WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Савватеева Людмила Владимировна

СОЗДАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ

РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЧЕЛОВЕКА

С ПОТЕНЦИАЛЬНЫМ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ЭФФЕКТОМ

Специальность 03.00.23. – биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2007 1

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институте медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы и на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова

Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, доктор химических наук, профессор Северин Сергей Евгеньевич

Официальные оппоненты: член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич, доктор биологических наук,профессор Глухов Александр Иванович

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится «…….» декабря 2007 года в 15 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской государственной академии тонкой химической технологии имени М.В. Ломоносова по адресу:

119571, Москва, пр. Вернадского, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.

Ломоносова. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru.

Автореферат разослан «…….» ноября 2007 года. ……………………………

Ученый секретарь Диссертационного Совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник Лютик А.И.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время злокачественным новообразованиям принадлежит второе место среди заболеваний, приводящих к летальному исходу. Недостаточная эффективность и избирательность существующих методов лечения рака делают крайне актуальной проблему поиска новых, более действенных и высокоспецифичных методов диагностики и противоопухолевой терапии. Разработка и исследование комбинаций лекарственных средств, принадлежащих к различным классам и действующих на разные клеточные мишени, представляются перспективными в успешном лечении онкологических заболеваний.





В предупреждении и элиминации развившихся опухолей большие надежды связывают с развитием иммунотерапии [Romero P. et al., 2002], которая подразумевает разработку стратегий для разрушения опухолей путем проявления противоопухолевого иммунитета. Так, успешно развивается цитокиновая терапия, специфическая иммунотерапия (вакцинация), адаптивная иммунотерапия (использование опухолеспецифических Т-клеток или моноклональных антител), используется ряд антигенных систем, широко исследуются методы стимуляции гуморального и/или клеточного иммунных ответов, тестируются различные адъюванты. Показано, что белки теплового шока (HSPs) играют важную роль в иммунном ответе, что дало основание использовать некоторые HSPs в качестве вакцин в иммунотерапии рака [Srivastava P.K., 1998]. Иммунологическое функционирование HSPs, которое получило наиболее пристальное внимание, основано на их способности перемещать антигены (в том числе опухолеспецифические) к антигенпрезентирующим клеткам (АПК). Также обнаружено, что взаимодействие HSPАПК независимо от переносимых антигенов приводит к увеличению количества костимуляторных молекул на антиген-презентирующих клетках и секреции воспалительных цитокинов, а взаимодействие HSPs с некоторыми В руководстве работой и подготовке ее к защите принимал участие зав. кафедрой биотехнологии МИТХТ им. М.В. Ломоносова, академик РАМН, д.х.н., профессор Швец В.И.

Активное участие в работе и руководстве диссертацией осуществляла к.б.н. Гороховец Н.В.

рецепторами вызывает активацию дендритных клеток (ДК) и трансдукционных сигналов [Wallin R. et al., 2002]. Эти уникальные иммуностимулирующие свойства HSPs позволяют использовать их в качестве адъювантов для разработки иммунотерапевтических средств.

Альтернативным подходом в решении указанной проблемы является поиск и изучение новых универсальных опухолевых маркеров, которые могли бы стать основой для создания чувствительных диагностических исследований и мишенью для разработки новых способов направленной противоопухолевой терапии. Предпочтением для выбора можно считать опухолеспецифические антигены, которые должны быть белками-рецепторами, избирательно или преимущественно представленными на опухолевых клетках. Известно, что эукариотические клетки путем эндоцитоза могут захватывать вместе с специфичности, в других условиях лишенные возможности проникать в клетку.

онкофетальных белков (в частности, рецепторы альфа-фетопротеина [Moro R.

et al., 1993]), а в качестве вектора могут выступать сами онкофетальные белки (например, альфа-фетопротеин или его фрагменты). Этот путь направленной доставки предполагает включение механизма рецептор-опосредованного эндоцитоза (receptor-mediated endocytosis, RME). Создание конъюгатов цитотоксических агентов и различных векторных молекул имеет большие перспективы. С помощью различных кросс-сшивающих агентов образуются ковалентные связи между молекулами белкового вектора и терапевтически применяемыми в химиотерапии. Использование механизма RME для доставки в опухолевую клетку конъюгированного цитотоксического препарата позволяет помимо задачи повышения эффективности цитотоксического действия решить проблему селективности и преодоления множественной лекарственной устойчивости опухолевых клеток.





Цели и задачи работы. Целью работы явилось создание и изучение потенциала в противоопухолевой терапии рекомбинантного белка теплового шока HSP70A1B человека и рекомбинантного третьего домена альфафетопротеина человека (AFP3D). В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

- клонирование и экспрессия в E.coli генных конструкций, осуществляющих биосинтез белка теплового шока HSP70A1B человека и третьего домена альфа-фетопротеина человека (AFP3D);

- разработка технологического метода получения рекомбинантных белков HSP70A1B и AFP3D;

- исследование биологической активности рекомбинантного HSP70A1B по способности взаимодействия с антигенпрезентирующими клетками;

- сравнение биологической активности рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D с активностью природного альфафетопротеина человека;

- синтез цитотоксического конъюгата AFP3D с химиопрепаратом, обеспечивающего направленное воздействие на опухолевые клетки, и исследование его эффективности in vitro.

Научная новизна и практическая значимость работы.

позволяющие эффективно осуществлять индуцированный биосинтез белка теплового шока человека HSP70A1B и третьего домена альфа-фетопротеина человека AFP3D в клетках соответствующих штаммов-продуцентов.

Разработаны высокоэффективные методы выделения исследуемых рекомбинантных белков в препаративном количестве.

Исследована биологическая активность рекомбинантного HSP70A1B, а также показана его способность к связыванию и активному эндоцитозу дендритными клетками.

Продемонстрирована возможность использования рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека в качестве векторной молекулы для создания противоопухолевых препаратов направленного действия за счет сохранения в AFP3D функциональной активности полноразмерной молекулы природного альфа-фетопротеина человека.

Синтезирован ковалентный конъюгат рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека с таксолом, и показана высокоспецифическая цитотоксическая активность конъюгата in vitro по отношению к клеткам злокачественной опухоли.

Полученные штаммы-продуценты HSP70A1B и AFP3D человека и разработанные методы их выделения могут быть использованы в области промышленной биотехнологии, а соответствующие рекомбинантные белки – в научно-исследовательских работах с последующим потенциальным применением в области практической медицины.

В целом, данная работа демонстрирует роль, которую рекомбинантные белки человека HSP70A1B и AFP3D могут сыграть в противоопухолевой терапии в качестве иммуномодулятора и вектора для направленной доставки лекарственных средств соответственно, а также подчеркивает необходимость дальнейшего совершенствования систем различного механизма действия с использованием рекомбинантных белков.

представлены на следующих симпозиумах и конференциях: XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Greece, Rhodes, 2005); 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (Budapest, Hungary, 2006); Российский Медицинский Форум «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop “New Technologies in Medicine and Experimental Biology” (Bangkok-Pattaya, Thailand, 2007).

По материалам диссертации опубликовано 5 работ, оформлена 1 заявка на выдачу патента РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 130 страницах;

содержит 30 рисунков и 3 таблицы; состоит из введения, обзора литературы, результатов и обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы, включающей 245 наименований.

1. Получение белка теплового шока HSP70A1B человека и третьего домена 1.1. Конструирование рекомбинантных плазмидных ДНК.

1.1.1. Клонирование гена белка теплового шока человека HSP70A1B в pETa(+).

На основе известной последовательности мРНК HSP70 (GenBank NM_005346) человека с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности HSP70 для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции. По результатам анализа этих данных были подобраны и синтезированы праймеры для амплификации ДНК HSP70, соответствующей подсемейству белков теплового шока HSP70A1. Тотальную РНК выделяли из лимфоцитов человека после теплового шока. Комплементарную ДНК (кДНК) гена HSPA1B человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы мышиного вируса лейкемии Молони (RT М-MuLV). Амплификацию кДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя две пары праймеров, в результате чего получили два перекрывающихся фрагмента ДНК HSP70A1B:

N-концевой фрагмент (1068 п.о.) и C-концевой фрагмент (895 п.о.), примерно соответствующие АТP- и пептид-связывающим доменам белка [Tsai M. et al., 1994]. Фрагменты клонировали по SmaI-сайту в плазмиде pUC19 с последующим секвенированием. Полноразмерную последовательность транслируемой области гена HSPA1B получали лигированием фрагментов по сайту PstI, находящегося в области перекрывания этих фрагментов. Плазмиду pUC-HSP70А1B с нуклеотидной последовательностью, соответствующей гену HSPA1B, рестриктировали ферментами NdeI и HindIII. ДНК, соответствующую полноразмерной последовательности транслируемой области гена HSPA1B, встраивали в полилинкер коммерческого экспрессионного вектора pET-28a(+) по указанным сайтам рестрикции (рис. 1).

Рис. 1. Схема конструирования экспрессионной плазмиды pET-hHSP70A1B.

Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить белок HSP70A1В с несколькими дополнительными аминокислотами на N-конце: MetGly-Ser-Ser-(His)6-Ser-Ser-Gly-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-His-Met-Gly-Ser (далее обозначаемый His-tag). Размер белка составляет 663 аминокислотных остатков или 72.33 кДa. Сайты узнавания и расщепления тромбином (выделены курсивом и подчеркиванием, соответственно) позволяют при необходимости удалить лишние аминокислоты. Введение C- и N- концевых сайтов рестрикции SalI и BamHI на уровне генной конструкции pET-hHSP70A1B (рис. 1) дает возможность создания гибридных (fusion) белков, имитирующих комплексы HSP70-антиген.

1.1.2. Клонирование фрагмента гена альфа-фетопротеина человека, соответствующего третьему домену белка (AFP3D), в pET-28a(+).

Для определения отсутствующих и уникальных сайтов рестрикции с помощью компьютерной программы DNA-SUN была получена рестрикционная карта ДНК-последовательности альфа-фетопротеина человека (AFP) на основе известной последовательности мРНК AFP человека (GenBank NM_001134).

Тотальную РНК выделяли из клеток продуцирующей альфа-фетопротеин гепатоцеллюлярной карциномы человека линии HepG2. Комплементарную ДНК (кДНК) гена AFP человека синтезировали на мРНК с помощью обратной транскриптазы вируса миелобластоза птиц (RT AMV). Для получения рекомбинантного третьего домена AFP (AFP3D) соответствующий фрагмент гена клонировали в плазмидном векторе pET-28а(+) под контролем промотора бактериофага T7. Фрагмент ДНК, кодирующий AFP3D, получали методом ПЦР, используя в качестве матрицы кДНК альфа-фетопротеина человека. Для амплификации были использованы два олигонуклеотидных праймера:

смысловой праймер 5’tttt CCA TGG GAT ACC AGG AGT TAT TG 3’, содержащий сайт узнавания рестриктазой NcoI (подчеркнут), и антисмысловой праймер 5’tttt CTC GAG AAC TCC CAA AGC AGC AC 3’, содержащий сайт XhoI (подчеркнут). Полученный в результате ПЦР фрагмент ДНК клонировали в вектор pET-28а(+) по рестрикционным сайтам NcoI-XhoI (рис. 2). Данная генная конструкция позволяет при трансляции получить белок AFP3D, который по аминокислотной последовательности соответствует третьему домену молекулы AFP с метионином на N-конце и Leu-Glu-(His)6 на С-конце.

1.2. Экспрессия рекомбинантных генов. Очистка белков.

1.2.1. Получение рекомбинантного HSP70A1B.

Плазмидную ДНК pET-hHSP70А1B трансфицировали в клетки E.coli BL21(DE3). Выбранный по результатам секвенирования штамм-продуцент BL21(DE3)/pET-hHSP70А1B выращивали на канамицин-содержащей среде, синтез белка индуцировали добавлением изопропил--D-тиогалактопиранозида (ИПТГ). Уровень экспрессии целевого белка (~72 кДа) составлял от 40 до 50% от общего клеточного белка, что показал электрофорез в 12% полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (рис. 3). В отличие от описанных ранее систем экспрессии HSP70A1L [Jindal S. et al., 1995], где основная масса рекомбинантного белка нарабатывалась в Е.соli в виде нерастворимых телец включения, нами получен штамм, продуцирующий рекомбинантный HSP70A1B как в растворимой форме, так и в виде телец включения, причем примерно в равном соотношении (рис. 3).

Клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции, осаждали центрифугированием и собирали супернатант (растворимая фракция белка), а из осадков получали тельца включения. Выделение белка HSP70A1B, проводимое из обеих фракций независимо, было основано на аффинной хроматографии с использованием иминодиацетат-сефарозы, активированной ионами никеля, что стало возможным благодаря введению в состав белка последовательности из шести остатков гистидина. Это значительно упрощает выделение рекомбинантного белка и предотвращает контаминацию DnaK – бактериальным аналогом эукариотического HSP70, что особенно важно при исследовании иммунологических свойств рекомбинантных HSPs человека.

Белок HSP70A1B, находящийся в растворимой фракции, не требует рефолдинга, что дает возможность нарабатывать его без значительных затрат времени и в больших количествах - не менее 30 мг с литра бактериальной культуры. Выделенный белок из солюбилизированных гуанидинхлоридом телец включения восстанавливали -меркаптоэтанолом и ренатурировали последовательным диализом против буферов E (0.1М Трис-HCl, 0.5М NaCl, 2мМ ЭДТА, рН 8.0) и F (0.05М Трис-HCl, 0.15М NaCl, рН 8.0) для удаления детергента. Выход белка составлял 10-12 мг с литра бактериальной культуры.

Чистота выделенного белка в обоих случаях составляла не менее 90% (рис. 4).

Рис. 4. Электрофореграмма препаратов рекомбинантного HSP70A1B в 12% ПААГ с додецилсульфатом натрия в восстанавливающих условиях. А. Выделение HSP70A1B из растворимой фракции: супернатант из штамма E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70A1B после обработки ультразвуком (1); HSP70A1B после аффинной хроматографии на Ni2+-сефарозе (2). Б. HSP70A1B, выделенный из телец включения: суспензия телец включения после обработки ультразвуком (1);

HSP70A1B после аффинной хроматографии на Ni2+-сефарозе (2); М - белковые маркеры молекулярной массы.

Соответствие очищенного белка семейству HSP70 подтверждено данными электрофореза в градиентном полиакриламидном геле (5-20%) и иммуноблота с использованием моноклональных антител к HSP70 человека (рис. 5).

Рекомбинантный HSP70A1B подвергали ферментативному протеолизу тромбином для удаления His-tag (см. п. 1.1.1.) с получением белка HSP70A1В* молекулярной массы 70.45 кДа.

Inhibiting Substance) в качестве контроля (3); Мбелковые маркеры молекулярной массы.

Подавляющая часть сведений, касающихся свойств белков теплового шока в качестве противоопухолевых вакцин, получена в экспериментах с использованием природных HSPs [Srivastava P.K. et al., 1997]. Такие методики включают в себя накопление и гомогенизацию ткани, экстракцию целевого белка, а также фракционирование препарата с помощью нескольких хроматографических стадий. Основными недостатками получения HSPs из природных источников являются необходимость накопления опухолевых тканей, трудоемкость процесса выделения, малый конечный выход и не всегда достаточная степень чистоты и гомогенности полученных препаратов. Функции индивидуальных белков различных семейств HSPs до сих пор мало изучены, а исследование и их практическое использование требует препаративного количества высокоочищенных белков (или отдельных доменов). В связи с этим, представляется перспективным использование созданного нами высокоэффективного штамма E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70A1B для получения по упрощенной технологии и с высоким выходом рекомбинантного HSP70A1B человека.

1.2.2. Получение рекомбинантного AFP3D.

Для создания штамма-продуцента третьего домена альфа-фетопротеина человека рекомбинантной плазмидой pAFP28D3 были трансформированы компетентные клетки E.coli BL21(DE3), имеющие хромосомную копию гена Т РНК-полимеразы под контролем промотора lac UV5, индуцируемого изопропил--D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ).

Синтез рекомбинантного белка тестировали методом электрофореза в присутствии SDS. Целевой белок (~27 кДа) накапливался в клетках в виде телец включения с высоким выходом (рис. 6).

Выделенные тельца включения растворяли в буфере, содержащем 6М гуанидинхлорид, и подвергали очистке методом аффинной хроматографии на иминодиацетат-сефарозе, активированной ионами никеля. Связавшийся белок последовательным диализом относительно буферов E (0.1М Трис-HCl, 0.5М NaCl, 2мМ ЭДТА, рН 8.0) и F (0.01М Трис-HCl, 0.15М NaCl, рН 8.0).

Диализованный белок концентрировали на ячейке Amicon, фракционировали на колонке SuperdexTM 200, элюируя буфером F. Было выделено две фракции:

фракция I соответствует димеру, фракция II – мономеру AFP3D (рис. 7). Как видно из хроматограммы, эффективность получения мономера II достигает 40% от суммарного белка.

А Для оценки гомогенности очищенных фракций белка проводили электрофорез в 13% полиакриламидном геле в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях; чистота мономера составляла не менее 98% (рис. 8).

Следует отметить, что определяемая на электрофорезе полоса целевого мономера соответствует ~24 кДа, что не отвечает расчетной молекулярной массе - 27 кДа. Реальная масса AFP3D была определена массспектрометрически (MALDI-TOF). Оказалось, что около 70% белка имеет массу 27.058 кДа, а остальная часть - 27.200 кДа (рис. 9). Разница, составляющая около 150 Да, соответствует молекулярной массе N-концевого метионина, отщепляющегося в процессе клеточного биосинтеза. Конечный выход высокоочищенной мономерной формы AFP3D составил 5 мг с литра бактериальной культуры.

трудоемкий и дорогостоящий процесс, который требует использования моноклональных антител и значительное количество исходного материала.

Получение рекомбинантного альфа-фетопротеина связано со значительными трудностями ввиду его высокой молекулярной массы и наличия углеводных компонентов и внутримолекулярных дисульфидных связей. В значительной мере избежать этих затруднений позволяет использование генно-инженерных конструкций, обеспечивающих продукцию не целого белка, а его биологически активных фрагментов. В данной работе нами разработан технологический метод получения рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека, способного заменить использование как природного, так и рекомбинантного полноразмерного альфа-фетопротеина в качестве вектора для направленной доставки цитотоксических препаратов.

2. Определение активности рекомбинантных белков.

2.1. Исследование функциональной активности HSP70A1B.

Известно, что белки теплового шока в качестве шаперонов обеспечивают стабилизацию нативной конформации различных клеточных белков, их внутриклеточную транслокацию в различные компартменты клетки, используя активный ATP-зависимый конформационный процесс [Hartl F.U. et al., 1996].

Колориметрическим методом определили, что 1 мг рекомбинантного HSP70A1B человека (как выделенного из растворимой фракции, так и рефолдированного) гидролизует 2-4 нмоль ATP/мин при 30С, что указывает на биологическую активность целевого продукта. Также показано, что более 60% HSP70A1B (равно как и HSP70A1B*, не содержащий His-tag) связывается с ADP-агарозой, т.е. имеет нативную конформацию ATP-связывающего домена.

Помимо шаперонных функций HSP70 может принимать участие в развитии противоопухолевого иммунитета, обусловленного взаимодействием антигенпредставляющих клеток (АПК) с HSP70 путем рецепторопосредованного эндоцитоза через рецепторы CD91, CD40, LOX и некоторые другие [Arnold-Schild D. et al, 1999]. После интернализации связанные с HSP высвобождаются из эндосом в цитоплазму, подвергаются процессингу и образуют комплексы с молекулами МНС I, обеспечивая тем самым возможность индукции специфического клеточного иммунного ответа.

связыванию и эндоцитозу в качестве АПК были выбраны незрелые дендритные клетки, а в качестве метода детекции - проточная цитофлуориметрия.

Препараты рекомбинантных HSP70A1B и HSP70A1B*, предварительно меченные флуресцеинизотиоцианатом (FITC), инкубировали с дендритными клетками при двух температурных режимах: +4С в присутствии азида натрия и +37С. Известно, что при +4С мембранные рецепторы взаимодействуют со наблюдается только при +37С.

Как видно по уровню флуоресценции клеток (рис. 10), происходит не только связывание HSP70A1B и HSP70A1B* со специфическими рецепторами, представленными на используемых дендритных клетках, но и очень активный процесс интернализации (эндоцитоз) белковых препаратов. При этом, судя по сопоставимым средним значениям интенсивности флуоресценции (MFI), не были выявлены существенные различия между HSP70A1B и HSP70A1B*, что подтверждает предположение об отсутствии влияния His-tag не только на конформацию ATP-связывающего домена полученного нами рекомбинантного белка, но и на его способность к связыванию и эндоцитозу АПК.

нами рекомбинантного HSP70A1B человека гидролизовать ATP, связываться с эффективного эндоцитоза, являются качественной характеристикой белка для потенциального проявления противоопухолевого иммунитета.

2.2.1. Связывание и захват FITC-меченного AFP3D опухолевыми клетками рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина к связыванию со специфическим рецептором AFP на поверхности опухолевых клеток человека и связывания клетки инкубировали с флуоресцентно-меченным AFP3D (AFP3DFITC) при +4°С в течение часа, отмывали, фиксировали и измеряли флуоресценцию клеток на проточном цитофлуориметре. Было показано, что AFP3D-FITC связывается с опухолевыми клетками (карциномами яичника линии SKOV3 и молочной железы линии MCF-7) и практически не связывается с нестимулированными лимфоцитами периферической крови (рис. 11).

Интенсивность флуоресценции, отн.ед.

специфичность связывания AFP3D с рецептором AFP. Интенсивность Данная часть работы проводилась при участии в.н.с. Московского НИИ медицинской экологии, к.б.н. Г.А. Посыпановой.

флуоресценции клеток, обработанных AFP3D-FITC (до концентрации 1 мкM) была близка к флуоресценции клеток, обработанных AFP-FITC (рис. 12а). Для исследования специфичности связывания, клетки SKOV3 инкубировали с AFP3D-FITC в присутствии 30-кратного избытка AFP человека в течение часа при +4°C. Инкубация SKOV3 в этих условиях приводила к значительному снижению связывания AFP3D-FITC с опухолевыми клетками (рис. 12б). Из рисунка видно, что природный AFP в значительной степени ингибировал связывание AFP3D-FITC с клетками. Эти данные подтверждают, что AFP3D действительно связывается с рецептором AFP на опухолевых клетках и конкурирует с AFP за сайт связывания.

Рис. 12. а) Сравнение связывания AFP-FITC и AFP3D-FITC с клетками карциномы яичника человека SKOV3; б) Ингибирование связывания AFP3D-FITC 30-кратным избытком AFP с клетками карциномы яичника человека SKOV3 (инкубация 1 ч, +4°С).

лимфоцитами периферичекой крови человека показало, что опухолевые линии MCF-7 и SKOV3 активно эндоцитируют AFP3D-FITC (рис. 13), причем Интенсивность флуоресценции, отн.ед.

особенно высоким захват был в клетках аденокарциномы яичника SKOV3. В лимфоцитах эндоцитоз AFP3D-FITC практически отсутствовал. Эти данные хорошо коррелируют с полученными ранее результами по связыванию и эндоцитозу природного полноразмерного альфа-фетопротеина человека опухолевыми клетками линий MCF-7, SKOV3 и лимфоцитами [Ницветов М.Б.

и др., 2001].

Исследование препаратов клеток SKOV3 через 24 часа после инкубации с AFP3D-FITC с помощью флуоресцентной микроскопии подтвердило, что клетки активно захватывают AFP3D-FITC (рис. 14).

Рис. 14. Распределение AFP3D-FITC в клетках карциномы яичника человека линии SKOV3 после 24 ч инкубации: а) зеленая флуоресценция FITC-меченого AFP3D, б) ядро клетки, окрашенное Hoechst, с) фазовый контраст (фотография любезно предоставлена Г.А. Посыпановой).

Интересно, что в отличие от AFP-FITC, флуоресценция наблюдалась не только в цитоплазматических компартментах (эндосомах, мультивезикулярных тельцах, комплексе Гольджи), окружающих ядро [Alava M.A. et al., 1999], но и в клеточных ядрах. По-видимому, это связано с тем, что в рекомбинатном третьем домене экспонируется на поверхность один (или более) из так называемых сигналов ядерной локализации, который маскируется в молекуле AFP вторым и первым доменами.

эндоцитировать в опухолевые клетки и конкурировать с молекулами природного альфа-фетопротеина за рецептор указывает на то, что структура рецептор-связывающего участка полученного нами рекомбинантного домена белка не претерпела существенных изменений.

аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 in vitro.

Одним из параметров биологической активности альфа-фетопротеина является его способность ингибировать эстрадиол-индуцированный рост гормон-зависимых опухолевых клеток как in vivo, так и in vitro [Bennett J.A. et пролиферацию клеток аденокарциномы молочной железы MCF-7 in vitro. Для этого клетки MCF-7 инкубировали до достижения монослоя в среде DMEM без фенолового красного, содержащей 5% бычью сыворотку новорожденных (NBS, CE23 пг/мл). Для стимуляции пролиферации к клеткам добавляли E2 в концентрации 10-9 M. В этих условиях через 72 часа стимуляция пролиферации клеток, оцениваемая по включению [3H]-тимидина в ДНК, составляла в среднем 165% от контроля. При одновременном с E2 добавлении к клеткам AFP или AFP3D в диапазоне концентраций 10-11-10-6 M включение [3H]-тимидина значительно снижалось (117±5.85% для AFP и 120±4.8% для AFP3D) (рис. 15).

повышении концентрации до 10-8 M эффект исчезал.

Включение [3H]тимидина, % от контроля 2.2.3. Исследование цитотоксической активности конъюгата AFP3DТаксол.

рекомбинантного третьего домена AFP подтвердило, что AFP3D обладает связываться со специфическим рецептором AFP и ингибировать пролиферацию эстроген-зависимых клеток in vitro.

Ранее было показано, что конъюгаты AFP человека c доксорубицином [Severin S.E. et al., 1996], и некоторыми другими противоопухолевыми лекарствами [Severin S.E. et al., 1997] эффективно подавляют рост опухолевых клеток как in vitro, так и in vivo. Однако широкое применение AFP в качестве универсального белка-транспортера лекарственных соединений в раковые клетки ограничено тем, что выделение в достаточных для производства лекарственных препаратов количествах AFP сопряжено с технологическими трудностями.

биологически активного AFP3D в качестве вектора для направленного транспорта химиопрепаратов нами был синтезирован конъюгат AFP3D с таксолом - цитотоксическим агентом, широко применяющимся в медицинской немелкоклеточным раком легкого.

Таксол (международное название – паклитаксел; химическая формула полимеризации клеточного белка тубулина и в образовании чрезмерного количества дефектных микротрубочек. Следствием нарушения функции микротрубочкового аппарата опухолевой клетки является блокирование процесса ее деления, а также повреждение цитоскелета, приводящее к трансмембранных сигналов.

рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина в качестве вектора, конъюгированного с таксолом, для направленной доставки цитотоксического препарата непосредственно в клетки опухоли.

Рис. 16. Схема синтеза конъюгата третьего домена альфа-фетопротеина с таксолом.

Конъюгат AFP3D с таксолом был получен с использованием ангидрида глутаровой кислоты для модификации таксола. Схема получения конъюгата приведена на рис. 16. Из литературных данных известно, что реакция таксола с ангидридами янтарной или глутаровой кислот при комнатной температуре в растворе пиридина дает С2'-монопроизводное таксола, т.к. именно реакционноспособной по сравнению с другими группами молекулы таксола [Deutsch H.M. et al., 1989]. Показано также, что модификация С2'-положения молекулы не влияет на цитотоксичность таксола [Lataste H. et al., 1984]. Таким образом, для осуществления синтеза не требуется предварительного введения защитных групп и специфических условий проведения реакции, что значительно упрощает и удешевляет технологию получения исследуемого конъюгата.

Соотношение компонентов в конечном продукте оценивали на основе результатов фотометрического определения белка с использованием медного комплекса бицинхониновой кислоты [Wiechelman K.J. et al., 1988] и определения количества таксола с помощью ВЭЖХ. Молярное соотношение AFP3D:Таксол составило 1:1.5, т.е. конъюгат содержал 1-2 молекулы таксола, ковалентно связанных с одной молекулой рекомбинантного белка.

цитотоксической активности (ЦТА) in vitro на культуре клеток карциномы дозозависимую ЦТА в отношении указанной линии опухолевых клеток, при этом ЦТА исследуемого конъюгата была сравнима с активностью конъюгата AFP-Таксол (рис. 17).

Конъюгаты AFP3D-Таксол и AFP-Таксол оказались не токсичнее свободного таксола (рис. 17), что, по-видимому, связано с тем, что значительной мере определяется количеством рецепторов векторного белка на поверхности опухолевых клеток, различиями в сродстве вектора к его рецептору, а также скоростью рецептор-опосредованного эндоцитоза.

Выживаемость, % Следует учитывать, что in vivo противоопухолевые лекарственные соединения (в частности, таксол) легко проникают не только в опухолевые, но и во все типы нормальных клеток, что является причиной возникновения конъюгаты AFP-Таксол и AFP3D-Таксол будут проникать, главным образом, в опухолевые клетки, гиперэкспрессирующие рецептор альфа-фетопротеина, минимальным. Поэтому, несмотря на большие значения ЦТА конъюгатов по сравнению с ЦТА свободного таксола in vitro, преимущество конъюгатов при их терапевтическом применении in vivo представляется очевидным.

Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о том, что полученный нами рекомбинантный третий домен альфа-фетопротеина AFP3D обладает высоким векторным потенциалом (очень близким к потенциалу полноразмерной молекулы природного AFP) для доставки цитотоксических химиопрепаратов в клетки злокачественных опухолей. При этом нормальные клетки поражаются подобными препаратами в значительно меньшей степени, что дает возможность практического использования уникальных свойств злокачественных новообразований.

ВЫВОДЫ

1. Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК pET-hHSP70A1B, а также создан высокоэффективный штамм-продуцент E.coli BL21(DE3)/pEThHSP70A1B, который позволяет осуществлять получение по упрощенной технологии белка теплового шока человека HSP70A1B, относящегося к шаперонному семейству HSP70.

2. Продемонстрировано, что рекомбинантный HSP70A1B обладает биологической (ATP-гидролизующей) активностью, способен связываться и активно интернализоваться дендритными клетками, подтверждая свои потенциальные иммуномодулирующие свойства.

3. В экспрессионной системе E.coli получен рекомбинантный фрагмент альфафетопротеина человека, соответствующий третьему домену белка (AFP3D) и разработан технологический метод его получения.

4. Исследована биологическая активность рекомбинантного третьего домена альфа-фетопротеина человека. Показано, что AFP3D обладает такими важными свойствами полноразмерного AFP, как способность связываться со специфическим рецептором AFP на опухолевых клетках и ингибировать пролиферацию эстроген-зависимых клеток in vitro.

5. Синтезирован конъюгат рекомбинантного третьего домена альфафетопротеина человека AFP3D c противоопухолевым препаратом (таксол), который обладает цитотоксической активностью в отношении опухолевых клеток линии MCF-7. Это дает возможность практического использования AFP3D в качестве вектора для создания новых эффективных средств направленной доставки для лечения злокачественных новообразований.

1. Савватеева Л.В., Гороховец Н.В., Черников В.А. Данилевский М.И., Северин С.Е. Получение рекомбинантного HSP70А1В человека. Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 2007, №3, с. 38-42.

2. Гороховец Н.В., Савватеева Л.В., Северин Е.С., Северин С.Е.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pET-hHSP70, кодирующая белок теплового шока человека HSP70, и штамм E.coli BL21(DE3)/pET-hHSP70продуцент белка теплового шока человека HSP70. Заявка на выдачу патента РФ № 2006140913 от 21.11.2006.

3. Savvateeva L, Gorokhovets N, Makarov V, Posypanova G, Severin S.

Recombinant third domain of human alpha-fetoprotein: selectivity and antitumor activity of conjugate with Taxol. Abstracts of the XXXIII Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (ISOBM), Rhodes, Greece, September 24-28, 2005, p. 84.

4. Savvateeva L, Gorokhovets N, Posypanova G, Makarov V. Recombinant domain III of human alpha-fetoprotein–new vector for antitumor drug delivery. Abstracts of the 19th Meeting of the European Association for Cancer Research (EACR), Budapest, Hungary, July 1-4, 2006, p. 86.

5. Савватеева Л.В., Гороховец Н.В., Черников В.А. Данилевский М.И., Северин С.Е. Получение рекомбинантного HSP70 человека. Тезисы докладов Российского Медицинского Форума-2006 «Фундаментальная наука и практика», Москва, 18-20 октября, 2006, с. 119.

6. Savvateeva LV, Gorokhovets NV, Chernikov VA, Danilevskiy MI, Severin SE.

Recombinant human HSP70 and its potential application in cancer immunotherapy. Abstracts of the International Scientific-Practical Interdisciplinary Workshop “New Technologies in Medicine and Experimental Biology”, Bangkok-Pattaya, Thailand, February 28-March 8, 2007, p. 62.



 
Похожие работы:

«ЗНАК НАТАЛИЯ ЕВГЕНЬЕВНА ТЕОРИЯ РОСТА И ИСПАРЕНИЯ АЭРОЗОЛЬНЫХ КАПЕЛЬ ВО ВНЕШНЕЙ ГАЗОВОЙ СРЕДЕ Специальность 03.00.16 – Экология (физико-математические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2008 2 Работа выполнена на кафедре теоретической физики Московского государственного областного университета заслуженный деятель науки РФ, Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Яламов Юрий...»

«ХМЕЛЕВА АННА НИКОЛАЕВНА ВЛИЯНИЕ УЛЬТРАЗВУКОВОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА РИЗОГЕННУЮ АКТИВНОСТЬ РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ В ПРИСУТСТВИИ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА специальность 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул 2009 2 Работа выполнена на кафедре общей химии и экспертизы товаров Бийского технологического института (филиал) ГОУ ВПО Алтайский государственный технический университет им. И.И. Ползунова. доктор химических наук,...»

«БЕЛОЗЕРОВА Наталья Сергеевна Влияние цитокининов и салициловой кислоты на экспрессию генов митохондриальных белков 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в лаборатории экспрессии генома растений Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, Москва Научный руководитель : Кандидат биологических наук Пожидаева Елена...»

«Васильева Галина Валериевна СЕМЕННАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ И РОСТ ПОТОМСТВА ЕСТЕСТВЕННЫХ ГИБРИДОВ МЕЖДУ КЕДРОМ СИБИРСКИМ (PINUS SIBIRICA DU TOUR) И КЕДРОВЫМ СТЛАНИКОМ (P. PUMILA (PALL.) REGEL) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте мониторинга климатических и экологических систем Сибирского отделения РАН, г. Томск Научный руководитель : кандидат...»

«МУРАЛЕВ Сергей Григорьевич АГРОПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРАНУЛОМЕТРИЧЕСКОГО СОСТАВА ПОЧВ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ Специальность: 03.02.13 - почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре почвоведения и природообустройства Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии кандидат сельскохозяйственных наук, Научный руководитель :...»

«ЛАЗАРЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ СЕМЯН У ВИДОВ И СОРТОВ ГРЕЧИХИ FAGOPYRUM MILL. 03.00.12 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург– 2007 2 Работа выполнена в лаборатории биохимии Всероссийского научноисследовательского института зернобобовых и крупяных культур (Орел) в 2003гг. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Павловская Нинель Ефимовна Официальные...»

«ДОБРОТВОРСКАЯ Ирина Сергеевна ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ОТ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА АНТИОКСИДАНТОВ И МОДУЛЯТОРОВ АКТИВНОСТИ ГЛУТАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ Специальность 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научном центре неврологии РАМН Научный руководитель : Доктор биологических наук Федорова Татьяна Николаевна Официальные...»

«ПОПОВА ЮЛИЯ АЛЕКСАНДРОВНА ДЕТОКСИКАЦИЯ ПОЧВ ЗОНЫ ВЛИЯНИЯ НОВОЧЕРКАССКОГО ЭЛЕКТРОДНОГО ЗАВОДА ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПОЛИЦИКЛИЧЕСКИМИ АРОМАТИЧЕСКИМИ УГЛЕВОДОРОДАМИ И ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ 03.00.27 - почвоведение 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2007 2 Работа выполнена на кафедре Инженерная экология и защита окружающей среды ГОУ ВПО Южно-Российский государственный технический университет (Новочеркасский...»

«Воробьев Алексей Викторович ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕТАНО- И МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА BEIJERINCKIACEAE Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель : доктор биологических наук С.Н. Дедыш Официальные оппоненты : доктор...»

«Синежук Екатерина Борисовна ДЕМОНСТРАТИВНАЯ ПЕСНЯ ОБЫКНОВЕННОЙ ЧЕЧЕВИЦЫ CARPODACUS ERYTHRINUS (PALLAS, 1770): СТРУКТУРА, ИНДИВИДУАЛЬНАЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 03.02.04 - Зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 Работа выполнена на кафедре Зоологии позвоночных федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«  БЛАГОДАТНОВА Анастасия Геннадьевна САМЫЙ ЛУЧШИЙ АВТОРЕФЕРАТ В МИРЕ Самый лучший автореферат ПОЧВЕННЫЕ ВОДОРОСЛИ БОЛОТНЫХ ЭКОСИСТЕМ (ПЛЕСЕЦКИЙ РАЙОН АРХАНГЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.01 - Ботаника 03.02.08 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2010 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии ГОУ ВПО Новосибирского государственного педагогического университета Научный руководитель – доктор биологических наук,...»

«Уфимцев Владимир Иванович ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА СОСТОЯНИЕ НАСАЖДЕНИЙ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (Pinus sylvestris L.) НА ОТВАЛАХ КУЗБАССА 03.02.08 – Экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2011 Работа выполнена в Институте экологии человека СО РАН (г. Кемерово) в отделе Кузбасский ботанический сад. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Куприянов Андрей Николаевич Официальные...»

«ПОЛЕНОГОВА Ольга Викторовна ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВО И ПРОЯВЛЕНИЕ ПОЛИЭДРОЗА У НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (Lymantria dispar L.) 03.02.05. - энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный доктор биологических наук руководитель: Ильиных Александр Васильевич...»

«Тимонин Андрей Николаевич БИОСЕНСОРНЫЕ МАТЕРИАЛЫ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК С ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ ПРОИЗВОДНЫМИ КРАУНЭФИРОВ 03.01.04-биохимия 03.01.06-биотехнология (в том числе бионанотехнологии). Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2010 www.sp-department.ru Работа выполнена в ФГОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина (ФГОУ ВПО МГАВМиБ) Научные руководители:...»

«Хархун Екатерина Викторовна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТАГОНИЗМА PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AUREOFACIENS ПРИ СОЗДАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СОСТОЯНИЕ МИКРОБОЦЕНОЗА ПОЧВЫ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, профессор, Научный...»

«БРИЛЛИАНТОВА Анна Николаевна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ ВАНКОМИЦИН-УСТОЙЧИВЫХ Enterococcus faecium В ГЕМАТОЛОГИИ 14.01.21 гематология и переливание крови 03.01.03 молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научные руководители: кандидат медицинских наук Г.А.Клясова доктор...»

«ЦИБУЛЬКИНА Елена Арнольдовна ИММУНОЛИПОСОМАЛЬНЫЕ СИСТЕМЫ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА МАЛЫХ ИНТЕРФЕРИРУЮЩИХ РНК В КЛЕТКИ-МИШЕНИ 03.00.23 – биотехнология 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М. В. Ломоносова и в лаборатории иммунохимии отдела биологической психиатрии ФГУ Государственного научного...»

«НИКОЛАЕВ Кирилл Евгеньевич ОСОБЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ ЖИЗНЕННЫХ ЦИКЛОВ ТРЕМАТОД СЕМЕЙСТВ ECHINOSTOMATIDAE И RENICOLIDAE В ЛИТОРАЛЬНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ КАНДАЛАКШСКОГО ЗАЛИВА БЕЛОГО МОРЯ 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологический Институт Российской Академии Наук Научный руководитель : Галактионов Кирилл Владимирович,...»

«КУТРОВСКИЙ МИХАИЛ АЛЕКСЕЕВИЧ ЭКОЛОГО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РЕНДЗИН ЧЕРНОМОРСКОГО ПОБЕРЕЖЬЯ КАВКАЗА 03.00.16 – экология 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2006 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Ростовского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Вальков Владимир Федорович Официальные...»

«ПАНОВ Алексей Валерьевич ОБОСНОВАНИЕ, ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЗАЩИТНЫХ И РЕАБИЛИТАЦИОННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ НА ТЕРРИТОРИЯХ, ПОДВЕРГШИХСЯ ЗАГРЯЗНЕНИЮ ПОСЛЕ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС Специальность: 03.00.01 – радиобиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Обнинск - 2009 2 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научноисследовательской институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.