WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПОПРОТЕИНОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НОРМО- И ГИПЕРТРИГЛИЦЕРИДЕМИИ ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Дергунов Александр Дмитриевич

СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПОПРОТЕИНОВ

ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ НОРМО- И ГИПЕРТРИГЛИЦЕРИДЕМИИ

03.00.04 – биохимия и 03.00.02- биофизика

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении "Государственный научноисследовательский центр профилактической медицины" Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович доктор биологических наук Торховская Татьяна Ивановна доктор физико-математических наук, профессор Рууге Энно Куставич

Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится "_" _ 2009 года в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.057.01 при Федеральном государственном учреждении "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" Федерального медикобиологического агенства по адресу: 119435, Москва, улица Малая Пироговская, дом 1А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения "Научно-исследовательский институт физико-химической медицины" Федерального медико-биологического агенства.

Автореферат разослан "_" _ 2009 года

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор биологических наук М.А. Мурина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Помимо известной связи увеличенного содержания холестерина плазмы с развитием атеросклероза и ишемической болезни сердца, роль увеличенного содержания триглицеридов (ТГ) как независимого фактора риска становится все более очевидной (Austin, 2000). Гипертриглицеридемия часто ассоциирована с пониженным содержанием холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛВП) (Chapman et al., 2004). В метаболизме ТГ-богатых липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП) и ЛВП ключевое значение играют апобелки апоE (Brown, 2007) и апоA-I (Frank and Marcel, 2000) соответственно. Патофизиологическая и прогностическая значимость отдельного метаболического компартмента (про- или антиатерогенный эффект в развитии атеросклероза) тесно зависит от состояния сети метаболизма липопротеинов в целом. Действительно, существующая неопределенность оценки роли апоЕ связана с концентрационно-зависимыми эффектами промотирования клиренса ремнантов триглицерид-богатых частиц в области физиологических концентраций апобелка и индукции гипертриглицеридемии его большими концентрациями (Kypreos and Zannis, 2007).





Аналогично, хорошо известная атеропротективная роль ЛВП может сменяться их проатерогенной активностью в некоторых условиях (Florentin et al., 2008; Kontush and Chapman, 2006; Norata et al., 2006). Становится необходимым использование интегративного подхода в вычленении вкладов отдельных компартментов и относительной роли отдельных метаболических реакций (гидролиз триглицеридов и фосфолипидов липазами, генерация и транспорт эфиров холестерина, рецептор-опосредованный клиренс). Роль апобелковэффекторов этих реакций в пулированности компартмента может реализоваться на уровне структурной организации липидной фазы и апобелков, придавая частице и пластичность и устойчивость к изменению сети (Pownall and Ehnholm, 2006), например, через модулирование отношений апоA-I : апоA-II в случае ЛВП и апоЕ : апоC-III в случае триглицерид-богатых частиц. Особенно актуальна предположенная ассоциация апоЕ как белка с внутренне-неупорядоченной структурой с развитием ишемической болезни сердца (Cheng et al., 2006). Помимо этого, постулированная роль апоЕ в биогенезе и метаболизме ЛВП (Kypreos and Zannis, 2007) предполагает участие апобелка в сопряжении метаболизма триглицерид-богатых частиц и ЛВП. Связь физико-химических свойств липопротеинов, их апобелков и параметров отклика сети при различных метаболических состояниях является одной из основных проблем липопротеомики (Alonzi et al., 2008; Brown, 2007).

Цель исследования Изучение роли структуры апобелков и липидной фазы в эффективности основных реакций транспорта липидов и метаболизма липопротеинов плазмы крови человека при нормо- и гипертриглицеридемии и системное построение метаболических цепей.

1. Изучить структуру и стабильность апобелков в растворе и липид-ассоциированном состоянии и роль индивидуальных доменов и частично-свернутых структур в связывании и обмене апобелков между липопротеинами.

2. Изучить особенности организации и динамики липидной фазы и связь с субстратными и лигандными свойствами липопротеинов разных классов.

3. Изучить влияние апобелков через белок-белковые и апобелок-липидные взаимодействия на эффективности гидролиза триглицеридов, генерации эфиров холестерина и связывания с ЛНП-рецептором.

4. Разработать и использовать метаболом-подобный подход для визуализации структурнодетерминированных компартментов системы транспорта липидов.

5. Оценить связи между липид- и апоЕ-содержащими компартментами и роль апоЕ в сопряжении метаболизма триглицерид-богатых липопротеинов и липопротеинов высокой плотности при нормо- и гипертриглицеридемии.





1. Разработан и использован метаболом-подобный подход для анализа системы транспорта липидов с параллельной детекцией распределения апоЕ и аналога церамида между липопротеинами.

2. Меньшая стабильность и специфическое междоменное взаимодействие в молекуле апоЕ4 приводят к накоплению апоЕ4 в ЛОНП.

3. Радиальная гетерогенность динамики дипальмитоилфосфатидилхолина в реконструированных дискоидальных ЛВП с апоA-I, имевшаяся в бинарных комплексах при температурах ниже температуры фазового перехода Tt, присутствовала в тройных комплексах с холестерином при температурах выше и ниже Tt. В трех холестеринсодержащих комплексах степень исключения холестерина из пограничного липида вблизи апобелка возрастала в ряду апоA-I апоE апоA-II.

Схожесть локализации и упаковки -спиралей в С-доменах молекул апоA-I и апоЕ приводит к схожей природе взаимодействий двух апобелков с фосфатидилхолином и в заместительную роль в генерации эфиров холестерина.

эффективность взаимодействия возрастает при кластеризации нескольких молекул апобелка на поверхности частиц.

гипертриглицеридемии и апоC-III модулирует апоЕ-опосредованное взаимодействие частиц с ЛНП-рецептором.

7. С увеличением содержания триглицеридов плазмы конкуренция ЛОНП и ЛНП за ЛНПрецептор in vivo нарастает.

8. АпоC-II активировал, а апоC-III бесконкурентно ингибировал гидролиз триглицеридов липопротеинлипазой коровьего молока in vitro.

9. Активация печеночной липазы и ингибирование липопротеинлипазы, наиболее гипертриглицеридемии.

10. Эффективность клиренса триглицеридов плазмы реципрокно контролируется апоЕ и апоC-III. Сниженный клиренс триглицеридов плазмы у пациентов с апоЕ4 по сравнению с апоЕ3 и апоЕ2 ассоциирован со сниженным клиренсом ЛНП.

Обнаружены двухдоменная организация апоЕ3, апоЕ2 и апоЕ4 и сниженная стабильность апоЕ4. Выяснена природа накопления апоЕ4 в частицах ЛОНП и учтен вклад распределения апобелка между липопротеинами разных классов в соотношения путей катаболизма ЛОНП и ЛНП при нормо- и гипертриглицеридемии, различающиеся для трех изоформ. Ассоциация апоЕ4 с ишемической болезнью сердца может объясняться наибольшей внутренней неустойчивостью молекулы апоЕ4. Охарактеризованы пути влияния С-апобелков на рецептор- и липолиз-зависимые пути катаболизма триглицерид-богатых частиц. Выявлена саморегуляция липолитической деградации ЛОНП через изменение содержания эффекторных апобелков. Описаны молекулярные механизмы увеличенного связывания ЛОНП с ЛНП-рецептором и сниженной эффективности их липолитической деградации при гипертриглицеридемии, лежащие в основе атерогенного действия триглицерид-богатых частиц. Выявлен вклад физического состояния липидной фазы в динамику молекулы апоВ в ЛНП. Предположен и использован алгоритм системного анализа метаболических связей между индивидуальными липид- и апоЕ-содержащими компартментами и выявлены изоформ-специфичные ассоциации. Изучены молекулярная реконструированных частицах ЛВП дискоидальной формы, содержащих индивидуальные апобелки апоA-I, апоE и апоA-II и предположен вклад структурно-динамической неоднородности фосфолипида в обратный транспорт холестерина с участием пре-ЛВП.

Изученные механизмы вклада структуры липопротеинов и их апобелковых компонент в регуляцию метаболизма липопротеинов определяют феноменологию гипертриглицеридемии как независимого фактора риска сердечно-сосудистых заболеваний.

Эти механизмы определяют основы будущей генной и пептидной терапии дислипидемий при индукции специфичной экспрессии генов ферментов и апобелков-регуляторов, при использовании рекомбинантных апоA-I и апоЕ, их фрагментов и комплексов апобелка с фосфолипидом для увеличения эффективности обратного транспорта холестерина и сопряжения метаболизма триглицерид-богатых частиц и ЛВП. Обнаруженная липидная гетерогенность дискоидальных ЛВП будет определять стратегию поиска модуляторов физического состояния липидной фазы пре-ЛВП для увеличения сорбции холестерина частицами. Разработанный на основе капиллярного изотахофореза и набора метаболических правил метаболом-подобный подход можно использовать для экспресс-диагностики и поиска молекулярных мишеней при функциональном и структурном нарушениях метаболизма липопротеинов. Обнаруженный фенотип-чувствительный ответ баланса изменения содержания триглицеридов плазмы и холестерина ЛВП определяет эффективность терапии статинами с позиций фармакогеномики. Пути коррекции таких конформационно-чувствительных патологических состояний, ассоциированных с апоЕ4, как болезнь Альцгеймера и атеросклероз, могут включать влияние на различные стабильность и распределение изоформ апоЕ между липопротеинами.

Материалы работы представлены на 9 отечественных и 36 международных симпозиумах, в том числе на 5 и 6 симпозиумах по биохимии липидов (Алма-Ата, 1987;

Санкт-Петербург, 1994); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); международном биофизическом когрессе (Ванкувер, 1990); Европейских конференциях по спектроскопии биологических молекул (Йорк, 1991; Лутраки, 1993; Сан-Лоренцо де Эль Эскориал, 1997; Твенте, 1999); конгрессах Европейского общества изучения атеросклероза (Ницца, 1992; Иерусалим, 1993; Зальцбург, 2002; Хельсинки, 2007; Стамбул, 2008);

международных симпозиумах по атеросклерозу (Монреаль, 1994; Париж, 1997; Хельсинки, 2000; Киото, 2003; Рим, 2006; Бостон, 2009); международных симпозиумах по препаратам, влияющим на метаболизм липидов (Хьюстон, 1995; Флоренция, 1998; Нью-Йорк, 2001;

Венеция, 2004; Нью-Йорк, 2007). Результаты работы обсуждены на межлабораторном семинаре отдела изучения биохимических маркеров 24 марта 2009 года.

По включенным в диссертацию материалам опубликовано 46 статей в рецензируемых научных журналах и изданиях.

Диссертация изложена на 389 страницах и состоит из введения, обзора литературы ( главы), экспериментальной части с описанием материалов и методов (4 главы), результатов исследования и их обсуждения (5 глав) и выводов. Работа включает 47 таблиц, 95 рисунков, 89 уравнений и схем. Список цитированной литературы включает 729 наименований.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

СТРУКТУРА АПОБЕЛКА Е В РАСТВОРЕ

Сворачивание апоЕ (смесь изоформ пула плазмы) в растворе Меченный флуоресцеином апоЕ характеризовался высоким значением анизотропии флуоресценции. Рассчитанное значение молекулярной массы, равное 91 кДа, существенно превышало известную величину 34 кДа. Равновесный процесс денатурации/ренатурации апоЕ/Ф при действии гуанидин-гидрохлорида (рис. 1) включал два перехода с точками перегиба при концентрациях 1 М и 2,5 М GuHCl, что свидетельствует о существовании стабильных промежуточных форм. При проведении обмена молекулами апобелка между существующими самоассоциированными формами или ренатурации белка регистрировали индуктивно-резонансный перенос энергии между донор- и акцептор-меченными молекулами апоЕ. При "сшивании" препарата апоЕ водо-растворимым бифункциональным реагентом образовывались промежуточные димерные и тримерные формы и конечный продукт тетрамер. Таким образом, апоЕ/Ф в растворе существует в равновесии между тетрамером и мономером. Первая фаза денатурации может соответствовать диссоциации самоассоциированной формы; при увеличении концентрации GuHCl выше 1 М начинается денатурация мономеров апоЕ/Ф и переход заканчивается при 4 М GuHCl.

Сложный процесс сворачивания апоЕ/Ф выявлен при измерении изменений во времени величин переноса, интенсивности, анизотропии и тушения флуоресценции флуоресцеина при инкубации апобелка при 0 °С (холодовая инкубация) или 24 °С (тепловая инкубация) после проведения диализа пре-денатурированных препаратов апобелка (табл. 1). При мономеризации апоЕ холатом Na эффективность переноса энергии флуктуировала вблизи значения 29% в процессе 6-часовой инкубации апобелка как при 0 °С, так и при 24 °С. Не менялась также анизотропия флуоресценции при холодовой инкубации, при тепловой инкубации наблюдалось снижение этого параметра с 0,146 до 0,135. Таким образом, инкубация после диализа выявляет по наличию переноса энергии и высокому значению Рис. 1. Обратимость GuHCl-индуцированной денатурации апоЕ/Ф. Отношение I536/I508 индикатор положения максимума спектра флуоресценции (2) равна сумме компонент (I + 2I), полученных при измерении (открытые символы) апобелка.

денатурировали в холате, детергент удаляли эластазой (В), субтилизином (Г), протеазой регистрировали температурную зависимость разделяли электрофорезом в Ds-Na-ПААГ.

анизотропии флуоресценции апоЕ/Ф r.

Таблица 1. Сворачивание апоЕ при двух температурах.

анизотропии самоассоциированную форму апобелка. Снижение интенсивности флуоресценции при инкубации апоЕ/Ф при 24 °С было менее выраженным по сравнению с изменением интенсивности флуоресценции при инкубации при 0 °С. Температурная зависимость изменения интенсивности флуоресценции апоЕ/Ф указывает на вовлеченность гидрофобных взаимодействий, более стабильных для алифатических радикалов при комнатной температуре, чем при 0° С (Кушнер, 1977). Степень доступности хромофоров f для анионов I- не изменялась после холодовой инкубации и значимо снижалась при тепловой инкубации. Константа тушения Штерн-Фольмера КШ-Ф флуоресценции доступных хромофоров не изменялась в процессе инкубации при обеих температурах. Можно предположить протекание при тепловой инкубации конформационных изменений со самоассоциированного состояния в более структурированное с образованием гидрофобного "ядра". Действительно, дополнительная тепловая инкубация препарата апоЕ/Ф индуцировала структурный переход при 30,5 °С (рис. 2). Сворачивание при пониженной температуре не вызывало появления структурированной формы.

Самоассоциация и доменная структура рекомбинантных изоформ При гель-фильтрации трех рекомбинантных изоформ р-апоЕ2, р-апоЕ3 и р-апоЕ регистрировали пять компонент. Компонента с величиной Rs 6,6 – 7,7 нм может соответствовать тетрамеру (до 65% массы для р-апоЕ2 и р-апоЕ4), а компоненты с радиусом Стокса Rs 4,7 – 5,2 нм и 4,0 – 4,1 нм (50% для р-апоЕ3) соответствуют менее самоассоциированным структурам. С использованием значений Rs для этих структур были ультрацентрифугировании обнаружено шесть компонент и из их положения определены коэффициенты седиментации s (табл. 2). Три основные компоненты обладали массами 153, – 175,8 кДа, 69,3 – 81,9 кДа и 32,4 – 47,6 кДа. Основной самоассоциированной формой является тетрамер с массой 156 кДа, компоненты с меньшими значениями s и Rs обладали массами димера и мономера. Данные по равновесному распределению соответствовали равновесию мономер-димер-тетрамер для р-апоЕ3, мономер-димер-тетрамер-октамер для рапоЕ2 и мономер-димер-тетрамер-октамер для р-апоЕ4. Растворы р-апоЕ2 и р-апоЕ содержали структуры, включавшие более четырех молекул апобелка и эти структуры отсутствовали в растворе р-апоЕ3.

Для изучения доменной структуры изоформ использовали ограниченный протеолиз.

При протеолизе р-апоЕ3 пятью протеазами образовывались две группы фрагментов (рис. 3).

Реакция с моноклональными антителами свидетельствует о принадлежности фрагментов первой группы с массой 20 - 38 кДа к N-домену апобелка и фрагментов второй группы с массой меньше 16 кДа к С-домену. Число и масса карбоксил-терминальных фрагментов рапоЕ4 отличались от таковых для р-апоЕ2 и р-апоЕ3. В начале протеолиза р-апоЕ генерировались фрагменты с массой 16 или 14 кДа (атака области 202-224) и затем они деградировали до фрагментов с массой 12-10 кДа (атака области 230-260). Однако в р-апоЕ и р-апоЕ3 атаковалась только область 230-260 и фрагменты 16 или 14 кДа не появлялись.

Можно предположить, что в р-апоЕ4, в отличие от двух других изоформ, область 230- менее доступна для протеаз из-за междоменного взаимодействия с вовлечением Glu255.

Таблица 2. Гидродинамические свойства и молекулярные массы трех рекомбинантных изоформ апоЕ в растворе. Представлены данные для трех основных компонент каждой изоформы. Коэффициенты диффузии D20,w рассчитаны из данных по скоростному центрифугированию (а) и из значений Rs (б).

Температурная денатурация. Денатурационные зависимости по эллиптичности при 222 нм в диапазоне 15 - 80 °C для п-апоЕ3, р-апоЕ3 и р-апоЕ4 включали один переход в области 40 – 60 °C и второй минорный переход в области 20 – 40 °C для р-апоЕ2.

Наибольшие значения температуры перехода Tm и энтальпии H для р-апоЕ2 предполагают наибольшую температурную стабильность р-апоЕ2 среди трех рекомбинантных изоформ и Таблица 3. Индуцированная температурой денатурация изоформ и изолированных доменов апоЕ по данным КД в дальнем и ближнем ультрафиолете.

наименьшую для р-апоЕ4 (табл. 3). Стабильность р-N-домена выше по сравнению с п-Сдоменом. Денатурация обоих доменов включала два перехода в области 20 – 45 °C и 50 – °C и первый переход отсутствовал в интактном белке. Потеря вторичной структуры при нагревании трех рекомбинантных изоформ и апоЕ3 плазмы была необратимой, в отличие от обратимой температурной денатурации апоA-II (Gursky and Atkinson, 1996) и апоC-I (Gursky and Atkinson, 1998) и частичного восстановления структуры для апоA-I (Suurkuusk and Hallen, 1999). Отметим обратимость денатурации вторичной структуры изолированных доменов. Двух-доменная структура может усложнять ренатурацию интактного белка вследствие, например, междоменного взаимодействия.

Изменения третичной структуры при нагревании регистрировали по эллиптичности при 292 нм. Сравнение температур перехода (табл. 3) выявило возрастание стабильности в ряду р-апоЕ4 р-апоЕ3 п-апоЕ3 р-апоЕ2, идентично данным по стабильности по КД в дальнем УФ. Для р-апоЕ3 и р-апоЕ4 переход по КД в ближнем УФ происходил при меньших температурах по сравнению с КД в дальнем УФ (табл. 3), что соответствует состоянию "расплавленной глобулы"; переходы совпадали для п-апоЕ3 и р-апоЕ2. Эти результаты коррелируют с конформационным переходом при 30,5 °C плотно-упакованной при 24 °C самоассоциированной структуры в случае смеси изоформ белка плазмы.

Химическая денатурация. Из зависимости положения максимума спектра триптофановой флуоресценции и молярной эллиптичности при 222 нм от концентрации GuHCl оценивали долю нативной структуры. Для каждой рекомбинантной изоформы существовало два перехода. Первый переход между 0 и 1,5 M GuHCl соответствовал денатурации С-домена и второй переход между 1 и 5 M GuHCl – денатурации N-домена. Для каждого перехода рассчитывали свободную энергию денатурации (табл. 4). Устойчивости к химической денатурации интактных белков и доменов различались для трех изоформ.

Увеличенная стабильность р-апоЕ2 обусловлена увеличенной стабильностью N-домена.

Таблица 4. Индуцированная GuHCl денатурация изоформ и доменов апоЕ по данным флуоресценции и КД в дальнем ультрафиолете. GnHu2O, GnHi2O и GiHu2O соответствуют свободным энергиям денатурации интактного белка, С-домена и N-домена.

Стабильности С-доменов меньше стабильности N-доменов. Стабильности р-апоЕ4 и ее Nдомена были наименьшими среди трех изоформ. По данным гель-фильтрации в присутствии GuHCl, для мономера с развернутым С-доменом и свернутым N-доменом значение Rs составляло 4 нм, для развернутого мономера – 6,6 нм. Разворачивание р-апоЕ4 происходило при меньших концентрациях GuHCl, а разворачивание р-апоЕ2 – при наибольших.

Индивидуальные зависимости для N- и С-доменов каждой из изоформ по гельфильтрации, круговому дихроизму и флуоресценции не совпадали. При денатурации Nдомена всех изоформ первоначально происходило увеличение размера, затем последовательно менялись вторичная и третичная структуры. Несмотря на увеличение размера молекулы, окружение трех остатков триптофана (24, 34 и 38) первой -спирали, входящей в пучок из четырех спиралей, не изменялось. Это может отражать открытие пучка, наиболее выраженное в апоЕ4, аналогично изменению при ассоциации апоЕ с липидом (Weisgraber, 1994). При денатурации С-домена в каждой изоформе несовпадающие изменения по размеру и флуоресценции предшествовали потере вторичной структуры, что предполагает диссоциацию С-домена перед его денатурацией. Помимо интермедиата с развернутым С-доменом и свернутым N-доменом, разворачивание обоих доменов изоформ апоЕ может включать более двух состояний.

Обнаруженная относительно двух других изоформ сниженная стабильность апоЕ4 с максимальным числом аргининовых остатков (рассматриваемых как индуцирующих неупорядоченность) может лежать в основе ассоциации апоЕ как внутренненеупорядоченного белка с сердечно-сосудистыми заболеваниями (Cheng et al., 2006).

СТРУКТУРА И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА РЕКОНСТРУИРОВАННЫХ

ДИСКОИДАЛЬНЫХ АПОБЕЛОК-ФОСФОЛИПИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ

АпоЕ-содержащие комплексы. Согласно одной из моделей структуры дискоидальных комплексов апоA-I с фосфолипидом (Brasseur et al., 1992; Vanloo et al., 1991), -спиральные участки ориентированы параллельно ацильным цепям фосфолипида по периметру диска, а гидрофобные аминокислотные остатки взаимодействуют с липидной фазой. Образующие пару соседние спирали расположены антипараллельно из-за наличия -структуры, ревертирующей ориентацию второй -спирали. Нами выполнен сравнительный анализ топографии, структуры и стабильности комплексов с апоЕ. Последовательность 206- включает наиболее стабильную пару -спиралей в силу возможного существования шести ионных связей. Для дискоидальных комплексов апоE3 плазмы и его двух доменов с дипальмитоилфосфатидилхолином (ДПФХ) по сравнению с белком в растворе наблюдался “голубой” сдвиг максимума флуоресценции триптофановых остатков, особенно заметный для С-домена. По данным КД и ИК-спектроскопии полного отражения, связывание с фосфолипидом приводило к увеличению содержания -спиралей на 10%. Из величины дихроичного отношения следует, что ацильные цепи фосфолипида и спиральные участки апоЕ3 ориентированы почти параллельно друг другу с отклонением от нормали на 20° и 30° соответственно. Образование комплекса сопровождалось возрастанием устойчивости вторичной структуры к GuHCl-индуцированной денатурации и для белка в комплексе применима модель одиночного перехода между нативным и денатурированным состояниями, в отличие от белка в растворе. По переносу энергии выявлена самоассоциация и/или тесный контакт по крайней мере двух молекул апоЕ (смесь изоформ) в дискоидальных и везикулярных комплексах. Обнаружена также самоассоциация апоA-I и апоC-III-1 в комплексах с димиристоилфосфатидилхолином в широком диапазоне отношения липид:белок.

индивидуальными апобелками апоA-I, апоE и апоA-II в отсутствие и в присутствии 4, вес% (9,1 моль%) холестерина (ХС) исследована с помощью флуоресцентных зондов циспаринаровой и транс-паринаровой кислот с преимущественной локализацией в твердом (транс-ПК) и жидком (цис-ПК) бислое. Начальное весовое соотношение ДПФХ:белок равнялось 3:1, что соответствует мольным отношениям 115:1 для апоА-I, 139:1 для апоЕ и 36:1 для апоА-II. Комплекс апоЕ/ДПФХ характеризовался увеличенным размером и большей гомогенностью. При включении холестерина его содержание в изолированных комплексах возрастало в ряду апоA-II апоE апоA-I и размер комплексов не менялся (табл. 5).

Встраивание цис-ПК и транс-ПК в комплексы с апоA-I оценено по коэффициенту распределения зондов Кр между липидной и водной фазами. Повышение значения Кр при и 50 °C (особенно выраженное для цис-ПК при 25 °C) в случае комплексов апоA-I/ДПФХ относительно липосом свидетельствует об индукции апобелком дефектов в фосфолипидной Таблица 5. Состав, размер и степень гомогенности комплексов с различными апобелками. Приведены среднее значение ± ошибка среднего (n 2) и число разделений.

(*) - репрезентативные значения для индивидуальных препаратов; (**) - ширину пика измеряли на уровне базовой линии.

области, в которой преимущественно локализована цис-ПК. Включение холестерина в комплекс снижало встраивание цис-ПК при 25 °C, вероятно, из-за иммобилизующего действия холестерина, что совпадало со сниженным встраиванием при 50 °C транс-ПК в комплекс апоA-I/ДПФХ/ХС по сравнению с липосомами ДПФХ/ХС. Индуцированные температурой изменения Кр для обоих зондов в противоположном направлении в отсутствие и в присутствии холестерина сложно объяснить распределением зонда между водной и гомогенной липидной фазами. Можно предположить наличие разных фосфолипидных доменов в диске и различное температуро-чувствительное распределение зондов между ними. В этой связи изучены пространственные взаимоотношения в комплексах с помощью переноса энергии с триптофанилов апоA-I на молекулы зондов при температурах ниже и выше Tt (25 и 50 °С) (рис. 4).

квантовый выход, отн. ед.

Рис. 4. Эффективность переноса энергии с Рис. 5. Эффективность переноса энергии с апоA-I на зонды при 25 °С (сплошные апоA-I на зонды в ХС-содержащих комплексах линии) и 50 °С (пунктирные линии). при 25 °C и 50 °C.

Радиальная упаковка белка и липида в комплексе апоA-I/ДПФХ. При 25 °С перенос энергии с белка на цис-ПК более эффективен по сравнению с транс-ПК. Анализ данных в модели оккупированности зондами концентрических областей диска с различной удаленностью от центра диска при вариации размеров диска, областей локализации зондов, толщины и локализации слоя апобелка удовлетворял набору параметров: толщина бислоя в центре диска равна 4,0 нм, флуорофорные группы обоих зондов одинаково погружены в бислой, молекулы транс-ПК выталкиваются из периферической области бислоя в непосредственном контакте с апобелком шириной 0,7 – 1,2 нм, цис-ПК избегает центральной области диска с радиусом 1,0 - 2,5 нм и накапливается в области пограничного липида вблизи апобелка, триптофанилы апоA-I погружены в липидную фазу не более чем на 0,2-0, нм. При 50 °С концентрационные зависимости переноса для двух зондов совпадают и занимают промежуточное положение между зависимостями для 25 °С. Расположение зондов относительно белка стало одинаковым и вся липидная фаза реконструированных ЛВП (рЛВП) доступна для цис-ПК и транс-ПК. Оптимизация данных по переносу энергии при °С выявляет отсутствие заметного изменения расстояния от апобелка до центра частицы.

При 25 °С липидная фаза рЛВП менее упорядочена по сравнению с чисто липидным бислоем: регистрируемые по анизотропии вращательная подвижность и по интенсивности флуоресценции сегментальная подвижность обоих зондов увеличены; температуроиндуцируемый фазовый переход сдвигался на 2-4 °С в высокотемпературную область; после плавления ДПФХ вращательная подвижность молекул зонда снижена относительно липосом; в отличие от вращательной, сегментальная подвижность зондов после фазового перехода становится такой же, как в чисто липидном бислое. В модели дискоидальной частицы апоA-I/ДПФХ молекулы ДПФХ локализованы в трех радиальных зонах с увеличивающейся площадью молекулы So при удалении от центра: зона слабо-возмущенного липида (So = 0,53 нм2), промежуточная зона (So = 0,59 нм2), зона пограничного липида (So = 0,65 нм2). При T Tt возможно исчезновение вариации параметра So вдоль радиуса частицы и равномерное распределение молекул зонда в липидной фазе.

Влияние природы апобелка и холестерина на белок-липидные взаимодействия. В присутствии 8 моль% холестерина в рЛВП взаимное расположение апоA-I и паринаровых кислот изменялось (рис. 5). Вариация параметров локализации зондов при Т Тt выявила их локализацию на периферии диска с радиусом 5,4 нм. После фазового перехода транс-ПК оккупирует основную долю липидной фазы за исключением периферической области от 5 до 5,4 нм; для цис-ПК центральная область с радиусом 1,5-2 нм остается недоступной. Таким образом, внедрение ХС в рЛВП при Т Тt сопровождается образованием области в центре частицы с радиусом 2,8 нм (средняя величина для цис-ПК и транс-ПК) и включающей 30% молекул ДПФХ. Фазовый переход сопровождается снижением размеров этой области, хотя зона радиусом 1,5 - 2 нм все еще недоступна для цис-ПК. Более того, латеральное распределение ХС не является гомогенным. Если транс-ПК исключается из ДПФХ-ХС области при Т Тt, то молекулы холестерина накапливаются в центре частицы. При Т Тt внедрение ХС приводило к снижению встраивания обоих зондов: снижение на 30% коэффициента распределения соответствует размерам ХС-обогащенной области. После фазового перехода увеличивается размер области, доступной для зондов, и коэффициент распределения возрастал в 2 и 1,5 раза для встраивания транс-ПК и цис-ПК в ХСсодержащие комплексы. Однако ХС-обогащенная зона может все еще существовать при температурах выше Tt.

Таблица 6. Температуро-индуцированный переход в липосомах и рЛВП с разными апобелками, детектируемый по интенсивности F и анизотропии r флуоресценции цис-ПК и транс-ПК.

Липосомы из ДПФХ цис-ПК (5) 41,1±0,3 1,58±0,06 40,2±0,2 2,14±0, Липосомы из ДПФХ/ХС цис-ПК (4) 39,8±0,3 1,54±0,07 38,5±0,2 1,86±0, Формирование комплексов индивидуальных апоA-I, апоA-II, апоE с ДПФХ приводило к подавлению амплитуды и кооперативности перехода, регистрируемого по флуоресценции обоих зондов в основном из-за снижения квантового выхода при температурах ниже Tt. ЦисПК не дискриминировала природу апобелка, тогда как падение выраженности перехода, детектируемого транс-ПК, было максимальным для комплексов с апоA-I, промежуточным для комплексов с апоЕ и минимальным для комплексов с апоA-II (табл. 6). В комплексах по сравнению с липосомами из ДПФХ переход сдвигался в область высоких температур.

Основываясь на концепции гидрофобного соответствия (Mouritsen and Bloom, 1984), можно предположить избыточную гидрофобную длину апоA-I по сравнению с апоA-II и преимущественное взаимодействие апобелка с фосфолипидом в гелевой фазе. Наличие белка приводило к флюидизации бислоя при T Tt и возрастанию его ригидности при температурах выше Tt. Для тройного комплекса апобелок/ДПФХ/ХС по сравнению с комплексом апобелок/ДПФХ выраженность перехода, детектируемого цис-ПК по отношению интенсивностей флуоресценции, максимально снижалась для комплексов с апоA-I, не менялась для апоA-II-содержащих комплексов и была промежуточной для комплексов с апоЕ. Выраженность снижения Tt, регистрируемая этим зондом в этих комплексах, была прямо противоположной. Противоположный по выраженности ответ на включение холестерина в комплексы детектировался по отношению интенсивностей флуоресценции транс-ПК: максимальным снижение этого параметра было для комплексов с апоA-II, минимальным - для апоA-I-содержащих комплексов. Изменения температуры фазового перехода, детектируемого транс-ПК, также вели себя противоположным образом по сравнению с изменением отношения интенсивностей флуоресценции (табл. 6). Различное распределение зондов в комплексах с тремя апобелками, лежащее в основе температуроиндуцируемых ответов, может быть связано с различной степенью исключения молекул холестерина из зоны пограничного липида. Можно предположить более прочное взаимодействие апоA-II с фосфолипидом по сравнению с апоA-I. Молекулы ХС и апоA-I (но не апоA-II) взаимно компенсируют противоположное влияние на соответствие гидрофобной длине ацильных цепей с относительным обогащением пограничного липида холестерином в апоA-I-содержащих рЛВП относительно комплексов с апоA-II. Различное взаимодействие апобелков с ДПФХ и разное содержание ХС в комплексах может приводить к их различным субстратным свойствам в реакции с лецитин-холестерин ацилтрансферазой (ЛХАТ).

Влияние структуры липид-связанного апоЕ на активность ЛХАТ, акцепцию холестерина и связывание дискоидальных комплексов с ЛНП-рецептором Функциональными характеристиками комплексов апоЕ3 с фосфолипидом служили их субстратные свойства в реакции с ЛХАТ (рис. 6) и способность к акцепции клеточного холестерина. Снижение значения кажущейся максимальной скорости реакции Vmax (1, нмоль эфира ХС/час) для комплекса апоЕ3 с пальмитоиллинолеоилфосфатидилхолином (ПЛФХ) и ХС в 7 раз по сравнению с комплексами апоA-I/ПЛФХ/ХС может иметь в основе различную ориентацию/иммобилизацию молекул холестерина локальными участками апоA-I и апоЕ. Дискоидальные комплексы апоЕ3/ДПФХ акцептировали холестерин с нагруженных холестерином макрофагов J774 с эффективностью, составляющей 62% от акцепции комплексами апоA-I/ДПФХ (Rosseneu et al., 1993), возможно, в соответствии с пределом исключения ХС из пограничного липида. Сферические частицы получали при совместной инкубации комплексов апоЕ3/ДПФХ/ХС, ЛНП и ЛХАТ. В результате реакции ЛХАТ в апоЕсодержащих сферах накапливалось меньше эфиров холестерина (ЭХС) (62%) по сравнению с комплексами с апоA-I (86%) (Vanloo et al., 1992) вследствие лучших активаторных свойств апоA-I. Трансформация дискоидальных комплексов в сферические частицы приводила к снижению их размера. Изучение вторичной структуры апобелка методом ИК-спектроскопии эфир ХС, % данные для расчета кинетических параметров концентрации апоЕ рЛВП, ингибировавшие (нмоль/ч).

полного отражения выявило отсутствие изменения содержания -спиралей в результате фосфолипида и спиральных участков апобелка в дисках изменялась на хаотическую в сферах. Можно предположить основной вклад апоA-I-содержащих частиц в синтез ЛВП с заместительной ролью апоЕ в условиях дефицита или отсутствия апоA-I.

Были приготовлены и охарактеризованы комплексы апоЕ (смесь изоформ плазмы) с ДПФХ или пальмитоилолеоилфосфатидилхолином (ПОФХ). Эффективность связывания комплексов с иммобилизованным ЛНП-рецептором in vitro возрастала при увеличении размера комплекса и усредненная для обоих фосфатидилхолинов константа ассоциации Ka скачкообразно возрастала в 10 раз от 3,8·107 до 3,8·108 M-1 с величиной перехода при моль ФХ/моль апоЕ (рис. 7), что могло бы отражать изменение упаковки липидов и/или конформации апобелка. Комплексы эффективно конкурировали с изолированными частицами ЛОНП за связывание с ЛНП-рецептором. Вновь наблюдалось скачкообразное возрастание эффективности конкуренции при увеличении содержания фосфатидилхолина с величиной перехода 135 моль ФХ/моль апоЕ (рис. 7). Переходы в прямом и конкурентном вариантах связывания, возможно, соответствуют увеличению числа "активных" молекул апоЕ на поверхности комплексов при изменении размера и/или геометрии комплексов.

АПОЕ-ЗАВИСИМОЕ СВЯЗЫВАНИЕ ТРИГЛИЦЕРИД-БОГАТЫХ ЧАСТИЦ С ЛНПРЕЦЕПТОРОМ IN VITRO

Механизм взаимодействия ЛОНП и ЛНП с ЛНП-рецептором Сравнена аффинность препаратов ЛОНП и ЛНП из кинетических и квази-равновесных (2 ч при 37 °С) измерений в двух моделях связывания с иммобилизованным ЛНПрецептором (табл. 7). Кинетическая константа ассоциации Ka11 в модели образования лигандрецепторного комплекса в случае ЛОНП совпадала с равновесной величиной Ka. Однако для связывания ЛНП в рамках этой модели величина Ka в среднем в 18 раз превышала величину Ka11, что привело к рассмотрению более сложной модели, включающей, помимо быстрой Таблица 7. Кинетическое и равновесное изучение связывания ЛОНП и ЛНП с ЛНПрецептором. Частицы изолированы из плазмы крови гипертриглицеридемиков с фенотипом Е3/3 ([ТГ] = 384±99 мг/дл, n = 3).

Модель "комплекса столкновений" Модель "медленной изомеризации" *) p 0,05 для сравнения ЛОНП и ЛНП в столбце с помощью одностороннего t-теста в модели "комплекса столкновений"; #) p 0,05 для сравнения ЛОНП и ЛНП в столбце с помощью одностороннего t-теста в модели "медленной изомеризации"; $) p 0,07 для сравнения с помощью одностороннего t-теста величин Ka11 и Ka12 для связывания ЛНП.

стадии образования лиганд-рецепторного комплекса с константой ассоциации Ka12, медленную стадию его конформационного превращения с константой равновесия Ka22. В этой модели исчезала разница между равновесными и кинетическими значениями констант ассоциации для ЛНП (табл. 7). Значения Ka соответствовали данным других авторов (LundKatz et al., 1998) и в среднем Ka(ЛОНП) превышала Ka(ЛНП) в 2,8-3,5 раз. Рассчитанное отношение размеров лигандных зон в ЛОНП и ЛНП равнялось 2,5 и соответствовало среднему содержанию апоЕ в частице ЛОНП как 2-3 молекулы апобелка. Соответствие предполагает вклад апоЕ во взаимодействие частицы ЛОНП с ЛНП-рецептором и наличие континуума из близко-расположенных молекул апоЕ в ЛОНП. Действительно, при увеличении триглицеридов плазмы содержание апоЕ в ЛОНП возрастало и апобелок в гипертриглицеридемийных ЛОНП существовал в кластерах увеличивающегося размера, выявленных "сшиванием" апобелков.

Состав, структурные свойства и связывание с ЛНП-рецептором ЛОНП и ЛНП при нормо- и гипертриглицеридемии: связь с фенотипом апоЕ Структурное исследование. Были сформированы три группы пациентов из первой когорты по фенотипу апоЕ - гомозиготы Е3/3 (группа Е3), гомозиготы Е2/2 и гетерозиготы Е2/3 (группа Е2+), гомозиготы Е4/4 и гетерозиготы Е3/4 (группа Е4+) с разбиением на подгруппы с низким (ТГн 200 мг/дл) и высоким (ТГв 200 мг/дл) содержанием триглицеридов плазмы (табл. 8). В изолированных частицах ЛОНП и ЛНП измерено содержание липидов и апобелков и рассчитана относительная плотность упаковки триптофанилов ПТ на поверхности частиц, обратно зависящая от размера частиц (табл. 8).

В группе Е3 для частиц ЛОНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с увеличением содержания ХС, апоЕ и апоC-III; содержание апоЕ положительно коррелировало с ХС-ЛОНП, а содержание апоC-III положительно коррелировало с ТГЛОНП. Частицы ЛОНП гипертриглицеридемиков по сравнению с частицами из нормотриглицеридемиков увеличены в размере, ХС-обогащены и отношение ТГ/ХС снижено в 1,5 раза. Параметр ПТ отрицательно коррелировал с ТГ-ЛОНП, ХС-ЛОНП и с содержанием апоC-III в ЛОНП и положительно коррелировал с отношением апоЕ/апоC-III. Для частиц ЛНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с увеличением содержания ТГ и со снижением содержания ХС; отношение ТГ/ХС соответственно возрастало и частицы ЛНП становились ТГ-обогащенными. Содержание апоЕ в ЛНП не изменялось. Относительная плотность упаковки триптофанилов возрастала вследствие снижения размера частиц при снижении содержания ХС (Berneis and Krauss, 2002). Действительно, параметр ПТ отрицательно коррелировал с ХС-ЛНП.

В группе Е2+ для частиц ЛОНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с изменениями содержания ТГ и ХС, аналогичными для группы Е3 и содержание ХС в частицах гипертриглицеридемиков было значимо выше по сравнению с подгруппой Е3.

Аналогично группе Е3, частицы ЛОНП становились крупнее и ХС-обогащенными и напоминали ремнант-подобные частицы. Увеличенное по сравнению с группой Е содержание апоЕ и сниженное содержание апоC-III в ЛОНП гипертриглицеридемиков подгруппы Е2+ соответствует ремнантным свойствам частиц и данным других авторов о сниженном отношении апоC-III/апоЕ в ЛОНП пациентов с III типом дислипидемии и близком к нормальному для пациентов с IV типом (Fredenrich et al., 1997); последнее соответствует гипертриглицеридемикам из группы Е3. Для частиц ЛНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с тенденцией к обогащению по ТГ, как для группы Е3. Однако в противоположность ЛНП из группы Е3, величина ПТ характеризовалась тенденцией к снижению и параметр ПТ отрицательно коррелировал с ТГ-ЛНП.

Таблица 8. Содержание липидов и апобелков плазмы и состав изолированных ЛОНП и ЛНП в группах пациентов первой когорты (структурное исследование). Представлены средние значения (± ошибка среднего, n 2) и первое и второе значения в скобках означают соответственно число пациентов-гомозигот и общее число пациентов в каждой подгруппе.

Надстрочные индексы обозначают значимые (p 0,05) различия при сравнении: *), в строке подгрупп ТГн и ТГв внутри индивидуальной группы; 2-3), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E2+ и E3; 2-4), в строке идентичных подгрупп ТГн в группах E2+ и E4+;

, в строке идентичных подгрупп ТГн в группах E3 и E4+.

Таблица 9. Тушение триптофановой флуоресценции апобелков ЛОНП и ЛНП анионами I- при 25 и 40°C (структурное исследование).

Таблица 10. Эффективность связывания липопротеинов с ЛНП-рецептором и содержание липидов плазмы в группах пациентов второй когорты, сформированных на основе содержания ТГ плазмы и фенотипа апоЕ (функциональное исследование).

Надстрочные индексы обозначают значимые (p 0,05) различия при сравнении: *, в строке подгрупп ТГн и ТГв внутри индивидуальной группы; 2-3), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E2+ и E3; 2-4), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E2+ и E4+; 3-4), в строке идентичных подгрупп (ТГн или ТГв) в группах E3 и E4+; #), в колонке параметра для ЛОНП или ЛНП при 25 и 40 °C.

В группе Е4+ (только подгруппа ТГн) в частицах ЛОНП снижено содержание ХС и апоЕ по сравнению с пациентами группы Е2+. В отличие от частиц ЛОНП из группы Е3, для частиц ЛОНП из группы Е4+ отношение ТГ/ХС положительно коррелировало с содержанием ТГ плазмы. Для величины ПТ отмечена тенденция к максимальному значению для трех групп и отрицательная корреляция с ТГ плазмы и ТГ-ЛОНП. Для частиц ЛНП, содержание ТГ и отношение ТГ/ХС были наименьшими для трех групп и величина ПТ имела тенденцию к минимальному значению для трех подгрупп.

Упаковка и динамика молекул апобелков на поверхности изолированных частиц ЛОНП и ЛНП изучена с помощью тушения триптофановой флуоресценции апобелков анионами Iпри температурах 25 и 40 °С для учета влияния фазового перехода липидов (табл. 9). Для частиц ЛОНП, доступность триптофанилов f при 40 °С положительно коррелировала с ХСЛОНП и с содержанием апоЕ в ЛОНП для группы Е3 и отрицательно коррелировала с ТГ плазмы для группы Е2+. Параметр КШ-Ф для флуоресценции ЛОНП при 40 °С отрицательно коррелировал с содержанием ТГ плазмы, ХС-ЛОНП и с содержанием апоЕ в ЛОНП для группы Е3. Для частиц ЛНП, доступность триптофанилов характеризовалась тенденцией к увеличению при нагревании частиц из Е3 группы безотносительно содержания ТГ плазмы и частиц E4+/TGн и тенденцией к снижению для частиц группы Е2+ безотносительно уровня ТГ плазмы. Параметр f для флуоресценции ЛНП при 40 °С отрицательно коррелировал с содержанием ТГ плазмы для группы Е2+.

При совместном рассмотрении данных для трех групп обнаружено возрастание доступности триптофанилов ЛОНП при 25 °С с минимальным значением fmin = 0,28 ± 0, при увеличении плотности упаковки триптофанилов (рис. 8). Значение fmin хорошо соответствует наименьшему экспериментальному значению f и может служить оценкой доступности триптофанилов в полностью ассоциированных молекулах апобелков в частицах ЛОНП. Константа тушения флуоресценции апоВ в составе ЛНП при 40 °С возрастала при увеличении отношения ТГ/ХС в частицах (рис. 8), возможно, за счет “замораживающего” действия ХС на подвижность апоВ. Значение KШ-Ф(min) = 0,97 M-1 может служить нижней оценкой динамики триптофанилов в ХС-“замороженных” частицах ЛНП.

Функциональное исследование. Три группы пациентов из второй когорты, сформированные аналогично структурному исследованию, характеризовались сопоставимым содержанием липидов плазмы. Для трех групп изучены параметры связывания изолированных ЛОНП и ЛНП с ЛНП-рецептором in vitro (табл. 10). В группе Е3 для связывания частиц ЛОНП, увеличение содержания ТГ плазмы ассоциировано с увеличением константы ассоциации Ka, максимальное число участков Bmax не менялось. Для связывания ЛНП, значение Ka характеризовалось тенденцией к снижению, значение Bmax не менялось.

Рис. 8. Влияние состава ЛОНП и ЛНП на динамику и топографию апобелков. (а) – доля f триптофанилов ЛОНП, доступных для анионов I- при 25 °C как функция плотности триптофановых остатков ПТ на поверхности частиц. (б) – константа тушения ШтернФольмера КШ-Ф флуоресценции ЛНП при 40 °C как функция отношения ТГ/ХС для частиц.

Значения констант ассоциации для связывания ЛОНП ((3,3-4,6)·108 M-1) и ЛНП ((0,8-1,0)· M-1) соответствовали данным других авторов (Chappell et al., 1992; Chappell and Medh, 1998).

Зависимости между Ка(ЛОНП), содержанием апоЕ в ЛОНП и плазме, с одной стороны, и содержанием ТГ плазмы с другой, аппроксимировали функцией с насыщением. Для трех параметров средние величины содержания триглицеридов ТГ1/2, при которых достигалось 50% максимального эффекта, составляли 88-103 мг/дл. Область значений 2ТГ1/2 близка к "отрезному" значению концентрации ТГ 1,5 ммоль/л (133 мг/дл) (Packard and Shepherd,1997), при превышении которого заметно накопление небольших плотных ЛНП-III. В группе E2+ Рис. 9. Влияние состава ЛОНП и ЛНП на связывание липопротеинов с ЛНП-рецептором.

Схема: вставка молекул апоC-III между лигандными молекулами апоЕ3. Нижний индекс соответствует стехиометрии конкретного апобелка в комплексе апоЕ-апоC-III, верхний индекс соответствует максимальному числу возможных контактов между прилегающими молекулами одного или другого апобелка, e – общее число молекул апоЕ, i – общее число молекул апоЕ3, j – общее число молекул апоC-III.

(только E2/3 гетерозиготы) для связывания ЛОНП, при увеличении содержания ТГ плазмы начально высокое значение Ka не менялось, тогда как значение Bmax возрастало, будучи значимо выше значений для групп E3 или E4+. В группе Е4+ для связывания частиц ЛОНП, при увеличении содержания ТГ плазмы изначальное высокое по сравнению с группой Е значение Ka характеризовалось тенденцией к снижению, тогда как параметр Bmax не изменялся.

Изучена связь Ka и Bmax с содержанием апоE и апоC-III в частицах ЛОНП для всех трех групп. Константа ассоциации возрастала при увеличении содержания апоЕ в ЛОНП (рис. 9).

Максимальное число участков связывания снижалось при увеличении содержания апоC-III в ЛОНП (рис. 9) с максимальной выраженностью эффекта для группы Е2+. Возможно, это отражает вставку дополнительных молекул апоC-III между прилежащими друг к другу молекулами апоЕ с увеличением среднего расстояния между лигандными молекулами (”спейсерный” эффект). Для ЛНП, связь параметра Ka с относительной плотностью упаковки триптофанилов описывалась зависимостью, проходящей через максимум (рис. 9), что соответствует данным других авторов (Lund-Katz et al., 1998) о максимальных значениях Ka для связывания ЛНП промежуточного размера.

Оценена возможная конкуренция между ЛОНП и ЛНП за связывание с ЛНПрецептором in vivo. Параметр IC50 соответствует концентрации ЛОНП, ингибирующей связывание ЛНП на 50% (табл. 10). Для трех групп при увеличении содержания ТГ плазмы параметр IC50 характеризовался тенденцией к снижению, что соответствует увеличенной эффективности связывания ЛОНП и/или сниженной для ЛНП. Действительно, для группы Е3 параметр IC50 отрицательно коррелировал с Ka(ЛОНП) и положительно с Ka(ЛНП), то есть в сосудистом русле гипертриглицеридемика ЛОНП и ЛНП могут конкурировать за связывание с ЛНП-рецептором. Значения IC50 проявляли тенденцию к наибольшим значениям для группы Е3 безотносительно содержания ТГ плазмы.

РЕГУЛЯЦИЯ ЛИПОЛИЗА IN VITRO

Обратимое связывание амфипатических апобелков с ЛОНП Исходя из известных параметров связывания апобелков с ЛОНП, рассчитано остаточное содержание апоЕ, апоC-II и апоС-III на поверхности ЛОНП при разведении частиц. При разведении от 1 до 0,01 мг белка/мл степень насыщения уменьшалась от 100% до 35-39% для апоC-II и апоC-III и до 7% для апоЕ. Таким образом, степень диссоциации апобелков в разбавленных растворах ЛОНП может достигать заметных значений. В этой связи сравнена доступность эпитопов этих апобелков в растворе и в составе ЛОНП. Fabфрагменты антител связывались с флуоресцеин-мечеными апобелками в растворе с высокой аффиностью: значение константы диссоциации комплекса антиген-антитело в растворе составило 12 нМ для апоС-II и 20-75 нМ для апоС-III при стехиометрии, близкой к 1.

Разведение препаратов ЛОНП приводило к увеличению доступности антигенных детерминант апоЕ от 7% при концентрации белка ЛОНП 0,6 мг/мл до 48% при 0,077 мг/мл, но доступность апоC-II и апоC-III была низкой и разведение влияло незначительно. Различия в реакции Fab-фрагментов с апобелками в растворе и в ЛОНП могут объясняться маскированием антигенных детерминант апобелков в частицах; при разведении препарата ЛОНП апобелки диссоциируют от поверхности частиц. Оценка размера лигандной зоны при связывании ЛОНП с ЛНП-рецептором и "сшивание" апобелков ЛОНП выявили кластерный характер локализации апоЕ на поверхности частицы. Наличие маскированных эпитопов апобелков за счет белок-белкового и/или белок-липидного взаимодействия может объяснять гетерогенность пула апобелков в реакции обмена между апобелок-содержащими частицами (Bukberg et al., 1985; Ibdah et al., 1991) и низкую иммунохимическую реактивность апобелков в нативных липопротеинах (Barr et al., 1981; Mao et al., 1980).

Эффекторная роль амфипатических апобелков в ЛПЛ-катализируемом гидролизе Активаторные свойства апоC-II в гидролизе псевдосубстрата. Измерены кинетические параметры Vmax (кажущаяся максимальная скорость реакции) и Km (кажущаяся константа Михаэлиса) гидролиза эмульгированного триолеина липопротеинлипазой (ЛПЛ) из коровьего молока при нескольких фиксированных концентрациях апоС-II относительно контрольных значений в его отсутствие (табл. 11).

Значение Vmax в присутствии апобелка увеличивалось в 3-4 раза и не изменялось при варьировании его содержания. Значение Km при небольшой концентрации апоС-II было существенно меньше контрольного значения, а затем увеличивалось при возрастании содержания апобелка, превысив контрольное значение при концентрации апоС-II 72 мкг/мл.

концентрации апоС-II 8,5 мкг/мл объясняются увеличенной скоростью распада комплекса ЛПЛ-триолеин-апоC-II по сравнению со скоростью катализа в отсутствие активатора.

Активатор в небольших концентрациях увеличивает эффективность катализа за счет индукции конформационного изменения молекулы ЛПЛ, что экспериментально обнаружено (Posner et al., 1983). При увеличении концентрации активатора в среде инкубации фермент насыщается активатором и Vmax не зависит от содержания апоC-II. Монотонное увеличение Km может иметь в основе мицеллирование субстрата (из-за недостаточной стабилизации детергентом) при добавлении апобелка с суммарным снижением размеров частиц.

Связывание ЛПЛ прямо коррелирует с размером липопротеина (Fisher et al., 1995) или микроэмульсий (Yamamoto et al., 2003). Итак, апоC-II активирует ЛПЛ in vitro за счет прямого взаимодействия фермент-активатор.

Таблица 11. Влияние апоС-II на гидролиз липопротеинлипазой эмульгированного триолеина V (+апоC-II)/ V (-апоC-II) K (+апоC-II)/ K (-апоC-II) Апобелки ЛОНП и регуляция липолиза. При возбуждении в полосе поглощения триптофановых и тирозиновых остатков (281 нм) спектр флуоресценции частиц ЛОНП с апоВ, апоЕ и апоС имел максимум при 332 нм и полуширину 58 нм, при чисто “триптофановом” возбуждении (295 нм) соответствующие параметры равнялись 335 и 55 нм.

Спектр флуоресценции частиц ЛНП с апоВ при возбуждении 281 нм имел максимум при нм и полуширину 55 нм, при “триптофановом” возбуждении эти величины равнялись 332 и 51 нм. Эти параметры характерны для гидрофобного расположения флуорофоров обоих классов частиц; в то же время наличие амфипатических апоЕ и апоС на поверхности ЛОНП отражается в более длинноволновом и более гетерогенном спектре испускания. Константа тушения флуоресценции триптофанилов ЛОНП акриламидом превышала аналогичную величину для ЛНП в 1,58 раза, доступность флуорофоров ЛОНП для молекул тушителя была меньше доступности триптофанилов ЛНП на 8%. Большее значение К Ш Ф может отражать увеличенную подвижность апоЕ и апоС в составе ЛОНП по сравнению с апоВ в составе ЛНП и/или сниженную микровязкость частиц ЛОНП. Снижение значения f ЛОНП может быть связано с кластерным характером расположения амфипатических апобелков на поверхности ЛОНП и (или) их частичным экранированием апобелком В. Действительно, при изучении кинетики протеолиза трипсином апобелков ЛОНП обнаружена быстрая деградация апоВ, протеолиз амфипатических апобелков происходит с существенно меньшей скоростью.

Обнаружена диссоциация амфипатических апобелков ЛОНП при обработке частиц неионным (твин-20) и ионным (дезоксихолат натрия) детергентами в не-солюбилизирующих частицы концентрациях: в реизолированных нативных и подвергнутых действию твин- частицах ЛОНП при одинаковом содержании апоВ снижалось содержание апоС и особенно апоЕ в обработанных детергентом частицах. Свободные жирные кислоты как продукты липолиза могут обладать схожим действием. Действительно, сравнение кинетик накопления свободных жирных кислот, изменений интенсивности флуоресценции и светорассеяния при добавлении к частицам ЛОНП липопротеинлипазы выявило, что появление свободных жирных кислот в мономерной форме, когда еще нет возрастания светорассеяния, характеризуется более быстрой кинетикой по сравнению с диссоциацией апобелков.

Накопление продуктов липолитической деградации частиц ЛОНП, обладающих детергентными свойствами, приводит к диссоциации апобелков, которые являются эффективными регуляторами липолиза. Изучена связь между содержанием апоС-II относительно суммы (апоС-II + апоC-III) в частицах ЛОНП, реизолированных после действия твин-20, и первоначальным отношением детергент/белок ЛОНП (рис. 10). Эта связь характеризовалась зависимостью с максимумом, возможно, из-за различного сродства апоСII и апоС-III к поверхности частиц ЛОНП. Связь между изменением кажущихся кинетических параметров липолиза и отношением детергент/белок ЛОНП описывалась Vmax(+твин)/Vmax (-твин) Кm(+твин)/ Кm(-твин) мг твин-20/мг белка ЛОНП Рис. 10. Влияние твин-20 на относительное апобелков (1) и кинетические параметры Km реизолированных после действия твин-20 (n (2) и Vmax (3) липолиза ЛПЛ частиц ЛОНП, реизолированных после действия детергента.

аналогичными зависимостями (рис. 10). Для липолиза обработанных детергентом частиц по сравнению с нативными образцами относительное изменение Km линейно зависело от относительного изменения Vmax (рис. 11) (для нативных частиц ЛОНП Vmax = 50,5 ± 6, мкмоль Н+/мин на 1 мг белка липопротеинлипазы, Km = 0,128 ± 0,036 мг/мл (n = 23)). Эти результаты могут быть связаны с бесконкурентным ингибированием активности ЛПЛ апобелком С-III. Бесконкурентное ингибирование исключает возможность прямого взаимодействия ингибитора и липопротеинлипазы и согласуется с результатами других авторов (Matsuoka et al., 1980), которые показали отсутствие взаимодействия между апоC-III и иммобилизованным на сорбенте ферментом. Возможно, ингибитор и фермент-субстратный комплекс взаимодействуют на поверхности частиц. Снижение каталитической активности фермента наряду с его увеличенной сорбцией в присутствии ингибитора может отражать взаимодействие амфипатических спиральных участков апоС-II и апоС-III. Если фосфолипидсвязывающий фрагмент апоС-II необходим для проникновения активного центра ЛПЛ к sn-I ацильной связи (Vainio et al., 1983), то взаимодействие фосфолипид-связывающих фрагментов апоC-II и апоС-III может затруднять образование комплекса ЛПЛ-(апоC-II)-ТГ.

Нельзя, однако, полностью исключить ингибирующее действие и апоЕ, так как добавление апоЕ приводило к снижению кажущихся максимальной скорости и константы Михаэлиса в апоС-II-активируемом гидролизе ТГ в эмульсиях ФХ/ТГ (Yamamoto et al., 2003), а добавление твин-20 в наших условиях приводило к выраженной диссоциации апоЕ от частиц ЛОНП. Относительное содержание апобелковых эффекторов на поверхности частицы ЛОНП может определять эффективность липолитического процесса.

ВЛИЯНИЕ АПОЕ НА ОСНОВНЫЕ ПУТИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИПОПРОТЕИНОВ ПРИ

НОРМО- И ГИПЕРТРИГЛИЦЕРИДЕМИИ IN VIVO

Липопротеины плазмы крови пациентов третьей когорты с фенотипом Е3/3, окрашенные флуоресцентным зондом 6-((N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4ил)амино)гексаноил)сфингозином как аналог церамида, с помощью капиллярного изотахофореза (КИТФ) разделялись на 11 компонент. Первые шесть компонент В1 - В обозначены как быстрые (В1, В2), промежуточные (В3, В4, В5) и медленный (В6). Среди четырех Н1 - Н4 компонент аналогично выделяли быстрый (Н1), промежуточный (Н2) и медленные (Н3, Н4) компоненты. Компоненты В1 - В6, (О+П) и Н1 -Н4 содержали ЛВП, ЛОНП и ЛНП соответственно и масса В- и Н-пулов, пересчитанная на содержание ХС, значимо коррелировала с содержанием ХС-ЛВП и ХС-ЛНП, определенным с помощью преципитации. Можно предположить полную или частичную идентичность компонент Н1 и (промежуточные ЛНП-II + небольшие ЛНП-III), Н2 и больших ЛНП-I соответственно.

Действительно, отношение Н1/Н2 возрастало в 2 раза при увеличении содержания ТГ плазмы от 53 до 381 мг/дл. Отношение Н1/Н2 можно рассматривать как индикатор накопления небольших плотных ЛНП-III, специфичных для про-атерогенного В-фенотипа.

Внутри В-пула, как промежуточные (В4+В5), так и медленный (В6) компоненты значимо возрастали в 1,4 и 1,7 раза соответственно при увеличении содержания ТГ. Основываясь на увеличении содержания пре-1-ЛВП при ожирении (Sasahara et al., 1997), можно предположить идентичность пре-ЛВП и компонента В6. Медленный, промежуточные и быстрые В-компоненты могут быть ассоциированы с начальным, промежуточным и конечным компартментами в цепи генерации эфиров ХС с участием ЛХАТ. Тогда отношения (В1+В2)/(В4+В5) и (В4+В5)/В6 могут служить индикаторами эффективности двух этапов ЛХАТ-катализируемой трансформации ЛВП. Оба параметра проявляли тенденцию к снижению при увеличении содержания ТГ и эффективность реакции с участием ЛХАТ может снижаться при гипертриглицеридемии; аналогичный вывод сделан в работе (Brites et al., 2000).

Возможные связи между метаболизмом ЛВП и ЛОНП могут отражаться в зависимости двух отношений (В4+В5)/(О+П) и В6/(О+П) от содержания ТГ. Первый параметр отрицательно коррелирован с содержанием ТГ и отношение изменялось в 2,4 раза для крайних концентрационных точек. Аналогичная тенденция получена и для отношения В6/(О+П). Дефицит насцентных частиц ЛВП при гипертриглицеридемии, несмотря на увеличение их относительного содержания в В-пуле, может отражать изменение метаболизма ЛОНП, например, нарушение их липолиза. Помимо этого, причинами развития гипертриглицеридемии могут являться избыточный синтез больших ЛОНП (Packard and Shepherd, 1997) с накоплением апоЕ в частицах (Batal et al., 2000) и наоборот, апоЕ может индуцировать синтез ТГ (De Beer et al., 2000; Tsukamoto et al., 2000). Возможное ингибирующее действие апоЕ на активность ЛПЛ может приводить к снижению образования пре-ЛВП при липолизе ЛОНП - одного из основных путей генерации пре-частиц (Fielding and Fielding, 1995); это может являться "отрицательным" вкладом апобелка в стационарный уровень пре-ЛВП, сопряженным с увеличением содержания ТГ плазмы. "Положительный" вклад апоЕ в генерацию пре-ЛВП может быть предположен из активаторного действия апоЕ на активность печеночной липазы (ПЛ) при гидролизе фосфолипидов апоЕсодержащих ЛВП (Thuren et al., 1991; Thuren et al., 1992). Распределение апоЕ между ЛВП и ТГ-богатыми частицами сдвигается при гипертриглицеридемии. В этой связи проанализировано распределение апоЕ между липопротеинами и метаболические связи в стационарных условиях и при индукции липолиза in vivo в зависимости от фенотипа апоЕ.

Влияние изоформ на распределение апоЕ между липопротеинами При разделении липопротеинов плазм, окрашенных флуоресцирующим аналогом церамида в условиях увеличенного разрешения, в профиле КИТФ присутствовало компонент. В профиле распределения флуоресцеин-меченного апоЕ между липопротеинами присутствовало 11 компонент (рис. 12). Частицы ЛОНП содержались в пике 8, что следовало из селективного увеличения пика при добавлении к образцу плазмы аутологичных ЛОНП.

Можно соотнести первые семь пиков в церамидном (1-7Cb) и апоЕ-профилях (1-7Eb) с ЛВП, пик 8 (8Cb, 8Еb) с ЛОНП, последние четыре пика в церамидном (9-12Cb) и три пика в апоЕпрофилях (9-11Еb) с липопротеинами промежуточной/низкой плотностей. Содержание ХС и апоЕ в ЛОНП, рассчитанное из относительных площадей пика ЛОНП и содержания ХС и апоЕ плазмы, значимо коррелировало с содержанием ХС и апоЕ в изолированных ЛОНП.

Таким образом, можно измерить содержание ХС и апоЕ в индивидуальных липопротеинах, разделенных с помощью КИТФ, после окрашивания плазм церамидным зондом и апоЕ/Ф.

Сформированные по фенотипу апоЕ три группы пациентов четвертой когорты – гомозиготы Е3/3, гетерозиготы Е2/3 и Е3/4 – не различались между собой по антропометрическим и базальным (“before” - до введения гепарина) величинам содержания липидов и апобелков в плазме. Спустя 10 мин после внутривенного введения гепарина (“after”) в дозе 50 м.е./кг для стимуляции липолиза in vivo, содержание ТГa плазмы снизилось в среднем на 21%, 21% и 12% для групп Е33, Е23 и Е34 соответственно. Содержание ТГ относительно базального значения в частицах ЛОНП, изолированных из пост-липолизных плазм, снижалось в среднем на 38%, 40% и 43% для групп Е33, Е23 и Е34 соответственно.

Содержание апоЕ в пост-липолизных частицах ЛОНП имело тенденцию к снижению.

Аналогично содержание апоC-III снижалось, значимо для группы Е34.

Рис. 12. Локализация ЛОНП в профиле КИТФ (пациент 13). Церамидные (а,в,д) или апоЕ/Ф профили (б,г,е) получали до (а,б) или после (в,г) добавления ЛОНП; приведены изменения площадей пиков (д,е). Содержание ТГ плазмы – 1,32 мМ, ХС-ЛВП – 1,27 мМ, фенотип E3/4.

относительная площадь относительная площадь Рис. 13. Фенотип-зависимое распределение интенсивности флуоресценции при окрашивании плазмы церамидным зондом (а) и апоЕ/Ф (б) и вытеснение апобелка (в). Вытеснение апоЕ/Ф из ЛОНП при титровании апобелком C-III-1 плазмы из пациента 8 с фенотипом Е3/ описывали уравнением: y = A1 + A2*exp(-A3*x).

Для трех групп пациентов изучено распределение церамидного зонда и апоЕ/Ф до введения гепарина (рис. 13). При сравнении сигнала зонда из пулов ЛВП, ЛОНП и ЛПП/ЛНП три группы не различались между собой. При окрашивании апоЕ/Ф основная доля сигнала соответствовала "быстрым" ЛВП (1Eb, 3Eb) и липопротеинам 9Eb (Е33) или 8Eb (Е34) (рис. 13). Содержание апоЕ в ЛОНП пациентов с фенотипом Е3/3 по сравнению с Е3/ значимо снижено. Таким образом, связывание апоЕ с ЛОНП было фенотип-зависимым и максимальным для гетерозигот Е3/4. Предположенное взаимодействие между N- и Cдоменами в молекуле апоЕ4, но не апоЕ3, может лежать в основе преимущественного связывания апоЕ4 с частицами больших размеров по сравнению с ЛВП и отсутствия влияния кривизны поверхности частицы на связывание апоЕ3.

Относительное сродство апоЕ к липопротеинам изучено при титровании плазм in vitro апоC-III-1 и последующем анализе остаточного содержания апоЕ/Ф. Расчитаны размер невытесняемого пула (параметр А1), предельная сорбционная емкость липопротеина для апоЕ в отсутствие интерференции со стороны апоC-III (параметр A2) и эффективность вытеснения апоЕ апобелком C-III (параметр A3) (рис. 13). Связывание апоЕ с пиком 8Eb для группы Е34 относительно Е33 характеризовалось увеличенным размером невытесняемого пула апоЕ и тенденциями к увеличению предельной сорбционной емкости и снижению эффективности вытеснения, что может определять преимущественное связывание апоЕ с ЛОНП для группы Е34 в сравнении с Е33. Для группы E33, содержание апоЕ в липопротеине 9Eb положительно коррелировало с размером невытесняемого пула. Возможно, белокбелковые взаимодействия контролируют содержание апоЕ в этом ремнантном липопротеине.

Кроме того, содержание апоЕ может контролироваться относительным сродством апоЕ (1Eb) или предельной сорбционной емкостью (2Eb, 5Eb, 8Eb). На содержание апоЕ в других липопротеинах апоС-III может не оказывать влияния. Из сравнения величин отношения абсолютных площадей апоЕ/Ф- и церамид-окрашенных пиков следует, что по крайней мере для групп Е33 и Е34 есть два типа упаковки апоЕ – первый в частицах ЛВП с промежуточной электрофоретической подвижностью (Е3b) и второй в липопротеинах 4Eb (не включен для Е34), 5Eb, 7Eb, 9Eb и 10Eb. Остальные частицы занимают промежуточное положение. Второй тип упаковки хорошо соответствовал более сложному, чем опосредованному влиянием апоC-III, контролю содержания апоЕ в липопротеинах 1Eb, 4Eb, 5Eb, 9Eb, 10Eb, 11Eb.

Бивариантный анализ принадлежности идентифицированных по распределению липидного зонда и апоЕ/Ф индивидуальных липопротеинов к одному метаболическому компартменту при положительной корреляции (равновесие между липопротеинами) и отношения субстрат-продукт при отрицательной корреляции позволил обозначить стационарные метаболические сети для групп с разными фенотипами (рис. 14). Для группы Е33, предполагается равновесие между 1Cb и 2Cb, 8Cb и 9Cb, 8Cb и 11Cb. Липопротеины 1Cb и 7Cb, 8Cb и 7Cb, 11Cb и 10Cb вовлечены в отношения субстрат-продукт. Можно предположить вовлеченность активностей ЛПЛ и ПЛ в вариабельность содержания 7Cb. Положительная корреляция между 8Cb и 11Cb может отражать обмен ТГ и ЭХС, катализируемый белкомпереносчиком эфиров холестерина. Метаболическая сеть на основе распределения апоЕ Рис. 14. Метаболические компартменты в сети обмена липопротеинов в группах пациентов Е33 (а) и Е34 (б), детектируемые по распределению церамидного зонда и апоЕ/Ф. Связи установлены на основании положительной (принадлежность к одному компартменту) или отрицательной (отношение субстрат-продукт) корреляций между индивидуальными липопротеинами.

содержит больше связей и включает 9 компартментов: (1Eb + 2Eb); 3Eb; (4Eb + 5Eb); 6Eb; 7Eb;

8Eb; 9Eb; 10Eb; 11Eb. Связи в двух типах карт не совпадали и липопротеины 1Eb и 3Eb участвуют в сопряжении обмена апоЕ между ТГ-богатыми частицами и ЛВП. Реципрокные связи 11Eb-3Eb и 8Eb-3Eb, возможно, отражают липидный обмен между 11Сb и 8Сb.

Отрицательные корреляции между 7Eb (и 6Eb) и 2Eb или 3Eb отражают роль липопротеина 7Eb как продукта липолиза "быстрых" ЛВП и/или начального субстрата в цепи генерации ЭХС с участием ЛХАТ. Липопротеин 3Eb отрицательно коррелирует с 9Cb и находится в равновесии с 6Cb, за липидную фазу которого конкурируют апоЕ, апоC-III и апоA-I.

Содержание 3Eb отрицательно коррелировало с предельной сорбционной емкостью по апоЕ для 4Eb и содержание 6Eb аналогично зависело от A2:5Eb; можно предположить связи субстрат-продукт (4Eb-3Eb и 5Eb-6Eb) из-за разно-направленных потоков, контролируемых активностями ЛПЛ и ПЛ. Содержание апоЕ в пост-липолитических частицах ЛОНП отрицательно коррелировало с содержанием апоC-III и ХС в частицах-предшественниках (вследствие ассоциации увеличенного клиренса ЛОНП с увеличенным содержанием апоЕ и/или увеличенной диссоциации апоЕ при липолизе частиц с увеличенным содержанием ХС); содержание апоЕ в ЛОНП при липолизе контролируется апобелком C-III. Изменение абсолютного и относительного содержания апоЕ и апоC-III при липолизе ЛОНП соответственно отрицательно и положительно коррелировало с содержанием липопротеина 4Cb. Перенос апоC-III на липопротеин 4Cb ассоциирован со снижением размера невытесняемого пула апоЕ (1Eb, 2Eb, 3Eb, 4Eb, 6Eb) и максимальной сорбционной емкости по апоЕ (2Eb, 3Eb, 6Eb) в частицах ЛВП. Наличие положительных корреляций между изменением 2С или 7С и содержанием триглицеридов плазмы и содержанием апоC-III в плазме и ЛОНП до и после введения гепарина предполагает увеличение прироста 2С и 7С при ингибировании клиренса ЛОНП апобелком C-III. Появление ЛВП2 (Forte et al., 1979) и частиц ЛВП с пребета-подвижностью (Barrans et al., 1994) при гепарин-индуцированном липолизе показано и другими авторами. Увеличение прироста 2С и 7С положительно коррелировало с максимальной сорбционной емкостью по апоЕ липопротеинов 2Eb и 3Eb.

Максимальная сорбционная емкость по апоЕ липопротеина 6Eb отрицательно коррелировала с 6Ca-b; возможно, перенос апоЕ со второго на шестой липопротеин препятствует переносу на 6С диссоциирующего от ЛОНП при липолизе апоC-III. Действительно, величина 6Еa-b отрицательно коррелировала с изменением относительного содержания апоC-III в ЛОНП при липолизе, а параметры 2Ca-b и 6Ca-b противоположным образом (отрицательно и положительно соответственно) коррелировали с отношением (E/C-III)b в интактных ЛОНП.

Для группы Е34, метаболическая сеть отличалась от сети для Е33. Изменение относительного содержания апоC-III, как и отношение (апоЕ/апоC-III)a для частиц ЛОНП, положительно коррелировали с содержанием липопротеина 2Eb, что (противоположно ситуации для группы Е33) может соответствовать переносу апоЕ с липопротеина 2Е на ЛОНП и/или переносу апоC-III на 2Е. Последнее может происходить и-за увеличенного сродства апоЕ4 к ЛОНП. Метаболические карты могут различаться вследствие сдвига равновесия быстрые медленные ЛВП вправо для группы Е34 относительно Е33 с контролированием вариабельности содержания ХС-ЛВП соответственно липопротеинами 6С и 3Е; для группы Е34 можно предположить функциональный дефицит активности ЛХАТ.

Действительно, активность ЛХАТ была наименьшей с реконструированными дискоидальными ЛВП с апоЕ4 относительно частиц с апоЕ3 или апоЕ2 (Rye et al., 2006).

Константы скоростей псевдо-первого порядка клиренса ТГ плазмы (П) и ЛОНП (Л) и апоВ в ЛОНП для трех групп пациентов рассчитаны как клиренс "массы" (k1) или как "удаление ТГ из частицы" и без доведения на число частиц (k1* = Vmax/Km) (табл. 12).

Таблица 12. Клиренс триглицеридов ЛОНП и плазмы.

k1(Л), мин k1(П), мин-1 0,024 ± 0,0033-4) 0,024 ± 0,0052-4) 0,013 ± 0, Значения констант скоростей k1 клиренса ТГ ЛОНП k1(Л), плазмы k1(П) и апоВ ЛОНП k1(В) рассчитаны для трех групп пациентов. Аналогичные значения k1*(Л) и k1*(Л/В) рассчитаны для клиренса массы ТГ ЛОНП (Л) и молекул ТГ из частицы ЛОНП (Л/В), значение Fстатистики для k1* приведено в скобках. 2-4) и 3-4) соответствуют значимым различиям (p 0,05 по одностороннему t-критерию) при сравнении в строке групп Е23 с Е34 и Е33 с Е соответственно; $) значимое различие (p 0,05 по ANOVA) при сравнении в столбце. н.о. – не определено.

Значения k1(Л) близки к аналогичным значениям в другом исследовании (Wang et al., 1987) и не различались для трех групп. Клиренс ТГ плазмы был значимо замедлен относительно ТГ ЛОНП для всех трех групп. Однако значения k1(П) для групп Е33 и Е23 были в 2 раза больше значения для группы Е34 и клиренс ТГ плазмы относительно ЛОНП был более чем в два раза снижен в группе Е34 относительно двух других групп. Значение k1(Л) для группы Е отрицательно коррелировало с параметром A1:2Eb и с параметром А2 для 2Eb и 3Eb, что может отражать контроль клиренса ТГ ЛОНП липопротеинами высокой плотности и/или накоплением в "быстрых" ЛВП молекул апоЕ, диссоциирующих от ЛОНП при липолизе.

Двукратное увеличение значения k1*(Л/В) для клиренса ТГ из частицы ЛОНП в группе Е относительно группы Е23 связано с увеличенной эффективностью липолиза триглицеридов ЛОНП в пациентах с апоЕ4 и ингибированием липолиза изоформой апоЕ2. Для группы Е (но не Е34) значения k1(Л) положительно коррелировали с k1(П) и с 4Cb. Последнее

ПЛ ПЛ ПЛ

ЛХАТ ЛХАТ ЛХАТ

ЛПЛ ЛПЛ ЛПЛ

ПЛ ПЛ ПЛ

Рис. 15. Баланс между фермент- и рецептор-зависимыми путями катаболизма для трех групп пациентов. ЛОНП и ЛОНП* соответствуют нативным и пост-липолизным частицам. Пути превращения липопротеинов обозначены открытыми стрелками, опосредованный белкомпереносчиком эфиров ХС перенос молекул ТГ с нативных и ремнантных ЛОНП на другие частицы обозначен закрытыми стрелками. Общий для ТГ-богатых частиц и ЛНП путь катаболизма с участием ЛНП-рецептора (ЛНПр) обозначен линией с закрытым кружком.

Сплошная и пунктирная линии соответствуют относительной выраженности конкретного пути (сильной и слабой соответственно) для трех групп.

предполагает лимитирующее участие этого липопротеина в акцепции продуктов липолиза (акцепторная роль ЛВП установлена (Chung and Dashti, 2000)) и/или прямое взаимодействие ЛОНП-ЛВП. Анализ вклада состава ЛОНП в клиренс ТГ ЛОНП и плазмы выявил отрицательный вклад изменений в абсолютном и относительном содержании апоЕ и положительный вклад изменения в относительном содержании апоC-III и отношения апоЕ/апоC-III в пост-гепариновых ЛОНП; предполагается противоположное влияние апоЕ (активатор) и апоC-III (ингибитор) на клиренс ТГ ЛОНП, опосредованный ЛПЛ и/или ЛНПрецептором. В двух моделях с включением параметров плазмы или ЛОНП выявлен вклад одиночного предиктора – изменения относительного содержания апоC-III в ЛОНП – в 72% вариабельности параметра k1(Л); противоположные вклады двух предикторов – содержания апоЕ ( = 0,94 ± 0,22) и апоC-III ( = -0,63 ± 0,22) в пост-гепариновых ЛОНП – объясняли 65% вариабельности параметра k1(П). Для группы Е34, значения k1(Л) положительно коррелировали с содержанием пула 1-7Cb (и апоA-Ia) и 11Cb как продуктов липолиза в стационарных условиях, возможно, из-за лимитации клиренса липолизом. Также клиренс ТГ ЛОНП положительно коррелировал с изменением содержания липопротеина 6Е. Клиренс ТГ плазмы не был ассоциирован ни с одним из параметров плазмы или состава ЛОНП, хотя положительно коррелировал с изменением содержания липопротеина 1С, что может отражать вклад гидролиза ТГ ЛВП в клиренс ТГ плазмы.

Совокупность данных позволяет предложить схему модуляции изоформами апоЕ реакций липолиза, обмена гидрофобных липидов и ЛНП-рецептор-опосредованного клиренса (рис. 15). Для группы Е33, гидролиз ТГ ЛОНП сопровождался увеличением содержания ХС-ЛВП и снижением мольного отношения ТГ/ХС для ЛОНП с 2,85 до 2,04;

кроме того, среднее значение Km(Л) (0,89 мМ) совпадало с концентрацией ТГ плазмы (0, мМ) как величиной полу-насыщения ТГ-зависимой конкуренции между ЛОНП и ЛНП за ЛНП-рецептор in vivo. Это предполагает лимитирующую роль липопротеин-рецепторного взаимодействия в клиренсе ТГ плазмы для группы Е33. Для группы Е23, сниженные эффективности гидролиза ТГ и связывания с ЛНП-рецептором сопровождались увеличенным переносом молекул ТГ с ЛОНП на ЛВП2 и увеличенной генерацией ЛВП3 с участием ПЛ с конечным эффектом в виде снижения содержания ХС-ЛВП, сохранения клиренса массы ТГ ЛОНП и плазмы вследствие эффективного клиренса ЛНП и аналогичного изменения отношения ТГ/ХС в ЛОНП с 2,90 до 2,02. Для группы Е34, значения активностей ЛПЛ и ПЛ, сравнимые с активностями для группы Е33, и увеличенная эффективность связывания ЛОНП с ЛНП-рецептором с ингибированием связывания ЛНП по механизму отрицательной обратной связи могут сопровождаться увеличенным переносом молекул эфиров ХС от ЛНП на ЛОНП и ТГ с ЛОНП главным образом на ЛНП и увеличением содержания ЛВП3 из-за дисбаланса между сохраненной активностью ПЛ и сниженной активностью ЛХАТ; конечный эффект реализуется в снижении содержания ХС-ЛВП, снижении клиренса ТГ плазмы из-за замедленного клиренса ЛНП и сниженных значениях отношения ТГ/ХС в ЛОНП как 2,26 и 1,71 до и после гепарина соответственно. Итак, липолиз- и рецептор-опосредованные пути катаболизма ТГ наиболее сбалансированы для группы Е33. Предположенная генерация липопротеина 7С из 1С при сниженном клиренсе ЛОНП согласуется с увеличенным содержанием пре-ЛВП при гипертриглицеридемии; эта контролируемая ПЛ реакция может играть защитную роль из-за участия пре-ЛВП в обратном транспорте ХС, хотя при гипертриглицеридемии возможно снижение активности ЛХАТ, лежащей в основе обратного транспорта.

Таблица 13. Частные коэффициенты корреляции во множественной регрессии при анализе вклада начальных липидных показателей в изменение содержания липидов при терапии флувастатином и отмене препарата для групп с различным фенотипом апоЕ. R2 - доля объясненной вариации.

ХС-ЛВП16/ Соотношение путей катаболизма липопротеинов при действии флувастатина: роль Были сформированы три группы пациентов с различным фенотипом апоЕ из пятой когорты - гомозиготы Е3/3 (группа Е3), гомозиготы Е2/2 и гетерозиготы Е2/3 (группа Е2+), гомозиготы Е4/4 и гетерозиготы Е3/4 (группа Е4+). Терапия флувастатином в течение недель (содержание липидов измеряли после 0, 4, 8 и 12 недель) с последующей отменой препарата в течение 4 недель (16 неделя в протоколе исследования) приводила к зависимому от времени изменению содержания липида, выраженному в процентах () относительно начального уровня или, в случае отмены препарата, относительно последнего значения при приеме флувастатина. Сравнение изменений между группами или соответствующими подгруппами не выявило влияния фенотипа апоЕ и был проведен анализ вариабельности содержания липидов в каждой отдельной группе с помощью множественной регрессии (табл.

13). Для отрицательных величин ТГ, ХС и ХС-ЛНП предполагается положительная ассоциация в случае отрицательных величин коэффициентов корреляции r и положительная ассоциация положительных величин ХС-ЛВП в случае положительных значений r.

Существовала положительная ассоциация “ответов” ТГ, ХС и ХС-ЛНП и негативная для ХСЛВП с начальным содержанием этих липидов для трех групп. Отмечены положительные и отрицательные значения при низких и высоких начальных концентрациях триглицеридов соответственно. Для Е3 и Е4+ групп только один параметр определял вариацию изменений липидов; для Е2+ группы начальные концентрации ТГ0 и ХС противоположным образом определяли изменения ТГ12/0, эти предикторы положительно ассоциированы с ХС8/0; начальные уровни ХС0 и ХС-ЛВП0 противоположным образом определяли вариацию ХС-ЛВП12/0. Начальное содержание ХС-ЛВП противоположным образом определяло вариабельность содержания ХС-ЛНП в группах Е2+ и Е4+. В рамках схемы апоЕ-опосредованной трансформации липопротеинов (рис. 15) предполагается активация ЛПЛ и ингибирование ПЛ флувастатином; ингибирование активности ПЛ флувастатином (Marz et al., 2001) и аторвастатином (Hoogerbrugge and Jansen, 1999) предположено другими авторами.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«Трошева Татьяна Дмитриевна АНТИФУНГАЛЬНЫЕ СРЕДСТВА И ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ ОППОРТУНИСТИЧЕСКИХ ГРИБОВ 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности Российской академии наук (НИЦЭБ РАН) в...»

«МОСКАЛЕНКО ОЛЬГА ЛЕОНИДОВНА ВЛИЯНИЕ ГОРОДСКОГО ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЮНОШЕЙ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2014 Работа выполнена в ФГБУ Научно-исследовательский институт медицинских проблем Севера СО РАМН доктор медицинских наук, профессор Научный руководитель : Пуликов Анатолий Степанович Официальные оппоненты : Бакшеева Светлана Сергеевна доктор...»

«ЕНУЩЕНКО Илья Валерьевич Триба Овсовых злаков (Poaceae: Aveneae) в Байкальской Сибири 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2010 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики в ГОУ ВПО Иркутский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Чепинога Виктор Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологическах наук, профессор Олонова Марина Владимировна...»

«Мамонтов Юрий Сергеевич ФЛОРА МОХОВИДНЫХ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники, цитологии и генетики ГОУ ВПО Омский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Борис Фёдорович Свириденко Официальные оппоненты : доктор биологических наук, доцент Андрей Ильич Пяк кандидат биологических наук...»

«ЧЕРЕПКОВА Оксана Анатольевна ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин...»

«САВЕЛЬЕВА ЛЮДМИЛА ЮРЬЕВНА СООБЩЕСТВА ЖЕСТКОКРЫЛЫХ НА РАННИХ СТАДИЯХ ПИРОГЕННОЙ СУКЦЕССИИ В СОСНЯКАХ ЛИШАЙНИКОВЫХ ПЕЧОРО-ИЛЫЧСКОГО ЗАПОВЕДНИКА Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2010 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«ПОЛЕНОГОВА Ольга Викторовна ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВО И ПРОЯВЛЕНИЕ ПОЛИЭДРОЗА У НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (Lymantria dispar L.) 03.02.05. - энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный доктор биологических наук руководитель: Ильиных Александр Васильевич...»

«Никитина Оксана Викторовна ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА TRAMETES PUBESCENS (SCHUMACH.) PILT Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2006 Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель кандидат биологических наук, С. В. Шлеев Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«КУЗНЕЦОВА ЛЮБОВЬ ЛЕОНИДОВНА НАСЛЕДОВАНИЕ ПРИЗНАКА РОЗОВАЯ ОКРАСКА ВЕНЧИКА У КРУПНОПЛОДНОЙ ЗЕМЛЯНИКИ FRAGARIA ANANASSA DUCH. 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : кандидат биологических наук Батурин...»

«ЯЗЫНИНА Елена Валентиновна РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕРБИЦИДОВ 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва - 2003 Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН. Научные руководители: доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев, кандидат биологических наук А.В. Жердев. Официальные оппоненты : доктор химических наук Б.А. Кузнецов, кандидат химических...»

«СУЛЕЙМАНОВА АЛИЯ ДАМИРОВНА НОВАЯ ГИСТИДИНОВАЯ КИСЛАЯ ФИТАЗА PANTOEA VAGANS: ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Шарипова...»

«ЛЕОНОВА Тамила Шамильевна ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННЫЕ СВЯЗИ PASSER DOMESTICUS L, 1758 И PASSER MONTANUS L, 1758 В УСЛОВИЯХ СОВМЕСТНОГО ОБИТАНИЯ НА УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЯХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2013 Работа выполнена на кафедре биоэкологии ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) Федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ЗЕЛЕНКИНА Татьяна Савельевна Разнообразие и функциональная активность метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал 03.00.16 – экология 03.00.07– микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 2 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Дагурова Ольга Павловна Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«ЕФРЕМЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 03.00.02 – биофизика 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный консультант : Варфоломеев Сергей Дмитриевич, доктор...»

«ШАДРИНА МАРИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 03.01.07 – Молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН доктор биологических наук, профессор Научный консультант : Петр Андреевич Сломинский Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной...»

«Салеем Кайд Мохаммед Абдулла ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.00.16 –экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук 2 МОСКВА 2003 г. Работа выполнена в Российском государственеом университете нефти и газа им. И. М. Губкина на кафедре промышленной экологии. Научный...»

«Княжанская Екатерина Сергеевна Характеристика интегразы пенообразующего вируса и оценка возможности ее использования для направленной интеграции ДНК 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор...»

«Краснопевцева Виктория Михайловна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЕСЕННИХ ЭФЕМЕРОИДОВ - РЕЛИКТОВЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ХРЕБТА ХАМАР-ДАБАН (ЮЖНОЕ ПРИБАЙКАЛЬЕ) 03.00.05. – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2007 Работа выполнена в Байкальском государственном биосферном природном заповеднике. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Намзалов Бимба-Цырен Батомункуевич доктор биологических наук,...»

«Головина Екатерина Олеговна Петрофитные степи западной части Ононской Даурии 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в Лаборатории географии и картографии растительности Учреждения Российской академии наук Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Сафронова Ирина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«Цыренов Баир Солбонович Сезонные изменения физико-химических условий и активности микробного сообщества в содовом озере Белое (Западное Забайкалье) 03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Абидуева Елена Юрьевна Научный консультант : кандидат биологических...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.