WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ОВАНЕСОВ Михаил Владимирович

Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови

на пространственную динамику роста сгустка

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2002 2

Работа выполнена в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор Ф.И. Атауллаханов

Официальные оппоненты - доктор медицинских наук, профессор С.А. Васильев;

доктор физико-математических наук, В.Н. Буравцев Ведущее учреждение - Московский Физико-технический Институт (Государственный университет)

Защита состоится " " 2002 г. в час.

на заседании диссертационного совета Д001.045.02 в Государственном учреждении Гематологический Научный Центр Российской Академии медицинских наук (Москва, 125167, Новозыковский проезд, 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан " " 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук старший научный сотрудник В.Д. Реук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В организме человека в ответ на нарушение целостности стенки кровеносного сосуда инициируется система гемостаза. В месте повреждения образуется гемостатический тромб, который предотвращает потерю крови. Основу тромба составляет свернувшаяся плазма крови - сгусток. Нарушения свертывания - неконтролируемые кровоточивость или тромбообразование сопровождают большинство патологических процессов с летальным исходом.

Поэтому изучение механизмов инициации и развития коагуляционного процесса является одной из важнейших задач современной биофизики и медицины.

Настоящая работа посвящена изучению роста сгустка в нормальной плазме и в плазме больных дефицитами факторов внутреннего пути свертывания (гемофилии) in vitro. Гемофилии - самые распространенные вызывающие кровоточивость патологии свертывания. Гемофилии хорошо изучены с клинической стороны.





Однако, анализ литературы показывает, что вопрос о механизме нарушения тромбообразования при этом заболевании остается до сих пор спорным. Связано это с тем, что при повреждении сосуда свертывание инициируется только по внешнему пути, а при гемофилии нарушен другой, внутренний путь свертывания. Более того, стандартные тесты внешнего пути свертывания не отражают нарушений в образовании сгустка у гемофиликов. Интерес к исследованию именно пространственного свертывания вызван рядом причин. Во-первых, современные экспериментальные и теоретические работы указывают на то, что при гемофилии может быть нарушена пространственная фаза роста сгустка. Однако прямых экспериментальных подтверждений этой гипотезы нет, поскольку фаза роста изучена слабо. Во-вторых, изучение различных режимов формирования сгустка в пространстве при нарушенных функциональных частях каскада свертывания является в свою очередь инструментом в исследовании. Действительно, система свертывания обладает пороговыми свойствами и автокатализом, и поэтому ее поведение в пространстве может иметь много общего с активными средами. В работах проф. Атауллаханова Ф.И. и Гурия Г.Т. (Атауллаханов Ф.И. и др., 1994) была выдвинута гипотеза, согласно которой пространственное (но не гомогенное) формирование сгустка происходит автоволновым образом. Анализ литературы показывает, что автоволновая фаза роста может быть нарушена при дефиците именно факторов внутреннего пути свертывания. Определение влияния факторов внутреннего пути на пространственную фазу роста сгустка позволит понять не только природу кровоточивости у больных гемофилией, но и механизмы функционирования системы свертывания в целом.

Пространственно неоднородный процесс роста сгустка можно исследовать только в пространственно распределенной системе, в которой активация осуществляется локально, а сгусток растет в плазме, свободной от привнесенных активаторов. В гомогенной системе с полным перемешиванием получить ограниченные тромбы нельзя, т.к. в этом случае активатор не локализован, а распределен во всем объеме, поэтому происходит образование множественных сгустков, и свертывание охватывает изучаемый образец плазмы целиком. В настоящее время практически отсутствуют постановки экспериментов, позволяющие измерять рост фибринового сгустка in vitro. Поэтому в качестве объекта изучения роли пространства в динамике формирования сгустка была выбрана модель коагуляции, которая с одной стороны упрощена (сгусток растет в неперемешиваемом слое рекальцифицированной свободной от тромбоцитов плазмы крови человека, приведенной в контакт с поверхностью активатора (монослой фибробластов, искусственные тромбогенные поверхности)), но с другой стороны именно в такой постановке пространственный аспект свертывания проявляется наиболее сильно.

Цель работы: экспериментальное определение пространственной динамики роста сгустка в плазме крови, дефицитной по факторам внутреннего пути, при активации по внешнему и внутреннему путям свертывания. Исследование пространственной динамики свертывания в нормальной плазме.





Задачи исследования:

1) разработать методику, позволяющую изучать пространственное формирование тромба и распределение активных факторов свертывания;

2) исследовать динамические характеристики роста сгустка от различных активаторов внешнего и внутреннего путей свертывания;

3) определить влияние дефицита факторов внутреннего пути свертывания на фазы образования сгустка;

4) исследовать влияние препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания при гемофилии, на пространственный рост сгустка.

Научная новизна. Предложена новая экспериментальная система включающая в себя кювету, регистрирующую установку и комплекс программ обработки данных, которая позволяет исследовать пространственную динамику роста сгустка в плазме крови in vitro. Измерена неизвестная ранее динамика образования фибриновых сгустков в тонком слое неперемешиваемой рекальцифицированной плазмы доноров и больных гемофилиями А, В при активации как внешним, так и внутренним путями свертывания. Установлено влияние дефицита факторов внутреннего пути свертывания (факторы VIII и IX) на фазы пространственного образования сгустка. Определен эффект препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания при гемофилии, на пространственный рост сгустка. Показано, что, факторы внутреннего пути свертывания важны не для инициации, а для роста сгустка. Обнаружено, что у больных гемофилией пространственный рост сгустка происходит в два-три раза медленнее, чем в плазме здоровых доноров, и для восстановления динамики роста сгустка in vitro достаточно восполнения дефицита фактора свертывания до 5-10% от нормального уровня. Впервые найдено, что фибробласты могут инициировать лизис сгустка.

Научно-практическим значением работы является вклад в понимание механизмов формирования сгустка (тромба) в пространстве, а также механизма нарушения свертывания при гемофилиях. Результаты данной работы найдут практическое применение при разработке математических моделей свертывания крови, экспериментальном исследовании коагуляционных процессов в условиях, отражающих события, происходящие in vivo. Разработанная система может послужить основой для новых методов диагностики, а также исследования влияния различных препаратов на системы гемостаза и фибринолиза in vitro.

Внедрение результатов исследования. Результаты работы используются в клинической практике Гематологического Научного Центра РАМН и Центра Матери и Ребенка РАМН.

Основные положения, выносимые на защиту:

Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать пространственную динамику коагуляционных процессов, активированных по внешнему и внутреннему путям свертывания.

Охарактеризован пространственный рост сгустка в нормальной и гемофильной плазме, инициированный рядом активирующих поверхностей.

Обнаружено, что при формировании сгустка в плазме больных гемофилией наиболее нарушена не инициация, а пространственная фаза свертывания.

Показано, что факторы внутреннего пути свертывания важны именно для пространственного формирования гемостатического тромба.

Исследовано влияние ряда препаратов, возмещающих дефицит факторов свертывания при гемофилии, и показано, что 5-10% от нормальной концентрации факторов VIII или IX достаточно для достижения нормальной динамики роста сгустка.

Апробация работы состоялась 11 марта 2002 г. на заседании проблемной комиссии "Криоконсервирование клеток крови и костного мозга. Биохимия и биофизика крови" в Гематологическом Научном Центре РАМН.

Материалы диссертации докладывались на научно-практической конференции "Производственная трансфузиология на рубеже ХХI века" (Москва, 1999 г.), на XLII научной конференции МФТИ (Долгопрудный МО, 1999 г.), на Международной конференции под эгидой ЮНЕСКО "Биофизическая химия на рубеже столетий" (Москва, апрель 2000 г.), на IIм Российском конгрессе по патофизиологии (с международным участием) (Москва, октябрь 2000 г.), на 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (Birmingham, Англия, 2000 г.), на конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино МО, октябрь 2001 г.), на VIIой Всероссийской конференции "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза" (Москва, март 2002 г.), на Iм Российском съезде гематологов (Москва, апрель г.), на IXм Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, апрель 2002 г.), на 3rd Annual Conference on Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology (Salt Lake City, США, апрель 2002 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 тезисов в сборниках трудов 10 конференций и 5 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на _ страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 - обзора литературы, главы 2 - описания материалов и методов исследования, главы 3 результатов и главы 4 - обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего _ источников.

Работа выполнена на базе Гематологического Научного Центра РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф.

Атауллаханов Ф.И.).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований.

Пациенты и доноры. В работе была использована кровь 55 больных тяжелой формой гемофилии А (активность фVIII1%) и 20 больных тяжелой формой гемофилии В (активность фIX1%), а также 7 больных средней и легкой степенями тяжести гемофилий А и В (активность фактора 1.5, 2.6 и 5.5%). Больные наблюдались врачами Абушиновой К.В. и Лопатиной Е.Г. в Гемофилическом центре ГНЦ РАМН (рук. проф. Плющ О.П.). Все больные тяжелой формой гемофилий А и В страдали частыми кровотечениями. Кровь забиралась вне эпизода кровотечения не ранее 4 – 5 дней (гемофилия А) и не ранее 8 – 10 дней (гемофилия В) после последнего введения препаратов, содержащих дефицитный фактор, что соответствует рекомендациям Международного общества по тромбозу и гемостазу (Morfini M. et al., 1991). АЧТВ плазмы больных тяжелой формой гемофилии А было 60-131 сек, больных тяжелой формой гемофилии В - 60-86 сек, тогда как в нормальной плазме этот показатель составлял 26-35 сек (см. также Таблицу 1). У всех больных гемофилией в течение десяти месяцев перед взятием крови в лаборатории Гемофилического центра проводилось определение уровня дефицитного фактора (одностадийным коагуляционным тестом) и определение титра антител (ингибиторов) к факторам свертывания (методом Бетезда (Kasper C.K.

et al., 1975)). У одного больного тяжелой формой гемофилии А ингибитор составил 20 Бетезда единиц (БЕ). У остальных больных тест показал отсутствие значимого титра антител к факторам свертывания (уровень ингибитора менее 0.5 БЕ).

Кровь нормальных доноров, у которых не было болезней свертывания, забирали на станции переливания крови ГНЦ РАМН. Для экспериментов были приготовлены 47 пулов, состоящих из плазм двух или трех доноров.

Забор крови и подготовка плазмы. Кровь доноров и пациентов заготавливали на цитратном буфере (3.8% цитрат натрия, закисленный лимонной кислотой до рН 5.5; соотношение кровь:цитрат - 9:1). После предварительного отделения эритроцитов центрифугированием в течение 20 или 25 минут при 2400g или 3000g, плазма центрифугировалась 5 минут при 10000g для удаления тромбоцитов. Затем рН плазмы стабилизировался на уровне 7.2-7.6 путем инкубации с молочной кислотой по методике (Sinauridze E.I. et al., 1998).

Эксперименты с ингибитором трипсина из зерен кукурузы (CTI). Ингибитор контактной фазы (фактора XIIa) из зерен кукурузы (corn trypsin inhibitor, CTI) был приготовлен по методике (Hojima Y. et al., 1980) Смоляниновой Г.В. в ИТЭБ РАН.

Кровь больных гемофилией в двух случаях забиралась на 3.8% цитрат натрия с CTI, к нормальной плазме ингибитор добавлялся за два часа до эксперимента. Конечная концентрация CTI - 0.2 мг/мл, при этой концентрации фактор фXIIa эффективно ингибирован, поскольку в нормальной плазме АЧТВ удлинняется в 2.5 раза (данные Коротиной Н.Г., 2001).

Восполнение дефицита фактора VIII. Фактор VIII человека сверхвысокой очистки (для in vitro исследований) был любезно предоставлен нам проф. Саенко Е.Л. (лаборатория им. J.H. Holland, Институт "Американский Красный Крест", США). Фактор был очищен методом иммуно-аффинной хроматографии из терапевтических концентратов (Method M, American Red Cross, (Saenko E. et al., 1996)), имел специфичную активность 1600 МЕ/мг и не содержал других белковых примесей, в т.ч. и фактора Виллебранда. В день эксперимента фактор VIII добавлялся в плазму (40 мкл на мл) до конечной концентрации 64 нг/мл (0.1 МЕ/мл).

Эта концентрация фактора была далее последовательно разведена в плазмах тех же пациентов каждый раз в два раза, до последней концентрации 0.05 нг/мл (объем каждой пробы 0.6 мл плазмы). При восполнении дефицита фактора пулами свежих донорских плазм, гемофильная и нормальная плазмы смешивались непосредственно перед экспериментом в соотношениях 99/1, 97.5/2.5, 95/5, 90/10, 80/20 и 60/ (гемофилия/норма).

Фармакокинетика Агемфила А и Агемфила В. Препараты Агемфил А и В (ГНЦ РАМН) представляют собой лиофилизированные концентраты фактора VIII и комплекса фактора IX, полученные из свежезамороженной плазмы крови доноров.

Агемфил А и В вводились из расчета 20 МЕ/кг. Уровень фактора и рост сгустка измерялись в плазме крови, взятой до введения препарата (базальный уровень), через 15, 30 минут, 1, 3, 6, 9, 21, 24, 30 и 48 часов после введения препарата.

Исследование проводилось совместно с Гемофилическим центром ГНЦ РАМН (рук.

проф. Плющ О.П.) и лабораторией фракционирования белков плазмы крови ГНЦ РАМН (зав. лабораторией Ажигирова М.А.) Тесты АЧТВ и ПВ. Для проведения тестов были использованы реактивы "Коагулотест" и ПВ фирмы НПО Ренам (ГНЦ РАМН, Москва). Свертывание регистрировалось по светорассеянию на компьютерном лазерном фотометре 320LA (фирма Биола, Москва).

Культура фибробластов. Для активации свертывания по внешнему пути были использованы монослои экспрессирующих тканевой фактор фибробластов на подложке из полиэтилен терефталатовой (ПЭТ) пленки. Клеточная линия фибробластов легких эмбриона человека (Институт вирусологии им.

Д.И.Ивановского АМН РФ) выращивалась на базе Института иммунологии МЗ РФ Ульяновой Л.И. Клетки культивировались при 37°C в 24-х луночных планшетах (Flow, США). Слои фибробластов различной плотности получали, варьируя количество клеток в начале культивирования от 1103 до 300103 в мл питательной среды. Если исходная концентрация клеток в лунке планшета была клеток/мл, то после одно-двух суточной инкубации на ПЭТ пленке, помещенной на дно лунки, образовывался клеточный монослой с плотностью клеток/мм2. При концентрации клеток в лунке 1103 клеток/мл поверхность ПЭТ пленки была покрыта единичными фибробластами с плотностью 5-50 клеток/мм2.

Плотность клеток после окрашивания фибробластов акридином оранжевым измерялась по фотографиям, полученным на флуоресцентном микроскопе Leica DM/RBE (Leica Gmbh., Germany), оснащенном цифровой фотокамерой Kodak DC260.

Исследование пространственного роста сгустка проводилось в специально сконструированной кювете, собранной в полистироловой чашке Петри (см. рис. 1А).

Для этого на дно чашки ( = 40 мм, Ленинградский завод медполимеров) приклеивался активатор толщиной 1 мм (предметное стекло или стекло, обернутое чистой ПЭТ пленкой или пленкой со слоем фибробластов) и сверху активатор накрывался полистироловой пластиной. Плазма рекальцифицировалась (1.2-2 мМ Са++), перемешивалась и 0.4 мл быстро переносились в кювету, которая герметично закрывалась и помещалась в водяной термостат (37оС) экспериментальной установки (см. рис. 1Б). Растущий от активатора в тонком слое плазмы сгусток регистрировался оптически по вызываемому им светорассеянию при помощи компьютерной видеокамеры EDC 1000D (Electrim Corp., США). Для работы нами была написана специальная программа на основе драйверов видеокамеры, которая обеспечивала автоматический сбор данных (фотографии сгустков каждые 30 сек) и Рис. 1. Схема экспериментальной установки: кювета (А) и регистрирующая система (Б).

Установка состоит из исследовательской кюветы (1-6), которая помещается в воду, находящуюся в прозрачном термостатируемом отсеке при 37°С (7), и освещается снизу светодиодами красного цвета свечения (8) или ультрафиолетом: свет от ртутной лампы (9), собранный конденсором (10), проходит через тепловой (11) и входной ультрафиолетовый (12) фильтры и падает на полупрозрачное интерференционное зеркало (13).

Изображение области контакта плазмы (5) с активатором (4) фокусируется на охлаждаемой ПЗС матрице (14) с помощью фокусирующей системы, состоящей из теле-фотообъектива (15) и короткофокусного конденсора (16). Оцифрованное ПЗС камерой изображение передается в компьютер (17). Детали устройства кюветы изображены укрупненно на рисунке А: крышка (1), герметизирующая прокладка (2), полистироловая чашка Петри (3), активатор (4), исследуемая плазма (5), их предварительную обработку. В области изображения, свободной от спонтанных сгустков, проводился перпендикуляр к поверхности активатора, вдоль которого для всех моментов времени вычислялись профили интенсивности регистрируемого сигнала. Далее на уровне половины максимальной интенсивности светорассеяния в сгустке измерялся размер сгустка. Зависимость размера сгустка от времени строилась в программе Microcal Origin 5.0 (Microcal Software Inc., MA, USA), где по наклону линейного участка методом наименьших квадратов определялась скорость роста сгустка.

Измерение пространственных распределений тромбина производилось по методике (Kondratovich A.Yu. et al., 2002) при помощи флуорогенных субстратов BOC-Ala-Pro-Arg-AMC и BОС-Ile-Gly-Arg-AMC (Kawabata S. et al., 1988), которые перед экспериментом добавлялись в плазму в концентрации 200-300 мкМ (эксперименты были поставлены совместно с Красоткиной Ю.В.). Для интерпретации полученных результатов была написана численная модель эксперимента, которая описывает влияние различных экспериментальных погрешностей на результат восстановления активности фактора.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика экспериментальной системы. Экспериментальное исследование пространственного свертывания показало, что в формировании сгустка выделяются две пространственные фазы: фаза инициации свертывания, которая отражает события у активатора, она характеризуется временем от контакта плазмы с активирующей поверхностью до момента начала свертывания (время инициации), и фаза роста сгустка от активатора вглубь кюветы, характеризующаяся скоростью роста сгустка. Фаза инициации имеет много общего со свертыванием в известных экспериментальных системах (например, АЧТВ), в то время как пространственная фаза роста сгустка - уникальна, и была исследована впервые.

Рост сгустка в нормальной плазме. В плазме здоровых доноров при инициации свертывания по внутреннему пути на поверхности стекла сгусток (вызванное им светорассеяние) появлялся через 6.5±2.0 мин. Полиэтилен терефталатная пленка была слабым активатором и вызывала свертывание в 1.5- раза позже (см. Табл. 1). После инициации светорассеяние вблизи активатора быстро достигало максимального значения, и далее сгусток рос вглубь плазмы параллельно активатору (рис. 2А). Фаза роста сгустка происходила одинаково при Рис. 2. Фотографии роста сгустка в нормальной плазме: активация (А) стеклом и (Б) фибробластами. На кадрах вертикальная полоса слева - активатор. Время между кадрами 5 мин, первый кадр снят через 1 мин после рекальцификации. Помимо сгустка от активатора, в нормальной плазме наблюдалось образование спонтанных сгустков, несвязанных с активатором.

плато от активатора до края сгустка и резкий переход от сгустка к несвернувшейся плазме, см. рис. 3).

При активации свертывания монослоем фибробластов сгусток на активаторе был виден уже на первом кадре (приблизительно 1 мин после заполнения кюветы плазмой). Изменение количества фибробластов на активаторе (монослои с плотностью от 5 до 1500 клеток/мм2) не приводило к существенному изменению времени инициации (которое всегда было меньше минуты). В остальном, пространственное свертывание происходило также, как и при активации по внутреннему пути: сгусток рос непрерывно и параллельно активатору (см. рис. 2Б), интенсивность светорассеяния и его распределение в сгустке совпадали с таковыми для активации стеклом (ср. рис. 3А и Б) Скорость роста сгустка практически не зависела от типа активатора и была равна ~49 мкм/мин (Табл. 1).

Рис. 3. Рост сгустка в нормальной плазме: активация по внутреннему пути (А) ПЭТ, стеклом и по внешнему пути (Б) фибробластами (монослои разной плотности). Самый левый и маленький профиль светорассеяния на каждом графике соответствует моменту появления сгустка на активаторе, каждый следующий профиль сдвинут правее и вычислен через 2 мин.

Для того, чтобы показать, что на рост сгустка, инициированный по внешнему пути свертывания, не влияют факторы контактной активации, также как и в работах (Cawthern K.M. et al., 1998; Keularts I.M. et al., 2001), использовался селективный ингибитор фактора XIIа, ингибитор трипсина из зерен кукурузы (CTI). Добавление CTI в плазму полностью прекратило свертывание от стекла более чем на 1 час.

Однако, при активации фибробластами время инициации не изменилось (менее мин), и форма профилей светорассеяния оказалась такой же, как и в экспериментах без CTI, при этом скорость роста сгустка уменьшилась на 30%.

Таблица 1. Основные характеристики свертывания в нормальной плазме и плазме больных фибробластов (1500 кл/мм ) Т - время инициации свертывания; V - скорость роста сгустка; D - размер сгустка на 40-й минуте эксперимента; АЧТВ - активированное частичное тромбопластиновое время; ПВ протромбиновое время. Средние значения±стандартное отклонение, в скобках указано число доноров крови. Активация пространственного свертывания осуществлялась стеклом, полиэтилен терефталатной пленкой и плотным слоем фибробластов. Время начала свертывания на поверхности активатора определялось по первому заметному увеличению светорассеяния на активаторе, точность определения 1 мин. Размер и скорость роста сгустка определялись по профилю светорассеяния сгустка на уровне половины максимальной Таким образом, хотя в нормальной плазме длительность фазы инициации при активации по внутреннему и по внешнему путям свертывания отличается во много раз, фаза роста сгустка происходит одинаково и не зависит ни от пути инициации, ни от силы инициирующего сигнала. Эти данные находятся в хорошем согласии с автоволновой гипотезой свертывания, согласно которой пространственная фаза роста сгустка определяется реакциями самоподдерживающегося автокаталитического производства факторов внутри плазмы и поэтому слабо зависит от способа инициации (Атауллаханов Ф.И. и др., 1994).

Рис. 4. Фотографии роста сгустка в гемофильной плазме: активация (А) стеклом при гемофилии А и (Б) фибробластами при гемофилии В. На кадрах вертикальная полоса слева активатор. Время между кадрами 4 мин, первый кадр снят через 1 мин после рекальцификации.

Рост сгустка в плазме больных тяжелой формой гемофилий А или В. При активации стеклом и ПЭТ время инициации в плазме больных тяжелой формой гемофилии (см. рис. 4А) было в несколько раз больше времени инициации в нормальной плазме, что неудивительно, поскольку при гемофилии нарушен внутренний путь свертывания. Так же, как и в стандартном тесте АЧТВ, при гемофилии А время инициации было несколько длиннее, чем при гемофилии В, более того, у 15 больных гемофилией А плазма не начинала сворачиваться не менее 90 минут. Скорость роста сгустка от стекла при тяжелой форме гемофилий А и В была в 4-6 раз меньше нормы (Табл. 1, рис. 5).

Фаза инициации при активации свертывания фибробластами в плазме больных гемофилией происходила почти также, как и в нормальной плазме.

Независимо от числа фибробластов на активаторе (от 5 до 1500 клеток/мм2) сгусток был виден уже на первом кадре (менее 1 мин, см. рис. 4Б). В отличие от нормы, при гемофилии скорость роста сгустка существенно зависела от силы активации (плотность фибробластов) и при редком слое, состоящем из единичных клеток (5- клеток/мм2), была в 1.5-2.5 раза меньше, чем при плотном монослое ( клеток/мм2). Однако, даже в последнем случае сгусток рос в 3 раза медленнее, чем в норме (Табл. 1 и рис. 5Б). Этот важный результат прямо показывает, что внутренняя Светорассеяние (усл. ед.) Светорассеяние (усл. ед.) Рис. 5. Рост сгустка в плазме больных тяжелой формой гемофилии: активация по внутреннему пути (А) стеклом и по внешнему пути (Б) фибробластами (монослои разной плотности). Самый левый и маленький профиль светорассеяния на каждом графике соответствует моменту появления сгустка на активаторе, каждый следующий профиль сдвинут правее и вычислен через 2 мин (время экспериментов 1 час). На рисунке (Б) показан рост сгустка в плазме больного гемофилией А: в серии зависимостей размеров сгустков от времени активация осуществлялась монослоями с плотностью: 1300, 150, 15, 5 фибробластов/мм2 (кривые сверху вниз).

теназа (наработка которой нарушена при дефиците факторов VIII и IX) почти не важна для фазы инициации свертывания по внешнему пути (что было известно и до нас (Marlar R.A. et al., 1982; Nemerson Y., 1988)), но необходима для нормального процесса распространения свертывания от активатора вглубь плазмы (показано нами впервые). Важно отметить, что поскольку при гемофилии скорость роста сгустка на больших временах (40 мин) и расстояниях (1 мм) зависит от числа фибробластов, строго утверждать, что фаза роста сгустка определяется лишь автокаталитическими петлями обратных связей каскада свертывания, идущими в объеме плазмы, нельзя. Очевидно, значительный вклад в скорость роста сгустка (при малых концентрациях факторов VIII или IX) вносят также реакции, происходящие на активаторе.

Восполнение дефицита фактора VIII in vitro очищенным белком. На следующем этапе работы мы более подробно изучили роль факторов внутреннего пути в динамике пространственного роста сгустка. Для этого мы восполняли дефицит фактора VIII увеличивающимися концентрациями очищенного белка (рис.

6). Активация свертывания осуществлялась плотным монослоем фибробластов. Как видно из рис. 7, начиная с очень небольшой добавки фактора VIII (конечная активность фактора VIII составляет 0.03% от нормы) скорость роста сгустка растет пропорционально (логарифму) фактора VIII, и при 5-10% активности практически нормализуется (ср. рис. 6В и Г).

Известно, что частые введения препаратов факторов свертывания у ~1-20% пациентов могут вызывать образование антител (ингибиторов) к дефицитным белкам (Giannelli F. et al., 1983; Sallah S., 1997). Отсутствие возможного эффекта таких ингибиторов к фактору VIII на полученные результаты было проверено в негативном контроле. К плазме больного тяжелой формой гемофилии А с высоким титром ингибитора (20 БЕ) был добавлен фактор VIII до конечной активности 5% от нормы. Через 3 часа инкубации рост сгустка в этом образце плазмы не отличался от свертывания до добавления фактора. Влияние контактной активации мы исключили, проведя два контрольных эксперимента, в которых кровь больных гемофилией забиралась в цитрат с CTI. Восполнение дефицита в этом случае так же, как и без CTI, приводило к заметному и пропорциональному увеличению скорости роста сгустка.

Рис. 7. Влияние очищенного фактора VIII на рост сгустка при тяжелой форме гемофилии А: (А) зависимости размера сгустка от времени для экспериментов, показанных на рис. 6. (Б) Зависимость скорости роста сгустка от конечной концентрации добавленного фактора (активация монослоем фибробластов большой плотности, 1500 клеток/мм2). На рисунке (Б) даны средние значения±среднеквадратичная ошибка (n=9), пунктиром показано нормальное значение скорости Скорость роста сгустка (мкм/мин) Рис. 8. Восполнение дефицита фактора VIII: (А) влияние плотности фибробластов на активаторе, (Б) сравнение очищенного фактора VIII и нормальной плазмы. А: Восполнение дефицита очищенным фактором VIII. Активация слоем большой плотности, фибробластов/мм2 (, n=9) и малой плотности, 5-50 фибробластов/мм2 (, n=4). Б: Восполнение дефицита очищенным фактором VIII (, n=9) и пулами нормальных плазм (, n=4). Активация слоем большой плотности, 1500 фибробластов/мм2. Пунктиром показано нормальное значение Эффект фактора VIII на скорость роста сгустка заметно зависел от плотности слоя фибробластов (рис. 8А). До добавления фактора в плазме больных гемофилией А при низкой плотности фибробластов на активаторе (менее 50 клеток/мм2) скорость роста сгустка была в 1.5 – 1.7 раза меньше, чем при высокой плотности (~1500 клеток/мм2). Влияние добавленного фактора VIII на скорость роста проявлялось, как и в случае сильной активации, начиная с концентраций 0. МЕ/мл.

Бльшие добавки фактора приводили к пропорциональному увеличению скорости роста. Однако, при всех исследованных концентрациях фактора VIII скорость роста сгустка при слабой активации (рис. 8А, ) была в ~1.6 раз ниже, чем при высокой (рис. 8А, ). При 0.1 МЕ/мл концентрации добавленного фактора VIII скорость роста составляла ~67% нормальной. Таким образом, по крайней мере при 10% от нормальной концентрации фактора VIII скорость пространственного роста сгустка существенно зависит от реакций на активаторе. Эти результаты хорошо согласуются с данными о замедлении свертывания в отсутствие фактора VIII в условиях полного перемешивания (гомогенные эксперименты) лишь при низких концентрациях тканевого фактора (Josso F. & Prou-Wartelle O., 1965; Marlar R.A. et al., 1982; Cawthern K.M. et al., 1998).

Сравнение влияния очищенного фактора VIII и нормальной плазмы на рост сгустка в плазме больных тяжелой формой гемофилии А. Мы использовали свежую донорскую плазму для восполнения дефицита фактора А в гемофилической плазме и получили неожиданный результат: эффект нормальной плазмы был в четыре раза слабее, чем очищенного фактора. Чтобы достичь одинаковых скоростей роста сгустка нам надо было добавить в 4 раза больше фактора VIII нормальной плазмы (в пересчете на активность фактора), чем очищенного белка (рис. 8Б, ср. и ).

Природа этого различия не ясна. Поскольку контрольные эксперименты на тех же образцах плазмы показали, что тест АЧТВ не чувствителен к источнику фактора VIII, мы можем предположить, что гемофильная плазма отличается от нормальной не только по концентрации фактора VIII, но и по содержанию каких-то других компонентов системы свертывания. Хорошо известно, что при патологических состояниях наблюдается развитие компенсаторных механизмов. При гемофилии, например, это может быть снижение уровня некоторых ингибиторов, что позволяет несколько скомпенсировать недостаток фактора VIII. В таком случае, после добавления нормальной плазмы уровень этих ингибиторов повышается (нормализуется), что и ведет к уменьшению скорости роста сгустка. В терапевтическом смысле полученный результат может указывать на преимущество использования для лечения гемофилии фактора VIII, очищенного от остальных компонентов плазмы.

Восполнение дефицита факторов VIII и IX in vivo. Полученный нами результат о сильной зависимости динамики роста сгустка от уровня фактора VIII при его восполнении in vitro был подтвержден в ходе измерения роста сгустка в плазме, взятой у больных тяжелой гемофилией через разные промежутки времени после введения антигемофильных препаратов Агемфил А и Агемфил В. Через 0.5 ч после инъекции Агемфила А динамика роста сгустка (свертывание инициировалось монослоем фибробластов) становилась аналогичной той, которая наблюдается для плазмы здорового донора. Однако, скорость роста сгустка продолжала увеличиваться до 5-го часа после введения, когда достигалось нормальное значение Активность ф.VIII (% от нормы) Рис. 9. Восполнение дефицита фактора VIII препаратом Агемфил А. Уровни фактора VIII (А) и изменение скорости роста сгустка (Б) в плазмах больных тяжелой формой гемофилии А после введения единичной дозы Агемфила А. Активация пространственного свертывания осуществлялась монослоем фибробластов малой плотности, 5-50 клеток/мм2. Средние (рис. 9Б). Близкий к нормальному характер свертывания сохранялся до 15-ти и более часов после введения препарата. К этому времени активность фактора снижалась до 5% от нормы (рис. 9А). После 30-48 часов после введения Агемфила А динамика роста сгустка ухудшалась, приближаясь к исходному состоянию.

Аналогичные результаты были получены при исследовании роста сгустка после введения Агемфила В больным гемофилией В (n=5). Активация свертывания осуществлялась стеклом. Через 30 минут после введения уровень фактора IX в крови поднимался до 18.5±5.0% от нормы. При этом in vitro нормализовалось время инициации свертывания и скорость роста сгустка. Через 30 часов, когда уровень фактора был ~5% от нормы, начинала уменьшаться скорость роста сгустка, однако даже через 40 часов (уровень фактора 3.4±1.1%) сгусток рос в интенсивнее, чем до введения.

Корреляция между динамикой роста сгустка и тяжестью гемофилии.

Известно, что при концентрации факторов VIII и IX, равной 5-10% от нормы, клиницисты рекомендуют осуществлять превентивное лечение гемофилии (Nilsson I.M., 1994). Суть такого превентивного лечения гемофилии заключается в переводе тяжелой формы заболевания в легкую путем повышения уровня фактора до 5-20% от нормы. Действительно, тяжесть кровоточивости при гемофилиях А и В, как правило, можно предсказать на основании уровня прокоагулянтной активности дефицитного фактора. В наших экспериментах (работа проведена совместно с Красоткиной Ю.В. и Абушиновой К.В.) было исследовано свертывание в плазме одного больного гемофилией А средней тяжести (фVIII=1.5%), у четырех больных гемофилией В средней тяжести (фIX=1.5% и 2.6%) и одного - легкой степенью тяжести (фIX=5.5%). Нарушение динамики свертывания в плазмах больных гемофилией легкой и средней степени тяжести было выражено слабее, чем в плазме больных тяжелой формой гемофилии. При активности фIX=2.6% и 5.5% формирование фибрина начинается соответственно с 16 и 12 минут после активации плазмы стеклом. Динамика профилей светорассеяния при этом была аналогична наблюдаемой в нормальной плазме, но скорость роста сгустка - в два раза меньше.

Однако даже при 5.5% уровне фактора IX спонтанные сгустки не возникали.

Определение активности тромбина. Эксперименты по восстановлению распределений тромбина (активация осуществлялась по внутреннему пути) показали, что в нормальной плазме тромбин распространяется в виде бегущей волны (рис. 10А). Амплитуда фронта волны при этом была равна ~30 нМ, что хорошо совпадает с данными последней теоретической работы по моделированию пространственного роста сгустка (Пантелеев М.В. и др., 2002). При гемофилии распределения тромбина оказались качественно другими: активность фермента была Рис. 10. Пространственные распределения тромбина: в нормальной плазме (А) и в плазме больного тяжелой формой гемофилии А (Б). Тромбин измерен с использованием флуорогенного субстрата BОС-Ile-Gly-Arg-AMC (300 мкМ). Время экспериментов - 1 час, профили показаны через каждые 10 мин, начиная с 10-й минуты, активация свертывания осуществлялась стеклом.

сосредоточена в приактиваторной зоне (~1 мм), и ее распространение от активатора происходило медленно (рис. 10Б). Измеренные профили тромбина хорошо коррелируют с данными по динамике профилей светорассеяния от растущих сгустков: в норме сгусток действительно растет "ступенькой", фронт которой быстро самоподобным образом движется от активатора вглубь плазмы (рис. 3), а при гемофилии сгустки (при слабых активациях) имеют диффузный, размытый вид (рис. 5). Различную динамику роста сгустка поэтому можно объяснить тем, что вдали от активатора в норме происходит интенсивное производство факторов свертывания, а при гемофилии фаза автокаталитической наработки факторов почти отсутствует: тромбин производится только на активаторе (рис. 10Б), и малая скорость его диффузии от места производства определяет форму и скорость движения фронта светорассеяния (скорость роста сгустка).

Пространственная динамика лизиса сгустка. Хорошо известно, что фибробласты являются инициаторами свертывания. В наших экспериментах было обнаружено, что при определенных условиях фибробласты также инициируют и лизис сгустка. При больших плотностях фибробластов на активаторе в некоторых плазмах (n=4 из 15 больных тяжелой формой гемофилии А и n=4 из 20 здоровых доноров) через 20-300 минут после начала свертывания интенсивность светорассеяния около активатора начинала падать. Контрольные эксперименты показали, что (1) сгусток растворяется, и область от активатора до фронта сгустка заполнена жидкой плазмой, (2) лизис инициируется только на фибробластах, но не на стекле или ПЭТ, и (3) для инициации лизиса необходима большая плотность монослоя - более 1500 клеток/мм2 (что соответствует 200400103 клеток/мл в лунке планшета при выращивании культуры). С течением времени зона лизиса распространялась от фибробластов с постоянной скоростью, которая была в Рис. 11. Пространственная динамика роста и лизиса сгустка в плазме больного тяжелой формой гемофилии А. Активация свертывания осуществлялась фибробластами большой плотности. На несколько раз меньше скорости роста сгустка, при этом фронт профиля светорассеяния на лизирующемся краю был значительно резче фронта растущего сгустка (рис. 11). Известно, что система фибринолиза регулируется тромбином, который активирует мощный ингибитор лизиса - TAFI (Bajzar L., 2000). Поэтому in vitro при дефицитах факторов внутреннего пути свертывания из-за нарушенного производства тромбина лизис может начинаться раньше, и восполнение дефицита ингибирует этот процесс (Mosnier L.O. et al., 2001). В наших экспериментах добавление фактора VIII к плазме больных гемофилией А и доноров не оказывало влияние на время инициации лизиса (ср. рис. 11А и Б). Однако, известно, что у больных гемофилией А уровень TAFI часто значительно снижен (Antovic J. et al., 2001). Отсутствие влияния фактора VIII на лизис сгустка поэтому могло быть вызвано дефицитом TAFI у исследованных больных. Полученные нами данные о повышенной инициации системы фибринолиза в месте повреждения сосуда (на поверхности фибробластов) хорошо коррелируют с клинически оправданной практикой использования антифибринолитиков при лечении гемофилии.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать пространственную динамику коагуляционных и фибринолитических 2. Показано, что в процессе пространственного формирования фибринового сгустка в нормальной и гемофильной плазме выделяются две фазы: фаза 3. Доказано, что в плазме крови больных гемофилией наиболее нарушена не инициация свертывания, а фаза пространственного роста сгустка.

4. Предложен механизм, согласно которому in vivo факторы внутреннего пути свертывания важны именно для пространственной фазы формирования гемостатического тромба.

5. Выявлено, что 5-10% от нормального уровня плазменной активности антигемофильных факторов достаточно для достижения нормальной динамики роста сгустка.

6. Показано, что фибробласты человека могут инициировать не только свертывание, но и лизис сгустка.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Абушинова К.В., Ажигирова М.А., Плющ О.П., Копылов К.Г., Северова Т.В., Фетисова Л.В., Ованесов М.В., Тенцова И.А. "Изучение фармакокинетических показателей первого отечественного антигемофильного препарата фактора свертывания Агемфила В". Проблемы гематологии и переливания крови.

2000;2:25-29.

2. Коротина Н.Г., Ованесов М.В., Плющ О.П., Копылов К.Г., Лопатина Е.Г., Саенко Е.Л., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. "Исследование природы спонтанных сгустков в нормальной плазме и плазме больных гемофилией А".

Гематология и трансфузиология, 2002, в печати.

3. Ованесов М.В., Красоткина Ю.В., Абушинова К.В., Лопатина К.В., Коротина Н.Г. Независимо от пути инициации свертывания при гемофилии нарушена пространственная динамика роста сгустка. Тромбоз, гемостаз и реология.

2002;1(9):87-91.

4. Пантелеев М.А., Зарницына В.И., Морозова О.Л., Лобанов А.И., Ованесов М.В., Коротина Н.Г., Лобанова Е.С., Атауллаханов Ф.И. "Математическое моделирование пространственно-временной динамики свертывания крови".

Труды международной конференции "Параллельные вычисления и задачи управления (РАСО'2001)", (Москва, 2-4 октября 2001г.) - Москва - 2001:54-78.

5. Krasotkina J.V., Abushinova K.V., Ovanesov M.V., Vorob'ev A.I., Severova T.V., Plyushch O.P., Azhigirova M.A., Ataullakhanov F.I. Spatial dynamics of clot formation initiated by the intrinsic coagulation pathway in plasma of healthy donors and patients with hemophilia B. Submitted to Thrombosis Research (2002).

6. Ovanesov M.V., Krasotkina J.V., Ul’yanova L.I., Abushinova K.V., Vorob’ev A.I., Plyushch O.P., Domogatskii S.P., Ataullakhanov F.I. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth. Accepted by Biochimica et Biophysica Acta (2002).

7. Ovanesov M.V., Lopatina E.G., Saenko E.L., Ul'yanova L.I., Plyushch O.P., Butiline A.A., Ataullakhanov F.I. Effect of factor VIII on tissue factor-activated spatial clot growth. Submitted to Thrombosis and Haemostasis (2002).

Тезисы докладов на конференциях.

1. Ажигирова М.А., Фетисова Л.В., Абушинова К.В., Вязова Е.П., Ованесов М.В., Плющ О.П. "Исследование лечебной эффективности препарата фактора IX “Агемфил В”". "Производственная трансфузиология на рубеже ХХI века:

тезисы докладов научно-практической конференции. (Москва, 1999)" - Нижний Новгород - 1999. – стр. 70-71.

2. Красоткина Ю.В., Ованесов М.В., Абушинова К.В., Ажигирова М.А., Атауллаханов Ф.И "Пространственная динамика тромбообразования у здоровых доноров и больных гемофилией А и В". "Производственная трансфузиология на рубеже ХХI века: тезисы докладов научно-практической конференции. (Москва, 1999)" - Нижний Новгород - 1999. – стр. 15-16.

3. Красоткина Ю.В., Абушинова К.В., Ованесов М.В., Атауллаханов Ф.И., Ажигирова М.А. "Фармакокинетика “Агемфила В” у больных гемофилией В".

"Производственная трансфузиология на рубеже ХХI века: тезисы докладов научно-практической конференции. (Москва, 1999)" - Нижний Новгород - 1999.

– стр. 12-13.

4. Коротина Н.Г., Ованесов М.В., Ажигирова М.А., Дереза Т.Л., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. "Исследование пространственного роста фибринового сгустка in vitro". Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", (Москва, 24-26 октября 2001 г.) Пущино - 2001 - стр. 66-67.

5. Коротина Н.Г., Ованесов М.В., Лопатина Е.Г., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. "Исследование спонтанных центров активации в плазме больных гемофилией А". VII Всероссийская конференция "Новое в изучении патогенеза, диагностике, профилактике и лечении патологии гемостаза." (Москва, 27- марта 2002 г.) - Москва - 2002 - стр. 77.

6. Коротина Н.Г., ДерезаТ.Л., Ажигирова М.А., Ованесов М.В., Ульянова Л.И., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. "Исследование природы спонтанных центров активации свертывания крови". Материалы I Всероссийского съезда гематологов (Москва, 16-18 апреля 2002 г.). Проблемы гематологии и переливания крови.

2002;1:42-43.

7. Коротина Н.Г., Дереза Т.Л., Ажигирова М.А., Ованесов М.В., Атауллаханов Ф.И. "Зависимость динамики пространственного роста фибринового сгустка и образования спонтанных центров активации от концентрации антитромбина III".

Тезисы приняты к печати IXм Российским национальным конгрессом "Человек и лекарство" (апрель 2002 г.).

8. Красоткина Ю.В., Ованесов М.В., Ульянова Л.И., Абушинова К.В., Ажигирова М.А., Атауллаханов Ф.И. "Образование фибринового сгустка в плазме здоровых доноров и тяжелых больных гемофилией А и В при активации внешнего пути свертывания крови". Тезисы докладов II Российского конгресса по патофизиологии (с международным участием). Секция “Система крови”.

(Москва, 10-12 октября 2000 г.) - Москва - 2000 - стр. 93.

9. Красоткина Ю.В., Ованесов М.В., Абушинова К.В., Ажигирова М.А., Атауллаханов Ф.И. "Геометрия фибринового тромба в плазме здоровых доноров и больных гемофилией А и В при активации внутреннего пути свертывания крови". Тезисы докладов II Российского конгресса по патофизиологии (с международным участием). Секция “Система крови”. Москва (10-12 октября 2000 г.) - Москва - 2000 - стр. 93.

10.Ованесов М.В., Красоткина Ю.В., Атауллаханов Ф.И. "Методика исследования свертывания плазмы крови in vitro". "XLII научная конференция МФТИ": тезисы докладов научной конференции. - Москва - 1999 - стр. 26.

11.Ованесов М.В., Красоткина Ю.В., Ульянова Л.И., Абушинова К.В., Атауллаханов Ф.И. "Исследование пространственной динамики свертывания при гемофилиях А и В." Международная конференция под эгидой ЮНЕСКО "Биофизическая химия на рубеже столетий": сборник материалов. (Москва, апрель 2000 г.) - Москва - 2000 - стр. 61.

12.Ованесов М.В., Лопатина Е.Г., Ульянова Л.И., Саенко Е.Л., Плющ О.П., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. "Исследование пространственной динамики свертывания при восполнении дефицита фактора VIII при гемофилии А". Труды конференции "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям", (24-26 октября 2001 г.) - Пущино - 2001 - стр. 86.

13.Шулутко Е.М., Ованесов М.В., Атауллаханов Ф.И. "Факторы риска катетерассоциированных тромбозов центральных вен". Материалы I Всероссийского съезда гематологов (Москва, 16-18 апреля 2002 г.). Проблемы гематологии и переливания крови. 2002;1:102.

14.Krasotkina Y.V., Ovanesov M.V., Ataullakhanov F.I. "Evidence that the primary destination of the intrinsic coagulation pathway is to provide the propagation of clotting". Biochemical Society Transactions. 2000;28(5):A328.

15.Ovanesov M.V., Saenko E.L., Ataullakhanov F.I. Effect of factor VIII on tissue factor-initiated spatial clot growth. Abstracts for the 3rd Annual Conference on Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology, (Salt Lake City, Utah, USA. 6- April 2002). - 2002:Р281 - стр. 82.



 
Похожие работы:

«Славгородская Дарья Алексеевна ВЛИЯНИЕ СЛОЖНОГО ОРГАНОМИНЕРАЛЬНОГО КОМПОСТА НА СВОЙСТВА ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО И УРОЖАЙНОСТЬ ОЗИМОЙ ПШЕНИЦЫ В ЗАПАДНОМ ПРЕДКАВКАЗЬЕ Специальность 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук Краснодар – 2014 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Кубанский государственный аграрный университет в...»

«Тишин Денис Владимирович ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАДИАЛЬНЫЙ ПРИРОСТ ОСНОВНЫХ ВИДОВ ДЕРЕВЬЕВ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ Специальность 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2006 2 Работа выполнена в лаборатории биомониторинга Института экологии природных систем АН РТ, г. Казань Научный руководитель : кандидат биологических наук Аськеев Олег Васильевич Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«СУЛЕЙМАНОВА АЛИЯ ДАМИРОВНА НОВАЯ ГИСТИДИНОВАЯ КИСЛАЯ ФИТАЗА PANTOEA VAGANS: ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Шарипова...»

«Липчанская Мария Анатольевна ОЦЕНКА ФАКТОРОВ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ У НАСЕЛЕНИЯ СЕВЕРО-КАЗАХСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2012 Работа выполнена в Институте водных и экологических проблем СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Пузанов Александр Васильевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сысо Александр...»

«Мартемьянова Анна Анатольевна ОСОБЕННОСТИ КОНКУРЕНТНЫХ ОТНОШЕНИЙ МНОГОЛЕТНИХ РАСТЕНИЙ В АГРОФИТОЦЕНОЗАХ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной экологии в ФГОУ ВПО Иркутской государственной сельскохозяйственной академии Научный руководитель : Доктор сельскохозяйственных наук, профессор Хуснидинов Шарифзян Кадирович Официальные оппоненты : Доктор...»

«Альфрайхат Махмуд Хасан УСТОЙЧИВОСТЬ ПОЧВ ВЫСОКОГО ПЛАТО ИОРДАНИИ И ЕГО ОБРАМЛЕНИЯ Специальность: 03.00.27-почвоведение Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва-2009 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения и земледелия Российского университета дружбы народов Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ларешин Вячеслав Григорьевич. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ганжара Николай...»

«ПАВЛУШИН Сергей Викторович ВЛИЯНИЕ ФЕНОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ЛИСТЬЕВ БЕРЕЗЫ ПОВИСЛОЙ (Betula pendula Roth.) НА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (Lymantria dispar L.) И ТЕЧЕНИЕ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.05 – энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный...»

«ЧУЙКИН Илья Александрович МЕХАНИЗМЫ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ ДЕАЦЕТИЛАЗ ГИСТОНОВ НА ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МЫШИ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2006 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург...»

«Димеева Лилия Аминовна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ ПУСТЫНЬ ПРИАРАЛЬЯ И ПРИКАСПИЯ 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 1 Работа выполнена в РГП Институт ботаники и фитоинтродукции КН МОН Республики Казахстан Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Курочкина Лидия Яковлевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна доктор географических наук,...»

«Романюта Евгений Михайлович ВЛИЯНИЕ СВОЙСТВ ПОЧВ И АНТРОПОГЕННЫХ СУБСТРАТОВ НА ПРОИЗРАСТАНИЕ ГАЗОННОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ В УСЛОВИЯХ ДОНО-АКСАЙСКОЙ ПОЙМЫ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре почвоведения и оценки земельных ресурсов ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Безуглова...»

«КОНЕВА Лада Анатольевна МОДЕЛИРОВАНИЕ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ СПИНОЦЕРЕБЕЛЛЯРНОЙ АТАКСИИ I ТИПА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕНЕТИКО-ДЕМОГРАФИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЯКУТСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ 03.00.15 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН и Учреждении Российской академии...»

«НИКИТЕНКО Елена Викторовна МАКРОЗООБЕНТОС ВОДОЕМОВ ДОЛИНЫ ВОСТОЧНОГО МАНЫЧА 03.02.10 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Борок – 2014 Работа выполнена в Бюджетном научном учреждении Республики Калмыкия Институт комплексных исследований аридных территорий в отделе экологических исследований Научный руководитель : доктор биологических наук, Щербина Георгий Харлампиевич Официальные оппоненты : Курашов Евгений...»

«БУХАРОВА Надежда Владимировна АФИЛЛОФОРОВЫЕ ГРИБЫ ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО ЗАПОВЕДНИКА БАСТАК 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2013 Работа выполнена в лаборатории низших растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биолого-почвенного института ДВО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Булах Евгения Мироновна Научный консультант : кандидат биологических...»

«Левицкая Наталья Николаевна Критерии и индикаторы для оценки состояния лесов Московской области Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН Научный руководитель : Черненькова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник...»

«ЕФРЕМОВА ЕЛЕНА АЛЕКСАНДРОВНА ВЛИЯНИЕ СЕЛЕКТИВНОГО СВЕТА НА МОРФОГЕНЕЗ И ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС КУКУРУЗЫ, ИНФИЦИРОВАННОЙ МОЗАИЧНЫМ ВИРУСОМ КАРЛИКОВОСТИ 03.00.05 – ботаника 03.00.12 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2003 2 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Карначук...»

«САМСОНОВА ИРИНА ДМИТРИЕВНА МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ СТЕПНОГО ПРИДОНЬЯ Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2014 1 Работа выполнена на кафедре мелиораций земель в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новочеркасская государственная мелиоративная академия Научный консультант : Добрынин Николай Дмитриевич, доктор...»

«Карбышев Михаил Сергеевич СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОЛЬТ-СЕНСОРНОГО ДОМЕНА КАЛИЕВОГО КАНАЛА KvAP И -ТЕРАФОТОКСИНА-Gr3a ПОЛУЧЕННЫХ В БЕСКЛЕТОЧНЫХ БЕЛОКСИНТЕЗИРУЮЩИХ СИСТЕМАХ 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2014 Работа выполнена в Институте биофизической химии при Университете им. И.В. Гёте (Франкфурт на Майне, ФРГ) и ФГБУ НИИ онкологии Сибирского отделения Российской академии...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»

«Брежнева Ирина Николаевна МЕТОДИКА ОЦЕНКИ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФИТОСТРОМУ ПРИ СТРОИТЕЛЬСТВЕ СКВАЖИН (на примере Оренбургского Предуралья) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2010 2 Работа выполнена в Волго-Уральском научно-исследовательском и проектном институте нефти и газа, г. Оренбург доктор биологических наук, профессор, Научный Рябинина Зинаида Николаевна руководитель доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.