WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Еремеева Елена Владимировна

ФОРМИРОВАНИЕ АКТИВНОГО ФОТОПРОТЕИНОВОГО

КОМПЛЕКСА НА ПРИМЕРЕ ОБЕЛИНА И АКВОРИНА

И ИХ МУТАНТНЫХ ФОРМ

03.01.02 – биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск – 2010

Работа выполнена в лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, г. Красноярск

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук Высоцкий Евгений Степанович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Гаевский Николай Александрович Кандидат биологических наук Межевикин Владислав Валентинович

Ведущая организация:

Государственное учебно-научное учреждение Химический факультет Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Защита состоится « » 2010 г. в час. на заседании диссертационного совета Д 003.007.01 в Институте биофизики СО РАН по адресу:

660036, г. Красноярск, Академгородок, д. 50, стр. 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики СО РАН.

Автореферат разослан «_»_ 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Франк Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Несмотря на то, что биолюминесценция была открыта более 100 лет назад, интерес ученых к изучению этого явления не только не ослабевает, но и возрастает. Главным образом это обусловлено тем, что в настоящее время биолюминесцентные белки нашли широкое аналитическое применение в различных областях. Поскольку свет с помощью современных регистрирующих приборов может быть измерен с высокой чувствительностью, методы с использованием биолюминесцентных белков позволяют измерять вещества даже ниже 10-18 моля.

Биолюминесценция – явление, широко представленное в природе и присущее многим организмам в различных филогенетических ветвях: от бактерий до рыб. Широко распространены виды, использующие в качестве субстрата биолюминесцентной реакции целентеразин: это мягкий коралл Renilla, креветки Oplophorus, медузы Periphylla, копеподы Gaussia и Metridia, остракоды Conchoecia, цефалоподы Vampyroteuthis и другие. Наиболее изученными белками, использующими целентеразин в качестве субстрата, являются Са2+регулируемые фотопротеины, ответственные за свечение ряда морских кишечнополостных организмов.





Все Са2+-регулируемые фотопротеины, исследованные к настоящему времени, демонстрируют высокую степень гомологии как аминокислотных последовательностей, так и пространственных структур. Фотопротеины являются односубъединичными белками (~22 кДа), содержащими три Са2+-связывающих центра «EF-hand» типа. Фотопротеины представляют собой стабильный фермент-субстратный комплекс, состоящий из апофотопротеина, и молекулы органического субстрата – преактивированного кислородом целентеразина (2гидропероксицелентеразина), который прочно, но нековалентно связан с белком. Связывание ионов кальция с фотопротеином, приводящее к изменению конформации белка, запускает реакцию декарбоксилирования 2гидропероксицелентеразина, в результате которой образуется целентерамид в возбужденном состоянии и СО2. Переход целентерамида из возбужденного состояния в основное сопровождается излучением кванта света.

Предыдущие исследования фотопротеинов были направлены в основном на изучение механизма биолюминесценции, и в данной области был достигнут значительный прогресс. Однако, несмотря на широкое применение рекомбинантных фотопротеинов, процесс формирования активного ферментсубстратного комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода все еще очень слабо изучен, и его молекулярный механизм по-прежнему остается загадкой.

Выяснение молекулярного механизма формирования активного фотопротеинового комплекса, безусловно, имеет и фундаментальное, и прикладное значение, так как является необходимым шагом в понимании механизма биолюминесценции и, в перспективе, будет способствовать существенному повышению эффективности аналитического применения фотопротеинов, в особенности при их использовании в качестве репортерных молекул in vivo.

Цель и задачи исследования. Целью представленной работы являлось исследование процесса образования активного Са2+-регулируемого фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода, а также функциональной роли отдельных аминокислотных остатков активного центра фотопротеинов в этом процессе.

Выполнение данного исследования требовало:

1. Исследовать кинетические характеристики образования активного фотопротеинового комплекса на примере формирования активного обелина и акворина из апобелка, целентеразина и молекулярного кислорода и разработать математическую модель, описывающую этот процесс.

2. Для выявления функциональной роли аминокислот целентеразинсвязывающей полости в формировании активного фотопротеина методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получить мутанты обелина и акворина с заменами His175, Trp179 и Tyr190 на остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей, выделить мутантные белки в гомогенном виде и изучить их основные физико-химические При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:





1. Образование активного фотопротеинового комплекса является двухстадийным процессом, в котором первый этап соответствует формированию комплекса между апофотопротеином и целентеразином и занимает миллисекунды. Вторая стадия соответствует конвертации связанного целентеразина в 2-гидропероксицелентеразин и занимает от нескольких десятков минут до нескольких часов в зависимости от состояния апобелка и условий инкубации с субстратом, что свидетельствует о том, что данная стадия является лимитирующей в образовании активного фотопротеина.

2. Согласно предложенному механизму образования активного фотопротеинового комплекса, His175 выполняет функцию переносчика протона от N7-атома азота на С2-атом углерода целентеразина, а Tyr138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома углерода, необходимое для образования 2гидропероксицелентеразина.

Научная новизна и практическая ценность работы. Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, поскольку добавляют новую информацию к пониманию механизма образования активного фотопротеинового комплекса. Кроме того, полученные результаты могут найти применение в прикладных исследованиях. К примеру, возможность управлять процессом образования активного фотопротеинового комплекса чрезвычайно важна для использования фотопротеинов в качестве репортерных молекул in vivo, так как фотопротеины экспрессируются внутри клетки-мишени в форме апобелков и там же конвертируются в форму активного фотопротеина инкубацией с экзогенным целентеразином.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Сан-Диего, США, 2006; Шанхай, Китай, 2008; Лион, Франция, 2010), на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН, департамента биохимии Университета Вагенингена (Вагенинген, Нидерланды) и Национальной лаборатории Биомакромолекул Института биофизики Китайской академии наук (Пекин, Китай).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Структура и объем работы. Работа изложена на 121 странице машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение результатов исследования, заключение, выводы и список цитируемой литературы (115 источников). Диссертационная работа проиллюстрирована 35 рисунками, содержит 8 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Штаммы-продуценты, экспрессирующие апообелин и апоакворин, были сконструированы старшим научным сотрудником лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН Марковой С.В. Для получения мутантов обелина и акворина с точечными заменами использовали набор для мутагенеза QuickChange sitedirected mutagenesis kit.

Трансформированные клетки E. coli (штаммы BL21 Gold и XL1-Blue) культивировали в LB-среде, содержащей ампициллин (200 мг/мл) при 37°C.

Индукцию лактозного оперона осуществляли добавлением в культуральную среду ИПТГ в конечной концентрации 0,5 мМ при достижении клетками оптической плотности ОD590= 0,7-0,8 и растили 3 часа при интенсивном перемешивании. Выделение и очистку апообелина и апоакворина, а также их мутантов из телец включений проводили по методу, разработанному в лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН для рекомбинантного апообелина дикого типа с небольшими модификациями.

Для всех экспериментов по исследованию связывания с целентеразином и кинетики формирования активного комплекса апофотопротеины инкубировали в течение ночи с 10 мМ дитиотреитола и пропускали через колонку Superdex 200, для того чтобы получить мономерную форму апофотопротеинов, свободную от дисульфидных связей и агрегатов.

Измерение собственной флуоресценции апофотопротеинов проводили на спектрофлуориметре AMINCO, оснащенном системой контроля температуры.

Длина волны возбуждения – 295 нм, спектр записывался в диапазоне от 300 до 500 нм при 20°С. Во всех измерениях использовалась постоянная концентрация апобелка – 1,22 мкM. Спектры корректировали на разведение образца за счет добавления раствора целентеразина и на эффект внутреннего фильтра, наблюдающегося при взаимодействии белка и лиганда.

Кажущиеся константы диссоциации для комплекса апофотопротеинцелентеразин определяли из тушения триптофановой флуоресценции апофотопротеинов разными концентрациями субстрата, целентеразина. Данные анализировали исходя из предположения, что фракция связанного целентеразина соответствует отношению тушения флуоресценции (Q = F0 – Fq) к максимальному тушению (Qmax = F0 – Fqmax), где F0, Fq и Fqmax – интенсивности флуоресценции при 336 нм без добавления субстрата, в присутствии субстрата и при насыщающей концентрации субстрата, соответственно. Для расчета кажущихся констант диссоциации использовали формулу:

где С, L и KD – концентрации апофотопротеина и целентеразина, и константа диссоциации, соответственно.

Апофотопротеины активировали инкубацией апобелков с 15-кратным молярным избытком синтетического целентеразина (0,05 мкM) при температуре 20°С. Кинетику активации апофотопротеинов определяли по биолюминесцентной активности в аликвотах зарядочной смеси, отобранных через определенные промежутки времени. Биолюминесценцию регистрировали с помощью люминометра БЛМ8802, оснащенного нейтральными фильтрами с различными коэффициентами пропускания для расширения линейного диапазона измерения.

Спектры поглощения регистрировали при помощи спектрофотометра UVIKON 943. Для определения кинетических параметров и относительной удельной активности биолюминесценцию фотопротеинов измеряли с помощью планшетного люминометра Luminoskan Ascent. Спектры биолюминесценции и флуоресценции измеряли на спектрофлуориметре AMINCO. Все спектры корректировали на спектральную чувствительность ФЭУ, а также на спад биолюминесцентного сигнала. Измерение кинетики тушения флуоресценции триптофанов с помощью метода остановленной струи проводили на «stopped-flow»

спектрометре Hi-Tech SF-51 при 20оС.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Связывание целентеразина с апофотопротеинами Все Са2+-регулируемые фотопротеины, аминокислотные последовательности которых известны к настоящему моменту, содержат 6 триптофановых остатков; 4 из них (Trp92, Trp114, Trp Рис. 1. Пространственная структура хроматографией на колонке Mono Q, обелина (PDB код 1QV0). Молекула 2- характерен очень слабый уровень собгидропероксицелентеразина показана стрелкой.

флуоресценции апофотопротеинов (рис. 2). Очевидно, что связывание целентеразина с апобелком с последующим формированием активного фотопротеинового комплекса приводит к тушению собственной флуоресценции. Поскольку спектр поглощения целентеразина в буфере имеет плечо при 340 нм, что соответствует максимуму флуоресценции триптофанов апофотопротеинов, можно предположить, что увеличение интенсивности флуоресценции целентеразина при взаимодействии с апобелком происходит вследствие резонансного переноса энергии между триптофанами и связанным целентеразином (рис. 3). Поскольку целентеразин обладает слабой флуоресценцией, можно также предположить, что именно резонансный перенос энергии приводит к тушению собственной флуоресценции апофотопротеинов при связывании с целентеразином.

Рис. 2. Спектры флуоресценции апо- Рис. 3. Спектры флуоресценции обелина (пунктирная линия), актив- апообелина (пунктирная линия), ного обелина отделенного ионооб- свежеприготовленного целентеразименной хроматографией на колонке на (черная линия) и их смеси в моMono Q от незаряженного апобелка лярном соотношении 1:1 (серая литемно-серая линия) и свежеприго- ния). Возбуждение при 295 нм для товленного целентеразина (черная всех измерений; концентрация аполиния). Возбуждение при 295 нм для обелина и целентеразина – 1, всех измерений; концентрация всех мкМ.

образцов – 1,22 мкМ.

С помощью последовательной замены триптофанов на фенилаланин определен вклад каждого остатка триптофана в собственную флуоресценцию апообелина (рис. 4). Несмотря на то, что Trp92 находится глубоко в целентеразинсвязывающей полости белка (рис. 1.), интенсивность собственной флуоресценции мутанта W92F снижена примерно на 40% по сравнению с флуоресценцией обелина дикого типа (рис. 4). Trp114, Trp179 и Trp18, из которых два, Trp114 и Trp179, также как и Trp92, находятся в целентеразин-связывающей полости, вносят по 20% в собственную флуоресценцию апообелина (рис. 4). Замена Trp135, четвертого триптофана субстрат-связывающей полости, практически не влияет на общий уровень собственной флуоресценции, что, по-видимому, обусловлено тушением его флуоресценции аминокислотным окружением. Trp103 – единственный остаток триптофана, расположенный на поверхности молекулы фотопротеина (рис. 1). Однако вклад этого триптофана в собственную флуоресценцию апообелина составляет только около 5% (рис. 4). Вполне вероятно, что именно этот триптофан ответственен за слабую собственную флуоресценцию активного фотопротеина, интенсивность которой составляет примерно 5-6% от флуоресценции апофотопротеина (рис. 2).

константы диссоциации для комплексов апообелин–целентеразин и апоакворин–целентеразин, которые составили 1,2 ± 0,12 мкM – в случае апоакворина и 0,2 ± 0,04 мкM – в случае Рис. 4. Нормированные спектры флуо- целентеразин не являются равновесресценции апообелина дикого типа и ными константами диссоциации (или его мутантов W18F, W92F, W103F, ассоциации), так как диссоциацию цеW114F, W135F, и W179F. Возбужделентеразина из комплекса при быстние при 295 нм для всех измерений.

ром разбавлении образца зафиксировать не удалось. Таким образом, в данном случае более корректно использовать термин «кажущиеся константы диссоциации».

Попытки определить кинетические параметры связывания целентеразина с апобелком с помощью метода остановленной струи (stopped-flow) потерпели неудачу. Связывание целентеразина с апобелком оказалось настолько быстрым, что использованное оборудование («мертвое время» 1,5 мс) не позволило зарегистрировать кинетику тушения собственной флуоресценции. Однако из этого следует вывод, что связывание целентеразина происходит менее чем за 1,5 мс и, следовательно, с большой скоростью.

Рис. 5. Тушение собственной флуоресценции апофотопротеинов целентеразином. А – спектры флуоресценции апообелина в диапазоне 310–380 нм без добавления (а) и в присутствии 1,22 (б) и 9,15 мкМ (в) целентеразина. Б – определение кажущихся констант диссоциации для комплексов апообелин– () и апоакворин–целентеразин () по тушению собственной флуоресценции при связывании целентеразина. Возбуждение при 295 нм.

2. Кинетика формирования активного фотопротеинового комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода Скорость образования активного фотопротеинового комплекса зависит от состояния апобелка, инкубируемого с целентеразином. В случае если для активации используется апофотопротеин, получаемый после экспрессии и очистки с помощью ионообменной хроматографии, который представляет собой смесь агрегированной и мономерной форм апобелка, время образования активного фотопротеинового комплекса составляет примерно 3 часа при 20°С. Однако, если для активации использовать только мономерную фракцию апофотопротеинов, то скорость образования активного фотопротеинового комплекса значительно возрастает: для апообелина концентрация активного комплекса при 20°С достигает максимума уже через 15 минут после начала инкубации с субстратом (рис. 6).

Упрощенно формирование активного фотопротеина из апобелка, целентеразина и кислорода может быть представлено как двухстадийный процесс:

где S1, целентеразин; S2, молекулярный кислород; X, апофотопротеин; X1, комплекс апофотопротеина с целентеразином; X2, активный фотопротеин; k1, и k2, константы скорости реакции. На первом этапе образуется комплекс между апофотопротеином и целентеразином. Этот процесс очень быстрый, занимающий менее 1,5 мс. Второй этап соответствует образованию 2-гидропероксицелентеразина из связанного целентеразина и молекулярного кислорода.

Для мономерной формы апофотопротеина продолжительность процесса составляет 15-20 мин (рис. 6).

Рис. 6. Кинетика образования актив- Рис. 7. График Аррениуса для обраного обелина из мономерной формы зования активного фотопротеиновоапообелина, целентеразина и кисло- го комплекса из мономерного апорода. RLU – относительные люми- обелина, целентеразина и кислорода.

несцентные единицы. Каждая точка выполнена в трех повторах.

Мы не рассматриваем обратные процессы (k-1 и k-2), так как экспериментально диссоциацию целентеразина из комплекса с апобелком при разбавлении образца зарегистрировать не удалось, а образование целентеразина из 2гидропероксицелентеразина вряд ли возможно. Кроме того, так как, исходя из пространственных структур различных конформационных состояний фотопротеинов, сложно предположить наличие какого-либо специфического сайта связывания кислорода, исключен из кинетической схемы и промежуточный комплекс XS1S2, в котором апофотопротеин, целентеразин и кислород связаны одновременно.

На основании кинетической схемы предложена математическая модель, описывающая формирование активного фотопротеинового комплекса из апофотопротеина, целентеразина и кислорода, которая может быть записана в виде системы дифференциальных уравнений:

Начальные условия: X(0) = X0; X1(0) = 0; X2(0) = 0. При S1 и S2 X систему дифференциальных уравнений можно записать в виде:

где S10 и S20 – начальные концентрации целентеразина и молекулярного кислорода, соответственно.

В результате решения системы дифференциальных уравнений получено уравнение зависимости концентрации комплекса от времени инкубации:

верное при условии k1S10 k 2 S 20.

Данное уравнение полностью соответствует уравнению, описывающему необратимую бимолекулярную химическую реакцию A + B C. В сущности, формирование 2-гидропероксицелентеразина можно рассматривать как обычную химическую реакцию целентеразина с молекулярным кислородом, но происходящую в белковом окружении.

Для оценки константы скорости формирования активного обелина использовали уравнение для X2(t) и экспериментальные данные по активации мономерного апобелка, представленные на рис. 6. Константа скорости образования активного обелина из апобелка, целентеразина и кислорода при температуре 20°С и pH 6,5 составила 11 ± 0,4 M-1сек-1. Из зависимости константы скорости от температуры в диапазоне от 4 до 20°С и фиксированном рН 6,5 (рис. 7) определена также энергия активации (Ea) образования активного обелина, которая составила 45,0 кДж/моль.

3. Характеристика мутантов обелина и акворина с заменами His175, Tyr190 и Trp Согласно пространственным структурам обелина и акворина атомы боковых цепей His, Trp и Tyr (His175, Trp179 и Tyr190 в случае обелина) формируют водородные связи с 2-гидроперокси-группой и карбонильной группой 2гидропероксипроизводного целентеразина (рис. 8). Предполагается, что именно водородные связи между 2-гидроперокси-группой и атомами этих аминокислотных остатков стабилизируют нестабильную молекулу 2-гидропероксицелентеразина в целентеразин-связывающей полости фотопротеинов.

Для выяснения функциональной роли His, Trp и Tyr и водородных связей, которые они образуют, в формировании активного фотопротеинового комплекса с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза эти аминокислоты были заменены аминокислотными остатками с различными донорноакцепторными свойствами боковых цепей как в обелине, так и в акворине. Все 36 мутантов были экспрессированы, выделены, очищены, переведены в форму активного фотопротеина и охарактеризованы по следующим параметрам: относительная биолюминесцентная активность, Са2+-независимая люминесценция, константа спада биолюминесцентной реакции, спектры поглощения, биолюминесценции и флуоресценции.

В целом, практически все замены His, Trp и Tyr привели к существенному снижению биолюминесцентной активности мутантов по сравнению с фотопротеинами дикого типа (табл. 1). Необходимо, однако, отметить, что, несмотря на высокую структурную гомологию обелина и акворина, в ряде случаев аналогичные замены приводили к различному влиянию на биолюминесцентные свойства фотопротеинов. Например, замена Trp180 на Tyr и Phe в акворине привела к существенному снижению биолюминесцентной активности (мутанты сохранили 0,25 и 3,5% активности от активности акворина дикого типа, соответственно), в то время как соответствующие им мутанты обелина сохранили 23 и 67% активности фотопротеина дикого типа. Замена His на Gln также поразному влияла на активность. Мутант акворина сохранил около 23% активности, тогда как активность мутанта обелина составила менее 1% от активности обелина дикого типа (табл. 1). В то же самое время замена Tyr на Phe в обоих фотопротеинах привела к практически одинаковому эффекту – сохранению примерно пятой части активности.

Все мутанты обелина и акворина обладали люциферазоподобной биолюминесцентной активностью, наблюдающейся в течение инкубации апофотопротеинов с целентеразином в отсутствие ионов кальция (рис. 9). Однако, после инжекции кальция в раствор, содержащий апофотопротеин и целентеразин, наблюдается вспышка биолюминесценции, типичная для фотопротеинов. Кроме того, для этих мутантов характерен низкий выход активного фотопротеина и высокий уровень Са2+-независимой люминесценции. Таким образом, замена даже одного из вышеуказанных аминокислотных остатков приводит к формированию нестабильного фотопротеинового комплекса.

Мутанты обелина и акворина, сохранившие наибольший процент биолюминесцентной активности, имеют спектр поглощения, близкий к спектру поглощения фотопротеинов дикого типа. Например, и мутант H176Q (24% активности дикого типа), и акворин дикого типа в спектре поглощения имеют плечо на 310 нм и максимум на 460 нм, что показывает наличие 2-гидропероксицелентеразина в составе комплекса. По мере снижения биолюминесцентной активности мутантов исчезает максимум на 460 нм и увеличивается пик на 350 нм, что указывает на появление продукта реакции, целентерамида, образующегося в результате интенсивной Са2+-независимой биолюминесценцией. Некоторые мутанты с очень низкой активностью (например, W179А и W180A), не имеют поглощения не только на 460 нм, но и на 350 нм, что вероятно обусловлено диссоциацией целентерамида.

Биолюминесцентная активность мутантов обелина и акворина Биолюминесцентная Биолюминесцентная обелина дикого типа акворина дикого типа Жирным шрифтом выделены мутанты обелина и акворина, в которых идентичные аминокислотные замены привели к различному влиянию на биолюминесцентную активность.

В некоторых случаях замена His, Trp и Tyr приводит также к изменению спектров биолюминесценции. Например, у мутантов акворина H176A, H176F, W180K, W180A и Y191K в спектре биолюминесценции появляется плечо на 390 нм, которое свидетельствует о присутствии нейтральной формы целентеразина и которое отсутствует в спектре акворина дикого типа. Значительные изменения наблюдаются и во флуоресцентных свойствах Са2+-разряженных мутантов. Например, для многих из них характерно появление ярко выраженной бимодальной флуоресценции, которая отсутствует в Са2+-разряженном обелине и акворине.

Из спектральных свойств мутантов можно сделать заключение, что His, Trp и Tyr играют важную роль в позиционировании молекулы субстрата в целентеразинсвязывающей полости и с их заменой происходит нарушение водородных связей, не только также скорости образования активного фотопротеина для мутантов обелина H175N, W179Y, таблице 2. Помимо этих мутантов, выбор которых, прежде всего, определялся различным Рис. 9. Люциферазоподобная влиянием аминокислотных замен на биолюмии фотопротеиновая биолю- несцентную активность, кажущаяся константа минесцентные активности диссоциации и константа скорости образования на примере мутанта обелина активного комплекса определена также для муH175Q. танта обелина Y138F. Мутант Y138F был включен в исследование, потому что атом кислорода ОН-группы Tyr138 образует водородную связь с N1-атомом 2-гидропероксицелентеразина (рис. 8) и потому что, согласно квантово-химическим расчетам, если в районе N1-атома целентеразина отсутствуют полярные группы, молекула кислорода не способна приблизиться к С2-атому целентеразина на расстояние, необходимое для образования его 2-гидроперокси-производного.

Для всех мутантов с заменой Trp179 независимо от введенного остатка и биолюминесцентной активности мутанта наблюдается 5-6-кратное увеличение кажущейся константы диссоциации для комплекса апофотопротеин– целентеразин по сравнению с обелином дикого типа (табл. 2). Аналогичное увеличение кажущейся константы диссоциации характерно и для мутанта Y190E. Однако для двух мутантов, H175N и Y190F, кажущиеся константы диссоциации комплекса апофотопротеин–целентеразин не изменились, несмотря на то, что относительные биолюминесцентные активности этих мутантов отличаются почти в 10 раз. Хотя мутант Y138F сохраняет 60% активности обелина дикого типа, кажущаяся константа диссоциации для этого мутанта увеличилась почти в 3 раза (табл. 2). Необходимо, однако, отметить, что константы скорости образования активного комплекса в случае всех исследованных мутантов снижены приблизительно на порядок по сравнению с константой скорости для обелина дикого типа (табл. 2). Вероятнее всего, связывание целентеразина с апобелком в случае мутантов H175N, Y138F и Y190F происходит достаточно эффективно из-за того, что эти замены не нарушают существенно конформацию как молекулы в целом, так и конформацию целентеразин-связывающей полости. Однако на этапе активации кислородом, по-видимому, происходят нарушения, которые приводят к снижению скорости образования 2-гидропероксицелентеразина.

Основные характеристики процесса формирования активного фотопротеинового комплекса для некоторых мутантов обелина 4. Роль остатков His175 и Tyr138 в процессе формирования активного фотопротеинового комплекса Согласно существующему гипотетическому механизму образования 2гидропероксицелентеразина в целентеразин-связывающей полости фотопротеина, первым этапом этой реакции является депротонирование N7-атома азота целентеразина при участии основания. Однако, согласно пространственным структурам различных конформационных состояний фотопротеинов, вблизи N7-атома азота нет ни одной боковой цепи аминокислотных остатков, которые могли бы играть роль основания. Следовательно, депротонирование N7-атома азота должно происходить до того, как целентеразин займет окончательное положение в субстрат-связывающей полости, то есть в течение миллисекунд, за которые происходит его связывание. Вполне вероятно, что в этом процессе принимает участие один из His, который может выступать в роли основания при нейтральных pH, особенно в паре с карбоксильной группой Asp или Glu.

Рис. 10. Предполагаемая роль His175 в образовании активного фотопротеинового комплекса обелина.

Из пространственной структуры целентеразин-связывающей полости обелина, а также исследований влияния различных мутаций His175 на образование активного фотопротеинового комплекса и результатов квантовохимических расчетов, было предположено, что наилучшим кандидатом на роль основания является His175, который к тому же может выполнять двойную функцию (рис. 10). На начальном этапе в момент связывания целентеразина с апобелком His175 забирает протон от N7-атома азота целентеразина, используя «основный» атом азота. Это приводит к образованию N7-целентеразин-аниона, который за счет быстрой перестройки системы связей преобразуется в C2анион целентеразина (рис. 10). На следующем этапе положительно заряженный His175 отдает протон от своего «кислого» атома азота на C2-анион целентеразина с образованием целентеразина, протонированного по С2-атому углерода (C2(H)-целентеразин). Таким образом, His175 выполняет функцию переносчика протона (“proton shuttle mechanism”), на разных этапах реакции являясь и «основанием» и «кислотой» (рис. 10).

Согласно предложенному механизму, после формирования целентеразина, протонированного по C2-атому, он взаимодействует с О2, образуя 2гидропероксицелентеразин. Наличие полярной группы (ОН-группа Tyr138 или Н2О) в непосредственной близости от имидазолпиразинового кольца целентеразина приводит к поляризации N1-атома азота. В результате так называемого индукционного эффекта C2-H связь также поляризуется. Под воздействием дисперсионных сил молекула кислорода притягивается к C2-атому целентеразина на расстояние 2,3, увеличивая вероятность инициации реакции образования 2-гидроперокси-производного (рис. 11). Важность Tyr138 для образования активного фотопротеинового комплекса подтверждена и мутагенезом (табл. 2). Необходимо отметить, что, несмотря на драматическое снижение скорости в случае мутации Y138F, активный фотопротеин все же образуется. Это обусловлено тем, что присоединение кислорода является вероятностным процессом, а поляризация C2-H связи увеличивает вероятность присоединения, но не является строго необходимой для него.

Рис. 11. Предполагаемая роль Tyr138 в образовании активного фотопротеинового комплекса обелина.

Таким образом, в результате исследований была предложена функциональная роль аминокислот целентеразин-связывающей полости в образовании активного фотопротеинового комплекса. Согласно гипотезе, His175 участвует не только в стабилизации 2-гидропероксицелентеразина, но и в процессе образования целентеразина, протонированного по С2-атому, играя роль переносчика протона от N7-атома. В свою очередь, Tyr138 поляризует C2-H связь, обеспечивая тем самым позиционирование молекулы кислорода возле протонированного C2-атома целентеразина, необходимое для последующего эффективного образования 2-гидроперокиси-производного.

ВЫВОДЫ

1. Определен вклад каждого из шести остатков триптофана в собственную флуоресценцию апофотопротеинов на примере апообелина с использованием мутантов с заменами остатков триптофана на фенилаланин. Показано, что наибольший вклад в собственную флуоресценцию апофотопротеинов вносят Trp92 (40%), Trp179 (20%) и Trp114 (20%), боковые цепи которых направлены внутрь целентеразин-связывающей полости.

2. Показано, что степень тушения флуоресценции триптофанов апообелина и апоакворина зависит от концентрации целентеразина. Это позволило впервые определить кажущиеся константы диссоциации комплекса с целентеразином для апоакворина (1,2 ± 0,12 мкM) и апообелина (0,2 ± 0, мкM).

3. Установлено, что связывание целентеразина с апофотопротеинами происходит в течение нескольких миллисекунд. Так как связывание занимает миллисекунды, а формирование активного фотопротеинового комплекса из апобелка, целентеразина и кислорода занимает несколько десятков минут, сделано заключение, что лимитирующим этапом реакции является образование 2-гидропероксицелентеразина.

4. Предложена математическая модель, описывающая процесс формирования активного фотопротеинового комплекса. Данная модель позволила оценить константу скорости реакции для образования 2-гидропероксицелентеразина из целентеразина и молекулярного кислорода в активном центре обелина (11,0 ± 0,4 M-1сек-1) и определить энергию активации этого процесса (45,0 кДж/моль).

5. Методом олигонуклеотид-направленного мутагенеза получено 36 мутантов акворина и обелина с заменами His175, Trp179 и Tyr190 на аминокислотные остатки с различными донорно-акцепторными свойствами боковых цепей. Все мутантные белки выделены в гомогенном виде и охарактеризованы. Показано, что все мутации His175, Trp179 и Tyr190 приводят к снижению биолюминесцентной активности и скорости образования активного фотопротеинового комплекса.

6. Предложен механизм образования активного фотопротеинового комплекса, согласно которому His175 участвует в образовании целентеразина, протонированного по С2-атому, выполняя функцию переносчика протона от N7-атома, а Tyr138 обеспечивает позиционирование молекулы кислорода возле протонированного С2-атома целентеразина, необходимое для последующего образования его 2-гидроперокси-производного.

7. Установлено, что, несмотря на высокую идентичность аминокислотных последовательностей, а также сходство пространственных структур обелина и акворина, аналогичные замены His175, Trp179 и Tyr190 в этих фотопротеинах в ряде случаев по-разному отражаются на биолюминесцентных свойствах. Это свидетельствует о том, что акворин и обелин, несмотря на высокую гомологию, в ответ на связывание кальция могут претерпевать различные конформационные переходы, приводящие, например, к разной кинетике биолюминесцентного ответа или различной чувствительности к ионам кальция.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Eremeeva E.V. The intrinsic fluorescence of apo-obelin and apo-aequorin and use of its quenching to characterize coelenterazine binding / E.V. Eremeeva, S.V.

Markova, A.H. Westphal, A.J.W.G. Visser, W.J.H. van Berkel, E.S. Vysotski // FEBS Letters. – 2009. – V. 583. – P. 1939-1944.

2. Eremeeva E.V. The main function of His175, Trp179 and Tyr190 residues of the obelin binding site is to stabilize the hydroperoxycoelenterazine intermediate / E.V.

Eremeeva, S.V. Markova, L.A. Frank, E.S. Vysotski // In: Bioluminescence & Chemiluminescence: Chemistry, Biology and Application. Eds A.A. Szalay, P.J.

Hill, L.J. Kricka, P.E. Stanley. Singapore: World Scientific. – 2007. – P. 7-10.

3. Eremeeva E.V. The kinetics of coelenterazine binding with apo-obelin and apoaequorin / E.V. Eremeeva, S.V. Markova, L.A. Frank, J. Lee, W.J.H. van Berkel, A.J.W.G. Visser, E.S. Vysotski // Luminescence. – 2008. – Vol. 23. – P. 66-67.

4. Eremeeva E.V. The main function of His175, Trp179 and Tyr190 residues of the obelin binding site is to stabilize the hydroperoxycoelenterazine intermediate / E.V.

Eremeeva, S.V. Markova, L.A. Frank, E.S. Vysotski // Luminescence. – 2006. – Vol. 21. – P. 275-276.

5. Tomilin F.N. Quantum chemical study of mechanism of active photoprotein generation / F.N. Tomilin, L.U. Antipina, E.V. Eremeeva, S.G. Ovchinnikov, E.S. Vysotski // Luminescence. – 2010. – Vol. 25. – P. 210-211.

6. Vysotski E.S. Ca2+-regulated photoproteins: structure, bioluminescent reaction mechanism, engineering, and application / E.S. Vysotski, S.V. Markova, L.A. Frank, N.P. Malikova, G.A. Stepanyuk, L.P. Burakova, E.V. Eremeeva, S. Golz, J. Lee // Luminescence. – 2010. – Vol. 25. – P. 212-213.



 
Похожие работы:

«КОЛЕСОВА Мария Анатольевна ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ ОБРАЗЦОВ D-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА AEGILOPS L. К ЛИСТОВЫМ БОЛЕЗНЯМ (ЛИСТОВАЯ РЖАВЧИНА, СЕПТОРИОЗ, ТЕМНО-БУРАЯ ЛИСТОВАЯ ПЯТНИСТОСТЬ) Специальности: 03.00.15 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург - 2007 Диссертационная работа выполнена в отделе иммунитета Государственного научного центра Российской Федерации...»

«КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна ИНДУКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PODOSPORA ANSERINA (RABENH.) NIESSL В ПРОЦЕССЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОГО ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Специальность 03.02.12 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного...»

«Хабибуллина Ирина Ифировна РАЗРАБОТКА ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ КИНЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ РАЦЕМИЧЕСКИХ СПИРТОВ, КИСЛОТ И ЭФИРОВ Специальность 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань – 2007 Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета Научный руководитель доктор химических наук, профессор Зорин...»

«Каюкова Светлана Николаевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА OROSTACHYS FISCH. В ВОСТОЧНОМ ЗАБАЙКАЛЬЕ 03.00.05 - ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 Работа выполнена в Забайкальском государственном гуманитарнопедагогическом университете им. Н.Г. Чернышевского доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Бэлла Иванова Дулепова Официальные оппоненты : Татьяна Петровна Анцупова, доктор...»

«Потапова Зинаида Михайловна ВИДОВОЙ СОСТАВ И ЭКОФИЗИОЛОГИЯ ЦИАНОБАКТЕРИЙ АЗОТНЫХ ТЕРМАЛЬНЫХ ИСТОЧНИКОВ СЕВЕРНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.00.16 – экология 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2010 2 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Бархутова Дарима Дондоковна Научный консультант : доктор биологических наук, профессор...»

«Новосадова Александра Викторовна МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ ОСЕТРОВЫХ РЫБ У ПОТОМСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ 03.02.06 ихтиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО), г. Москва Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Головатин Михаил Григорьевич ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ НАСЕЛЕНИЯ ПТИЦ СЕВЕРНЫХ ШИРОТ: ДИНАМИЧЕСКИЙ АСПЕКТ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Рябицев Вадим Константинович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ГОГОЛЬ Эллина Владимировна СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук К А З А Н Ь - 2000 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор...»

«Чирков Сергей Николаевич Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений 03.00.06 – Вирусология 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН. Научный консультант : доктор...»

«БЕРНИКОВ Кирилл Александрович Фауна и экология рукокрылых (Chiroptera) равнинной тайги Западной Сибири (на примере Ханты-Мансийского автономного округа) Специальность 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии ГОУ ВПО Сургутский государственный университет ХМАО – Югры. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Стариков Владимир Павлович...»

«верситет на кафедре зоологии Научный консультант доктор биологических наук, профессор Рахимов Ильгизар Ильясович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Шураков Аркадий Иванович доктор биологических наук, профессор Маматов Анвар Фаризунович Молодовский Анатолий Васильевич доктор биологических наук, профессор ВОДОПЛАВАЮЩИЕ ПТИЦЫ...»

«Попова Анна Михайловна ЛУГОВАЯ РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ПОЙМЫ СРЕДНЕГО ТЕЧЕНИЯ РЕКИ ВЫЧЕГДА 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2008 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Сыктывкарский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент ШУШПАННИКОВА Галина Сергеевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник МАРТЫНЕНКО Вера Антоновна...»

«Евженко Константин Сергеевич ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ВОДОЁМОВ ДОЛИН ПРАВОБЕРЕЖНЫХ ПРИТОКОВ РЕКИ ИРТЫШ (ОМСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск – 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники, цитологии и генетики ГОУ ВПО Омский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Свириденко Борис Фёдорович Официальные оппоненты : доктор...»

«Чудаев Дмитрий Алексеевич ДИАТОМОВЫЕ ВОДОРОСЛИ ОЗЕРА ГЛУБОКОГО (МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2014 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Благодаря более чем столетней истории существования одноименной гидробиологической станции, оз. Глубокое считается модельным водоемом для...»

«Чимитдоржиева Эржена Очировна ЗАПАСЫ УГЛЕРОДА В ЧЕРНОЗЕМАХ И КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ И ЭМИССИЯ СО2 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2011 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского...»

«ДОМАНИЦКАЯ НАТАЛЬЯ ВАСИЛЬЕВНА РОЛЬ ABCC10-ТРАНСПОРТЕРА В ФОРМИРОВАНИИ МНОЖЕСТВЕННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ТАКСАНАМИ 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научноисследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г....»

«ВОЙКИНА АННА ВЛАДИМИРОВНА НАКОПЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ В КОМПОНЕНТАХ ЭКОСИСТЕМ ТАГАНРОГСКОГО И ЯСЕНСКОГО ЗАЛИВОВ АЗОВСКОГО МОРЯ И ИХ АДДИТИВНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГИДРОБИОНТОВ 03.02.08 — экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в ФГУП Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (АзНИИРХ), г. Ростов-на-Дону и на кафедре экологии и природопользования Южного...»

«ЧЕРКАШИН Евгений Александрович СТРУКТУРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЛАККАЗ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ Специальность: 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва – 2009 Молекулярные Работа выполнена в лаборатории основы биотрансформаций Учреждения Российской академии наук Института биохимии имени А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.