WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

АККУРАТОВ Евгений Евгеньевич

ХАРАКТЕРИСТИКА ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ

Na/K-АТРазы И NMDA-РЕЦЕПТОРА

В ГРАНУЛЯРНЫХ КЛЕТКАХ МОЗЖЕЧКА

03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2012

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Болдырев Александр Александрович

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Твердислов Всеволод Александрович доктор биологических наук, профессор Гривенников Игорь Анатольевич

Ведущая организация: Учреждение Российской Академии Наук Институт Высшей Нервной Деятельности и Нейрофизиологии РАН (Москва)

Защита состоится 19 марта 2012 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д 501.001.71 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет, Большая биологическая аудитория (ББА).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан «» февраля 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Медведева М.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Na/K-АТРаза является одним из ключевых ферментов эукариотических клеток. Она долгое время была известна как фермент, способный поддерживать градиент ионов Na+ и K+, однако в 90-е годы XX века было установлено, что Na/K-АТРаза способна функционировать как рецептор, специфическим лигандом которого являются соединения класса кардиотонических стероидов (КТС) (Kometiani et al., 1998). Связывание Na/KАТРазы с этими соединениями может регулировать экспрессию генов раннего и позднего ответов через активацию транскрипционных факторов (Xie et al., 1999). В литературе обсуждается, что данные процессы протекают без ингибирования ферментативной активности Na/K-АТРазы. Несмотря на довольно длительный период, прошедший с момента этого открытия, данных об участии Na/K-ATPазы в процессах сигнализации в нейрональных клетках известно очень мало, причем основные исследования ведутся с использованием кардиомиоцитов, почечного эпителия и фибробластов.





Na/K-АТРаза в нейрональной ткани поглощает огромное количество АТР – до 50% от общего уровня аденозинтрифосфата клетки, что связано с необходимостью восстанавливать исходное соотношение ионов Na и K после возбуждения нейрона. В нейрональных клетках -субъединица Na/K-АТPазы представлена двумя изоформами – КТС-чувствительной 3-субъединицей и КТС-резистентной 1-субъединицей. В литературе активно обсуждается вопрос о том, каким образом разные изоформы способны вовлекаться в различные внутриклеточные сигнальные пути, а также ставится вопрос о наличии в тканях животных соединений класса кардиотонических стероидов и об их возможном синтезе de novo.

Недавно было показано, что белок агрин, участвующий в формировании нервномышечного синапса, способен специфически связываться с КТС-чувствительной 3субъединицей Na/K-АТPазы и вызывать эффекты, аналогичные действию КТС (Hilgenberg et al., 2006). Таким образом, был найден специфический «партнер» для КТСчувствительной 3-субъединицы, которая представлена только в нейрональных клетках, что позволяет говорить о возможных путях регуляции именно КТС-чувствительной 3субъединицы. Мутации в гене, который кодирует эту субъединицу, способны вызывать эпилепсию и паркинсонизм в моделях гетерозиготных мышей по данному гену (Clapcote et al., 2009).

В последнее время начали накапливаться данные о возможной взаимосвязи между Na/K-ATPазой и глутаматными рецепторами. Недавно показано, что связывание уабаина с Na/K-ATPазой может влиять на стабильность ионотропных рецепторов AMPA-класса в нейронах (Zhang et al., 2009), а также блокировать активность глутаматных переносчиков GLT-1 и GLAST в клетках глии (Rose et al., 2009). Все это позволяет говорить о возможном участии Na/K-ATPазы в функционировании глутаматной системы. Кроме ионотропного рецептора NMDA-класса (NMDA – N-метил-D-аспартат).

NMDA-рецепторы представляют собой ионотропные глутаматные рецепторы, которые участвуют в формировании синаптической пластичности и молекулярной памяти. Важным отличием NMDA-рецепторов от других ионотропных глутаматных рецепторов является то, что их канал проницаем не только для натрия и калия, но и для Ca2+, который является вторичным мессенджером и способен модулировать ответ клетки в зависимости от внешнего сигнала.

В литературе показано, что действие соединений класса кардиотонических стероидов приводит к проявлению экзайтотоксических эффектов глутамата (Stelmashook et al., 1999). Так как этот эффект снимается антагонистами NMDA-рецепторов, было выдвинуто предположение, что КТС способны влиять на функционирование NMDAрецепторов. Было также показано, что активация NMDA-рецепторов может приводить к частичному ингибированию активности Na/K-ATPазы (Булыгина и соавт., 2003). Однако на сегодняшний день не установлено, способны ли они взаимодействовать между собой.





Цель и задачи работы Целью данной работы явилось выявление особенностей структурного и функционального взаимодействия Na/K-ATPазы и NMDA-рецептора в гранулярных клетках мозжечка крыс.

В соответствии с этой целью были поставлены и решены следующие задачи:

1. Исследовать возможное структурное взаимодействие и ко-локализацию Na/KATPазы и NMDA-рецептора в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка.

2. Исследовать активацию Akt и ERK киназ при действии различных концентраций уабаина и оценить возможное участие NMDA-рецептора в этих сигнальных 3. Выявить механизмы «экзайтотоксического» действия глутамата на фоне действия действием уабаина на клетки.

5. Оценить возможное влияние NMDA-рецептора на активность Na/K-ATPазы в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка крыс и исследовать общие механизмы этого процесса.

Научная новизна и практическая значимость работы В этом исследовании впервые показано, что Na/K-ATPаза и NMDA-рецептор могут формировать функциональный комплекс, в котором способны принимать участие как КТС-чувствительная 3-субъединица, так и КТС-резистентная 1-субъединица Na/KATPазы.

Показано, что кратковременное взаимодействие уабаина с 3-субъединицей Na/KATPазы приводит к активации ERK, а взаимодействие уабаина с 1-субъединицей Na/K-ATPазы - к активации Akt. NMDA-рецепторы не участвуют в данных сигнальных каскадах. Связывание уабаина с 1-субъединицей Na/K-ATPазы приводит к усилению функции NMDA-рецепторов за счет фосфорилирования тирозиновых остатков NR2Bсубъединицы. Долговременное действие уабаина на 3-субъединицу Na/K-ATPазы приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. Был установлен механизм ингибирования Na/K-ATPазы при активации NMDA-рецепторов.

Полученные данные свидетельствуют о том, что NMDA-рецептор в гранулярных клетках мозжечка является объектом сложной регуляции, и на его активность могут влиять как 1-, так и 3-субъединицы Na/K-ATPазы. Полученные данные могут инициировать исследование причин, по которым недостаточность 3-субъединицы Na/KATPазы приводит к дефициту деятельности мозга.

Апробация работы и публикации Результаты диссертационной работы были представлены на II Международном семинаре по исследованию экспрессии, структуры и функции мембранных белков (Флоренция, Италия, 2009), XIII Международной конференции по ATPазам P-типа, (Пасифик Гров, США, 2011). Диссертация апробирована на заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (2011). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, среди которых 3 статьи в рецензируемых журналах, входящих в список ВАК РФ.

Структура и объем диссертации Работа изложена на 87 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 136 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объект исследования Объектом исследования была выбрана первичная культура гранулярных клеток мозжечка, так как эта культура содержит функциональные NMDA-рецепторы, а также две изоформы -субъединицы Na/K-АТРазы. Эти изоформы различаются по своей чувствительности к действию уабаина – 3-субъединица являются уабаин-чувствительной и связывается с уабаином в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1М, а 1-субъединица является уабаин-резистентной и связывается с уабаином в диапазоне концентраций от М до 1 мМ. Для приготовления первичной культуры гранулярных клеток мозжечка использовали 3-7 дневных крыс линии Wistar Kyoto. Крыс декапитировали, мозжечок измельчали и помещали на 20 минут в 0,05% раствор Трипсина-ЭДТА для разрушения межклеточных взаимодействий. Клетки промывали раствором Хенкса, затем диспергировали в свежей среде NBM (Neirobasal A-Medium) (Gibco, США) до получения однородной суспензии, которую центрифугировали 5 мин при 600g. Осажднные клетки ресуспендировали в соответствующем объме NBM, содержащем 2% Supplement B- (Gibco, США), 0,5 мM GlutaMax (Gibco, США), 100 U/мл пенициллин/стрептомицин (Gibco, США) и 20 мM KCl (Sigma, CША). Культивирование осуществляли в среде NBM в СО2 инкубаторе при 37°С, 5% СО2 и относительной влажности 98%. На 3-4 сутки арабинозинмоноцитозида (Sigma, США) для остановки пролиферации глиальных клеток.

Эксперименты ставили с клеточной культурой через 7-10 дней.

Для оценки внутриклеточного уровня Са2+ использовали суспензию гранулярных клеток мозжечка крыс, которая подвергалась анализу непосредственно в день изоляции.

Для этого 7-10 дневных крыс линии Wistar декапитировали, мозжечок измельчали на холоду и помещали в 2 мг/мл раствор коллагеназы (Wako, Япония), приготовленный на растворе Тироде (148 мM NaCl, 5 мM KCl, 2 мM CaCl2, 1 мM MgCl2, 10 мM глюкозы, мM HEPES, рН 7,4) для разрушения межнейронных контактов. Инкубацию с коллагеназой проводили в течение 30 мин при 32С. Затем клеточную суспензию отмывали от коллагеназы в растворе Тироде, клетки суспендировали пастеровской пипеткой и фильтровали через тефлоновый фильтр с размером пор 53 мкм. Содержание клеток в суспензии определяли с помощью камеры Горяева. Перед инкубацией с различными веществами клетки оставляли на 30 мин при 37С.

Для первичной культуры гранулярных клеток мозжечка за 4 ч перед экспериментом меняли среду на среду Хенкса (Sigma, США), не содержащую сыворотки (т. н. «голодающая среда»). Затем клетки преинкубировали с лигандами, время инкубации и концентрации уабаина и NMDA варьировали в зависимости от задач эксперимента, остальные лиганды преинкубировали с клетками в течение 30 мин. После инкубации реакцию останавливали различными способами, в зависимости от далее используемого метода: для Western blotting и иммунопреципитации – промывание холодным раствором Хенкса без Ca2+ и Mg2+ (Sigma, США), затем добавляли лизирующий буфер. Для определения ферментативных активностей реакцию останавливали пятикратным замораживанием – оттаиванием, для определения насосной функции Na/K-ATPазы клетки троекратно промывали холодным раствором Хенкса без Ca2+ и Mg2+ (Sigma, США), а затем добавляли холодную 5% трихлоруксусную кислоту (Sigma, США). Для проведения иммуноцитохимических методов клетки промывали раствором Хенкса без Ca2+ и Mg2+ (Sigma, США) при комнатной температуре, а затем проводили иммуноцитохимическое окрашивание.

Иммунопреципитирование После приготовления лизатов измеряли концентрацию белка по методу Лоури, разводили RIPA буфером до 1 мг/мл, затем к 1 мл лизата добавляли 100 л протеин-Асефарозы (Sigma, США), которую предварительно трижды промывали холодным раствором Хенкса, и инкубировали в течение 3 ч при +4°С. Затем центрифугировали при 8000 g 1 мин, к отобранному супернатанту добавляли антитела на NR1- или NR2Bсубъединицы NMDA-рецептора и инкубировали в течение ночи при +4°С. После окончания инкубации добавляли 100 л протеин-А-сефарозу и инкубировали при +4°С в течении 4 ч. Затем трехкратно отмывали холодным раствором Хенкса без Ca2+ и Mg2+ (Sigma, США) при помощи центрифугирования при 14000 g 30 сек и промывания осадка.

К осадку добавляли двукратный объем буфера для образцов, инкубировали в течении мин при 55°С для анализа мембранных белков или в течение 5 мин при 95°С для определения фосфотирозина, после чего центрифугировали и использовали супернатант для анализа образцов методом Western blotting.

Метод Western blotting полиакриламидном геле в присутствии SDS, описанным Леммли. Затем производили перенос на нитроцеллюлозную или PVDF мембрану в камере BioRad в течение 40 мин при силе тока 200 A. После электропереноса мембрану промывали в растворе TBST (TBS + 0,1% Твин-20), затем блокировали в растворе TBST с сухим молоком или БСА от специфического связывания, затем после трехкратного отмывания в TBST инкубировали вначале с первичными антителами, разведенными на растворе TBST+блокатор, при +4°С в течение ночи, а затем после трехкратного промывания в TBST - со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, также разведенными в растворе TBST+блокатор. Связывание первичных антител детектировали методом усиленной хемилюминесценции (ECL) с помощью набора «Amersham™ ECL Plus Western Blotting Detection Reagents» (GE Healthcare Life Sciences, Германия).

Определение активности Na/K-АТРазы В нашей работе активность Na/K-АТРазы мы регистрировали двумя способами:

при определении неорганического фосфата, образовавшегося в ходе ферментативной реакции, и при регистрации количества уабаин-зависимого поглощения клетками Rb+. Для лигандами, затем останавливали реакцию, однократно промывая клетки холодным бескальциевым и безмагниевым раствором Хенкса, затем разрушали клеточные мембраны пятикратным замораживанием-оттаиванием. Затем после проведения ферментативной реакции для определения неорганического фосфата использовали метод Ратбуна и Бетлах, основанный на использовании хлористого олова в качестве восстановителя. Для определения насосной функции Na/K-ATPазы клетки инкубировали с лигандами, затем за 10 мин до остановки реакции добавляли 2,5 мМ RbCl и останавливали реакцию, 5 раз промывая в холодном бескальциевом и безмагниевом растворе Хенкса, затем лизировали клетки при помощи 5% трихлоруксусной кислоты. Далее центрифугировали при 10000 g мин и в полученном супернатанте определяли количество ионов Rb+ при помощи атомноабсорбционного спектрометра (Интерфотофизика, Россия). В полученном осадке определяли концентрацию белка, нормируя по белку полученные данные.

Иммуноцитохимия Для приготовления иммуноцитохимических образцов клетки выращивали на стеклах для иммуноцитохимии. После инкубации клеток с лигандами препараты промывали в бескальциевой и безмагниевом растворе Хенкса при комнатной температуре, затем фиксировали в растворе 3,7% формальдегида в течение 20 мин. Затем образцы промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), далее в течение 15 мин инкубировали в 0,01% Tritonе X-100 для пермеабмилизации клеток. Затем трехкратно отмывали в PBS и блокировали образцы в 10% БСА в течении 30 мин. После этого добавляли первичные антитела и инкубировали при +4°С в течении ночи. Затем промывали 3 раза теплым PBS и инкубировали в течение 1 ч в темноте с раствором вторичных антител, конъюгированных с флуоресцентной меткой, на PBS. Затем трехкратно отмывали и заключали препараты в среду мовиол (Sigma, США). Препараты анализировали на конфокальном микроскопе при помощи объектива с увеличением 63х. Данные обрабатывали в ImageJ.

Проточная цитометрия Данным методом проводили детекцию уровня Са2+ в суспензии гранулярных клеток мозжечка. При анализе данных из общей популяции клеток выделяли клетки, по размерам соответствующие нейронам, таким образом выявляя изменение уровня Са 2+ флуоресцентный зонд Fluo-3-AM (пентаацетоксиметиловый эфир [2-амино-5-(2,7-дихлоргидрокси-3-оксо-9-ксантенил)фенокси]-2-(2-амино-5-метилфенокси)этан-N,N,N',N’тетрауксусной кислоты) (Sigma, США) (ex = 488 нм, em = 530 нм). К исследуемой суспензии клеток добавляли Fluo-3-AM (конечная концентрация 20 М) и инкубировали 30 мин в темноте при 37°С. Затем суспензию инкубировали с лигандами в течение заданного времени, после инкубации добавляли PI и через 1 мин проводили анализ флуоресценции методом проточной цитометрии. Отсекая мертвые клетки, анализировали изменение концентрации внутриклеточного Ca2+ в популяции живых клеток.

Статистическая обработка результатов Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерной программы «GraphPadPrism4». Достоверную значимость отличий в экспериментах Western blot проверяли с помощью одностороннего непараметрического критерия Манна-Уитни и критерия Дунетта. Для статистической обработки результатов, полученных методом проточной цитометрии, использовали критерий Смирнова-Колмогорова (коэффициент D/S(n), который отражает достоверность различий двух гистограмм), а для результатов соответствовала p0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс Было показано, что наш объект - первичная культура гранулярных клеток мозжечка крыс - содержит как уабаин-чувствительную 3-субъединицу, так и уабаин-резистентную 1-субъединицу Na/K-ATPазы, а также функционально активный NMDA-рецептор.

Последнее обстоятельство было подтверждено наличием NR1- и NR2B-субъединиц, необходимых для формирования функционального комплекса NMDA-рецептора (см. рис.

1).

Анализ структурного взаимодействия Na/K-ATPазы и NMDA-рецептора Na/K-ATPаза зачастую образует белок-белковые взаимодействия с другими мембранными и цитоплазматическими белками, влияя на их свойства. В литературе было показано, что при взаимодействии с соединениями класса кардиотонических стероидов Na/K-ATPаза способна активировать Src-киназу, которая непосредственно связана с субъединицей и путем структурных перегруппировок способна автофосфорилироваться и становиться активной (Tian et al, 2006). Судя по обилию литературных данных, такие реакции представляют собой общий принцип регуляции других белков при помощи ингибирования Na/K-ATPазы в нейрональной клетке.

В литературе также было показано, что связывание Na/K-ATPазы с уабаином таким же образом может влиять на функциональные свойства участников глутаматного обмена в нейрональной ткани, например, на ионотропные глутаматные AMPA-рецепторы в нейронах (Zhang et al, 2009) и на глутаматные переносчики GLT-1 и GLAST в глиальных клетках (Rose et al, 2009).

Нашей задачей было проанализировать возможное структурное взаимодействие между интересующими нас белками методом ко-иммунопреципитации. Для этого мы провели серию экспериментов, в которых инкубировали клетки первичной культуры гранулярных клеток мозжечка с 1 М уабаина, затем лизировали клетки и проводили иммунопреципитацию с антителами на NR1- или NR2B-субъединицы. Затем в пробах анализировали наличие 1- и 3-субъединиц методом Western blotting. Указанная концентрация уабаина была выбрана как минимальная концентрация, которая способна связываться как с высокочувствительной 3-субъединицей, так и с низкочувствительной 1-субъединицей. Для положительного контроля методом Western blotting использовали NR1- и NR2B-субъединицы, в качестве отрицательного контроля использовали лизат, проинкубированный только с протеин-А-сефарозой (рис. 2).

Рис. 2. Детекция 1- (А) и 3-субъединиц (Б) Na/K-ATPазы методом Western blotting (WB) после проведения иммуннопреципитации (IP) с NR1- или NR2B-субъединицами NMDAрецептора. В качестве положительного контроля мы детектировали NR1- (В) и NR2Bсубъединицы (Г) NMDA-рецептора. «кон» - контроль, «уаб» - уабаин.

Из представленных данных видно, что обе изоформы -субъединицы способны коиммунопреципитировать с NMDA-рецептором. Интересный факт заключается в том, что в наших условиях было показано возможное участие в процессах внутриклеточной сигнализации в нейронах как уабаин-чувствительной 3-субъединицы, так и уабаинрезистентной 1-субъединицы. Это может служить основанием для предположения о том, что обе субъединицы способны участвовать в механизмах регуляции глутаматного обмена, хотя и различными способами. Действие специфического ингибитора Na/KATPазы – уабаина не выявило изменений в количестве молекул NMDA-рецептора, иммунопреципитирующих вместе с -субъединицами Na/K-ATPазы. Это обстоятельство свидетельствует, что белок связывается с интересующим нас рецептором вне зависимости от своего конформационного состояния (Е1 или Е2).

Однако использование данного метода не является доказательством непосредственного взаимодействия между двумя белками, так как проведение иммунопреципитации способно «вытаскивать» целый пул других белковых молекул, особенно когда они находятся в солюбилизированном состоянии. Поэтому для анализа возможной ко-локализации между -субъединицами Na/K-ATPазы и NMDA-рецептором была произведена серия экспериментов, в которой мы инкубировали препараты с уабаином, затем проводили фиксацию клеток и последующее иммуноцитохимическое окрашивание на NR1-субъединицы NMDA-рецепторов (Alexa Fluor 488) и -субъединицы Na/K-ATPазы (Alexa Fluor 546). Анализ препаратов производили на конфокальном микроскопе.

На полученных после иммуноцитохимического окрашивания картинах видно, что как 1-субъединица Na/K-ATPазы и NR1-субъединица NMDA-рецептора, так и 3субъединица Na/K-ATPазы и NR1-субъединица NMDA-рецептора локализованы в одних и тех же частях тела клетки и аксональных отростков. Суммируя данные, полученные двумя различными методическими подходами, мы можем сделать вывод о том, что Na/K-ATPаза и NMDA-рецепторы ко-локализованы в нейрональных клетках и способны формировать комплексы, исследование функциональных свойств которых стало нашей следующей задачей.

Влияние уабаина на активацию сигнальных каскадов при кратковременной инкубации На кардиомиоцитах и на фибробластах было показано, что действие уабаина способно приводить к активации митоген-активируемой киназы ERK (Kometiani et al., 1998), а также протеинкиназы В (Akt) (Zhou et al., 2001). Активация ERK и Akt происходит по независимым сигнальным путям – если активация ERK происходит при помощи активации Src-киназы, с последующей активацией рецептора эпидермального ростового фактора (EGFR), то Akt активируется по Src-независимому пути при помощи белок-белковых взаимодействий -субъединицы Na/K-ATPазы с фосфоинозитол-3киназой, которые и являются механизмом запуска сигнального каскада, приводящего к активации в том числе и Akt.

Рис. 3. Фосфорилирование Akt и ERK под действием 1 М уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А – пример типичного эксперимента, Б – количественные данные. По оси ординат – процент выявляемых белков.

* - соответствует достоверному различию от контроля с p0,05.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что 1- и 3-субъединицы Na/KATPазы по-разному вовлечены в клеточный сигналинг в клетках нейробластомы SK-NAS: связывание 3-субъединицы с уабаином через 180 мин инкубации приводило к фосфорилированию ERK, а аналогичное действие на 1-субъединицу Na/K-ATPазы за то же время не приводило к фосфорилированию ERK. Первой нашей задачей стало исследовать, протекают ли схожие процессы на нашей модели первичной культуры нейрональных клеток мозжечка. Для этого была построена временная зависимость уровня фосфорилирования ERK и Akt при действии 1 М уабаина (см. рис. 3).

Из полученных данных видно, что уровень фосфорилирования для ERK увеличивается и достигает своего максимума через 10 мин инкубации, затем до 20 мин инкубации уровень фосфорилированной формы не изменяется. Для Akt показано, что максимум активации наблюдается к 15 мин, затем происходит уменьшение сигнала.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что действие малых концентраций уабаина на клетки приводит к активации клеточных сигнальных каскадов, приводящих к активации протеинкиназы В (Akt) и стресс-активируемой МАР-киназы ERK, что позволяет говорить о сходстве внутриклеточных процессов с клетками других тканей (кардиомиоциты, фибробласты). Для проведения дальнейших экспериментов было выбрано время 10 минут, так как, исходя из полученных результатов, на 10 мин приходится максимум фосфорилирования ERK киназы и при этом наблюдается статистически достоверное изменение фосфорилирования Akt.

Для установления того, какие изоформы фермента способны играть роль в данных процессах, мы провели измерение концентрационной зависимости активации Akt и ERK (см. рис. 4). Из полученных данных видно, что ERK киназа активируется при действии на первичную культуру уабаином в наномолярных концентрациях, максимум достигается при концентрации 10 нМ, а затем идет снижение уровня фосфорилирования, и при концентрации 10 М фосфорилирования вообще не наблюдается. Это позволяет предположить, что активация ERK киназы происходит при взаимодействии с уабаином уабаин-чувствительной 3-субъединицы, а при связывании уабаина с обеими субъединицами фосфорилирование снижается, достигая при 10 М контрольного значения.

Изменения уровня фосфорилирования Akt при низких концентрациях уабаина (1- нМ) не выявлено, однако начиная с концентрации 100 нМ происходит нарастание уровня фосфорилирования Akt, которое достигает максимума при 1 М, что позволяет утверждать: активация Akt может быть обусловлена связыванием уабаина с уабаинрезистентной 1-субъединицей.

Рис. 4. Фосфорилирование Akt и ERK под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А – пример типичного эксперимента, Б – количественные данные. По оси ординат – процент выявляемых белков.

* - соответствует достоверному различию от контроля с p0,05, ** - c p0,01.

Исходя из полученных результатов, мы считаем, что в нейронах эти процессы скорее всего также являются независимыми друг от друга и за них «ответственны»

различные -субъединицы Na/K-ATPазы: если за активацию сигнального каскада, приводящего к активации ERK, ответственна 3-субъединица, то к активации сигнального каскада, вызывающего активацию Akt, приводит взаимодействие уабаина с 1-субъединицей Na/K-ATPазы.

В нашей лаборатории ранее было показано, что преинкубация нейрональных клеток с D-AP5 (являющегося специфическим антагонистом NMDA-рецепторов) снижает активацию ERK при долговременной инкубации клеток (180 мин) с различными концентрациями уабаина. Нашей задачей стало оценить, участвуют ли NMDA-рецепторы в передаче сигнала с Na/K-ATPазы на Akt и ERK. Для этого мы инкубировали наши клетки с 1 М уабаином в течение 10 мин, так как в этих условиях мы ранее наблюдали статистически достоверную активацию этих киназ (см. рис. 5).

Рис. 5. Фосфорилирование Akt и ERK под действием 1 М уабаина в присутствии/отсутствии 10М D-AP5 в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А – пример типичного эксперимента, Б – количественные данные. По оси ординат – процент выявляемых белков. * - соответствует достоверному различию от контроля с p0,05.

Оказалось, что действие D-AP5 не снимает активацию Akt и ERK уабаином, причем сам D-AP5 способен активировать Akt. Таким образом, можно сделать вывод, что взаимодействие используемого КТС с уабаин-чувствительной 3-субъединицей приводит к активации ERK, а с уабаин-резистентной 1-субъединицей - к активации Akt киназы.

Блокирование NMDA-рецепторов не влияет на процессы запуска сигнальных каскадов, приводящих к активации ERK и Akt.

Влияние уабаина на активность NMDA-рецепторов В литературе существуют данные о том, что действие кардиотонических стероидов приводит к глутаматной экзайтотоксичности и что данный процесс происходит при участии NMDA-рецепторов, так как действие специфических антагонистов NMDAрецепторов предохраняет клетки от нее (Stelmashook et al., 1999). Однако механизм данного процесса оставался непонятен.

Вначале мы убедились в том, что действие уабаина вызывало увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ при помощи использования метода проточной цитометрии, причем было показано, что 10 нМ уабаина не вызывает существенного увеличения ионов Ca2+ (после 20 мин инкубации), однако 1 М уабаина в этих условиях вызывает 50% увеличение уровня ионов Ca2+ внутри клетки (рис. 6).

Из литературы известно, что одним из наиболее встречаемых механизмов регуляции активности NMDA-рецептора является тирозиновое фосфорилирование NR2субъединицы. Было показано, что ключевую роль в данном процессе выполняет тирозиновая Src-киназа (Salter, Calia, 2004). Как было сказано ранее, для кардиомиоцитов и фибробластов установлено, что уабаин вызывает активацию Src-киназы за счет непосредственных белок-белковых взаимодействий. Мы предположили, что Src-киназа может являться тем посредником между Na/K-ATPазой и NMDA-рецептором, о котором говорилось выше.

В наших экспериментах мы проанализировали действие двух концентраций уабаина: 10 нМ и 1 М (почему были выбраны именно эти концентрации - сказано выше) на активацию Src-киназы (см. рис. 7) и на тирозиновое фосфорилирование NR2Bсубъединицы (см. рис. 8). Мы не выявили статистически достоверной активации Srcкиназы (небольшое увеличение уровня фосфорилирования являлось недостоверным), однако действие 1 М уабаина приводило к увеличению степени тирозинового фосфорилирования NR2B-субъединицы и к увеличению входа Ca2+ через NMDA-рецептор.

Действие 10 нМ уабаина такого эффекта не вызывало, что позволило нам предположить, что к усилению канальной функции NMDA-рецептора приводит связывание уабаин-резистентной 1-субъединицы Na/K-ATPазы с уабаином. Мы предложили два возможных объяснения этому феномену. Либо Src-киназа активируется локально, что не вносит существенного вклада в суммарный уровень ее фосфорилирования во всей клеточной культуре, но локально фосфорилирует NR2Bсубъединицу NMDA-рецептора, либо в данном процессе участвует другая, не выявленная еще тирозиновая киназа.

Рис. 7. Фосфорилирование Src-киназы под действием различных концентраций уабаина в первичной культуре гранулярных клеток мозжечка. А – пример типичного эксперимента, Б – количественные данные. По оси ординат – процент выявляемых белков.

Эффект долговременной инкубации нейронов с уабаином Одним из наиболее важных механизмов долговременной регуляции активности NMDA-рецепторов является способность клетки изменять количество NMDA-рецепторов на клеточной поверхности. Ранее в литературе было показано, что введение эндобаина Е в кровь мышей приводило к увеличению экспрессии NMDA-рецепторов в кортексе через дня (Bersier et al., 2008). Мы решили проанализировать, будет ли влиять на этот процесс инкубация первичной культуры гранулярных клеток мозжечка крыс с 1 М уабаином. Для этого мы инкубировали клетки с уабаином в диапазонах от 0,5 до 6 часов (см. рис. 9) и от 6 до 24 ч (см. рис. 10), затем клетки лизировали и анализировали наличие NR1- и NR2Bсубъединиц NMDA-рецепторов, а также количество 1- и 3-субъединиц Na/K-ATPазы. В качестве положительного контроля мы использовали тубулин.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что долговременная регуляция с уабаином (1 ч и дольше) вызывает уменьшение количества NMDA-рецепторов в 2 раза, причем изменение NR2B-субъединицы происходит быстрее, нежели NR1-субъединицы NMDA-рецептора. Мы связываем эти данные прежде всего с тем, что в нейрональной клетке представлено несколько изоформ NR2-субъединицы и их изменения зависят друг от друга, однако во всех случаях NR1-субъединица является необходимой для формирования функционального комплекса, поэтому можно с уверенностью сказать, что уабаин вызывает уменьшение количества NMDA-рецепторов.

Рис. 9. Анализ методом Western blotting временной зависимости (6-24 ч) количества NMDA-рецепторов Na/K-ATPазы инкубации клеток с 1М уабаином. А – пример типичного эксперимента, Количественные данные: Б – NR1- и NR2B-субъединицы NMDAрецептора, В – 1- и 3-субъединицы Na/KATPазы. * - соответствует достоверному различию от контроля с p0,05, ** - c p0,01.

Рис. 10. Анализ методом Western blotting временной зависимости (0 - 6 ч) количества NMDA-рецепторов и Na/K-ATPазы при инкубации клеток с 1 М уабаином. А – пример типичного эксперимента, Количественные данные: Б – NR1- и NR2Bсубъединицы NMDA-рецептора, В – 1- и 3субъединицы Na/K-ATPазы. * - соответствует достоверному различию от контроля с p0,05, ** - c p0,01.

Чтобы выявить вовлеченность в данный процесс различных изоформ Na/KATPазы, мы построили концентрационную зависимость падения количества NMDAрецепторов от концентрации уабаина (в диапазоне от 1 нМ до 10 М) через 6 ч инкубации.

Одновременно было проанализировано изменение количества белка -субъединиц Na/KATPазы. В качестве положительного контроля мы измеряли количество тубулина в образцах (см. рис. 11).

Рис. 11. Анализ методом Western blotting концентрационной зависимости количества NMDA-рецепторов и Na/K-ATPазы при инкубации клеток уабаином в течение 6 ч. А – пример типичного эксперимента, Количественные данные: Б – NR1- и NR2Bсубъединицы NMDA-рецептора, В – 1- и 3субъединицы Na/K-ATPазы. * - соответствует достоверному различию от контроля с p0,05, ** - c p0,01.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество NR1-субъединицы изменяется уже при инкубации клеток с уабаином в концентрации 1 нМ и дальнейший прирост его концентрации уже не выявляет существенных изменений.

Изменения количества NR2B-субъединицы в диапазоне концентраций 1-100 нМ носят дозо-зависимый характер, достигая минимального уровня 54%, в дальнейшем прирост концентрации уабаина не влияет на изменение количества NR2B-субъединицы.

Таким образом, можно сделать вывод, что связывание уабаина с уабаин-чувствительной 3-субъединицей Na/K-ATPазы (в диапазоне 1 нМ – 1 М уабаина) приводит к уменьшению количества NMDA-рецепторов, а связывание уабаина с уабаин-резистентной 1-субъединицей (в диапазоне 1 М – 100 М уабаина) не влияет на данный процесс.

Что же происходит с NMDA-рецепторами? Для ответа на этот вопрос мы провели иммуноцитохимическое исследование, проанализировав распределение NMDAрецепторов в контрольных образцах и в клетках, проинкубированных с 1 М уабаина в течение 90 мин. Из полученных фотографий видно, что NR1-субъединица, обнаруживающаяся в контрольных образцах как в теле нейрона, так и в аксональных отростках, после инкубации клеток с 1 М уабаином перемещается в тело клетки. Таким образом, можно сделать вывод, что при взаимодействии уабаина с 3-субъединицей Na/KATPазы происходит интернализация субъединиц NMDA-рецепторов в тело клетки, а впоследствии и деградация (что отражает уменьшение общего количества белка, полученное нами при помощи Western blotting).

Влияние NMDA-рецептора на активность Na/K-ATPазы Охарактеризовав влияние ингибирования Na/K-АТPазы на функциональные свойства NMDA-рецепторов, мы решили оценить значение активации NMDA-рецепторов для активности Na/K-ATPазы. Вначале мы построили концентрационную зависимость активности Na/K-ATPазы от концентрации NMDA (в диапазоне от 5 до 750 М NMDA).

Время инкубации было ранее подобрано в нашей лаборатории, оно составило 30 мин.

Данная зависимость была проанализирована двумя различными путями: оценкой насосной функции Na/K-ATPазы, а также прямым измерением ферментативной функции (см. рис. 12).

Оказалось, что активация NMDA-рецепторов при помощи NMDA в концентрациях свыше 0,1 мМ приводит к дозо-зависимому снижению активности Na/K-ATPазы. Таким образом, было выявлено наличие классического механизма обратной регуляции – при больших токсических концентрациях лиганда происходит ингибирование Na/K-ATPазы.

Следующей нашей задачей стало установить возможный механизм ингибирования Na/K-ATPазы. Для этого мы преинкубировали клетки с D-AP5 (специфический блокатор NMDA-рецепторов), BAPTA (хелатор протеинкиназы С), так как из литературы известно, что активация NMDA-рецепторов приводит к входу в клетку ионов Ca2+ и последующей активации различных Ca-зависимых протеинкиназ, среди которых есть протеинкиназа С, способная фосфорилировать Na/KATPазу и приводить к снижению ее активности. Затем мы инкубировали клетки с NMDA, затем пятикратно замораживали-оттаивали, затем проводили ферментативную реакцию и определяли нарастание в пробах неорганического фосфата (см. рис. 13).

Оказалось, действие NMDA снимается преинкубацией клеток с BAPTA или хелеритрином. Таким образом, мы заключили, что ингибирование Na/K-ATPазы, Рис. 14. Предполагаемый механизм ингибирования активности Na/K-ATPазы при инкубации клеток с 0,5 мМ NMDA протеинкиназу С, способную фосфорилировать Na/K-ATPазу и снижать ее активность (см. рис. 14). Аналогичные примеры были известны из литературы (Лопина, 2001). Таким образом, данный процесс реализуется не за счет «белок-белковых» взаимодействий между Na/K-ATPазой и NMDA-рецептором, а является сложным результатом регуляции через ряд посредников.

Рис. 15. Кривые ингибирования Na/K-ATPазы, полученные при инкубации клеток без лигандов, с NMDA (0,5 мМ) и c NMDA + D-AP5 (10 М) Нашей следующей задачей стало выяснение того, какая изоформа фермента ингибируется при действии NMDA. Для этого нами были проведены эксперименты, позволяющие построить кривую ингибирования Na/K-ATPазы уабаином, полученную при помощи «ферментативного» подхода после пятикратного замораживания-оттаивания клеток, и оценить влияние на ход кривой преинкубации клеток с NMDA или с NMDA+DAP5, проведенной до стадии разрушения клеток (см. рис. 15).

Из литературы известно, что уабаин-чувствительная 3-субъединица Na/K-ATPазы ингибируется при действии на нее уабаина в диапазоне концентраций от 1 нМ до 1 М. Из рис. 17 видно, что действие NMDA (как индивидуальное, так и совместно c D-AP5) не приводит к существенному изменению активности 3-субъединицы, - в обоих случаях она составляет 30-35% от общей активности Na/K-ATPазы в контрольных образцах. Уабаинрезистентная 1-изоформа ингибируется в диапазоне концентраций от 1 М до 1 мМ. Из полученного графика видно, что в контроле активность этой субъединицы составляла 70% от активности Na/K-ATPазы в контроле, при инкубации клеток с NMDA она снижается до 25% от общей активности фермента в контроле (снизив, таким образом, свою активность на 45% по сравнению с активностью 1-субъединицы в контроле). При этом D-AP предотвращает действие NMDA, и активность 1-субъединицы составляет до 70% от общей активности Na/K-ATPазы (то есть величину, примерно равную той, что имелась в контроле).

Таким образом, нами был сделан вывод, что инкубация клеток с NMDA приводит к ингибированию 1-субъединицы и этот процесс опосредован входом ионов Ca2+ при открытии ионного канала NMDA-рецептора и активации протеинкиназы С, способной фосфорилировать 1-субъединицу Na/K-ATPазы и приводить к снижению ее активности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До 50% АТР всей клетки тратит для своей работы Na/K-ATPаза в нервной ткани.

Одной из функций, выполняемой Na/K-АТРазой в гранулярных клетках мозжечка крысы, является регуляция работы NMDA-рецепторов. Действие кардиотонических стероидов, которые были найдены в мозге, способно влиять на функциональные свойства NMDAрецептора через две изоформы -субъединицы Na/K-ATPазы. Если взаимодействие уабаина с уабаин-чувствительной 3-субъединицей приводит к долговременной регуляции NMDA-рецептора и вызывает уменьшение молекул NMDA-рецептора в нейрональных клетках, то связывание уабаина с уабаин-резистентной 1-субъединицей приводит к кратковременной регуляции NMDA-рецептора и приводит к тирозиновому фосфорилированию NR2-субъединицы и усилению функции NMDA-рецептора. В свою очередь, активация NMDA-рецепторов приводит к ингибированию 1-субъединицы Na/KATPазы. Общая схема полученных результатов представлена на рис. 16.

В последние годы в различных лабораториях независимо было показано, что Na/KATPаза играет ключевую роль в поддержании внутриклеточных сигнальных процессов в нейрональных клетках. Так, мутации в 3-субъединице приводили к развитию эпилепсии у мышей. Недавние исследования выявили, что агрин (белок, синтезирующийся исключительно в ЦНС) способен специфически связываться с 3-субъединицей, вызывая при этом те же эффекты, что и уабаин (Hilgenberg et al., 2006).

Чаще всего в литературе обсуждается вопрос о том, что взаимодействие уабаина с Na/K-АТРазой может включать различные сигнальные пути в нервной клетке. При этом упор в обсуждении делается на то, какие факторы являются специфическими или неспецифическими сигнальными молекулами для этого фермента (КТС, белки-партнеры или, возможно, неблагоприятные условия, например, недостаток АТР). Реже обращаетсявнимание на вероятность обратных взаимоотношений – невозможность развития сигнальных механизмов в нейроне в условиях активной Na/K-ATPазы. Этот аспект открывает совершенно новую страницу в изучении функции данного фермента и еще требует своего осмысления.

Так или иначе, результаты, полученные в нашей работе, представляются существенными для теоретической нейрохимии, так как они свидетельствуют о том, что организм способен через регулировать работу NMDA-рецепторов, играющих ключевую роль в синаптической пластичности и молекулярной памяти.

Рис. 16. Общая схема полученных результатов. Темными стрелками обозначено действие уабаина, светлыми – действие NMDA.

ВЫВОДЫ

Методами ко-иммунопреципитации и иммуноцитохимии показано структурное взаимодействие между 1- и 3-субъединицами Na/K-АТPазы и NMDA-рецептором.

Показано, что связывание уабаина с 3-субъединицей Na/K-АТPазы приводит к активации ERK, а связывание уабаина с 1-субъединицей Na/K-АТPазы приводит к активации Akt. NMDA-рецепторы не принимают участие в данных процессах.

Показано, что инкубация клеток с 1 М уабаина приводит к фосфорилированию NR2B-субъединицы обеспечивающему увеличение входа Са2+ в нейрональную клетку.

Долговременная инкубация (более 1 ч) гранулярных клеток мозжечка с низкими концентрациями уабаина ведет к деградации NMDA-рецепторов, что отражает участие 3субъединицы Na/K-АТPазы в регуляции стабильности NMDA-рецепторов.

Показано, что активация NMDA-рецепторов в гранулярных клетках ведет к ингибированию 1-субъединицы Na/K-АТPазы через увеличение внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ и активацию протеинкиназы С.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аккуратов Е.Е., Карпова Л.В., Болдырев А.А. (2008). Значение конформационного состояния Na/K-АТФазы для ее устойчивости к окислению. Нейрохимия 25(1-2), 146-149.

2. Карпова Л.В., Аккуратов Е.Е., Булыгина Е.Р., Болдырев А.А. (2008). Уабаинчувствительная и уабаин-резистентная изоформы Na,K-ATPазы гранулярных клеток мозжечка регулирует активность МАР-киназы. Биол. мембраны 25(2): 131–136.

3. Карпова Л.В., Аккуратов Е.Е., Бродская О.М., Болдырев А.А. (2010). Na-насос и внутриклеточные сигнальные механизмы. Биофизика 55 (6), 1022-1029.

1. Boldyrev A.A., Bulygina E.R., Karpova L.V., Akkuratov E.E. (2007). Involvement of different conformers of the neuronal Na,K-pump in cell signaling. 7th Int. Conf. on AAA proteins. England. Poster 10.

2. Аккуратов Е.Е. (2008). Исследование функционального взаимодействия между NMDA-рецепторами и Na/K-АТРазой в нейронах мозжечка. Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛомоносовМосква, с. 28.

3. Akkuratov E.E., Karpova L.V., Boldyrev A.A. (2008). K- and Na- conformers of Na/KATPase demonstrate different stability toward oxidation.

Abstract

of the 12th International ATPase Conference “Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Mechanisms, and Roles in Health and Disease”, August 2008, Aarhus, Denmark, p. 123.

4. Akkuratov E.E., Karpova L.V., Boldyrev A.A. (2009). Rat brain Na,K-ATPase is a sensor of oxidative stress. 2nd Int. Workshop on expression, structure and function of membrane proteins, September 20-24, 2009, Florence, Italy, p. 93.

5. Akkuratov E., Karpova L., Liu L., Boldyrev A. (2011). Functional interaction between Na/KATPase and NMDA-receptor. Abstract of the 13th International ATPase Conference “Na/KATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine”, September 2011, Pacific Grove, USA, p. 157.

6. Wu J., Akkuratov E., Gable M., Miller C., Liu L. (2011). Ouabain-induced Src-indendent PI3K/Akt pathway in mouse embryonic fibroblast cells. Abstract of the 13th International ATPase Conference “Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine”, September 2011, Pacific Grove, USA, p. 156.

7. Boldyrev A., Brodskaya O., Akkuratov E., Karpova L. (2011). Na/K-pump and cell signaling. Abstract of the 13th International ATPase Conference “Na/K-ATPase and Related Transport ATPases of P-type: Structures, Biology and Medicine”, September 2011, Pacific Grove, USA, p. 47.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Bersier MG et al., (2008). Neurochem. Res., 33(1): 66-72.

2. Clapcote SJ et al., (2009). Proc. Natl. Acad Sci U S A, 106(33): 14085-14090.

Hilgenberg LG et al., (2006). Cell, 125(2): 359-369.

4. Kometiani, P. et al., (1998). J. Biol. Chem., 273: 15249–15256.

5. Rose EM et al., (2009). J. Neurosci., 29(25): 8143-8155.

6. Salter MW, Kalia LV. (2004). Nat. Rev. Neurosci., 5(4): 317-328.

7. Stelmashook E.V. et al., (1999). FEBS Letters, 456: 41-44.

8. Tian J et al., (2006) Mol. Biol. Cell., 17(1): 317-326.

9. Xie, Z. et al., (1999). J.Biol.Chem., 274: 19323–19328.

10. Zhang D et al., (2009). J Neurosci., 29(14): 4498-4511.

11. Zhou, X. et al., (2001). Biochem. Biophys. Res. Commun., 285: 46-51.

12. Булыгина Е.Р. и соавт., (2002). Биохимия, 67, 1209-1214.

13. Лопина О.Д. (2001). Биохимия, 66 (10): 1122-

 
Похожие работы:

«Сидоренко Марина Леонидовна ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПОЧВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ НА РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ 03.00.27 - Почвоведение 03.00.07 - Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток - 2003 2 Работа выполнена в лаборатории почвоведения и экологии почв Биологопочвенного института ДВО РАН и в лаборатории экологии патогенных бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Научные...»

«МИХАЙЛОВА Валерия Вадимовна Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Д. И.Левицкий Официальные оппоненты : доктор биологических наук С.Ю....»

«Омельченко Галина Валентиновна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТОПОЛЯ ДЕЛЬТОВИДНОГО И ПИЛЕЗИИ МНОГОЦВЕТКОВОЙ В БИОМОНИТОРИНГЕ УРБОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов - на - Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре генетики и в НИИ биологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор педагогических наук, кандидат Научный руководитель : биологических наук,...»

«МЕЙСУРОВА Александра Федоровна БИОМОНИТОРИНГ АТМОСФЕРНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИК СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА ИНДИКАТОРНЫХ ВИДОВ ЛИШАЙНИКОВ (НА ПРИМЕРЕ ТВЕРСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Тверь-2014 1 Работа выполнена на кафедрах ботаники, физической химии и лаборатории спектроскопии ЦКП ФГБОУ ВПО Тверской государственный университет Научный консультант : доктор химических наук,...»

«ШАЙХУТДИНОВА АНАСТАСИЯ АНАТОЛЬЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА И ПРОГНОЗ КАЧЕСТВА АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПРОДУКТАМИ СЖИГАНИЯ ТВЕРДОГО ТОПЛИВА 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань 2010 Работа выполнена на кафедре Теоретические основы теплотехники Казанского государственного технического университета им. А.Н. Туполева. Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Байгалиев Борис...»

«ЕЛИЗАРЬЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИКА ЮЖНОГО УРАЛА OXYTROPIS GMELINII FISCH. EX BORISS. (FABACEAE) В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 2 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности в Учреждении РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный...»

«ПАВЛОВА ЕЛЕНА ПЕТРОВНА ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГО-ФИТОЦЕНОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА НАКОПЛЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В ПЛОДАХ ROSA ACICULARIS LINDLEY И ROSA DAVURICA PALLAS (ЗАПАДНОЕ ЗАБАЙКАЛЬЕ) 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Восточно-Сибирский государственный технологический университет Научный...»

«ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP1 И ELIP2 У Arabidopsis thaliana 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА Официальные оппоненты : доктор...»

«Тукмачева Елена Васильевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА ADENOPHORA FISCHER НА КУЗНЕЦКОМ АЛАТАУ 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2009 Работа выполнена на кафедре ботаники, физиологии растений и растительных ресурсов ГОУ ВПО Томский сельскохозяйственный институт филиал Новосибирского государственного аграрного университета и в лаборатории флоры и растительных ресурсов ОСП НИИ биологии и...»

«НОВИЧОНОК Елена Валентиновна ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ В БИОЦЕНОЗЕ МУССОННОГО ТРОПИЧЕСКОГО ЛЕСА ЮЖНОГО ВЬЕТНАМА 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Петрозаводский государственный университет (кафедра ботаники и физиологии растений,...»

«ФОМИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ВЗАИМОСВЯЗЬ СПЕКТРОВ КОЛЕБАНИЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И КРОВОТОКА ПАЛЬЦЕВ РУК 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Саратов 2013 Работа выполнена на кафедре медицинской физики ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : Заслуженный деятель науки РФ, доктор физико-математических наук, профессор Усанов Дмитрий Александрович Официальные...»

«ЕГОРОВА НАТАЛЬЯ ИВАНОВНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ АГРОФИТОЦЕНОЗА ПИВОВАРЕННОГО ЯЧМЕНЯ В ЮЖНОЙ ЛЕСОСТЕПИ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Омск - 2014 Работа выполнена в Омском государственном педагогическом университете на кафедре экологии и природопользования и в Сибирском научно-исследовательском институте сельского хозяйства (СибНИИСХ) СО РАСХН Научный Юшкевич Леонид Витальевич,...»

«Галицкая Анна Алексеевна ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ WOLFFIA ARRHIZA (L.) К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ 03.02.08 – экология (биология) 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) Научные руководители: доктор...»

«Вагун Илья Владимирович Продукционный процесс и фиторемедиационный потенциал сортов рапса на загрязненных тяжелыми металлами почвах Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре физиологии растений Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Кошкин...»

«Аушев Сергей Викторович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАВИСИМОСТИ ВЛИЯНИЯ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ ПРИРОСТА СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2006 Работа выполнена на кафедре радиотехнологий и экологического мониторинга Томского государственного университета систем управления и радиоэлектроники Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Карташев Александр Георгиевич...»

«БАЗАНОВА Любовь Петровна ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА (YERSINIA PESTIS) И БЛОХ (SIPHONAPTERA) (на примере сибирских природных очагов чумы) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2008 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Антропогенная трансформация ландшафтов, вовлечение территорий природной очаговости чумы в хозяйственную деятельность человека, существующая угроза террористических актов с...»

«Хархун Екатерина Викторовна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТАГОНИЗМА PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AUREOFACIENS ПРИ СОЗДАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО БИОПРЕПАРАТА И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА СОСТОЯНИЕ МИКРОБОЦЕНОЗА ПОЧВЫ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, профессор, Научный...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«ПАНИНА Яна Сергеевна МОДУЛИРОВАНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И ВОСПРИИМЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ 03.00.04 – биологическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическпих наук Москва 2005 2 Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ Ольга Леонидовна Официальные оппоненты...»

«ЗЕЛЕНКИНА Татьяна Савельевна Разнообразие и функциональная активность метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал 03.00.16 – экология 03.00.07– микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 2 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Дагурова Ольга Павловна Научный консультант : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.