WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Хабибуллина Ирина Ифировна

РАЗРАБОТКА ЭНАНТИОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОКАТАЛИЗАТОРОВ

КИНЕТИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ РАЦЕМИЧЕСКИХ СПИРТОВ,

КИСЛОТ И ЭФИРОВ

Специальность 03.00.23 – «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Казань – 2007

Работа выполнена на кафедре биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета

Научный руководитель доктор химических наук, профессор Зорин Владимир Викторович.

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Гуревич Петр Аркадьевич;

кандидат технических наук, доцент Кусова Ирина Валерьевна.

Ведущая организация Институт биологии Уфимского научного центра Российской Академии наук.

Защита состоится «28» февраля 2007 года в 14-00 на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.080.02 при Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420015, Республика Татарстан, г. Казань, ул.К.Маркса, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан «28» января 2007 года

Ученый секретарь совета Поникаров С. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Важнейшими синтонами при производстве лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются оптически чистые энантиомеры спиртов, кислот и сложных эфиров. Наиболее эффективными способами получения таких соединений является кинетическое разделение их рацемических смесей парциальным ацилированием или энантиоселективным гидролизом с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и липаз), отличающихся высокой селективностью, широкой субстратной специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде, так и в органических растворителях.

Клетки микроорганизмов с успехом применяются в качестве катализаторов во многих процессах регио- и энантиоселективной трансформации органических соединений. Использование их в качестве биокатализаторов кинетического разделения более перспективно по сравнению с ферментными препаратами, учитывая, с одной стороны, высокие затраты материалов и энергии на концентрирование и выделение внеклеточных и внутриклеточных ферментов, а с другой - значительный расход ферментов во время трансформации. Кроме того, важнейшим преимуществом интактных клеток перед ферментными препаратами явлется возможность их регенерации и многократного использования.





Принимая во внимание успехи, достигнутые в создании -функциональной боковой изопреноидной цепи -токоферола с 2-мя хиральными центрами Rконфигурации на основе хлорофилла, разработка биокаталитического метода получения S-хроманилэтанола - ключевого синтона полного аналога природного токоферола - является важной задачей на пути создания альтернативной технологии получения витамина Е на основе доступного растительного и нефтехимического сырья.

Использование методов энантиоселективной биотрансформации с применением клеток микроорганизмов также является перспективным подходом к синтезу оптически активного S-кетопрофена – ценного предшественника в синтезе нестероидных противовоспалительных препаратов.

В связи с этим создание доступных, технологичных и энантиоселективных катализаторов для синтеза оптически активных S-хроманилэтанола (ключевого синтона в синтезе витамина Е) и S-кетопрофена (синтона нестероидных противовоспалительных препаратов) является актуальной задачей.

Цель работы. Разработка энантиоселективных биокатализаторов для получения оптически активных S-(-)-6-бензилокси-2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8тетраметилхромана и S-(+)-2(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты на основе микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью. Поиск методов интенсификации процессов кинетического разделения оптически активных спиртов, кислот и эфиров.

В связи с этим задачами работы являлись:

• осуществление скрининга микроорганизмов, обладающих липолитической и эстеразной активностью;

• исследование свойств перспективных штаммов с целью их идентификации;

• разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального разделения спиртов, кислот и эфиров в процессах этерификации и гидролиза на основе клеток S-хроманилэтанола, энантиомеров других спиртов и S-кетопрофена;

• исследование условий эффективной работы и стабильности биокатализаторов;

• разработка методов получения оптически активных S-хроманилэтанола и S-кетопрофена с использованием созданных биокатализаторов;

• исследование подходов к интенсификации процессов кинетического разделения спиртов и эфиров.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с Федеральной целевой программой «Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки в 2002-2006 гг.» (2004-2006 гг., госконтракт № 02.438.11.7003), региональной программой РФФИ "Агидель" (2005г.), планами научно-исследовательских работ Уфимского государственного нефтяного технического университета (2003-2006 гг.), ведомственной научной программой “Развитие научного потенциала высшей школы” (проект «Научно-образовательная деятельность музея, созданного на базе кафедры биохимии и технологии микробиологических производств Уфимского государственного нефтяного технического университета» 2005-2006 гг.).





Научная новизна. Выделены и идентифицированы новые микроорганизмы родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2), на основе которых созданы энантиоселективные биокатализаторы, проявляющие каталитическую активность при парциальном ацилировании R,S-хроманилэтанола, переэтерификации R,S-кетопрофена и энантиоселективном гидролизе их рацемических эфиров.

Научно обоснованы методы синтеза оптически активных S-()-6-бензилоксии 2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана S-(+)-2-(3-бензоил-фенил) пропионовой кислоты с использованием биокатализаторов на основе микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2).

Обнаружена инверсия R-(+)-хроманилэтанола в S-()-хроманилэтанол в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма, относящегося к роду Rhodococcus (77-32). Найдены условия (температура, рН, растворитель), в которых биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Разработаны методы увеличения активности биокатализаторов путем их обработки органическими растворителями. Показано, что в условиях кинетического разделения биокатализаторы проявляют высокую стабильность. Доказана возможность многократного использования разработанных биокатализаторов.

Практическая значимость. На основе найденных культур микроорганизмов родов Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2) созданы энантиоселективные биокатализаторы и эффективные методы получения S-()хроманилэтанола – ключевого синтона витамина Е и S-(+)-кетопрофена – предшественника нестероидных противовоспалительных препаратов высокой оптической чистоты.

Разработаны методы увеличения активности ранее описанных катализаторов энантиоселективного гидролиза рацемических эфиров вторичных спиртов не снижающие энантиоселективность.

Результаты научных исследований легли в основу создания новых лабораторных работ и используются в учебном процессе при подготовке инженеров по специальности 240901 - «Биотехнология».

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на 55,56 и 57-й научно-технических конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых УГНТУ (Уфа, 2004-2006), V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школе «Химия и медицина» (Уфа, 2005), IV Всероссийской научной INTERNET-конференции «Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии» (Уфа, 2005), научнопрактической республиканской конференции «Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям» (Уфа, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов, материалов и методов исследования (глава 2), обсуждения результатов (глава 3), выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на 132 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков и 10 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1 Разработка энантиоселективных биокатализаторов для кинетического разделения рацемических 6-бензилокси–2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8–тетраметилхромана и 6-бензилокси–2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8–тетраметилхромана 1.1 Скрининг микроорганизмов, обладающих гидролазной активностью Для разработки эффективных биокаталитических методов получения оптически активных хроманов требовалось найти микроорганизмы, клетки которых могут быть использованы в процессах кинетического разделения рацемических смесей 6-бензилокси–2(2-гидроксиэтил)-2,5,7,8–тетраметилхромана (хроманилэтанола 1*) или 6-бензилокси–2(2-ацетоксиэтил)-2,5,7,8–тетраметил-хромана (хроманилэтилацетата 2*).

Скрининг энантиоселективных биокатализаторов осуществляли в два этапа.

На первом этапе были отобраны микроорганизмы, продуцирующие гидролазы и осуществляющие гидролиз ацетата хроманилэтанола. Объектами первичного скрининга служили более 100 музейных культур липолитических микроорганизмов из коллекции кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ, в том числе энантиоселективные культуры микроорганизмов родов Pseudomonas (77-47), Pseudomonas (77-33, 59-3), Bacillus (77-1, 79-54), Rhodococcus (78-5), способные осуществлять парциальное ацилирование ряда вторичных спиртов и энантиоселективный гидролиз их сложных эфиров, а также почвенные микроорганизмы (56 культур), выделенные на средах с этилацетатом и изопропанолом. В результате скрининга, было отобрано 25 культур.

На втором этапе скрининга среди отобранных продуцентов искомых гидролаз выявляли энантиоселективные микроорганизмы, способные осуществлять кинетическое разделение рацемических смесей хроманов (50%-ную конверсию субстрата по одному из энантиомеров).

Для получения оптически активных хроманилэтанолов с помощью липаз микроорганизмов могут быть использованы два процесса: парциальное ацилирование рацемического хроманилэтанола 1 и энантиоселективный гидролиз рацемического хроманилэтилацетата 2:

_ *Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам ИНК РАН д-ру хим. наук, проф.

Одинокову В.Н. и канд. хим. наук Спивак А.Ю. за предоставленные образцы рацемических соединений 1, 2 и внимание к работе.

Хроманилэтанол нерастворим в неполярных растворителях, поэтому наряду с поиском энантиоселективных биокатализаторов осуществляли подбор подходящего растворителя.

В более ранних работах с применением очищенных липаз микроорганизмов для парциального ацилирования хроманилэтанола в качестве реакционной среды использовался диэтиловый эфир и ацетон. В качестве ацилирующего агента в этих исследованиях использовали винилацетат.

Для суспендирования клеток в органическом растворителе промытую фосфатным буфером биомассу микроорганизмов предварительно обезвоживали ацетоном. Известно, что такая предобработка биомассы ацетоном не оказывает инактивирующего действия на клеточные липолитические биокатализаторы, а напротив - может увеличивать их активность и стабильность.

В результате тестирования 25 культур, обладающих гидролазной активностью в отношении хроманилэтилацетата, было найдено 16 культур микроорганизмов, способных синтезировать хроманилэтилацетат этерификацией хроманилэтанола винилацетатом в течение трех суток с 50%-ной конверсией субстрата. Более активно трансформация хроманилэтанола протекала в смешанных растворителях.

При этом все найденные микроорганизмы конвертировали субстрат в изооктане, содержащем 5 % ацетона. Многие культуры, хотя и менее активно, но работали в %-ном растворе ацетона в гексане.

Исследование оптических свойств остаточных субстратов и продуктов ацилирования хроманилэтанола показало, что в реакционных смесях этих клеток микроорганизмов (77-25, 77-32, И-10, Э-13, 77-5, 78-2, 77-34, 77-64, 79-2, 79-15, 57-3, 77-12 и 77-9) накапливаются правовращающие хроманы.

В качестве продукта трансформации преимущественно образуется S-(+)-2-(2ацетоксиэтил)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман, для которого, по литературным данным, величина []D равна +18,5. Это позволяет отнести найденные микроорганизмы к биокатализатарам S-типа, катализирующим преимущественно трансформацию S-энантиомера рацемического субстрата:

Остаточный субстрат трансформации представляет собой преимущественно 2-[Rдля которого, по (+)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанол, литературным данным, величина удельного вращения равна []D +17,35.

Однако, судя по величинам удельного вращения []D22, которые показали полученные препараты замещенных хроманов, большинство культур, за исключением клеток микроорганизмов 77-9 и 77-12, в исследуемых системах растворителей проявляют низкую энантиоселективность. Вероятно, в этих условиях конверсия близкая к 50 %-ному уровню, в большей степени обусловлена низкой скоростью реакции или ингибированием органическими растворителями.

Вместе с тем культуры микроорганизмов 77-9 и 77-12 проявили высокую энантиоселективность, позволяющую получать в ацетоне высокочистый S-хроманилэтилацетат (97% ее). Низкая оптическая чистота остаточного хроманилэтанола (52 и 40% ее соответственно), вероятно, связана с неполной конверсией исходного рацемического субстрата (37 и 33 %).

Таким образом, в результате скрининга были найдены две перспективные энантиоселективные культуры микроорганизмов 77-9 и 77-12.

С целью повышения эффективности найденных биокатализаторов при их практическом использовании в препаративных целях был осуществлен поиск новых условий, в которых они проявляют высокую селективность.

1.2 Исследование условий ацилирования хроманилэтанола винилацетатом в присутствии клеточных катализаторов на основе культур микрорганизмов77-12 и 77-9 в системах ацетон-изооктан Изменение липофильно-гидрофильного баланса, определяющего конформацию третичной структуры фермента за счет изменения полярности бинарного растворителя, является одним из методов, позволяющих регулировать каталитическую активность и энантиоселективность фермента.

При исследовании влиянии концентрации ацетона на начальную скорость ацилирования хроманилэтанола винилацетатом в присутствии катализаторов на основе клеток микроорганизмов 77-12 и 77-9 в системах ацетон-изооктан было установлено, что снижение содержания полярного растворителя приводит к существенному ускорению реакции в обоих случаях (рисунок 1).

Скорость ацилирования, Однако при этом было найдено, что высокая энантиоселективность проявляется лишь в системах, содержащих 70 % ацетона, в которых скорость реакции мала и сопоставима со скоростью в чистом ацетоне. При этом наиболее активно и энантиоселективно осуществлялась трансформация культурой 77- (рисунок 2).

Таким образом, наилучшие результаты при ацетилировании получены при использовании микроорганизма 77-9. С помощью данного биокатализатора в течение трех суток удается получать S-(+)-2-(2-ацетоксиэтил)-6-бензилокси-2,5,7,8тетраметилхроман с []D22 +16 с оптической чистотой 92 % ее, последующий гидролиз которого дает необходимый S-()-2-(2-гидроксиэтил)-6-бензилокситетраметилхроман.

1.3 Исследование биокатализируемого гидролиза хроманилэтилацетата Низкая скорость и энантиоселективность процессов ацетилирования, реализуемых в органических растворителях, побудила к исследованию альтернативного процесса получения оптически активных хроманов энантиоселективного гидролиза хроманилэтилацетата 2, в котором биокатализаторы находятся в водной среде. Растворенный в ацетоне субстрат вносили в буферный раствор (концентрация ацетона 20% (v/v)).

В качестве биокатализаторов использовались клетки микроорганизмов, проявивших на стадии экспресс-тестирования гидролазную активность в отношении хроманилэтилацетата (25 культур).

При исследовании кинетики гидролиза эфира 2, катализируемого различными культурами микроорганизмов, было установлено, что многие микроорганизмы за трое суток гидролизовали субстрат неселективно.

За этот период более высокая конверсия субстрата (25 – 50 %) была достигнута только в случае четырех культур (77-25, 77-32, 77-64 и 79-15).

Рисунок 3 – Кинетика гидролиза хроманилэтилацетата биокатализаторами на основе культур микроорганизмов 77-64, 77-25, 79-15 и 77-32 в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,0), содержащем 20% ацетона, начальной концентрации субстрата 3 г/л, скорости перемешивания 180 об/мин и температуре 30 0С Однако кинетика типичная для стереоселективного процесса, была выявлена только для культуры 77-32, который конвертировал 35% рацемического субстрата к 72 часам (рисунок 3).

В результате исследования оптических свойств «остаточного» эфира было обнаружено, что он представляет собой правовращающий S-(+)-хроманилэтилацетат 54 %-ной оптической чистоты ([]D +10).

биокатализаторам R-типа, катализирующим превращение R-энантиомера субстрата в R-продукт:

R,S-хроманилэтилацетат R-(+)-хроманилэтанол S-(+)-хроманилэтилацетат Известно, что 2-[R-(+)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанол является правовращающим соединением с []D22 +17,35. Однако в ходе исследуемой трансформации вместо ожидаемого правовращающего R-(+)-хроманилэтанола образуется левовращающий спирт с оптической чистотой 99 % ([]D22 17,16), то есть 2-[S-()-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанол.

Полученные результаты позволяют предположить, что в ходе гидролиза эфира 2 образующийся R-(+)-хроманилэтанол подвергается инверсии в S-()-хроманилэтанол:

В пользу этого предположения свидетельствуют результаты, полученные при инкубации биокатализатора на основе клеток микроорганизма 77-32 с рацемическим хроманилэтанолом в условиях, аналогичных гидролизу хроманилэтилацетата. Было найдено, что в этих условиях происходит обогащение смеси S-изомером (уже через двое суток энантиомерный избыток S-хроманилэтанола составил 74% ее).

Низкая чистота остаточного эфира (54% ее) в исследуемом процессе гидролиза хроманилэтилацетата при конверсии 35% (вместо теоретически возможной 50%-ной конверсии в энантиоселективном процессе) связана с неполным превращением R-(+)-энантиомера субстрата. Таким образом, для получения более чистого остаточного S-эфира необходимо увеличить продолжительность трансформации или увеличить скорость ее протекания.

В связи с этим была предпринята попытка увеличения каталитической активности клеток микроорганизма 77-32 путем оптимизации температуры и кислотности среды. При этом было установлено, что оптимальные значения рН и температуры близки к используемым (рН 7,0 и 30 0С).

Более значительное увеличение гидролазной активности культуры 77-32 было достигнуто при изучении влияния концентрации ацетона на гидролиз хроманилэтилацетата. Было обнаружено, что при концентрации ацетона 30 % конверсия субстрата составляет 43 % уже после 72 ч трансформации. При дальнейшем увеличении концентрации ацетона (более 30 %) скорость реакции и соответственно конверсия субстрата снижаются.

Рисунок 4 – Зависимость относительной активности клеток культуры 77-32 от концентрации ацетона при гидролизе хроманилэтилацетата в 0,1 М фосфатном буфере (рН=7,0), содержащем 5 – 40 % ацетона, при концентрации биомассы 30 мг(асв)/мл, начальной концентрации субстрата 3 г/л, скорости перемешивания 180 об/мин и температуре 30 0С Исследование оптических свойств хроманов после трансформации хроманилэтилацетата биомассой клеток 77-32 в системе с 30 % ацетона показало, что наряду с высокочистым 2-[S-(-)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-ил]этанолом (99 % ее) образуется и более чистый, чем в системе с 20%-ным содержанием ацетона, остаточный S-(+)-2-(2-ацетоксиэтил)-6-бензилокси-2,5,7,8-тетраметилхроман (76% ее). При увеличении времени трансформации до 96 ч энантиомерная чистота остаточного S-(+)-хроманилэтилацетата увеличивается до 99% ее.

Таким образом, в результате скрининга были найдены энантиоселективные культуры микроорганизмов 77-9 и 77-32, позволяющие получать оптически чистый S-хроманилэтанол с выходом 80%.

2 Разработка энантиоселективных биокатализаторов для кинетического разделения кетопрофена 2.1 Поиск потенциальных биокатализаторов для кинетического (кетопрофена) Аналогично скрининг микроорганизмов был выполнен при поиске биокатализаторов, способных осуществлять кинетическое разделение рацемической смеси кетопрофена – ценного предшественника в синтезе нестероидных противовоспалительных препаратов.

Помимо описанных выше культур микроорганизмов, объектами исследования служили также почвенные микроорганизмы, выделенные на среде с этанолом и бутиловым эфиром кетопрофена.

При первичном скрининге были отобраны 17 культур, способных гидролизовать бутиловый эфир кетопрофена.

Исследование конверсии субстрата и оптической чистоты образующегося продукта показало, что большинство выделенных микроорганизмов осуществляет гидролиз бутилового эфира кетопрофена неселективно.

Наиболее энантиоселективно гидролиз рацемического бутилового эфира кетопрофена протекает в присутствии клеток микроорганизмов К3-2, 77-1 и 79-54 с преимущественным образованием R-кетопрофена, что позволяет отнести его к биокатализаторам R-типа. Наилучший результат был получен при использовании культуры К3-2. При конверсии по субстрату 3 41% с практически количественным выходом 85 % был получен R-кетопрофен 78%-ной оптической чистоты.

Микроорганизмы R-типа перспективны для одновременного получения R-кетопрофена и S-эфиров в процессе гидролиза рацемической смеси эфира.

Гидролиз S-эфира под действием кислотных катализаторов приводит к получению S-кетопрофену:

R,S-бутиловый эфир кетопрофена Такой процесс имеет практическое значение, поскольку в последние годы появляется все больше сведений о расширении области применения R-кетопрофена.

2.2 Исследование переэтерификации кетопрофена Альтернативным энантиоселективным биокаталитическим процессом, лежащим в основе кинетического разделения кетопрофена, является переэтерификация. При переэтерификации кетопрофена в изооктане, содержащем 5% ацетона, различными акцепторами ацильных групп (этилацетат, винилацетат, бутилацетат) в присутствии биокатализаторов на основе клеток микроорганизмов К3-2, 79-54, 77-1 было установлено, что наиболее активно кетопрофен конвертируется в присутствии культуры К3-2 под действием винилацетата:

Было установлено, что в системе, содержащей 30% ацетона, образуется кетопрофен с оптической чистотой 75% ее.

3 Идентификация перспективных микроорганизмов С целью идентификации полученных в результате скрининга наиболее активных и селективных микроорганизмов были изучены их основные морфологические, физиолого-биохимические и хемо-таксономические свойства. На основании полученных результатов культура 77-32 была отнесена к роду Rhodococcus, 77-9 – к Microbacterium, а К3-2 – к Bacillus.

Испытания культур микрорганизмов на патогенность, выполненные в Институте экологии труда и гигиены человека (г. Уфа), показали, что они не обладают патогенными для человека и животных свойствами. Данные микроорганизмы хранятся в музее кафедры биохимии и технологии микробиологических производств УГНТУ.

4 Поиск методов увеличения активности, найденных биокатализаторов кинетического разделения рацемических хроманов и кетопрофена Для интенсификации различных методов кинетического разделения были изучены способы увеличения активности найденных биокатализаторов, как на стадии наращивания биомассы, так и в процессе биокатализируемой трансформации.

С этой целью был осуществлен поиск источников углерода (субстратовиндукторов), позволяющих наиболее эффективно осуществлять синтез целевых ферментов микроорганизмами, а также исследовано действие различных органических растворителей на активность биомассы.

4.1 Исследование липолитической и эстеразной активности клеток При исследовании липолитической активности было обнаружено, что все три культуры микроорганизмов 77-32, 77-9, К3-2 осуществляют гидролиз оливкового масла. Это подтверждает предположение о возможном участии клеточных липаз в трансформациях хроманов и кетопрофена исследуемыми микроорганизмами (таблица 1).

Таблица 1- Липолитическая и эстеразная активность биокатализаторов на основе культур микроорганизмов 77-32, 77-9 и К3- Липолитическая мкмоль/мгч Эстеразная активность2, мг/лч Примечания 1 0,2 М фосфатный буфер (рН 8,0); 1 мл смеси оливкового масла с 1% раствором поливинилового спирта, при температуре 37 С;

2 0,1 М фосфатный буфер (рН 7,0); этилацетат – 2 г/л; скорости перемешивания – 180 об./мин и температуре 30 С Было обнаружено, что культуры 77-32 и К3-2 проявляют высокую липолитическую активность по сравнению с микроорганизмом 77-9. В то же время клетки микроорганизма 77-9 проявили высокую эстеразную активность, сопоставимую с активностью клеток 77-32 и К3-2, обусловленной, скорее всего, работой липаз этих микроорганизмов.

Данный факт указывает на то, что за трансформацию сложных эфиров у микроорганизма 77-9 может отвечать клеточная эстераза.

При исследовании синтеза гидролитических ферментов микроорганизмами было обнаружено, что гидролазная активность клеток увеличивается параллельно приросту биомассы и достигает максимума к началу стационарной фазы роста.

Культура 77-32 проявляла наибольшую липолитическую активность в возрасте трое – четверо суток. В случае культуры К3-2 наибольший уровень липолитической активности наблюдался у суточной биомассы. Наибольшая эстеразная активность клеток микроорганизмов 77-9 была достигнута у 2-суточной культуры.

Учитывая, что синтез ряда липаз и эстераз микроорганизмов, как известно, может быть индуцирован в процессе роста субстратами этих ферментов (триацилглицеридами, твином 80, оливковым маслом и др.), а также глицерином и изопропанолом, для повышения эффективности разрабатываемых биокатализаторов было исследовано влияние этих веществ на их гидролазную активность.

Установлено, что уровень гидролазной активности культур микроорганизмов существенно увеличивается при внесении в ростовую среду некоторых указанных соединений (рисунок 5,6).

При исследовании гидролиза оливкового масла суточной биомассой клеток К3-2 было выявлено увеличение липолитической активности биомассы, выращенной на среде с глицерином (1 %), в 2,4 раза по сравнению с контролем (рисунок 5).

Л иполитическая активность, Значительный стимулирующий эффект глицерина (более чем в 2 раза) был обнаружен также при исследовании липолитической активности трехсуточной биомассы клеток микроорганизма 77-32 (рисунок 5). Напротив, при исследовании гидролиза этилацетата, было отмечено, что эстеразная активность микроорганизма 77-9 не увеличивается при выращивании культуры на среде с глицерином (рисунок 5).

В случае культуры 77-9 при тестировании двухсуточной биомассы было обнаружено некоторое увеличение эстеразной активности на среде с оливковым маслом (рисунок 6). При исследовании липолитической активности биомассы клеток микроорганизма 77-9, полученной на среде с этой добавкой, также обнаружено повышение её активности у суточной биомассы.

При исследовании динамики изменения липолитической активности культур микроорганизмов 77-32 и К3-2 во времени на средах с глицерином было установлено, что наибольшая активность, как и на среде без добавок, проявляется у суточной биомассы клеток К3-2 и трехсуточной биомассы у культуры 77-32.

хроманилэтилацетата, кетопрофена с помощью биокатализаторов, полученных на основе биомассы исследуемых микроорганизмов с максимальной липолитической активностью, было обнаружено, что скорость реакции возрастает в 1,3 и 1,7 раза в трансформациях, катализируемых культурами микроорганизмов 77-32 и К3- (таблица 2), соответственно.

Таблица 2 - Относительная активность биокатализаторов, полученных на средах с добавками глицерина и оливкового масла в различных реакциях Трансформация микроорган ростовой Переэтерификация кетопрофена Гидролиз хроманилэтилацетата *Примечание - рассчитана по отношению к контролю (биомасса, выращенная на среде без добавок, время трансформации двое суток) В то же время в случае ацилировании хроманилэтанола микроорганизмом 77- скорость реакции оставалась на прежнем уровне (как на среде без добавок) (таблица 2).

4.2 Исследование влияния способа обработки биомассы на гидролазную активность клеточных катализаторов В настоящем исследовании в процессах трансформации соединений 1, 2 и использовалась биомасса микроорганизмов, предварительно отмытая от ростовой среды фосфатным буфером и затем обезвоженная ацетоном.

Обезвоживание клеток ацетоном было необходимо для трансформации исследуемых субстратов в органических растворителях. Однако известно, что обработка органическими растворителями препаратов липаз или клеток микроорганизмов может существенно ускорять катализируемые ими реакции не только в безводных растворителях, но и в водной среде.

С целью увеличения активности биокатализаторов была осуществлена их обработка другими органическими растворителями, способными модифицировать клеточные мембраны (увеличивать их проницаемость) или активировать липолитические ферменты вследствие изменения липофильно-гидрофильного баланса внутримолекулярных взаимодействий, формирующих конформацию и связанную с ней активность фермента. В качестве растворителей наряду с ацетоном использовали изопропанол, толуол и хлороформ.

В результате исследования было установлено, что обработка ацетоном была оптимальным вариантом для клеток микроорганизмов 77-9 и К3-2 (рисунок 7).

относительная скорость, г/лч относительная а - гидролиз хроманилэтилацетата в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Rhodococcus (77-32);

б - ацилирование хроманилэтанола в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Microbacterium (77-9);

в - переэтерификация кетопрофена в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (К3-2) Рисунок 7 – Влияние природы растворителя, используемого при предобработке биомассы микроорганизмов, на их гидролазную активность В случае культуры микроорганизма 77-32 был найден более эффективный способ увеличения гидролазной активности биомассы. Установлено, что дополнительная обработка клеток толуолом после их обезвоживания ацетоном позволяет увеличить скорость гидролиза хроманилэтилацетата еще в 2 раза.

Таким образом, нами были подобраны условия увеличивающие активность биокатализаторов путем внесения ростовой добавки и обработки биомассы органическими растворителями на основе культур микроорганизмов: Rhodococcus (77-32), осуществляющий гидролиз хроманилэтилацетата и Bacillus (К3-2), осуществляющий переэтерификацию кетопрофена. В случае биокатализатора на основе культуры микроорганизма Microbacterium (77-9), осуществляющего ацилирование хроманилэтанола, активность оставалась на прежнем уровне.

Использование биокатализатора рода Rhodococcus (77-32), полученного в оптимизированных условиях, позволило увеличить конверсию R,Sхроманилэтилацетата до 48 % за трое суток, однако, при этом оптическая чистота образующегося S-хроманилэтанола оказалась ниже (66 % ее). В случае биокатализатора рода Bacillus (К3-2) оптическая чистота образующегося Sкетопрофена оставалась на прежнем уровне (75 % ее).

кетопрофена 5.1 Энантиоселективный гидролиз рацемического хроманилэтилацетата с помощью биокатализатора на основе микроорганизма рода Rhodococcus (77-32) В результате проведенных исследований разработан метод получения S-()-хроманилэтанола путем энантиоселективного гидролиза рацемического хроманилэтилацетата с помощью катализатора на основе микроорганизма рода Rhodococcus (77-32) и последующего щелочного гидролиза остаточного S- эфира, который позволяет получать целевой продукт практически со 100 %-ным выходом (от исходного субстрата), вследствие протекания катализируемой инверсии R-хроманилэтанола в S-энантиомер в условиях биотрансформации.

Время биотрансформации при соотношении субстрат - биокатализатор 3: (вес.) составляет 96 ч.

Показана возможность многократного использования биокатализатора, по крайней мере, в течение 5 циклов:

R,S-хроманилэтилацетат R-(+)-хроманилэтанол S-(+)-хроманилэтилацетат Предложена принципиальная технологическая схема получения S-хроманилэтанола (рисунок 8).

Процесс состоит из трех основных стадий: приготовление биокатализатора, био- и химические трансформации хроманилэтилацетата в S-()-хроманилэтанол и выделение готового продукта.

Трансформацию осуществляют в реакторе 1, куда подается растворенный в ацетоне субстрат, фосфатный буфер и вводится биокатализатор. Реакция проводится при 30-32 С и постоянном перемешивании в течение 96 ч. В центрифуге происходит осветление реакционной смеси, которая затем перекачивается в экстрактор 3, куда подается экстрагент - хлороформ. После экстракции и разделения органической и водной фаз органический слой осушается сульфатом магния в отстойнике 4 и через фильтр 5 подается в роторно-пленочный испаритель 6.

Разделение спиртовой и эфирной фракций осуществляется методом ВЭЖХ (элюэнт гексан:этилацетат) 7. Фракции, содержащие спирт или эфир, упариваются под вакуумом в аппаратах 8 и 9. Затем эфир подвергается щелочному гидролизу в емкости 10.

1 – реактор; 2-центрифуга; 4,10- емкости; 3-экстрактор; 5- фильтр, 6,8,9 – вакуумный испаритель; 7 – колонка ВЭЖХ Рисунок 8 - Принципиальная технологическая схема получения Обнаруженная в ходе кинетического разделения рацемического хроманилэтилацетата инверсия R-(+)-хроманилэтанола в S-()-энантиомер в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Rhodococcus (77-32) открывает новые пути к перспективной технологии получения S-()энантиомера непосредственно из рацемического хроманилэтанола. При этом технологическая схема процесса существенно упрощается и включает биореактор, экстрактор и испаритель.

5.2 Двухступенчатая переэтерификация кетопрофена в присутствии биокатализатора на основе микроорганизма рода Bacillus (К3-2) Известно, что при этерификации кетопрофена с помощью ферментного препарата Novozym 435 (Candida antarctica) удается получить остаточный Sкетопрофен с энантиомерным избытком при двухступенчатой переэтерификации оптическая чистота S-кетопрофена достигает 96 % ее.

Энантиоселективная переэтерификация рацемического кетопрофена с винилацетатом в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (К3-2) позволяет получить остаточный S-кетопрофен с 75% ее. Таким образом, разработанный биокатализатор на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (К3-2) не уступает по эффективности известному ферментному препарату Novozym 435 (Candida antarctica), позволяющему получать при двухступенчатой переэтерификации S-кетопрофен высокой оптической чистоты.

(R)-(-)-винилкетопрофенат Рисунок 9 - Принципиальная технологическая схема двухступенчатой переэтерификации кетопрофена в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (К3-2) 6 Увеличение активности биокатализаторов, используемых в процессах кинетического разделения вторичных спиртов и их эфиров Важнейшими синтонами при производстве лекарственных препаратов и биологических средств защиты растений являются оптически чистые энантиомеры спиртов, оксикислот и сложных эфиров. Перспективным методом получения этих соединений является кинетическое разделение рацемических смесей с помощью гидролаз микроорганизмов (эстераз и липаз), отличающихся высокой селективностью, широкой субстратной специфичностью, активностью, стабильностью, способностью работать как в воде, так и в органических растворителях.

Положительные результаты по увеличению гидролазной активности биокатализаторов кинетического разделения рацемических хроманилэтанола, хроманилэтилацетата и кетопрофена путем обработки биомассы различными растворителями показывают, что эта методология может оказаться перспективной и в отношении других энантиоселективных биокатализаторов.

С целью увеличения ферментативной активности и стабильности, ранее разработанных энантиселективных клеточных биокатализаторов на основе обработанных ацетоном биомасс культур микроорганизмов родов Rhodococcus (78Bacillus (77-1) и Bacillus (79-54) – продуцентов энантиоселективных внутриклеточных гидролаз сложных эфиров (липаз, эстераз) - осуществлен поиск способов их обработки различными органическими растворителями.

В результате исследования каталитической активности клеток Rhodococcus (78-5) в процессе энантиоселективного гидролиза рацемического этил-3оксибутирата (ЭОБ) было обнаружено, что наиболее эффективной для обработки биомассы является смесь ацетон-толуол (1:1), позволяющая увеличить её активность в 4,2 раза, что превышает в 1,8 раза активность биомассы, обработанной одним ацетоном:

H OH HO H

(R,S)-ЭОБ В случае клеток микроорганизма рода Bacillus (79-54) установлено, что для стереоселективного гидролиза рацемической смеси втор-бутилацетата наиболее эффективной является предварительная обработка биомассы смесью растворителей изопропанол-толуол (1:1), увеличивающая активность нативного катализатора в 4, раза. В случае культуры Bacillus (77-1) наибольший эффект роста активности (в 1, раза) достигается при обработке смесью ацетона и толуола (1:1). При энантиоселективном ацилировании октанола-2 обработка биомассы микроорганизма Bacillus (77-1) смесью изопропанол-толуол также позволила увеличить активность биокатализатора в 1,5 раза:

(R,S)-Втор-бутилацетат Показано, что предложенный способ интенсификации процесса гидролиза при кинетическом разделении рацемических смесей вторичных спиртов с помощью культур микроорганизмов родов Bacillus (77-1) и Bacillus (79-54), этил-3оксибутирата с помощью клеток рода Rhodococcus (78-5) не снижает энантиоселективных свойств биокатализаторов и позволяет получить S-(+)-вторбутанол, R-(-)-втор-бутилацетат, R-(-)-этил-3-оксибутират и S-(+)-оксибутират с оптической чистотой 96 - 98 % ее. При этом также сохраняется возможность многократного использования биокатализаторов (по крайней мере, в течение трех циклов).

6.1 Разработка однореакторного хемо-биокаталитического синтеза оптически активных вторичных спиртов с помощью клеточных биокатализаторов С целью упрощения технологии получения индивидуальных энантиомеров спиртов или эфиров высокой оптической чистоты была изучена возможность совмещения химического синтеза вторичного рацемического спирта из прохирального предшественника и его кинетического разделения в процессах энантиоселективного ацилирования винилацетатом в присутствии биокатализаторов на основе клеток рода Bacillus (77-1).

Рацемический октанол-2 был получен восстановлением октанона- боргидридом натрия в присутствии мелкодисперсного алюминия в гексане.

Для энантиоселективного ацетилирования рацемического октанола- использовались высокоселективные цельноклеточные биокатализаторы на основе культуры микроорганизма рода Bacillus (77-1), проявивших высокую активность в процессах ацетилирования ряда первичных и вторичных спиртов винилацетатом в гексане.

Показано, что предложенный однореакторный способ восстановления октанона-2 боргидридом натрия до рацемического октанола-2 и его кинетическое разделение с помощью клеток Bacillus (77-1) в гексане позволяет получить (S)-(+)втор-октанол и (R)-()-втор-октилацетат с оптической чистотой 96 - 98 % ее.

ВЫВОДЫ

1 В результате скрининга выделены и идентифицированы микроорганизмы Rhodococcus (77-32), Microbacterium (77-9) и Bacillus (K3-2), обладающие высокой липолитической и эстеразной активностью.

2 На основе культур микроорганизмов созданы энантиоселективные биокатализаторы родов Rhodococcus (77-32) для энантиоселективного гидролиза эфиров: хроманилэтилацетата и бутилового эфира кетопрофена, Microbacterium (77для парциального ацилирования R,S-хроманилэтанола и Bacillus (K3-2) для переэтерификации R,S-кетопрофена. Определены условия роста биомассы и трансформации на активность биокатализаторов. Показана возможность многократного применения созданных биокатализаторов в течение длительного времени.

3 Разработаны методы кинетического разделения рацемического хроманилэтанола путем его парциального ацилирования винилацетатом в присутствии биокатализаторов на основе клеток микроорганизма Microbacterium (77-9) и энантиоселективного гидролиза рацемического хроманилэтилацетата на основе клеток микроорганизма Rhodococcus (77-32), позволяющие получать (S)-()хроманилэтанол высокой оптической чистоты - 76 и 99 % ее соответственно.

4 Разработан метод кинетического разделения рацемического бутилового эфира 2-(3-бензоилфенил)пропионовой кислоты путем энантиоселективного гидролиза с помощью катализаторов на основе культур микроорганизмов рода Bacillus (K3-2), позволяющих получать R-()-кетопрофен высокой оптической чистоты (78% ее).

5 Разработан метод кинетического разделения рацемической 2-(3бензоилфенил)пропионовой кислоты путем переэтерификации с винилацетатом в присутствии биокатализатора на основе культуры микроорганизма Bacillus (K3-2), позволяющий получать кетопрофен высокой оптической чистоты.

6 Предложен метод увеличения активности энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования вторичных спиртов и гидролиза их эфиров, полученных на основе культур микроорганизмов Rhodococcus (78-5), Bacillus (77-1) и Bacillus (79-54), в 1,1-4,5 раза путем обработки их органическими растворителями без снижения их энантиоселективности.

7 Доказана возможность осуществления однореакторного хемобиокаталитического синтеза оптически активных вторичных спиртов из кетонов (на примере октанола-2) с использованием биокатализатора на основе клеток микроорганизма Bacillus (77-1), катализирующего энантиоселективное ацилирование рацемического октанола-2.

8 Научно обоснованы принципиальные технологические схемы получения оптически активных синтонов предшественников витамина Е и нестероидных противовоспалительных препаратов: (S)-()-хроманилэтанола и (S)-(+)-кетопрофена.

Содержание работы опубликовано в 9 научных трудах, из которых № 1- включены в перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, выпускаемых в Российской Федерации в соответствии с требованиями ВАК Минобразования и науки РФ 1 Хабибуллина И.И., Петухова Н.И., Одиноков В.Н. и др. Скрининг микроорганизмов для энантиоселективного ацетилирования 6-бензилокси-2(3гидроксиэтил)-2,5,7,8-тетраметилхромана – хирона для витамина Е //Башкирский химический журнал -2004.- Том 11, №1.- С.51.

2 Хабибуллина И.И., Петухова Н.И., Спивак А. Ю. и др. Создание биокатализаторов для энантиоселективного ацилирования хроманилэтанола // Башкирский химический журнал- 2005. -Том 12, №1, С.5-6.

3 Хабибуллина И.И., Лукьянова А.В., Петухова Н.И. и др. Поиск методов повышения активности биокатализаторов кинетического разделения рацемических смесей эфиров вторичных спиртов // Башкирский химический журнал - 2006.- Том 13, №1.- С. 92-95.

4 Вершинин С.С., Коньшин П.С., Хабибуллина И.И. и др. Синтез кетопрофена // Башкирский химический журнал- 2006.- Том 13, №1.- С. 74-78.

5 Башарова Р.В., Хабибуллина И.И., Петухова Н.И. и др. Скрининг микроорганизмов для ацетилирования 6 –бензилокси– 2(3' – гидроксиэтил) – 2,5,7, – тетраметилхромана // Материалы 55-й научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых.- Уфа: УГНТУ, 2004.- С.390.

6 Абдульманов Д.А.,. Хабибуллина И.И, Петухова Н.И. и др. Скрининг внутриклеточных ацетилэстераз микроорганизмов-биокатализаторов процесса ацилирования 6 –бензилокси– 2(3' – гидроксиэтил) – 2,5,7,8 – тетраметилхромана // Материалы 56-й научно-технической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых.- Уфа: УГНТУ, 2005.- С.179.

7 Хабибуллина И.И., Сучкова Е.В., Петухова Н.И. и др. Интенсификация биокаталитических методов получения оптически активных синтонов -токоферола // Химия и медицина: материалы II Всерос. науч. конф.- Уфа, 2005.- С.166-167.

8 Хабибуллина И.И., Исмагилова Л.М., Петухова Н.И. и др. Интенсификация процессов кинетического разделения рацемических смесей сложных эфиров оксикислот с помощью клеток Rhodococcus sp. 78-5 // Успехи интеграции академической и вузовской науки по химическим специальностям: материалы респ.

науч.-практ. конф.- Уфа.- 2006.- С.145-149.

9 Хабибуллина И.И., Исмагилова Л.М., Вершинин С.С. и др. Скрининг липолитических микроорганизмов для кинетического разделения кетопрофена // Интеграция науки и высшего образования в области био- и органической химии и биотехнологии: материалы IV Всерос. науч. internet-конф.- Уфа: Реактив, 2006.-С.

104-106.



 
Похожие работы:

«МАРТЫНОВА Кристина Владимировна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОРОТКИХ ГЛИЦИН- И ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ 03.00.23 – биотехнология 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в Отделе химии физиологически активных веществ Учреждения Российской академии наук Института...»

«ВОЙКИНА АННА ВЛАДИМИРОВНА НАКОПЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ В КОМПОНЕНТАХ ЭКОСИСТЕМ ТАГАНРОГСКОГО И ЯСЕНСКОГО ЗАЛИВОВ АЗОВСКОГО МОРЯ И ИХ АДДИТИВНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГИДРОБИОНТОВ 03.02.08 — экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в ФГУП Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (АзНИИРХ), г. Ростов-на-Дону и на кафедре экологии и природопользования Южного...»

«ХЛОПОВА Анна Владимировна МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ ГОРЧАКОВ (Cyprinidae, Acheilognathinae) И ПЕСКАРЕЙЛЕНЕЙ (Cyprinidae, Gobioninae) БАССЕЙНА РЕКИ АМУР 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология 03.00.10 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2009 2 Работа выполнена в Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской академии наук и в...»

«ТРУШКОВА Марина Александровна СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЛАНДШАФТАХ РАЗЛИЧНОГО РАНГА (на примере Нижегородского Поволжья) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 2 Работа выполнена на кафедре зоологии и общей биологии естественно-географического факультета ГОУ ВПО Нижегородский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических...»

«Галицкая Анна Алексеевна ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ WOLFFIA ARRHIZA (L.) К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ 03.02.08 – экология (биология) 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) Научные руководители: доктор...»

«Памирский Игорь Эдуардович АНАЛИЗ СТЕПЕНИ СТРУКТУРНОЙ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОДНОТИПНОСТИ ПОЛИВАЛЕНТНОГО ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ, СОДЕРЖАЩЕГОСЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЖИВОТНЫХ, И СОЕВОГО ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА 03.00.13 – физиология 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Благовещенск – 2009 2 Работа выполнена на кафедре биологической химии ГОУ ВПО Амурская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и...»

«Парыгин Виталий Викторович КАЧЕСТВО КЛЕЙКОВИНЫ В ЗЕРНЕ КАК АДАПТИВНЫЙ ПОКАЗАТЕЛЬ У ЭКОТИПОВ ПОПУЛЯЦИЙ Triticum vulgare L. В ПРЕДБАЙКАЛЬЕ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2011 2 Работа выполнена на кафедре физиологии растений, микробиологии и агрохимии ФГОУ ВПО Иркутская государственная сельскохозяйственная академия Научный руководитель : Илли Иван Экидиусович доктор биологических наук, профессор...»

«Воронкова Валерия Николаевна ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОШАДЕЙ САЯНО-АЛТАЙСКОГО РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК МАРКЕРОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2012г. Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва Научный...»

«ЛАЗАРЕВА ТАТЬЯНА НИКОЛАЕВНА ПОЛИМОРФИЗМ БЕЛКОВ СЕМЯН У ВИДОВ И СОРТОВ ГРЕЧИХИ FAGOPYRUM MILL. 03.00.12 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург– 2007 2 Работа выполнена в лаборатории биохимии Всероссийского научноисследовательского института зернобобовых и крупяных культур (Орел) в 2003гг. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Павловская Нинель Ефимовна Официальные...»

«Соколова Ирина Владимировна ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКУЛЬТИВАЦИОННЫХ ПОЧВЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ С ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫМИ ПО ГРАНУЛОМЕТРИЧЕСКОМУ СОСТАВУ СЛОЯМИ 06.01.03 – агропочвоведение, агрофизика 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук г. Москва 2009 г. Работа выполнена на кафедре физики и мелиорации почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научные руководители:...»

«ЕФРЕМОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО СВЕТА НА МОРФОГЕНЕЗ И ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС КУКУРУЗЫ, ИНФИЦИРОВАННОЙ МОЗАИЧНЫМ ВИРУСОМ КАРЛИКОВОСТИ 03.00.05 – ботаника 03.00.12 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2003 2 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Карначук...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«АНДРЕЕВА Алевтина Сергеевна ЖУКИ-ЛИСТОЕДЫ (COLEOPTERA: CHRYSOMELIDAE) БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ: ФАУНА, ЭКОЛОГИЯ, ХОЗЯЙСТВЕННОЕ ЗНАЧЕНИЕ 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Белгород – 2014 Работа выполнена на кафедре биоценологии и экологической генетики ФГАОУ ВПО Белгородский государственный национальный исследовательский университет Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент Присный Александр...»

«Токарь Ольга Егоровна ВОДНЫЕ МАКРОФИТЫ РЕКИ ИШИМ И ПОЙМЕННЫХ ОЗЕР (флора, растительность и фитоиндикация экологического состояния экотопов) 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Омск – 2005 Диссертация выполнена на кафедре ботаники и основ сельского хозяйства Омского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Борис Федорович Свириденко Официальные...»

«Рогозин Михаил Владимирович ИЗМЕНЕНИЕ ПАРАМЕТРОВ ЦЕНОПОПУЛЯЦИЙ Pinus sylvestris L. И Picea fennica (Regel) Kom. В ОНТОГЕНЕЗЕ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ И ЕСТЕСТВЕННОМ ОТБОРЕ Специальности 03.02.01 – ботаника; 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2013 Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории Экологии леса Естественнонаучного института ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«СИБИРНЫЙ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧ Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва, 2013 1 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и микробиологии биолого-почвенного факультета Жешовского...»

«БАБОША АЛЕКСАНДР ВАЛЕНТИНОВИЧ МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ Специальность: 03. 01. 05 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН)...»

«Горбачева Марина Анатольевна Биокаталитические свойства лакказ из различных источников Специальность 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2009 1 Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук С.В. Шлеев Официальные оппоненты : доктор химических наук И.Н. Курочкин кандидат химических...»

«Славгородская Дарья Алексеевна ВЛИЯНИЕ СЛОЖНОГО ОРГАНОМИНЕРАЛЬНОГО КОМПОСТА НА СВОЙСТВА ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО И УРОЖАЙНОСТЬ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗАПАДНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ Специальность 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар – 2014 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Кубанский государственный аграрный университет в...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.