., 1976;





Lvov D.K., 1987, 2008].

Варианты вирусов гриппа А, адаптированные к млекопитающим, имея аффинность рецептор-связывающего сайта НА к 2’-6’-сиаловым кислотам, поражают эпителий слизистой оболочки верхних отделов респираторного тракта, в результате чего происходит дегенерация, некроз и отторжение пораженных клеток трахеи и бронхов [Гамбарян А.С., 2007;

Львов Д.К., 2010]. Однако главным звеном в патогенезе гриппа А является поражение сосудистой и нервной систем, возникающее вследствие токсического действия вируса и стимулирования образования активных форм кислорода. Нарушение микроциркуляции является причиной возникновения геморрагических проявлений – от носовых кровотечений до геморрагического отека лёгких и кровоизлияний в вещество головного мозга [Киселёв О.И., 1994; Колобухина Л.В., 2001; Чучалин А.Г., 2006]. Вирусы гриппа А являются этиологическими агентами эпизоотической бронхопневмонии свиней; гриппа и тяжёлых пневмоний, осложнённых бактериальными коинфекциями, человека; заразного катара верхних дыхательных путей лошадей; заразного кашля верблюдов; эпизоотических бронхопневмоний морских млекопитающих [Горбунова А.С., 1973; Сюрин В.Н., 1998; Львов Д.К., 2005;

Колобухина Л.В., 2008].

Вирусы гриппа А занимают важное место в структуре заболеваемости людей острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ), составляющими до 90 % от всех других инфекционных болезней [Гендон Ю.З., 2001; Киселёв О.И., 2003]. По данным Всемирной Организации здравоохранения (ВОЗ), только тяжёлыми формами гриппа в мире ежегодно заболевают 3–5 млн. человек. Заболеваемость гриппом в РФ – 25–35 млн., из них 45–60 % – дети. Экономический ущерб РФ от сезонного эпидемического гриппа составляет, в среднем, 80 млрд. руб. / год, или порядка 85 % экономических потерь от инфекционных болезней в целом [Онищенко Г.Г., 2002, 2006]. Гриппозная инфекция играет важную роль в обострении хронических заболеваний и развитии осложнений, нередко являющихся причиной смерти больных: показано, что наличие хронических сердечно-сосудистых или лёгочных заболеваний повышает риск летального исхода при гриппе в 50–100 раз [Киселёв О.И., 1994;

Колобухина Л.В., 2008].

В период пандемий заболеваемость и смертность от гриппа А приобретают катастрофические масштабы стихийного бедствия. Например, пандемия «испанки» (1918– 1919 гг.; прототип – A/Brevig Mission/1/18 (H1N1) [A, A, A, 1A, A, 1A, B, 1A]) привела к заражению 600 млн. и гибели 50–100 млн. (т.е. 30 % и 5 % населения Земли, соответственно).

Пандемия «азиатского гриппа» (1957–1959 гг.; прототипный штамм – A/Singapore/1/57 (H2N2) [A, E, B, 2A, A, 2A, B, 1A]) стала причиной гибели более 1 млн.; пандемия «гонконгского гриппа» (1968–1970 гг.; A/Hong Kong/1/68 (H3N2) [A, D, B, 3A, A, 2A, B, 1A]) – около 1 млн.;

крупная эпидемия «русского гриппа» (1977–1978 гг.; A/USSR/90/77 (H1N1) [A, A, B, 1B, A, 1A, B, 1A]) – около 300 тыс. человек [Гендон Ю.З., 1998; Супотницкий М.В., 2006]. Современная пандемия «свиного гриппа» (2009–2010 гг.; A/California/07/09 (H1N1) swl [C, D, E, 1B, A, 1F, F, 1A]), на конец марта 2010 г., по данным ВОЗ, стала причиной более 17 тыс. смертей, потребовала масштабных затрат и усилий международного сообщества на проведение противоэпидемических мероприятий [Львов Д.К., 2010; Цыбалова Л.М., 2010].

Вероятность преодоления вирусом межвидового барьера резко возрастает в период обширных эпизоотий. В частности, пристальное внимание исследователей привлекает современная эпизоотия HPAI / H5N1, которая началась ещё в 1997 г. в Юго-Восточной Азии.

Прототипным штаммом для первой волны эпизоотии 1997 г. стал A/chicken/HK/258/97 (H5N1) [G, G, E, 5J, F, 1G, F, 1E] (т.н. генотип 0, или H5J 0). Этот штамм сформировался в результате множественных реассортаций: источником НА стал A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) [K, G, D, 5J, F, 1J, F, 2A]; NA – A/teal/HK/W312/97 (H6N1) [G, G, E, 6B, F, 1G, F, 1E]; внутренних генов – A/teal/HK/W312/97 (H6N1) и A/quail/HK/G1/97 (H9N2) [G, G, E, 9B, F, 2E, F, 1E] [Guan Y., 1999; Hoffmann E., 2000]. Вторая волна эпизоотии началась в 1999–2000 г., когда произошли новые реассортации, в которых участвовали A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1) и A/duck/HK/Y280/97 (H9N2) [K, G, E, 9C, F, 2B, F, 1E], и сформировались HPAI / H5N1 / 01, принадлежащие реассортационным генотипам A–E [Guan-02, Hatta-01] (не следует путать их с НА-генотипами линии H5J). Третья волна эпизоотии была предсказана отечественными исследователями [Lvov D.K., 2004] осенью 2001 г., когда в популяциях диких птиц Дальневосточно-Притихоокеанского миграционного русла была обнаружена аномально высокая интенсивность циркуляции вирусов гриппа А (Н5). Осенью 2003 г. эпизоотия HPAI / H5N1 охватила Юго-Восточную Азию, и мы стали готовиться к проникновению вируса в Северную Евразию (сформулировав, в частности, цели и задачи настоящей работы). Весной 2005 г. HPAI / H5N1 проник на юг Западной Сибири и осенью того же года вдоль миграционных путей диких птиц – на п-ов Индостан, в Европу, Среднюю Азию, Закавказье, Ближний Восток и в Африку. Весной 2008 г. вирус завершил захват Северной Евразии, проникнув в её восточный сектор.

Распространение HPAI / H5N1 на территории Старого Света может иметь катастрофические последствия в случае появления у этого вируса эпидемического потенциала, так как, во-первых, у человечества отсутствует коллективный иммунитет к вирусам гриппа А (Н5), а во-вторых, из 467 людей, заболевших в результате заражения HPAI / H5N1 за 2003–2009 гг., 282 умерли, т.е. летальность достигает 60 % [www.who.int].

Поскольку Северная Евразия является крупнейшим гнездовым ареалом птиц воднооколоводного экологического комплекса, где происходят интенсивные межвидовые взаимодействия в системе «вирусы гриппа А – дикие и домашние птицы – млекопитающие», а также активная амплификация вирусных вариантов в неиммунных популяциях сеголетних птиц, изучение эволюции HPAI / H5N1 на данной территории представляет не только фундаментальный, но и несомненный научно-практический интерес.

1.2. Цель исследования: изучение эволюции HPAI / H5N1 в процессе популяционных взаимодействий вируса, диких и домашних животных на основе комплексного экологовирусологического мониторинга в экосистемах Северной Евразии.

Работа выполнялась в соответствие с планом НИР «Популяционные взаимодействия в системе:вирусы гриппа - человек – животные» (госрегистрация № 0120.0 603538) и «Новые и возвращающиеся вирусные инфекции в системе биобезопасности государства»

(госрегистрация № 0120.0 603544) НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

1.3. Задачи исследования:

изучить характеристики циркуляции различных вариантов вируса гриппа А в высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1);

установить и обосновать схемы проникновения HPAI / H5N1 в экосистемы изучить экологические, фенотипические и молекулярно-генетические характеристики, установить корреляции между гено- и фенотипом вариантов HPAI / H5N1, получивших распространение в Северной Евразии;

выяснить пути распространения и схемы циркуляции HPAI / H5N1 на территории 1.4. Научная новизна работы заключается в том, что впервые были проанализированы причины и последствия проникновения вариантов HPAI / H5N1 – с полными генотипами [K, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1E] и [K, G, D, 5J 2.3.2, F, 1J, F, 1E] – в Северную Евразию, описан процесс их распространения и молекулярной эволюции. Это стало возможным благодаря включению современных молекулярно-генетических методов в технологическую цепочку экологовирусологических исследований, что также имеет инновационное значение: удалось интегрировать результаты экологических, вирусологических и молекулярно-генетических данных в единый комплекс, позволяющий вырабатывать достоверные среднесрочные прогнозы развития эпизоотии высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) в экосистемах Северной Евразии.

Впервые удалось добиться регулярного оперативного – в течение нескольких дней – получения молекулярно-вирусологических данных в ходе расшифровки эпизоотических вспышек HPAI / H5N1 в экосистемах Северной Евразии.

Разработаны новые высокоэффективные модели инфекции, вызванной HPAI / H5N1, в культурах клеток различного происхождения in vitro для разработки диагностических, лечебных и профилактических препаратов. Получен патент РФ № 2309983 (приоритет от 25.11.2005 г.) «Метод первичной изоляции штаммов вируса гриппа А, штамм virus A/duck/Novosibirsk/56/05 (H5N1) для приготовления диагностических и профилактических препаратов, для оценки противовирусной активности различных соединений». С помощью этих моделей получены приоритетные данные о резистентности и чувствительности к действию ряда противогриппозных препаратов вариантов HPAI / H5N1, получивших распространение в экосистемах Северной Евразии.

Впервые рекомендованы производственные штаммы HPAI / H5N1, один из которых был использован для разработки и крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины.

1.5. Практическая ценность работы.

Показано, что в период 2001–2005 гг. HPAI / Н5 отсутствовали на территории Северной Евразии, что является важным элементом доказательства интродукции этого вируса весной 2005 г..

Установлен этиологический агент – HPAI / H5N1 – для восьми крупных эпизоотических эпизодов на территории Северной Евразии, что позволило корректно спланировать систему противоэпизоотических мероприятий.

Показано, что HPAI / H5N1, получивший распространение в экосистемах Северной Евразии, содержит ряд молекулярных маркёров, повышающих тропизм к клеткам млекопитающих и эпидемический потенциал этого вируса.

В результате анализа генома и прямых биологических экспериментов на высокоэффективных моделях in vitro было установлено, что штаммы HPAI / H5N Северной Евразии чувствительны к коммерческим антигриппозным химиопрепаратам – ремантдину, озельтамивиру, арбидолу и рибавирину – что чрезвычайно важно с точки зрения подготовки к возможной эпидемии и пандемии HPAI / H5N1, а также химиотерапии и химиопрофилактики контингентов повышенного риска заболеваемости (персонала ПТФ, ветеринаров, охотоведов и т.д.).

Получен приоритет по депонированию в Государственную Коллекцию вирусов РФ (ГКВ РФ) 60 штаммов HPAI / H5N1 (2005–2009 гг.) и 1 штамма LPAI / H5N3 (2003 г.). Штамм A/chicken/Novosibirsk/64/05 предложен в качестве кандидата в вакцинные штаммы и используется для крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины «ФЛУ ПРОТЕКТ Н5».

1.6. Основные положения, выносимые на защиту:

В период 2001–2004 гг. – накануне проникновения в Северную Евразию HPAI / H5N1 – на данной территории этот вирус обнаружен не был. Это является одним из элементов доказательства проникновения HPAI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г..

Вирус гриппа А, вызвавший эпизоотическую вспышку среди диких и домашних птиц в Барабинской низменности летом 2005 г., имел высоковирулентный фенотип, принадлежал к генотипу [K, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1E] и был генетически близок к штаммам, изолированным на оз. Кукунор (пров. Цинхай, КНР) весной 2005 г.. Проникновение ЦинхайСибирского генотипа (H5J 2.2) в Северную Евразию произошло во время весенней миграции диких птиц 2005 г. из Юго-Восточной Азии через оз. Кукунор и «Джунгарские ворота»

(тектоническое понижение между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем).

Цинхай-Сибирский генотип (H5J 2.2) HPAI / H5N1, начиная с весны 2005 г. и по настоящее время, обладает следующими молекулярно-генетическими характеристиками: сайт протеолитического нарезания НА – P337QGERRRKKRGLF349 – обогащённый основными а.о., является маркёром HPAI-фенотипа; РСС НА соответствует птичьим вариантам вируса гриппа А с повышенной аффинностью к 2’-3’-сиаловым кислотам; в домене НА2 отсутствуют мутации, свойственные арбидол-резистентным штаммам; белок NA содержит делецию – C49NQSIITYENNTWVNQTYVN68относительно штамма A/goose/Guangdong/1/96 (H5N1), что свидетельствует о принадлежности к генотипу Z; в белке NA отсутствуют мутации, характерные для озельтамивир-резистентных штаммов; белок PB2 содержит сайт K627, РВ1 – Р13, NS1 – K41, S42, делецию A80IASS84 (относительно консенсуса HPAI / H5N1) и E92, являющиеся маркёрами повышенного тропизма вируса к клеткам млекопитающих; в белке РВ содержится ORF (95–367 н.о. относительно ORF PB1) для неструктурного белка PB1-F2, играющего важную роль в индукции апоптоза; белок М2 содержит L26, V27, A30, S31 и G34, определяющие чувствительность к адамантановым производным – ремантадину и амантадину.

Таким образом, штаммы Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) содержат ряд маркёров повышенной вирулентности по отношению к клеткам млекопитающих, что увеличивает вероятность преодоления межвидового барьера. Вирус сохраняет аффинность РСС НА к 2’сиаловым кислотам, содержащимся на поверхности эпителия птиц. Штаммы ЦинхайСибирского генотипа чувствительны к химиопрепаратам – ингибиторам нейраминидазной активности, функционирования протонных каналов, формируемых М2-тетрамерами, слияния мембран вириона и эндосомы, что подтверждается результатами как анализа генома, так и прямых экспериментов in vitro.

Распространение HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) в западном секторе Северной Евразии осенью 2005 г. происходило в южном направлении вдоль ИндоАзиатского миграционного русла (в результате чего вирус проник на п-ов Индостан) и в югозападном направлении вдоль Восточно-Европейского миграционного русла диких птиц, которые занесли вирус на юг Русской равнины, в Черноморско-Прикаспийский регион, откуда HPAI / H5N1 проник в страны Восточной и Западной Европы, Закавказья, Ближнего Востока и Африки. В этот период эпизоотия охватывала всё новые популяции неиммунных хозяев, а потому генетический дрейф вируса был выражен слабо.

генотипа (H5J 2.2) происходило в направлении из зимовочных ареалов к гнездовым ареалам на территории Северной Евразии. В частности, в этот период вирус проник с дикими утками с п- ва Индостан в Восточную Сибирь, где вызвал на оз. Убсу-Нур (на границе Республики Тыва РФ и МНР) одну из крупнейших эпизоотий с высоким уровнем падежа среди диких птиц. При расшифровке этой эпизоотии были впервые обнаружены варианты Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) Тувинско-Сибирской подгруппы.

В феврале 2007 г. в Подмосковье имели место 9 локальных эпизоотических вспышек (8 – в Московской, 1 – в Калужской обл.), этиологически связанных с HPAI / H5N1 ЦинхайСибирского генотипа (H5J 2.2) и происходящих из единого источника на рынке «Садовод»

(Юго-Восточный адм. округ г. Москвы) в результате непреднамеренных рукотворных действий. Штаммы, изолированные при расшифровке этой эпизоотии, были генетически близки к штаммам, полученным осенью 2006 г. в Причерноморско-Каспийском регионе, имели ряд уникальных аминокислотных замен относительно консенсуса Цинхай-Сибирского генотипа (особенно в белке РВ1, все 8 аминокислотных замен оказались уникальными) и положили начало новой генетической подгруппе внутри генотипа H5J 2.2 – ИраноСеверокавказской.

В сентябре 2007 г. эпизоотическая вспышка среди диких и домашних птиц на лимане Лебяжий вблизи юго-восточного побережья Азовского моря (Краснодарский край) была этиологически связана с HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) ТувинскоСибирской подгруппы.

Эпизоотическая вспышка в северной части Кубано-Приазовской низменности в декабре 2007 г. с эпицентром на ПТФ «Гуляй-Борисовская» (Ростовская обл.) имела ряд экологических особенностей: указанная ПТФ стала источником массового заражения диких птиц наземного экологического комплекса – грачей (Corvus frugilegus), ворон (Corvus corone), голубей (Columba livia), воробьёв (Passer montanus) и скворцов (Sturnus vulgaris) – у которых также наблюдали клинические проявления инфекции. Этиологический агент эпизоотии относился к Ирано-Северокавказской подгруппе Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

Центром генетического разнообразия высоковирулентного вируса гриппа А птиц Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) на территории западного сектора Северной Евразии является Кубано-Приазовская низменность.

Уровень вирулентности штаммов Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) последовательно снижался в период 2005–2007 гг.. Наиболее выраженное снижение вирулентности обнаружено в штаммах от домашних птиц, наименее выраженое – в штаммах от диких птиц. Путём сопоставления фенотипических и молекулярно-генетических данных выявлены точечные аминокислотные замены, вероятно влияющие на снижение вирулентности.

С весны 2005 г., когда HPAI / H5N1 начал распространяться в западном секторе Северной Евразии, и до весны 2008 г. в восточном секторе Северной Евразии не были обнаружены варианты HPAI / H5N1. В период 2005–2007 гг. на Дальнем Востоке – в СреднеАмурской низм. и юге Приморского края – методом ОТ-ПЦР обнаруживались лишь LPAI / H (главным образом, среди, птиц водно-околоводного экологического комплекса).

Проникновение HPAI / H5N1 в экосистемы восточного сектора Северной Евразии произошло весной 2008 г. с мигрирующими дикими птицами из южных провинций КНР и примыкающих территорий Вьетнама и Лаоса и было связано с Уссурийским генотипом (H5J 2.3.2).

Эпизоотическая вспышка среди диких птиц на оз. Убсу-Нур летом 2009 г. была этиологически связана с HPAI / H5N1 Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2). Проникновение вируса произошло из Юго-Восточной Азии вдоль Джунгарского миграционного русла.

Цинхай-Сибирский (H5J 2.2) генотип, распространённый в западном секторе Северной Евразии, отличается от Уссурийского (H5J 2.3.2), распространённого в восточном секторе, на 4.6–7.0 % по ORF HA; в среднем, – на 5.8 %. Внутри генотипа H5J 2.2 можно выделить 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую), ORF HA которых отличаются, в среднем, на 1.5 %; а внутри H5J 2.3.2 – 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую) и 2.1 %, соответственно.

1.7. Апробация диссертационной работы осуществлялась в ходе проведения ежегодных отчётных конференциях НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 2001– 2009 гг.; сессий Проблемной комиссии по гриппу РАМН; V Межрегиональной научнопрактической конференции с международным участием «Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты» (Омск, Россия; 25– 26 ноября 2004 г.); X Национальной конференции Монгольской Народной Республики «Актуальные вопросы вирусологии» (Улан-Батор, МНР; 25 ноября 2004 г.); Международном семинаре «Изменение климата и здоровье населения России в XXI веке» (Москва, Россия; 5– 6 апреля 2004 г.); III Всероссийской научно-практической конференции «Информационные технологии и математическое моделирование (ИТММ-2004)» (Анжеро-Судженск, Россия, 11– 12 декабря 2004 г.); Всероссийской научно-практической конференции «Качество образования:

теория и практика» (Анжеро-Судженск, Россия, 10–11 декабря 2004 г.); Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных» (Покров, Владимирская обл., Россия, 28–30 сентября 2004 г.); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Кольцово, Новосибирская обл., Россия; 8–10 сентября 2004 г.); Всероссийской научной конференции с участием зарубежных учёных «Сибирская зоологическая Конференция» (Новосибирск, Россия;

15–22 сентября 2004 г.); Международной научной конференции «Современные проблемы эпизоотологии» (Краснообск, Новосибирская обл., Россия; 30 июня 2004 г.); Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (СанктПетербург, Россия; 1–2 декабря 2004 г.); III Всероссийской конференции с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, Россия; 20– 24 января 2004 г.); III-го Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия; 14–18 марта 2005 г.); Second European Influenza conference (Valetta, Malta; September 11–14, 2005); Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия; 25–27 октября 2005 г.); XI международной научной конференции «Современные проблемы информатизации в прикладных задачах» (Воронеж, Россия; 15–20 января 2006 г.);

XII Международной орнитологической конференции (Ставрополь, Россия; 31 января – 5 февраля 2006 г.); VI Научно-практической конференции «Проблемы прогнозирования чрезвычайных ситуаций» (п. Никола, Иркутская обл., Россия; 5–7 сентября 2006 г.);

VI International conference «Options for the Control of Influenza» (Toronto, Canada; June 17–23, 2007); 6-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика – 2007» («Генодиагностика–2007») (Москва, Россия; 28–30 ноября 2007 г.); IV Международного ветеринарного конгресса по птицеводству (Москва, Россия; 08– 11 апреля 2008); XIV International congress of virology (Istanbul, Turkey; August 10–15, 2008);

Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирск, Россия;

9–10 октября 2008 г.); VI Научно-практической конференции «Инфекционные болезни и антимикробные средства» (Москва, Россия; 2–3 октября 2008 г.); International conference «New trends in infectious diseases» (Lyon, France; November 26–28, 2008); 8th Asia-Pacific congress of medical virology «Emerging zoonotic viruses in Northern Asia-Pacific ecosystems» (Hong Kong;

February 24 – March 02, 2009); Международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Сосновка, Новосибирская обл., Россия; 14–15 мая 2009 г.);

Международной конференции «Emerging influenza viruses: H5N1, H1N1» (Marburg, Germany;

February 15–16, 2010).

Диссертационная работа получила рекомендации к защите в Диссертационном Совете Д 001.020.01 на совместном заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по специальности «Вирусология» при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (Протокол № 7 от 27.05.2010).

1.8. Научные публикации по теме диссертации.

Результаты диссертационной работы отражены в 61 научной публикации: в 26 статьях (в том числе, опубликованных в периодических научных изданиях из списка ВАК – 22); в 1 главе монографии; в 2 статьях научных сборников; в 32 тезисах научных конференций (13 – российских; 1 – Национальной конференции МНР; 13 – международных, проводимых в России; 5 – международных зарубежных).

1.9. Структура диссертационной работы (488 с. машинописного текста):

«Содержание» (9 с.), «Введение» (10 с.); «Обзор литературы» (175 с., 108 рис., 18 табл.);

«Собственные исследования» (178 с., 66 рис., 63 табл.); «Обсуждение полученных результатов» (25 с., 7 рис., 4 табл.); «Выводы» (2 с.), «Дополнительные материалы» (89 с.;

список использованной литературы содержит 1256 наименований, из которых 521 – на русском языке).

2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы и методы.

Сбор полевого материала – клоакальных смывов и внутренних органов от диких и домашних птиц – осуществляли в процессе планового мониторинга ключевых точек Северной Евразии, а также при расшифровке эпизоотий (табл. 1, рис. 1). Полевой материал доставлялся в лабораторию в сосудах Дьюара с жидким азотом (- 196 °С) и хранился в низкотемпературны холодильниках при температуре не выше - 50 °С; все промежуточные операции осуществлялись без разрыва холодовой цепочки с применеием сухого льда (- 74 °С) [Львов Д.К., 1995, 2008].

Обратную транскрипцию с последующей полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР) для индикация РНК вируса гриппа А в полевом матерале и вирусосодержащих образцах после Таблица 1 (начало). Данные о штаммах * HPAI / H5N1 (2005–2009 гг.), депонированных в ГКВ РФ.

(генотип H5J 2.2) (генотип H5J 2.2) (генотип H5J 2.2) (генотип H5J 2.2) Февраль 2007 г.

Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых имеются сиквенсы полноразмрных геномов в базе данных GenBank; «МО» – Московская область, «КО» – Калужская область.

«БКП» – без клинических проявлений, «БЛН» – больная, «СПГ» – свежепогибшая птица.

Таблица 1 (окончание). Данные о штаммах * HPAI / H5N1 (2005–2009 гг.), депонированных в ГКВ РФ.

(генотип H5J 2.2) Сентябрь 2007 г.

(генотип H5J 2.2) (генотип H5J 2.3.2) (генотип H5J 2.3.2) Жирным шрифтом выделены штаммы, для которых имеются сиквенсы полноразмрных геномов в базе данных GenBank; «МО» – Московская область, «КО» – Калужская область.

«БКП» – без клинических проявлений, «БЛН» – больная, «СПГ» – свежепогибшая птица.

Рисунок 1. Клинические признаки заболевания КЧП, этиологически связанной с HPAI / H5N1, у диких и домашних птиц:

А – характерные движения – высокое поднятие киля – у больного красноголового нырка (Aythya ferina);

Б – больная домашняя утка (Anas platyrhynchos domesticus) в период заваливания головы: на спине у основания шеи видны признаки дерматита и гиперемии кожного покрова; помутнение роговицы;

В – инъекция сосудов двенадцатиперстного участка кишечника и изменение структуры поджелудочной железы красноголового нырка (Aythya ferina);

Г – цианоз и отек слизистой оболочки пищевода с точечными кровоизлияниями у домашней курицы (Gallus gallus domesticus);

Д – парез нижних конечностей у больного лебедя-шипуна (Cygnus olor);

Е – утыкание клюва в дно лодки, искривление шеи, заваливание тела на киль у больного лебедя-шипуна Ж – инъекция сосудов двенадцатипёрстного отдела кишечника и брыжейки у больного лебедя-шипуна З – поздняя стадия заболевания у чомги (Podiceps cristatus): отчётливо выражены признаки И – ранняя стадия заболевания у лысухи (Fulica atra): малоподвижность и дыхательная недостаточность при отсутствии признаков нейроинфекции на фоне умеренного энтерита;

К – кровоизлияние в жировую ткань у инфицированной домашней курицы (Gallus gallus domesticus);

Л – полнокровие сосудов кишечника у инфицированного сизого голубя (Columba livia);

М – полнокровие сосудов кишечника и изменение структуры поджелудочной железы у мёртвого инфицированного грача (Corvus frugilegus).

изоляции проводили с использованием праймеров, специфичных для сегментов NP, HA / H5 и НА / Н7, а ОТ-ПЦР в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ) – М и HA / H5 [Киреев Д.Е., 2007;

Гребенникова Т.В., 2008].

Изоляцию вируса проводили путём заражения 9–10-дневных развивающихся куриных эмбрионов в аллантоисную полость, а также клеточных линий СПЭВ и MDCK [Шубладзе А.К., 1949; Соминина А.А., 2006], предоставленных РККК при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН.

Идентификацию штаммов осуществляли с помощью РГА, РТГА [Hirst G.K., 1941;

МУ 3.3.2.1758-03], ИФА [МУ 3.3.2.1758-03Бутенко А.М., 2008], РН [Шубладзе А.К., 1949;

Гребенникова Т.В., 2008], ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР-РВ с набором специфических праймеров, а также – в ряде случаев – с помощью секвенирования нуклеотидных последовательностей полноразмерного вирусного генома или его фрагментов [Sanger F., 1977; Прилипов А.Г., 2008].

Изучение спектра клеточного тропизма штаммов HPAI / H5N1 проводили с использованием перевиваемых клеточных линий MDCK, СПЭВ, BHK-21, HEL, Vero-E6, Mpf, L929, CC81, CRFK, предоставленных РККК при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН [Каталог РККК, 1999], а также первичной культуры клеток ФЭК [Дерябин П.Г., 2007].

Изучение чувствительности штаммов HPAI / H5N1 к химиопрепаратам in vitro проводили при заражении клеточной линии СПЭВ. Снижение уровня репродукции вируса в присутствие препаратов – солянокислого ремантадина (АО «Адамантан», РФ), солянокислого амантадина («Олайнфарм», Латвия), рибавирина (виразол) (ICN Pharmaceutical, США), арбидола («Мастерлек» РФ) – по сравнению с контролем без препарата оценивали по уровню ЦПД, титра в РТГА и с помощью ИФА [Ленёва И.А., 1994; Львов Д.К., 2006].

Депонирование прототипных штаммов осуществляли в ГКВ РФ (табл. 1) [Фадеева Л.Л., 2008], а нуклеотидных последовательностей – в международную базу данных GenBank [Benson D.A., 2010].

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с использованием собственных информационных технологий на основе MS Excel, MatLab и WinStatics [Shchelkanov M.Yu., 1997; Щелканов М.Ю., 1998].

2.2. Мониторинг вирусов гриппа А на территории Северной Евразии в период 2001–2004 гг..

В период 2001 – 2004 гг. на территории Северной Евразии изолировались только низковирулентные штаммы вирусов гриппа А, включая Н5 (рис. 2). Штамм LPAI A/Anas platyrhynchos/Chany Lake/9/03 был депонирован в ГКВ РФ (Удостоверение ГКВ 2366).

Отсутствие высоковирулентных штаммов вируса гриппа А (H5) в Северной Евразии на протяжении 2001–2004 гг. является одним из элементов доказательства проникновения HPAI / H5N1 в Западную Сибирь весной 2005 г..

Рисунок 2. Изоляция низковирулентных штаммов от диких и домашних птиц в ключевых точках Северной Евразии (2001–2004 гг.).

2.3. Развитие эпизоотии HPAI / H5N1 в западном секторе Северной Евразии, начиная с весны 2005 г..

2.3.1. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц на юге Западной Сибири летом 2005 г. (см. рис. 12) позволила ретроспективно установить, что этиологическим агентом является HPAI / H5N1 [K, G, D, 5J 2.2, F, 1J, F, 1E], который генетически близок к штаммам, изолированным от диких птиц на оз. Кукунор (пров. Цинхай КНР) в мае 2005 г., и вместе с ними формирует Цинхай-Сибирский генотип, получивший позднее международное обозначение H5J 2.2 (рис. 3). Молекулярные маркёры биологических свойств этого генотипа HPAI / H5N1 представлены в табл. 2.

По данным ОТ-ПЦР, заражённость в очаге эпизоотии домашних птиц была свыше 95 %, диких – 35–50 % (главным образом, – водного экологического комплекса: речных уток (Anatinae) и больших поганок (Podiceps cristatus)). Методом биопробы на модели РКЭ и перевиваемых клеточных линий были изолированы 6 штаммов HPAI / H5N1 из клоакальных смывов и внутренних органов диких птиц без клинических проявлений, а также от погибших и больных домашних птиц (табл. 1). В клеточных культурах эти штаммы репродуцировались без добавления трипсина. Чувствительность клеточных линий последовательно возрастала в ряду BHK-21 HEL Vero-E6 MDCK СПЭВ. Штамм A/chicken/Novosibirsk/64/05, обладавший рекордным уровнем как продуктивности in vitro, так и титров антисывороток в РТГА, был выбран в качестве вакцинного кандидата: этот штамм используется для крупномасштабного производства отечественной ветеринарной вакцины «ФЛУ ПРОТЕКТ Н5».

Рисунок 3. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей полноразмерных ORF HA (1 707 н.о.) для прототипных штаммов HPAI / Н5, визуализированная с помощью UPGMA-алгоритма. Названия штаммов, изолированных в Чановской котловине летом 2005 г., выделены рамкой.

2.3.2. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди лебедей-шипунов (Cygnus olor) в нижнем поясе дельты Волги в ноябре 2005 г. (см. рис. 12) показала, что этиологическим агентом был HPAI / H5N1, в генетическом отношении, близкий к западносибирским штаммам того же года (см. п. 2.3.1) и вместе с ними формирующий т.н.

западносибирскую подгруппу Цинхай-Сибирского генотипа (рис. 4, 13, табл. 8–9).

Все лебеди-шипуны (100 %) с клиническими признаками заболевания были положительны в ОТ-ПЦР.

Генетические характеристики почти всех изолированных штаммов были идентичны западносибирским; исключение составлял только штамм A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast05-2-4/05, который содержал сайт Е627 вместо К627 в белке PB2, что свойственно большинству штаммов от птиц.

Таблица 2. Молекулярные маркёры биологических свойств Цинхай-Сибирского генотипа.

Белок Аминокислотная вируса последовательность

CNQSIITYENN

TWVNQTYVN

Подтверждено прямыми экспериментами in vitro.

2.3.3. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких птиц на оз. Убсу-Нур летом 2006 г. (см. рис. 12) выявила этиологическую роль Цинхай-Сибирского генотипа HPAI / H5N1. В окрестностях этого озера полностью отсутствуют сельскохозяйственные птицы, что подчёркивает ведущую и самостоятельную роль диких птиц в распространении вируса и поддержании эпизоотий.

Были изолированы семь штаммов HPAI / H5N1 (табл. 1). Анализ генома показал отличие тувинских штаммов 2006 г. от североевразийских штаммов 2005 г. – позднее выяснилось, что мы впервые обнаружили варинаты этого вируса Тувинско-Сибирской генетической подгруппы (рис. 13, табл. 8–9). На филогенетическом древе (рис. 5) тувинские штаммы 2006 г. формировали отдельный кластер вместе с индо-пакистанскими штаммами весны-лета 2006 г., дистанцируясь от цинхайских штаммов 2006 г. – в отличие от западносибирских штаммов 2005 г., которые группировались вместе с цинхайскими штаммами весны-лета того же года.

Рисунок 4. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей ORF HA (1 707 н.о.) для прототипных штаммов вируса гриппа А Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью UPGMA-алгоритма. Названия штаммов, изолированных от лебедей-шипунов (Cygnus olor) в период эпизоотии в нижнем поясе дельты Волги (ноябрь 2005 г.), взяты в рамку.

Рисунок 5. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей ORF HA (1 707 н.о.) для прототипных штаммов вируса гриппа А Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью SL-алгоритма. Убсунурские штаммы 2006 г. взяты в рамку.

сельскохозяйственных птиц в Подмосковье (Московская и Калужская области) в феврале 2007 г. (рис. 12) позволила установить этиологическую роль Цинхай-Сибирского генотипа HPAI / H5N1.

Штаммы HPAI / H5N1 были получены из всех 9 локальных эпизоотий (табл. 1). Анализ генома (на примере прототипного A/chicken/Moscow/2/07) выявил наибольшую гомологию с группой штаммов, изолированных в Причерноморско-Каспийском регионе зимой 2005– 2006 гг., что согласуется и с наличием большого числа общих аминокислотных замен (табл. 3).

Аминокислотные замены D N в НА и V I в РА прослеживаются, начиная с цинхайских штаммов, но большинство относятся к периоду зимы 2005–2006 гг..

Вместе с тем, подмосковные штаммы 2007 г. заметно отличаются, в молекулярногенетическом отношении, от всех других штаммов HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2). В четырёх генах – РВ2, РВ1, НА и NP – имеется 12 уникальных аминокислотных замен (табл. 4), которые нигде, кроме этого штамма, не встречаются. Более того, все аминокислотные замены в белке РВ1 относительно консенсуса HPAI / H5N1 являются уникальными. На филогенетическом древе (рис. 6) эти штаммы формируют отдельную генетическую подгруппу, получившую название «Ирано-Северокавказская».

2.3.5. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц в юго-восточной части побережья Азовского моря (Краснодарский край) в сентябре 2007 г. (рис. 12) выявила дальнейшую стратификацию Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) на две генетические подгруппы: Тувинско-Сибирскую и Ирано-Северокавказскую.

Анализ генома изолированных штаммов (табл. 1) позволил выявить значительную генетическую близость A/chicken/Krasnodar/300/07 (изолирован на ПТФ «ЛебежьяЧепигинское») и A/Cygnus cygnus/Krasnodar/329/07 (изолирован в ур. Лиман Лебяжий), что свидетельствует о том, что вирус проник на ПТФ из популяции диких птиц.

Внутри Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) выделялся кластер, содержащий штаммы, изолированные на территории Кубанско-Приазовской низменности. Внутри этого кластера (заключенного в прямоугольную рамку на рис. 7) чётко дифференцировались две генетические подгруппы: Тувинско-Сибирская и Ирано-Северокавказская (табл. 8–9). Первой из них принадлежат штаммы A/chicken/Krasnodar/{300,329}/07 и содержат ряд аминокислотных замен как общих с тувинскими штаммами 2006 г. (табл. 5), так и уникальных для штаммов данной эпизоотии (табл. 6).

2.3.6. Расшифровка эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц в северной части Кубано-Приазовской низменности (Ростовская область) в декабре 2007 г. подтвердила продолжающуюся молекулярную эволюцию Цинхай-Сибирского генотипа.

Экологические особенности распространения инфекции заключались в активном вовлечении в эпизоотический процесс диких птиц наземного комплекса – грачей (Corvus frugilegus), ворон (Corvus corone), голубей (Columba livia), воробьёв (Passer montanus) и скворцов (Sturnus vulgaris) – которые в огромных количествах скапливаются в окрестностях населённых пунктов и птицефабрик в осенне-зимний период, во время сезонных кочёвок.

Таблица 3. Аминокислотные замены в генах штамма A/chicken/Moscow/2/07 относительно консенсуса, которые встречаются в ограниченном числе штаммов HPAI / H5N1 ЦинхайСибирского генотипа (H5J 2.2).

Рисунок 6. Иерархическая структура ORF НА (1 707 н.о.) штаммов HPAI / H5N1 ЦинхайСибирского генотипа (H5J 2.2), визуализированная с помощью SL-алгоритма. Жирным шрифтом выделен подмосковный штамм 2007 г.. Компактные кластеры, соответствующие некоторым хронологическим группам штаммов, заключены в рамки.

Таблица 4. Уникальные * аминокислотные замены в генах штамма A/chicken/Moscow/2/07 по сравнению со штаммами HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

Белок Позиция A/chicken/ Консенсус Уникальными считаются те аминокислотные замены относительно консенсуса, которые встречаются только в белках штамма A/chicken/Moscow/2/07.

Таблица 5. Аминокислотные замены в белках вирусных штаммов A/chicken/Krasnodar/{300, 329}/07 относительно консенсуса, которые встречаются в ограниченном числе штаммов HPAI / H5N1 Цинхай–Сибирского генотипа (H5J 2.2).

Белок PB Рисунок 7. Филогенетические древо для полноразмерных нуклеотидных последовательностей гена НА штаммов вируса гриппа А (H5N1) Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа. Штаммы из урочища Лиман Лебяжий выделены жирным шрифтом полностью; у остальных штаммов из Краснодарского края жирным шрифтом выделена часть названия «Krasnodar».

Таблица 6. Уникальные * аминокислотные замены в белках штаммов A/chicken/Krasnodar/{300, 329}/07 относительно консенсуса для HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

Уникальными считаются те аминокислотные замены относительно консенсуса, которые встречаются только в белках штаммов A/chicken/Krasnodar/{300, 329}/07.

Приводящая к этому нуклеотидная замена не влияет на последовательность белка NS2, так как находится в сплайсируемом участке.

Результаты обследования полевого материала методом ОТ-ПЦР свидетельствуют о том, что этиологическим агентом эпизоотии был HPAI / H5N1. Вирус проник в популяции диких птиц наземного экологического комплекса и обнаружен у 60 % (9 / 15) врановых птиц, 58 % (7 / 12) голубей, 20 % (1 / 5) скворцов, 10 % (1 / 10) полевых воробьёв.

Из собранного полевого материала были изолированы 15 вирусных штаммов (8 – от диких, 7 – от домашних птиц) (табл. 1). Группа гуляй-борисовских штаммов образует плотный кластер внутри Ирано-Северокавказской подгруппы, наиболее близкий к штамму A/chicken/Moscow/2/07 (см. п. 2.3.4) (рис. 8). Уникальные аминокислотные замены, имеющиеся в белках изолированных штаммов, можно разбить на четыре группы (табл. 7): 1. уникальные для группы гуляй-борисовских штаммов, но не штамма A/chicken/Moscow/2/2007 (13 сайтов в РВ2, РА, НА, NP, NA, M2); 2. уникальные как для группы гуляй-борисовских штаммов, так и для штамма A/chicken/Moscow/2/2007 (4 сайта в РВ2, РВ1, NP); 3. уникальные для штамма A/chicken/Moscow/2/2007, но которые не воспроизвелись для группы гуляй-борисовских штаммов (8 сайтов в РВ2, РВ1, НА); 4. уникальные для единственного изолированного штамма: I273 вместо консенсусного V273 в РВ1 у A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07, а также V вместо консенсусного I273 в РА у A/starling/Rostov-on-Don/39/07. Штаммы из «московскоиранской» подгруппы образца декабря 2007 г. сохранили 4 уникальные аминокислотные замены, впервые отмеченные у штамма A/chicken/Moscow/2/07, и приобрели 13 новых уникальных замен, не встречающихся в других штаммах Цинхай-Сибирского генотипа.

Рисунок 8. Филогенетическое древо (в форме крупных кластеров с перечислением характерных штаммов) гемагглютинина 163 штаммов Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа вируса гриппа А (H5N1), для которых в базе данных GenBank имеются полноразмерные нуклеотидные последовательности. Иерархическая структура кластера, содержащего штаммы юга европейской части России, представлена полностью (жирным шрифтом выделены штаммы из эпицентра рассматриваемой эпизоотической вспышки).

Таблица 7 Аминокислотные замены, обладающие различной степенью уникальности, в белках группы гуляй-борисовских штаммов * HPAI / H5N1.

Аминокислотные замены, уникальные для группы гуляй-борисовских штаммов, но не штамма Аминокислотные замены, уникальные как для группы гуляй-борисовских штаммов, так и Аминокислотные замены, уникальные для штамма A/chicken/Moscow/2/2007, но не для группы Имеются в виду пять штаммов, подвергнутых секвенированию: A/pigeon/Rostov-on-Don/6/07, A/rook/Rostov-on-Don/26/07, A/chicken/Rostov-on-Don/35/07, A/starling/Rostov-on-Don/39/07 и A/muscovy duck/Rostov-on-Don/51/07.

2.4. Мониторинг вирусов гриппа А в восточном секторе Северной Евразии в период 2005–2007 гг..

Вплоть до весны 2008 г. (см. п. 2.5.1) в восточном секторе Северной Евразии не были обнаружены ни проявления КЧП у диких и домашних птиц, ни вирусы HPAI / H5N1. В указанный период на юге Приморского края были изолированы 1 штамм LPAI / H4 и 1 штамм LPAI / H7. Методом ОТ-ПЦР на территории Среднеамурской низм. выявлена циркуляция LPAI / H5, главным образом, среди, птиц водно-околоводного, и LPAI / H7 – среди птиц наземного экологического комплекса (рис. 9).

Рисунок 9. Доля положительных результатов в ОТ-ПЦР на НА / Н и НА / Н7 вируса гриппа А среди диких птиц на территории Среднеамурской низменности (2005–2007 гг.).

2.5. Развитие эпизоотии HPAI / H5N1 в восточном секторе Северной Евразии, начиная с весны 2008 г..

2.5.1. Расшифровка эпизоотии среди диких и домашних птиц на юге Дальнего Востока (Приморский край) весной 2008 г. (рис. 12) выявила этиологическую роль HPAI / H5N1 нового для Северной Евразии генотипа.

Из полевого материала, собранного в д. Воздвиженка (Уссурийский р-н Приморского края) в апреле 2008 г., были изолированы 4 штамма HPAI / H5N1 (табл. 1).

Филогенетический анализ показал принадлежность воздвиженских штаммов к генотипу H5J 2.3.2 (получившему название «Уссурийский»; рис. 10) с генотипической формулой [K, G, D, 5J 2.3.2, F, 1J, F, 1E].

Ещё при первичном обследовании полевого материала было установлено, что структура НА и NA изолированных штаммов из Приморья отличается от штаммов Цинхай-Сибирского генотипа 2.2, поскольку между ними имелись существенные различия в картине гибридизации с нуклеотидными зондами биологического микрочипа чипа (рис. 11). Действительно, оказалось, что гомология изолированных приморских штаммов со штаммами ЦинхайСибирского генотипа составляет для HA 92.9–95.3 %, для NA – 94.1–95.3 %. Таким образом, гибридизационный профиль биочипа может быть использован для первичного генотипирования высоковирулентных штаммов вируса гриппа А (H5N1). Сайт Рисунок 10. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей ORF НА штаммов, изолированных в с. Воздвиженка (выделены жирным шрифтом).

Рисунок 11. Результаты субтипирования вируса гриппа А с помощью биочипов:

А – структура биочипа;

Б – картина гибридизации при анализе A/chicken/Novosibirsk/64/05 (H5N1) ЦинхайСибирского генотипа (H5J 2.2);

В – картина гибридизации при анализе A/chicken/Primorje/1/08 (H5N1) Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2).

протеолитического разрезания НА у A/chicken/Primorje/1/08 и A/Anas crecca/Primorje/8/ характерен для генотипа 2.3.2: P337QRERRRKRGLF348; он имеет делецию K345 по сравнению с Цинхай-Сибирским генотипом (P337QGERRRKKRGLF349). Остальные свойства соответствуют Цинхай-Сибирскому генотипу (табл. 2).

2.5.2. Расшифровка эпизоотии среди диких птиц на озере Убсу-Нур (Республика Тыва) в июне 2009 г. (рис. 12) выявила расширение ареала HPAI / H5N Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2); 2. появление внутри этого генотипа собственных генетических подгрупп.

Из собранного полевого материала были изолированы 12 вирусных штаммов, 6 из которых были депонированы в ГКВ РФ (табл. 1). Анализ генома показал их принадлежность к HPAI / H5N1 генотипа Н5J 2.3.2. Наиболее близкой последовательностью ORF HA для убсунурских штаммов 2009 г. являются штаммы, изолированные на монгольской стороне того же озера в мае того же года.

Клинические признаки заболевания у диких птиц во время эпизоотии 2009 г. (связанной с генотипом H5J 2.3.2) существенно отличались от эпизоотии 2006 г. (связанной с генотипом H5J 2.2), когда ведущим симптомом было поражение ЦНС. В 2009 г. ведущим симптомом была интоксикация, что приводило к вялости и птиц и притуплению у них чувства опасности.

Инфекционный титр убсунурских штаммов 2009 г. снижен по сравнению со штаммами от диких птиц, изолированных на юге Приморья в апреле 2008 г.. Таким образом, циркуляция HPAI / H5N1 генотипа H5J 2.3.2 в восточном секторе Северной Евразии – также, как и циркуляция генотипа 2.2 в западном секторе Северной Евразии – сопровождается расширением ареала и снижением инфекционности.

2.6. Причины и последствия проникновения HPAI / H5N1 в экосистемы Северной Евразии (2005–2009 гг.).

2.6.1. Распространение и генетическая дивергенция Цинхай-Сибирского (H5J 2.2) генотипа HPAI / H5N1 необходимо начать описывать с осени 2001 г., когда в ходе планового мониторинга 2 ключевых точек Северной Евразии сотрудники НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН зафиксировали аномально высокую интенсивность циркуляции LPAI / H5 (ранее изолированных на Алтае) в популяциях диких птиц, совершавших осенний перелёт к зимовочным ареалам (главным образом – в Юго-Восточной Азии) вдоль Дальневосточно-Притихоокеанского миграционного русла (рис. 12). На территории ЮгоВосточной Азии – в условиях колоссальной плотности диких и домашних птиц и интенсивных популяционных взаимодействий – могла произойти селекция вирусных вариантов и превращение LPAI HPAI, о чём было доложено в октябре 2003 г. на Международной конференции «Options for the control of Influenza V» в Окинаве [Lvov D.K., 2004]. Через три месяца стало ясно, что сделанный прогноз полностью оправдался – в конце 2003 г.

HPAI / H5N1 вызвал в Юго-Восточной Азии масштабную эпизоотию.

После начала эпизоотии HPAI / H5N1 осенью 2003 г. был сделан второй прогноз: в одну из ближайших вёсен этот вирус проникнет на территорию Северной Евразии с перелётными дикими птицами вдоль одного из миграционных русел – Джунгарского (проходящего через «Джунгарские ворота» – тектоническое понижение между Тянь-Шанем и Монгольским Алтаем) и Дальневосточно-Притихоокеанского (вдоль тихоокеанского побережья Азии). Тогда Результаты этих исследований не вошли в диссертационную работу, но упоминуются в данном разделе для придания целостности изложению материала.

же – в рамках подготовки к возможным эпизоотическим событиям – были сформулированы цели и задачи настоящей диссертационной работы, начаты научно-организационные мероприятия по подготовке мониторинговых исследований в предполагаемых районах прорыва вируса.

Рисунок 12. Причины и последствия проникновения HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского (H5J2.2) и Уссурийского (H5J 2.3.2) генотипов в Северную Евразию: весна 2005 г. – лето 2009 г..

Результаты расшифровки эпизоотии с высоким уровнем падежа среди диких и домашних птиц на юге Западной Сибири летом 2005 г. (см. п. 2.3.1) подтвердили сделанное предположение: близость западносибирских и цинхайских штаммов (рис. 3) свидетельствует в пользу того, что занос HPAI / H5N1 в Северную Евразию (на юг Западной Сибири и, вероятно, далее на север вплоть до побережья Северной Ледовитого океана) произошёл во время весенней миграции диких птиц 2005 г. из Юго-Восточной Азии через оз. Кукунор и «Джунгарские ворота» (рис. 12).

Третий прогноз заключался в том, что во время осенней миграции 2005 г. дикие птицы разнесут вирус вдоль пролётных путей и в зимовочные ареалы. Этот прогноз также подтвердился: осенью 2005 г. ареал Цинхай-Сибирского генотипа охватил весь западный сектор Северной Евразии, Среднюю Азию, Индостан, Закавказье, Ближний Восток и Африку.

Этот прогноз тоже полностью оправдался. В частности, крупная эпизоотия среди лебедейшипунов (Cygnus olor) в нижнем поясе дельты Волги в ноябре 2005 г. (см. п. 2.3.2) произошла на одном из наиболее интенсивных «перекрёстков» миграционных путей диких птиц.

Источником вируса стали мигрирующие дикие утки (Aythya fuligula), только после прилёта которых заболевание распространилось среди местных лебедей-шипунов.

Генетическая близость штаммов HPAI / H5N1 с юга Западной Сибири (июль 2005 г.) и из нижней дельты Волги (ноябрь 2005 г.) свидетельствует о том, что, распространяясь в течение этих четырёх месяцев во всё новых популяциях неиммунных хозяев, когда генетический дрейф не является условием избегания вирусом иммунного прессинга, варианты Цинхай-Сибирского генотипа не претерпели существенных генетических изменений. Однако попав в зимовочные ареалы – в Африке и на п-ове Индостан – где высокая плотность популяций диких птиц водно-околоводного экологического комплекса сочетается с их значительной иммунной прослойкой, вирус вынужден был начать генетический дрейф, в результате которого в гнездовые ареалы Северной Евразии весной 2006 г. с мигрирующими птицами должны были вернуться генетически модифицированные варианты вируса. Это был наш четвёртый прогноз, который также подтвердился в процессе последующего экологовирусологического мониторинга.

Возвращение HPAI / H5N1 из зимовочных ареалов в гнездовые происходило не всегда теми же путями, что и занс весной. Например, генетическая близость убсунурских штаммов (июнь 2006 г.) (см. п. 2.3.3) с индо-пакистанскими штаммами зимы-весны и дистантность от цинхайских штаммов весны того же года (рис. 5) свидетельствует о том, что занос вируса в Убсунурскую Котловину весной 2006 г. произошёл не из Юго-Восточной Азии вдоль Джунгарского миграционного русла (как это было весной 2005 г. – см. п. 2.3.1), а вдоль восточного ответвления Индо-Азиатского миграционного русла с восточносибирскими утками, инфицирование которых произошло во время зимовки в 2005 / 2006 гг. на п-ве Индостан (рис. 12), где они смешиваются с популяциями западносибирских уток, встретившихся с вирусом весной-летом 2005 г.. Утки, вернувшиеся в Западную Сибирь весной 2006 г. занесли туда близкородственные убсунурским варианты (н-р, A/duck/Omsk/1822/06 (H5N1) на рис. 5).

Другие филогенетически близкие варианты HPAI / H5N1 из GenBank не могут считаться предшественниками убсунурских штаммов, так как были изолированы позже – осенью-зимой 2006 г. в Южной Корее и в 2007 г. в Юго-Восточной Азии: осенью 2006 г. убсунурские варианты вируса были занесены туда вдоль Джунгарского пролётного русла. Варианты Тувинско-Сибирской генетической подгруппы, впервые обнаруженные во время убсунурской эпизоотии 2006 г., вдоль миграционных русел диких птиц распространились в западном направлении и вызвали, в частности, эпизоотию в окрестностях лимана Лебяжий вблизи юговосточного побережья Азовского моря в сентябре 2007 г. (см. п. 2.3.5).

В то время, как Срединный Регион Северной Евразии был местом зарождения Тувинско-Сибирской генетической подгруппы, в Причерноморско-Каспийском регионе сформировалась другая – Ирано-Северокавказская генетическая подгруппа – с которой мы впервые столкнулись при расшифровке эпизоотии среди сельскохозяйственных птиц в Подмосковье в феврале 2007 г. (см. п. 2.3.4). Естественные миграции птиц в феврале на территории Подмосковья отсутствуют (за исключением локальных перемещений зимующих птиц). Однако Москва, являясь крупнейшим транспортным узлом в европейской части России, включена в систему транспортировки сельскохозяйственной продукции и сельскохозяйственных птиц. То, что именно последние стали источником завозного вируса, свидетельствует покупка птицы всеми владельцами заражённых подворий на рынке «Садовод», который рассматривается как вторичный очаг при неизвестном первичном эпизоотическом очаге. Вирус был завезён на московский рынок в мёрзлой подстилке вольеров с птицами из одного из неназванных до сих пор регионов Северного Кавказа. Таким образом, эта эпизоотия имела непреднамеренное рукотворное происхождение.

Варианты Ирано-Северокавказской генетической подгруппы вызвали и обширную эпизоотчискую вспышку в северной части Кубано-Приазовской низменности в декабре 2007 г.

(см. п. 2.3.6). Широкое вовлечение в эпизоотический процесс птиц наземного экологического комплекса (рис. 1.Л–М), которые в огромных количествах скапливаются в окрестностях населённых пунктов и ПТФ осенне-зимний период, во время сезонных кочёвок, было связано с попаданием отходов ПТФ «Гуляй-Борисовская» в примыкающие антропогенные биоценозы.

Кубано-Приазовская низменность является местом пересечения нескольких миграционных путей диких птиц, идущих из Западной Сибири в Африку и из Европы в Африку, Закавказье и Ближний Восток (рис. 12); в мягкие зимы здесь зимуют птицы вводнооколоводного комплекса. На территории южной оконечности Русской равнины выявлена циркуляция обеих генетических подгрупп Цинхай-Сибирского генотипа – ТувинскоСибирской и Ирано-Северокавказской. Таким образом, Кубано-Приазовская низменность является центром генетического разнообразия Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

2.6.2. Распространение и генетическая дивергенция Уссурийского (H5J 2.3.2) генотипа HPAI / H5N1 в Северной Евразии началось в апреле 2008 г., когда на одном из подворий в д. Воздвиженка (Уссурийский р-н Приморского края; рис. 12) в апреле 2008 г.

произошёл падёж невакцинированных сельскохозяйственных птиц (см. п. 2.5.1). Источником заноса HPAI / H5N1 генотипа H5J 2.3.2 стали, по-видимому, чирки-свистунки (Anas crecca):

для них получен наибольший процент ОТ-ПЦР-позитивных результатов как в целом по югу Приморья (31.8 %), так и для окрестностей с. Воздвиженка (62.5 %), а штамм A/Anas crecca/Primorje/8/08 идентичен A/chicken/Primorje/1/08. Ретроспективно было установлено, что на данной территории имели место три основные волны миграции диких уток (вид с доминирующей численностью указан первым): 1. чирки-клоктуны и кряквы; 2. кряквы и чирки-трескунки; 3. чирки-свистунки. Сбор полевого материала был проведён в узком временном диапазоне, когда вдоль Суйфун-Ханкайской низменности осуществляли миграцию заражённые популяции чирков-свистунков. Наиболее близкими, в генетическом отношении, к воздвиженским штаммам 2008 г. являются штаммы генотипа 2.3.2, ранее изолированные в южных провинциях КНР, Вьетнама и Лаоса (рис. 10), где располагается и центр зимовочного ареала чирков-свистунков.

Весной 2009 г. Уссурийский генотип (2.3.2) вызвал эпизоотию на оз. Убсу-Нур (см. п. 2.5.2), где тремя годами ранее «полыхал» Цинхай-Сибирский генотип (2.2) (см. п. 2.3.3).

Расшифровка этой эпизоотии показала, что генотип 2.3.2 не только расширяет свой ареал в восточном секторе Северной Евразии (рис. 12), но и генетически дивергирует: убсунурские штаммы 2009 г. (как с российской, так и с монгольской стороны озера) дистанцируются от воздвиженских штаммов 2008 г. (табл. 8–9), формируя самостоятельную генетическую подгруппу (рис. 13).

2.6.3. Современная (2009 г.) генотипическая структура высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) на территории России представлена на рис. 13 и в табл. 8–9.

Цинхай-Сибирский (H5J 2.2) генотип, распространённый в западном секторе Северной Евразии, отличается от Уссурийского (H5J 2.3.2), распространённого в восточном секторе (рис. 28), по ORF HA на 4.6–7.0 % (табл. 8); в среднем, – на 5.8 % (табл. 9).

Рисунок 13. Иерархическая структура нуклеотидных последовательностей полноразмерных ORF HA для прототипных штаммов HPAI / Н5N1 генотипов ЦинхайСибирского (H5J 2.2) и Уссурийского (H5J 2.3.2), визуализированная с помощью UPGMAалгоритма. Названия штаммов, изолированных на оз. Убсу-Нур летом 2009 г., взяты в рамку.

Внутри Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2) можно выделить 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, Тувинско-Сибирскую и ИраноСеверокавказскую), ORF HA которых отличаются, в среднем, на 1.5 %; а внутри Уссурийского генотипа (H5J 2.3.2) – 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую) со средней генетической дистанцией 2.1 % (табл. 9).

Таблица 8. Диапазон генетических расстояний (минимум – максимум) для ORF HA штаммов HPAI / H5N1 из различных эпизоотических вспышек Северной Евразии: число нуклеотидных замен (левый нижний угол таблицы) и процентное различие (правый верхний угол таблицы).

Оз. Цинхай (май-июнь 2005 г.) 7 Западная Сибирь Дельта Волги Оз. Убсу-Нур Подмосковье (февраль 2007 г.) Краснодарский край (сентябрь 2007 г.) Ростовская область (декабрь 2007 г.) Приморский край (апрель 2008 г.) Оз. Убсу-Нур Таблица 9. Средние генетические расстояния в форме числа нуклеотидных замен (левый нижний угол) и процентных различий (правый верхний угол) между генетическими подгруппами HPAI / H5N1, выявленными в экосистемах Северной Евразии.

H5J 2. ДальневосточноЮжнокитайская H5J 2.3. Таблица 10. Обратные величины титров в РТГА антисывороток к протипным штаммам HPAI / H5N1.

против штамма Рисунок 14. Схема формирования новых генетических вариантов вруса гриппа А вследствие асимметрии условий циркуляции вируса в популяциях птиц водно-околоводного экологического комлпекса в их гнедовых (весналето) и зимовочных (осень-зима) ареалах.

Условные обозначения:

– инфицированная особь на фоне наличия противовирусных антител;

Важно подчеркнуть, что оба генотипа близки в серологическом отношении (табл. 10), что обоснвывает продолжение использования вакцины на основе штамма 2005 г..

Формирование генетических подгрупп связано с асимметрией условий циркуляции вируса гриппа А во время зимовочного и гнездового периодов в популяциях птиц воднооколоводного экологического комплекса – основном природном резервуаре этого вируса. В первом случае, в зимовочных ареалов скапливаются предельно высокие концентрации птиц с максимально высоким уровнем коллективного иммунитета, что стимулирует вирус к интенсивному генетическому дрейфу. Новые вирусные варианты амплифицируются после появления неиммунных птенцов в весенне-летний период (рис. 14).

Рисунок 9. Динамика инфекционных титров in vitro у штаммов HPAI / H5N1 ЦинхайСибирского (H5J 2.2) генотипа от диких и домашних птиц в процессе развития эпизоотии в западном секторе Северной Евразии.

Аналитические выражения для линий трендов инфекционных титров (t – время, отсчитываемое от начала мая 2005 г.):

Таблица 8 (начало). Точечные аминокислотные замены в белках штаммов HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

A/Cygnus olor/Astrakhan/Ast Группа штаммов заключается в фигурные скобки. Если названия штаммов в группе различается только по небольшому фрагменту, то в фигурные скобки заключается перечень этих фрагментов, а общая часть пишется один раз. Символом «*» обозначается произвольный фрагмент. При указании множества штаммов, указываются только те замены, которые встречаются во всех без исключения штаммах этого множества.

Жирным шрифтом выделены замены относительно консенсусной последовательности генотипа 2.2; в рамку заключены замены, являющиеся уникальными для рассматриваемых российских штаммов генотипа 2.2 (т.е. не встречалась среди российских штаммов до развития данной эпизоотии);

в рамку на сером фоне заключены замены, которые уникальны не только для всего генотипа 2.2 (как российских, так и описанных в других странах); «» – замена, встречающаяся в штаммах как данной, так и последующих или предыдущих эпизоотий; «» – замены, встречающиеся только в штаммах данной эпизоотии.

Таблица 8 (окончание). Точечные аминокислотные замены в белках штаммов HPAI / H5N1 Цинхай-Сибирского генотипа (H5J 2.2).

Группа штаммов заключается в фигурные скобки. Если названия штаммов в группе различается только по небольшому фрагменту, то в фигурные скобки заключается перечень этих фрагментов, а общая часть пишется один раз. Символом «*» обозначается произвольный фрагмент. При указании множества штаммов, указываются только те замены, которые встречаются во всех без исключения штаммах этого множества.

Жирным шрифтом выделены замены относительно консенсусной последовательности генотипа 2.2; в рамку заключены замены, являющиеся уникальными для рассматриваемых российских штаммов генотипа 2.2 (т.е. не встречалась среди российских штаммов до развития данной эпизоотии); в рамку на сером фоне заключены замены, которые уникальны не только для всего генотипа 2.2 (как российских, так и описанных в других странах); «» – замена, встречающаяся в штаммах как данной, так и последующих или предыдущих эпизоотий; «» – замены, встречающиеся только в штаммах данной эпизоотии.

Таблица 9. Возможное влияние аминокислотных замен в белках штаммов HPAI / H5N1 ЦинхайСибирского генотипа (H5J 2.2) на уровень вирулентности.

Северная Евразия является крупнейшим в мире гнездовым ареалом птиц воднооколоводного экологического комплекса, который связан миграционными руслами с четырьмя зимовочными ареалами: Африкой, Индостаном, Юго-Восточной Азией и Северной Америкой.

Кроме того, в мягкие зимы птицы могут зимовать на юге Русской равнины, в ПричерноморскоКаспийском регионе. Цинхайская и Зпадномонгольская генетические подгруппы связаны с зимовочным ареалом вдоль Джунгарского, Тувинско-Сибирская – вдоль Индо-Азиатского, Ирано-Северокавказская – вдоль восточноевропейского, Дальневосточно-Южнокитайская – вдоль Дальневосточно-Притихоокеанского, Западномонгольская – вдоль Джунгарского миграционного русла.

2.6.4. Динамика уровня вирулентности штаммов высоковирулентного вируса гриппа А птиц Цинхай-Сибирского генотипа (2005–2007 гг.) представлена в табл. 1 и на рис. 9. Снижение репродуктивного потенциала in vitro наиболее выражено у домашних и менее выражено – у диких птиц. ЦПД в культуре клеток СПЭВ проявлялось через 16–24 ч для штаммов 2005 г., и 36–72 ч – для штаммов 2006–2007 гг..

Анализ аминокислотных замен между различными группами штаммов с известными последовательностями полноразмерного генома представлен в табл. 8. Точечные мутации в функционально-важных участках генома вируса гриппа А, способные влиять на снижение вирулентности штаммов представлены в табл. 9.

1. Результаты эколого-вирусологического мониторинга свидетельствуют о том, что накануне проникновения в Северную Евразию высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) в 2001 – 2004 гг. на данной территории, по-видимому, циркулировали только слабовирулентные штаммы вируса гриппа А (включая Н5).

2. Установлено, что проникновение высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) НАгенотипа 2.2 (получившего название «Цинхай-Сибирский генотип») в популяции диких и домашних птиц Северной Евразии произошло во время весенних миграций диких птиц с оз. Кукунор в северо-западной провинции Цинхай КНР вдоль Джунгарского пролётного русла. Дальнейшее распространение этого вируса в западном секторе Северной Евразии и в Африке происходило осенью 2005 г. вдоль миграционных путей диких птиц, связывающих Западную Сибирь и южную часть Русской равнины.

3. Установлено, что до весны 2008 г. высоковирулентный грипп А (H5N1) птиц встречался лишь в западном секторе Северной Евразии (западнее р. Енисей; самая восточная эпизоотия – среди диких птиц на озере Убсу-Нур в июне 2006 г.) и относился к Цинхай-Сибирскому генотипу.

4. Показана возможность возникновения рукотворных эпизоотий, этиологически связанных с высоковирулентным вирусом гриппа А (H5N1) птиц в отсутствие сезонных миграций диких птиц – на примере эпизоотии среди домашних птиц в Подмосковье в феврале 2007 г..

5. Установлено, что циркуляция высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) птиц ЦинхайСибирского генотипа в западном секторе Северной Евразии сопровождалась дивергенцией на две генетические подгруппы, получившие названия «Тувинско-Сибирская» и «ИраноСеверокавказская».

6. Выявлен центр генетического разнообразия высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) птиц Цинхай-Сибирского генотипа на территории западного сектора Северной Евразии – Кубано-Приазовская низменность – на территории которой установлена циркуляция Тувинско-Сибирской и Ирано-Северокавказской генетических подгрупп, а также показана циркуляция вируса в популяциях птиц как водно-околоводного, так и наземного экологического комплекса.

7. Показано снижение уровня вирулентности штаммов вируса гриппа А (H5N1) птиц ЦинхайСибирского генотипа, изолированных в период 2005–2007 гг.. Наиболее выраженное снижение вирулентности обнаружено в штаммах от домашних птиц, наименее выраженное – в штаммах от диких птиц. Путём сопоставления фенотипических и молекулярногенетических данных выявлены точечные аминокислотные замены, вероятно влияющие на снижение вирулентности.

8. Установлено, что проникновение высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) в экосистемы восточного сектора Северной Евразии произошло весной 2008 г. с мигрирующими дикими птицами из южных провинций КНР и примыкающих территорий Вьетнама и Лаоса и было связано с генотипом H5J 2.3.2.

9. Установлено, что весной 2009 г. высоковирулентный вирус гриппа А (H5N1) HAгенотипа 2.3.2 проник по Джунгарскому миграционному руслу в Котловину Больших Озёр Западной Монголии, где вызвал эпизоотию с высокой смертностью на оз. Убсу-Нур как на территории МНР, так и в РФ (в Республике Тыва).

10. Определена генотипическая структура штаммов высоковирулентного вируса гриппа А (H5N1) птиц, изолированных на территории Северной Евразии, включающая 2 генотипа: Цинхай-Сибирский (H5J 2.2) и Уссурийский (H5J 2.3.2); первый из них подразделяется на 4 генетические подгруппы (Цинхайскую, Западносибирскую, ТувинскоСибирскую и Ирано-Северокавказскую), второй – на 2 генетические подгруппы (Дальневосточно-Южнокитайскую и Западномонгольскую). Сформулированы экологические принципы формирования генетических подгрупп.

4. ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ.

4.1. Список научных публикаций по теме диссертационной работы:

1*. Львов Д.К., Ямникова С.С., Федякина И.Т., …, Щелканов М.Ю., и др. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002 гг.) // Вопросы вирусологии. – 2004. – Т. 49.

вирусологических, экологических и картографических исследований на основе Звёздочкой отмечены номера публикаций в периодических научных изданиях из списка ВАК.

современных информационных технологий // В сб.: III Всероссийская конференция с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины»

(Москва, Россия; 20–24 января 2004 г.). – М.: Научно-издательский Центр ММА им. И.М. Сеченова, 2004. – С. 159.

3. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л. Влияние климатических факторов на циркуляцию природноочаговых вирусных инфекций в Северной Евразии // В сб.:

Изменение климата и здоровье населения России в XXI веке. Труды международного семинара (Москва, Россия, 5-6 апреля 2004 г.). – М.: АдамтЪ, 2004. – С. 84–105.

4*. Львов Д.К., Ковтунов А.И., Яшкулов К.Б., …, Щелканов М.Ю. и др. Проблемы безопасности в связи с новыми и вновь возникающими инфекциями // Вестник РАМН. – 2004. – № 5. – С. 20–25.

5. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Дурыманова А.А. и др. Филогенетическое родство вариантов вируса гриппа А, выявленных у диких птиц на юге Западной Сибири и в других регионах Евразии // В сб.: Сибирская зоологическая Конференция. Материалы Всероссийской научной конференции с участием зарубежных учёных (Новосибирск, Россия;15–22 сентября 2004 г.). – Новосибирск, 2004. – С. 398.

6. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Щелканов М.Ю., Ковтунов А.И. и др. Мониторинг новых и возвращающихся вирусных инфекций на территории России и сопредельных стран // В сб.:

Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний.

Материалы Международной Конференции (Кольцово, Новосибирская область, Россия; 8– 10 сентября 2004 г.). – Новосибирск: ЦЭРИС, 2004. – С. 68–69.

7. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Терновой В.А. и др. Циркуляция вирусов гриппа А в популяциях диких птиц на территории юга Западной Сибири (данные 2002 г.) // В сб.:

Современные проблемы эпизоотологии. Материалы международной научной конференции (Краснообск, Новосибирская область, Россия; 30 июня 2004 г.). – Новосибирск, 2004. – С. 212–215.

8. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Юрлов А.К. и др. Особенности циркуляции вирусов гриппа А в популяциях диких птиц на юге Западной Сибири // Журнал инфекционной патологии. – 2004. – Т. 11. – № 3–4. – С. 91–94.

9. Разумова Ю. В., Щелканов М.Ю., Терновой В.А. и др. Филогенетические и экологические особенности вариантов вируса гриппа А, циркулирующих в популяциях диких уток на юге Западной Сибири // В сб.: Болезни диких животных. Труды Международной научнопрактической конференции (Покров, Владимирская область, Россия; 28–30 сентября 2004 г.). – Покров, 2004. – С. 85–89.

10. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Ямникова С.С., Громашевский В.Л. Краткие итоги долговременного мониторинга природных очагов вирусных инфекций Северной Евразии // В сб. (в 2 тт.): Актуальные проблемы здоровья населения Сибири:

гигиенические и эпидемиологические аспекты. Материалы V Межрегиональной научнопрактической конференции с международным участием (Омск, Россия; 25–26 ноября 2004 г.). – Омск, 2004. – Т. 2. – С. 156–164.

11. Щелканов М.Ю., Стариков Н.С., Бурунова В.В. и др. О целесообразности интеграции информационных технологий, разработанных для поддержки вирусологических и социально-гигиенических исследований // В сб. (в 2 тт.): Актуальные проблемы здоровья населения Сибири: гигиенические и эпидемиологические аспекты. Материалы V Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Омск, Россия; 25–26 ноября 2004 г.). – Омск, 2004. – Т. 2. – С. 171–173.

12. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Чаусов Е.В. и др. Результаты мониторинга вируса гриппа А на территории Барабинско-Кулундинской низменности (юг Западной Сибири) в 2002-2003 гг. // В сб. (в 2 Т.): Актуальные проблемы здоровья населения Сибири:

гигиенические и эпидемиологические аспекты. Материалы V Межрегиональной научнопрактической конференции с международным участием (Омск, Россия; 25–26 ноября 2004 г.). – Омск, 2004. – Т. 2. – С. 174–176.

13. Shestopalov A.M., Tserennorov D., Shchelkanov M.Yu., et al. To the study of circulation of influenza and West Nile viruses in the natural biocenoses of Mongolia // In: Current topics of virology.

Abstract

Book of X National Mongolian Conference (Ulaanbaatar, Mongolia;

November, 25, 2004). – Ulaanbaatar, 2004. – P. 122–123.

14. Славский А.А., Щелканов М.Ю., Львов Д.Н. и др. Разработка базы знаний по миграционному поведению птиц с целью анализа возможных переносов возбудителей инфекционных заболеваний // В сб. (в 2-х тт.): Информационные технологии и математическое моделирование (ИТММ-2004). Материалы III Всероссийской научнопрактической конференции (Анжеро-Судженск, Россия; 11–12 декабря 2004 г.). – Томск:

Изд-во Том. Ун-та, 2004. – Т. 1. – С. 92–93.

15. Щелканов М.Ю., Громашевский В.Л., Епанчинцева А.В. и др. Применение геоинформационных технологий для повышения качества подготовки специалистоввирусологов // В сб.: Качество образования: теория и практика (в 2-х тт.). Материалы Всероссийской научно-практической конференции (Анжеро-Судженск, Россия; 10– 11 декабря 2004 г.). – Томск: Изд-во НТЛ, 2004. – Т. 1. – С. 214–216.

16. Щелканов М.Ю., Шестопалов А.М., Романюха А.А. и др. Современные проблемы математического моделирования распространения вирусных инфекций // В сб.:

Биотехнология: состояние и перспективы развития (в 2-х тт.). Материалы III-го Московского Международного Конгресса (Москва, Россия, 14–18 марта 2005 г.). – М.:

«Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2005. – Т. 1. – С. 187–188.

17*. Разумова Ю.В., Щелканов М.Ю., Дурыманова А.А. и др. Молекулярно-генетическое разнообразие вируса гриппа A в популяциях диких птиц на юге Западной Сибири // Вопросы вирусологии. – 2005. – Т. 50. – № 4. – С. 31–35.

18. Львов Д.К., Щелканов М.Ю., Власов Н.А. и др. Изоляция вируса гриппа А/H5N1 от домашних и диких птиц в период эпизоотии в Западной Сибири (июль 2005 г.) // В сб.:

Генодиагностика инфекционных болезней. Материалы Российской научно-практической конференции (Сосновка, Новосибирская область, Россия; 25–27 октября 2005 г.). – Новосибирск, ЦЭРИС, 2005. – С. 133–136.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«КОМАРОВА ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА АЛЛЕЛОПАТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РАСТИТЕЛЬНЫХ ДОМИНАНТ В ОПТИМИЗИРОВАННЫХ ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ ЛУГОВЫХ АГРОЦЕНОЗАХ НИЖНЕГО ДОНА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2006 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и в Ботаническом саду Ростовского государственного университета Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Сидоренко Владимир Гаврилович кандидат...»

«Курбанова Патимат Магомедкадиевна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ПО ЭФФЕКТИВНОЙ ВОЗРАСТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ Специальность: 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунитета отдела генетики Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова в 2005 – 2009 гг. Научный руководитель :...»

«Степанченко Наталья Сергеевна Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва...»

«ГОСТИМСКАЯ Ирина Сергеевна NADH:УБИХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗА МИТОХОНДРИЙ: АЛАМЕТИЦИН КАК ИНСТРУМЕНТ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ВНУТРИМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ТОПОГРАФИЯ РЕАКЦИОННОСПОСОБНЫХ SH-ГРУПП КОМПЛЕКСА I 03.00.04 – биологическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва...»

«САДЕКОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА Генетические маркеры привычного невынашивания беременности I триместра 14.01.01 - Акушерство и гинекология 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Научные руководители: ООО Клиника на Петровке доктор медицинских...»

«ХРИТАНКОВА ИННА ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА МОДЕЛИ TDP43-ПРОТЕИНОПАТИИ И ЕЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ НЕЙРОПРОТЕКТОРНЫХ ПРЕПАРАТОВ 14.03.03 – Патологическая физиология 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт физиологически активных веществ РАН и в Федеральном государственном бюджетном учреждении...»

«БАБОША АЛЕКСАНДР ВАЛЕНТИНОВИЧ МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ Специальность: 03. 01. 05 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН)...»

«МОСИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, АМИНОКИСЛОТ И НУКЛЕОЗИДОВ, МЕЧЕННЫХ 2 Н (D) И 13С, С ВЫСОКИМИ СТЕПЕНЯМИ ИЗОТОПНОГО ОБОГАЩЕНИЯ. 03.00.23-Биотехнология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва -1996 2 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Научные...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«ЯГ Д АР ОВ А О льг а Ар к адь ев н а ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОНТОГЕНЕЗА ОДНОЛЕТНИХ ДЕКОРАТИВНЫХ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ГОРОДСКОЙ СРЕДЫ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань, 2013 Работа выполнена на кафедре экологии федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Марийский государственный университет Научный...»

«ПОСКРЯКОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ 03.00.23 - биотехнология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2007 Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы и метаболиты почвенных и ризосферных Ферменты микроорганизмов (номер государственной регистрации ГР № 01200210612) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Логинов Олег...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«СУДНИК Светлана Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРАТЕГИЙ КРЕВЕТОК 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград - 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Буруковский Рудольф Николаевич Официальные...»

«Фардеева Марина Борисовна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННО-ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ РАСТЕНИЙ, ДИНАМИКА И МОНИТОРИНГ 03.02.01 – ботаника 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань – 2014 Работа выполнена на кафедре общей экологии Института экологии и географии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«ГРИЗАНОВА Екатерина Валерьевна ИММУННЫЙ ОТВЕТ, СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩЕЙ СИСТЕМ ЛИЧИНОК БОЛЬШОЙ ВОЩИННОЙ ОГНЕВКИ GALLERIA MELLONELLA L. (LEPIDOPTERA, PYRALIDAE) ПРИ БАКТЕРИОЗАХ, ВЫЗВАННЫХ BACILLUS THURINGIENSIS 03.02.05 – энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2012 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института...»

«Кашина Ольга Викторовна АНАЛИЗ И СИНТЕЗ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩИХ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ВОДНОГО ХОЗЯЙСТВА МАСЛОЖИРОВЫХ ПРОИЗВОДСТВ Специальность 03.00.16 - Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Иваново-2008 Работа выполнена в ГОУВПО Ивановский государственный химикотехнологический университет на кафедре общей химической технологии. Научный руководитель : доктор технических наук, доцент Невский Александр Владимирович...»

«Лихачева Ольга Викторовна ЛИШАЙНИКИ УСАДЕБНЫХ ПАРКОВ ПСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Псков, 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре альгологии и микологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на кафедре ботаники и экологии растений...»

«ЖЕРДЕВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ОЦЕНКА И ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ЭКОТОКСИЧНОСТИ ПЕСТИЦИДОВ ПО DAPHNIA MAGNA STRAUS 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена в отделе рыбохозяйственной токсикологи Азовского научноисследовательского института рыбного хозяйства (ФГУП “АзНИИРХ”) Научный руководитель : доктор биологических наук Кренева Софья Викторовна Официальные оппоненты : доктор...»

«МУРАЛЕВ Сергей Григорьевич АГРОПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРАНУЛОМЕТРИЧЕСКОГО СОСТАВА ПОЧВ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ Специальность: 03.02.13 - почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре почвоведения и природообустройства Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии кандидат сельскохозяйственных наук, Научный руководитель :...»

«Алексеева Анна Юрьевна ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научный руководитель : Вейко Наталья Николаевна доктор биологических наук Официальные...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.