WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ГИЛЯРОВ

Александр Владимирович

НЕСТИН В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС

(ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)

03.00.25 — гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Государственном Учреждении Научноисследовательском институте экспериментальной медицины Российской Академии Медицинских Наук

Научный руководитель:

Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор, Отеллин Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Валькович Эрнест Иванович доктор медицинских наук, профессор Пузырев Андрей Анатольевич

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН

Защита состоится «_» января 2009 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. акад. Павлова 12, тел: (812) 234-6868, факс: (812) 234-9489, e-mail: iem@iem.spb.ru).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан «_» _ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор медицинских наук П. А. Дыбан.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Цитоскелет принимает непосредственное участие во всех внутриклеточных процессах.

Одним из важнейших компонентов цитоскелета являются промежуточные филаменты (ПФ). Они создают внутриклеточный каркас, обеспечивают упругость клетки, поддерживают упорядоченность расположения компонентов цитоплазмы, координируют связи между внеклеточным матриксом, цитоплазмой и ядром [Улумбеков, Челышев, 2007]. Несмотря на обширный литературный материал [Herrmann, Aebi, 2000, 2004; Strelkov et al., 2003; Goldman et al., 2008 и др.], посвященный ПФ, остается много нерешенных вопросов. В настоящее время известно более 50 белков промежуточных филаментов, которые разделяют на шесть классов, основываясь на сходстве в их аминокислотной последовательности [Cooper, 1997; Lendahl et al., 1990]. Одним из самых загадочных и малоизученных белков ПФ является нестин.





В настоящее время на нестин возлагаются большие надежды как на иммуноморфологический маркер нейральных стволовых/ прогениторных клеток (НСПК). Для исследования стволовых клеток требуется наличие специфических маркеров, выявление которых необходимо не только для более глубокого понимания нейрогенеза, но и может быть полезным для разработки подходов к лечению различных заболеваний и состояний центральной нервной системы (ЦНС). До настоящего времени не существует маркеров, которые были бы специфичны для НСПК. На роль такого маркера претендует нестин. Однако противоречивые данные разных авторов не дают возможности однозначно считать нестин маркером НСПК.

Нестин был открыт в 1985 г. [Hockfield, McKay, 1985].

Ген нестина был охарактеризован в 1990 г. [Lendahl et al., 1990].

Известно, что нестин активно экспрессируется в клетках головного мозга млекопитающих в эмбриональный период онтогенеза [Hockfield, McKay, 1985; Dahlstrand et al., 1995]. В мозге взрослых животных нестин, напортив, почти не обнаруживается.

Показано, что по мере дифференцировки нервной ткани синтез нестина подавляется [Zimmerman et al., 1994; Lothian, Lendahl, 1997], а в дифференцирующихся астроцитах и нейронах начинают экспрессироваться глиальный фибриллярный кислый белок (GFAP) и белки нейрофиламентов, соответственно. Важно отметить, что при этом недостаточно разработанными остались вопросы о том, когда и в каких клетках происходит смена ПФ. Изучению экспрессии нестина в раннем постнатальном периоде онтогенеза посвящено малое количество работ [Wie et. al., 2002]. Между тем, ранний постнатальный период является очень важным этапом онтогенеза — в этот период происходит адаптация к условиям внеутробной жизни.

В головном мозге млекопитающих в этот период происходит ряд процессов (пролиферация, дифференцировка, миграция и др.), обуславливающих созревание нервной системы. У человека он длится 28 дней после рождения, у крыс — 14 дней.

В ЦНС взрослых млекопитающих нестин в норме обнаруживается только в небольшом количестве клеток в субвентрикулярной зоне боковых желудочков (SVZ) и зубчатой фасции (FD) гиппокампа [Cameron, McKay, 2001; Fukuda et al., 2003;

Ernst, Christie, 2005; Ogita et al., 2005; Zecevic et al., 2005]. Однако при ряде патологических состояний наблюдается повышение экспрессии нестина. Одним из таких состояний является ишемия головного мозга. Ишемия — одно из наиболее распространенных характеризующихся острым развитием очаговой и общемозговой неврологической симптоматики. Появление нестина после ишемии ассоциируют с нейральными стволовыми клетками, предполагая, новообразованными [Sharp et al., 2002; He et al., 2005]. Тем не менее, на настоящее время в литературе нет однозначных данных, подтверждающих эту гипотезу.

Таким образом, изучение нестина актуально и имеет не только фундаментальное, но практическое значение.





Цель исследования: изучение экспрессии нестина в клетках конечного мозга крыс на отдельных этапах онтогенеза и после ишемического воздействия с помощью одного из наиболее совершенных методов — иммуногистохимии. В соответствие с целью исследования были сформулированы следующие задачи:

1. Изучение пространственно-временного распределения клеток, содержащих нестин, в ранний постнатальный период онтогенеза.

2. Характеристика нестин-иммунопозитивных клеток у взрослых интактных животных.

3. Определение морфологических типов и локализации нестиниммунопозитивных клеток после ишемического повреждения ЦНС.

Научная новизна. В настоящем исследовании впервые показаны изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза. Продемонстрирована зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемический период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период.

Теоретическое и практическое значение исследования.

Настоящая работа относится к числу фундаментальных исследований в области нейрогистологии. Полученные данные наглядно демонстрируют, что использование нестина как маркера нейральных стволовых клеток in situ возможно только при соблюдении ряда условий: обязательный учет морфологии и локализации нестиниммунопозитивных клеток, сочетание методов световой и конфокальной микроскопии, использование других маркеров.

Нестин не следует считать специфическим маркером нейральных стволовых клеток. Полученные данные могут быть использованы как при проведении научных экспериментов с применением иммуногистохимических методов, так и в качестве учебных материалов в курсах по нейроморфологии и молекулярной биологии для студентов медицинских и биологических ВУЗов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В пределах мозга существуют региональные различия в экспрессии нестина. Нестин-иммунопозитивные клетки в коре головного мозга и в гиппокампе выявляются на разных стадиях развития нервной ткани.

2. Транзиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах.

3. Нестин не является специфическим маркером нейральных стволовых/прогениторных клеток. Использование нестина, как маркера НСПК, возможно только с учетом морфологии и локализации нестиниммунопозитивных клеток, сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на: XIII Международном совещании и VI школе по эволюционной физиологи (Санкт-Петербург, 2006), V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения — 2006» (Санкт-Петербург, 2006), VIII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Орел, 2006), конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2007), ХХ съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), межинститутской конференции молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды»

(Санкт-Петербург, 2007), IX конгрессе Международной ассоциации морфологов (Бухара, 2008), IV Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008).

Диссертация апробирована на заседании отдела общей и частной морфологии НИИ экспериментальной медицины РАМН (25.09.2008).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 13 печатных работах, в том числе в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 142 с. машинописного текста, содержит введение, четыре главы, основные выводы, 5 таблиц, 63 рисунка и 4 схемы. Список литературы включает 149 источников, из них 21 отечественных и 128 иностранных источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Настоящая работа выполнена на 80 белых лабораторных крысах (Rattus norvegicus). Для исследования экспрессия нестина в ранний постнатальный период онтогенеза материалом служил головной мозг 34 крыс линии Вистар на 1 (n=5), 5 (n=7), 10 (n=8) и 14 (n=14) дни после рождения. В экспериментах с ишемией использовался головной мозг 37 половозрелых беспородных крыс-самцов на различных сроках после ишемии: 1 неделя (n=14), 2 недели (n=12) и 1 месяц (n=11).

В качестве контроля использовалось 9 половозрелых беспородных крыс, которые были разделены на две группы. Группа (n=3) — половозрелые интактные животные. Группа 2 (n=6) — половозрелые ложнооперированные крысы (без пережатия сосудов).

Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли с учетом «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Для изучения нестина в клетках ЦНС после ее поражения была выбрана упрощенная 2-х сосудистая модель общей ишемии головного мозга. Эта модель была разработана в Eklof и Siesjo в 1972 году [Eklof and Siesjo, 1972], и заключается во временном пережатии на 40 минут обеих общих сонных артерий и последующей реперфузией.

Для окраски срезов использовали гематоксилин, астровый синий и метод Ниссля.

и типоспецифических маркеров разных клеток применялся метод иммуногистохимии. Использовались первичные антитела к нестину (клон Rat-401, BD Pharmingen, США), маркеру астроцитов — глиальному фибриллярному кислому белку (GFAP, поликлональные, Dako, США), белку ПФ, с которым нестин образует гетерополимеры — виментину (клон V9, Immunon, США), маркеру зрелых нейронов пролиферирующих клеток антигену PCNA (клон PC-10, Dako, США).

Для выявления первичных антител были использованы 1 или 2-х ступенчатый (авидин-биотиновый) методы. Для визуализации пероксидазы использовали хромоген DAB+ (Dako, США).

Конфокальная микроскопия в настоящем исследовании использовалась для трехмерной реконструкции некоторых клеток с целью проследить ход их отростков, а также для изучения колокализации двух антигенов в пределах одной клетки.

Исследования проводили на конфокальном лазерном микроскопе LSM5 Pascal и Leica TCS SPE.

Фотографирование осуществлялось с помощью светового микроскопа Leica DM1000 и цифровой камеры DFC280 (Leica) и конфокальных микроскопов.

иммуногистохимической реакции использовали относительную шкалу интенсивности иммунной реакции [Wie et al., 2002]. Реакцию определяли как высоко интенсивную (+++), средней интенсивности (++), низкой интенсивности (+), отрицательную (–).

Измерения и подсчет клеток производились с помощью прилагающегося программного обеспечения Leica Application Suite и программы ImageJ 1.38. Часть изображений обрабатывалась в графическом редакторе Adobe Photoshop CS2 version 9.0.

Результаты исследования и их обсуждение Экспрессия нестина в конечном мозге крыс в ранний Первый день постнатального развития На первый день постнатального развития (P1) нестиниммунопозитивные (нестин+) клетки обнаруживаются в различных областях головного мозга. В двигательной коре больших полушарий направленными маловетвящимися отростками, клетки, в которых видны фигуры митоза, а также мигрирующие нестин+ клетки (клетки с “локомоторной” [по Borrell et al., 2006] морфологией: короткий лидирующий отросток, оканчивающимся структурой подобной конусу роста). Большое скопление нестин+ клеток имеется в SVZ боковых желудочков мозга (рис. 1а). В SVZ реакцию на нестин дают клетки обоих ее слоев: эпендимного и субэпендимного (SubE).

От эпендимоцитов отходят длинные отростки, направляющиеся в белое вещество. В SubE располагаются нестин+ радиальные глиоциты, пролиферирующие и мигрирующие клетки. Другой формацией мозга, где наблюдается выраженная реакция на нестин, является гиппокамп (рис. 2а). Во всех слоях гиппокампа, кроме str. pyramidale, выявляются делящиеся нестин+ клетки и отростчатые нестин+ клетки со сложным ветвлением. В str. pyramidale обнаруживаются лишь радиально направленные отростки и тела биполярных клеток. В области формирующейся зубчатой фасции встречаются единичные нестин+ клетки округлой и звездчатой формы.

Виментин на Р1 выявляется в тех же областях, что и нестин.

В двигательной коре обнаруживаются округлые, мигрирующие и звездчатые виментин-иммунопозитивные (виментин+) клетки и волокна, переходящие в белое вещество. Схожесть размеров и направления волокон, содержащих виментин, с волокнами, содержащими нестин, позволяет сделать предположение, что промежуточные филаменты в этих волокнах состоят из виментиннестиновых гетерополимеров. В SVZ боковых желудочков мозга окрашиваются эпендимоциты и клетки SubE, имеющие длинные маловетвящиеся радиально направленные отростки (рис. 1б).

В SVZ на этом сроке иммунная реакция на виментин наиболее выраженная (табл. 1). В гиппокампе, напротив, определяются только единичные клетки с небольшим количеством отростков (рис. 2б).

Выраженность иммуногистохимической реакции на нестин, виментин и GFAP на различных сроках раннего постнатального периода онтогенеза На сроке P1 реакция на GFAP выражена слабо. Встречаются немногочисленные GFAP-иммунопозитивные (GFAP+) клетки в SVZ (рис. 1в). Единичные GFAP+ клетки также можно увидеть в str. moleculare гиппокампа (рис. 2в). В других областях мозга GFAP не выявляется.

Пятый день постнатального развития На 5-й день постнатального развития (P5) в двигательной коре головного мозга можно увидеть большое количество нестин+ клеток с радиально направленными отростками, а также безотростчатых клеток на различных стадиях митоза. По-прежнему интенсивная реакция на нестин выявляется в SVZ боковых желудочков мозга (рис. 1г): нестин+ эпендимоциты с длинными отростками, радиально расходящимися от желудочков вглубь мозга и клетки в SubE.

Выраженная иммуногистохимическая реакция имеет место в гиппокампе (рис. 2г), где определяются множественные клетки с большим количеством обильно ветвящихся отростков. Встречаются нестин+ делящиеся клетки. В str. pyramidale, кроме радиальных отростков, в отличие от P1, наблюдаются нестин+ клетки округлой и звездчатой формы.

На P5 общая интенсивность иммуногистохимической реакции на виментин снижается (табл. 1). В двигательной коре головного мозга обнаруживается небольшое количество тонких волокон и редкие виментин+ клетки. По всей вероятности это сохраняющиеся нестин-виментин-иммунопозитивные волокна радиальных глиоцитов или же отростки мигрирующих нейробластов. В SVZ боковых желудочков мозга при выявлении виментина окрашивается вся эпендима и большинство клеток SubE (рис. 1д). По-прежнему сохраняется множество виментин+ клеток в SVZ, имеющих радиально направленные отростки. В гиппокампе относительно предыдущего срока выявляется больше виментин+ клеток с обильноветвящимися отростками. В str. pyramidale обнаруживались лишь единичные волокна и редкие виментин+ клетки (рис. 2д).

К P5 в двигательной коре головного мозге появляются первые астроцито-подобные, а также похожие на мигрирующие клетки, дающие положительную реакцию на GFAP. В SVZ боковых желудочков GFAP+клетки локализуются преимущественно в латеральной части (рис. 1е).

Здесь кроме мигрирующих клеток и части эпендимоцитов GFAP выявляется в отдельных радиально направленных отростках.

В гиппокампе GFAP+ клетки по сравнению с предыдущим сроком представлены более широко: появляются единичные звездчатые клетки в области гиппокампальной фиссуры (рис. 2е). Большинство эпендимоцитов III желудочка GFAP-иммунопозитивны. Также GFAP появляется в SubE в клетках, образующих периваскулярные отростки.

В других областях головного мозге GFAP не обнаруживается.

Таким образом, на сроках P1 и P5 в двигательной коре полушарий головного мозга и SVZ сохраняются нестин и виментин иммунопозитивные клетки, которые являются либо радиальными глиоцитами, либо радиально мигрирующими из SVZ клетками с “локомоторной” морфологией, часть из которых на сроке P начинает экспрессировать GFAP. А к моменту окончательного формирования гиппокампа (P5) выраженность иммунной реакции на нестин и виментин максимальна; появляются первые GFAPиммунопозитивные астроциты.

Десятый день постнатального развития иммуногистохимической реакции на нестин (табл. 1). В двигательной коре головного мозге выявляются тонкие нестин+ волокна с бусовидными утолщениями. В SVZ боковых желудочков реакцию на нестин дают некоторые эпендимоциты и часть клеток SubE (рис. 1ж).

В гиппокампе основная масса нестин+ клеток располагается в str. oriens и str. radiatum зоны CA1 и str. moleculare и hilus FD (рис. 2ж).

Иммуногистохимическая реакция на виментин, как и нестин, В двигательной коре головного мозга виментин+ клетки практически не выявляются — только тонкие бусовидные волокна. Сохраняется иммунореактивность эпендимы боковых и III желудочков (рис. 1з).

В SubE виментин не выявляется. В гиппокампе определяются отдельные звездчатые клетки и большое количество их отростков срезанных поперечно (рис. 2з).

На P10 реакция на GFAP становится интенсивнее по сравнению с предыдущими сроками (табл. 1). Выявляется большое количество мигрирующих и звездчатых клеток в белом веществе. Окрашиваются некоторые эпендимоциты и часть клеток SubE (рис. 1и).

В гиппокампе (рис. 2и), как и на P5, GFAP+ клетки представлены редкими отросчатыми клетками, расположенными преимущественно str. moleculare гиппокампа.

Четырнадцатый день постнатального развития На 14-й день постнатального развития (P14) интенсивность иммунной реакции на нестин еще больше уменьшается относительно предыдущего изучаемого срока. В двигательной коре головного мозга можно проследить редкие тонкие радиально направленные отростки;

встречаются и единичные звездчатые нестин+ клетки. В эпендимоцитах (рис. 1к) уже не определяются длинные отростки, направленные к поверхности коры больших полушарий. В SubE иногда можно видеть округлые нестин+ клетки и клетки с короткими отростками.

В гиппокампе (рис. 2к), как и на предыдущих сроках, нестин+ клетки располагались во всех слоях кроме str. pyramidale, однако наибольшее их количество располагается в области FD. В большинстве своем это отростчатые клетки, напоминающие по форме астроциты.

К P14 выраженность иммуногистохимической реакции на виментин также значительно уменьшается (табл. 1). Виментин выявляется только в эпендимоцитах и клетках, SubE прилегающих к эпендиме (рис. 1л). Кроме того, в гиппокампе преимущественно в области зубчатой фасции можно увидеть звездчатые виментин+ клетки с большим количеством отростков (рис. 2л).

На P14 наблюдаются типичные GFAP+ астроциты в области соответствующей переднему миграционному пути, stria terminalis и во всех слоях гиппокампа (кроме str. pyramidale) (рис. 2м).

и разнонаправленные отростки клеток SubE (рис. 1м). Четко определяются периваскулярные отростки астроцитов.

На всех изученных сроках раннего постнатального периода онтогенеза нестин выявлялся в клетках, образующих стенку капилляров мозга.

Учитывая данные J. Dahlstrand [Dahlstrand et al., 1995] о связи экспрессии нестина с митотической активностью клеток следует заключить, что сразу после рождения такие области головного мозга как двигательная кора больших полушарий, гиппокамп и SVZ боковых желудочков еще не сформированы и там продолжаются такие процессы как пролиферация, миграция и дифференцировка.

Другие области головного мозга к этому периоду уже сформированы, поэтому там нестин и не выявляется. Таким образом, полученные нами данные показывают, что проградиентное снижение синтеза нестина в ранний постнатальный период онтогенеза (P1–P14) связанно со степенью зрелости структур мозга.

Кроме того, на основании полученных нами данных можно сделать вывод, что существующая связь между экспрессией нестина и нейроногенезом различна в различных формациях мозга.

Так в двигательной коре головного мозга нестин+/виментин+/GFAP– клетки (предположительно нейробласты) выявляются на этапе формирования коры, а затем исчезают, а гиппокампе, напротив, нестин+/виментин+/GFAP– клетки (предположительно глиобласты) появляются на этапе глиогенеза, когда нейронные слои уже сформированы.

Рис. 1. Субвентрикулярная зона боковых желудочков мозга крысы.

P1, P5, P10, P14 — дни постнатального онтогенеза. Иммуногистохимическая реакция на нестин (а, г, ж, к); виментин (б, д, з, л); GFAP (в, е, и, м) с подкраской квасцовым гематоксилином. Масштабный отрезок — 50 мкм.

Рис. 2. Гиппокамп крысы. P1, P5, P10, P14 — дни постнатального онтогенеза. Условные обозначения: CA1 — зона гиппокампа CA1, FD — зубчатая фасция. Иммуногистохимическая реакция на нестин (а, г, ж, к); виментин (б, д, з, л); GFAP (в, е, и, м) с подкраской квасцовым гематоксилином. Масштабный отрезок 50 мкм.

Рис. 3. Участки конечного мозга крыс в контроле (а) и через 2 недели после транзиторной общей ишемии (б–л). Изменения в гиппокамне (б, в, е, и), двигательной коре (г, ж, к) и субвентрикулярной зоне боковых желудочков (д, з, л). Стрелками обозначено изчезновение пирамидных нейронов СА1 зоны гиппокампа. Окраска:

толуидиновый синий по Нисслю (а, б), иммуногистохимическая реакция на нестин (в, г, д), виментин (е, ж, з) и GFAP (и, к, л) с подкраской квасцовым гематоксилином. Масштабный отрезок: а, б, г, е, и, к — 200 мкм, ж, з, л — 100 мкм, в, д — 20 мкм.

Рис. 4. Колокализация нестина с GFAP. Зеленый сигнал — нестин (фуоресцеина изотиоцианат), красный — GFAP (тетраметилродамин изотиоционат), пурпурный — ядра клеток (флуоресцентный аналог краситель Ниссля NeuroTrace). — нестин-иммунопозитивная/ GFAP-иммунонегативная клетка. Масштабный отрезок — 50 мкм.

Как показали наши исследования, у половозрелых контрольных животных в большинстве участков мозга в клетках нервной ткани нестин не экспрессируется, что соответствует данным других авторов. Слабоположительную реакцию на нестин дают эндотелиоциты капилляров. В SVZ пролиферативной зоне конечного мозга встречались единичные нестин+ клетки.

В пролиферативной зоне гиппокампа (FD) клетки, содержащие нестин, в отличие от данных S. Fukuda с соавт. [Fukuda et al., 2003] нами обнаружены не были. В тоже время J. Dahlstrand (1995) указывает на то, что FD мРНК также нестина не определяется.

Отсутствие реакции на нестин можно объяснить наличием в FD пролиферативно-немой зоны [Melvin et al., 2007]. Однако подобная разница в результатах не может трактоваться однозначно, т. к. эксперименты проводились с использованием различных методов, а, следовательно, необходимо проведение дополнительного исследования.

Виментин экспрессируется во всех эпендимоцитах, в области латеральной стенки боковых желудочков в клетках SubE, а также арахноэндотелиоцитами, клетками, формирующими поверхностную глиальную мембрану, в клетках стенок кровеносных сосудов и в единичных астроцитах.

Иммуногистохимическую реакцию на GFAP в контроле дают типичные астроциты, расположенные во всех областях конечного мозга. В SVZ эпендимоциты GFAP-иммунонегативны, тогда как клетки SubE, напротив, дают положительную иммунную реакцию на GFAP.

половозрелых животных после ишемии В проведенных нами экспериментах транзиторная общая ишемия головного мозга приводила к дегенерация пирамидных нейронов гиппокампа, преимущественно зоны CA1 (рис. 3б). Иногда очаги деструкции локализовались двигательной коре головного мозга ипсилатерально очагу поражения в гиппокампе.

Ишемия головного мозга приводит к появлению нестин+ клеток как в области поражения (рис. 3в, г), так и вне его (рис. 3г). Через неделю после ишемического поражения головного мозга в клетках, находящихся в области поражения обнаруживается выраженная иммуногистохимическая реакция на нестин.

По своей морфологии (наличие длинных разветвленных отростков, формирование частью отростков периваскулярных “ножек”; рис. 3в) эти клетки могут быть идентифицированы как астроциты, что доказывается данными, полученными с помощью конфокальной лазерной микроскопии (рис. 4).

Встречаются также морфологически неидентифицируемые митотически делящиеся клетки. В гиппокампе нестин+ клетки располагаются преимущественно на месте погибших нейронов (рис. 3в). В двигательной коре головного мозга нестин+ клетки располагаются диффузно вокруг очага ишемического инфаркта (рис. 3г).

Результаты наших экспериментов свидетельствуют о зависимости экспрессии нестина от времени прошедшего после ишемии. Через неделю после пережатия сосудов в очаге появляется большое количество нестин-иммунопозитивных клеток; затем экспрессия нестина увеличивается, достигая пика к 2 неделям, и снижается к 4-м неделям. Сходная динамика описана в работе Y. Li и M. Chopp [Li, Chopp, 1999]. Интересно, что количество пролиферирующих клеток в гиппокампе после общей ишемии также сначала увеличивается, а затем снижается [Sharp et al., 2002].

Принимая во внимание, что регуляция функций нестина осуществляется посредством преимущественно cdc2-киназы, способствующей переходу из G2 в M фазу клеточного цикла [Sahlgren et al., 2001], можно сделать предположение, что, по крайней мере, часть нестин+ клеток в гиппокампе после ишемии есть клетки новообразованные.

В SVZ интенсивность реакции на нестин при ишемическом поражении увеличивается (рис. 3д). Через 1 неделю после повреждения часть эпендимоцитов, выстилающих боковые и III желудочки мозга обнаруживают иммунную реакцию на нестин.

На 2-х недельном сроке положительную реакцию на нестин дают уже все эпендимоциты и большинство клеток в SubE. Учитывая, что, во-первых, ишемия головного мозга приводит к увеличению интенсивности реакции на нестин и GFAP сначала в SubE, а затем и в эпендимном слое, во-вторых, по данным экспрессии маркера пролиферации PCNA, новые клетки образуются также сначала в субэпендиме, а затем и в эпендимном слое, в-третьих, по представлениям А.А. Стадникова с соавт. [Стадников, Шевелюк, 2006] основную роль в восстановлении утраченных клеток играют не стволовые клетки, а клетки значительно большей дифференцированности, в-четвертых, противоречия в данных различных авторов о локализации нейральных стволовых клеток в SVZ [см. обзор Викторов, 2001], можно предположить следующее.

В эпендимном слое существует популяция стволовых клеток, которые в покое не делятся. В субэпендиме располагаются прогениторные клетки. Ишемия приводит к активации прогениторных клеток. Однако, вероятно, если их потенциала не хватает для полного восстановления, то задействуются и стволовые клетки.

Мы отдаем себе отчет в том, что высказанное предположение о происхождении и дифференцировке клеток ЦНС во многом базируется на логических построениях и нуждается в специальном экспериментальном подтверждении.

Нестин как маркер нейральных стволовых клеток На основании полученных нами данных можно сделать вывод, что нельзя любые нестин+ клетки однозначно считать стволовыми.

При применении наиболее совершенного из существующих методов выявления колокализации двух (и более) антигенов — конфокальной лазерной микроскопии — можно заключить, что в большинстве своем нестин экспрессируется в астроцитах. На рис. 4 видно, что реакция на нестин является в тех же клетках, что и реакция на GFAP. При этом степень колокализации двух белков ПФ различна. Однако выявляются и нестин-иммунопозитивные/GFAP-иммунонегативные клетки (на рис. 4 отмечена стрелкой). Не смотря на то, что в указанной на рис. 4 клетке мы наблюдаем реакцию на GFAP, выраженность этой реакции не достаточна (расчет степени колокализации производился с помощью программы Leica Appication Suite со специальным плагином), чтобы можно было говорить о колокализации нестина и GFAP. По своей морфологии (размеры, отросчатая форма) их сложно отнести к нейронам или олигодендрогии. Также нельзя сказать, что это клетки сосудистой стенки, мигрирующие клетки или радиальные глиоциты. Поэтому нами высказывается предположение, что эти нестин+/GFAP– клетки есть низкодифференцированные предшественники астроцитов (судя по отростчатой форме), хотя не исключено, что и предшественники нейронов.

Взаимодействие нестина с другими белками Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в ранний постнатальный период онтогенеза в клетках нервной ткани происходит смена профиля промежуточных филаментов: вместо виментина появляется GFAP. Такая перестройка ПФ происходит при непосредственном участии нестина. Известно, что ПФ в большинстве своем являются гетерополимерами, т. е. в их состав входят различные белки [Herrmann, Aebi, 2000].

В частности, нестин всегда кополимеризуется с твиментином [Herrmann, Aebi, 2000] или другими белками ПФ III класса, например, GFAP [Wie et al., 2002; Гиляров, Шмонин, 2007].

В соответствие с современными представлениями [Chou et al., 2003;

Michalczyk, Ziman, 2005] нестин рассматривается как интегратор различных компонентов цитоскелета, необходимый для перестройки цитоплазматических компартментов делящихся и мигрирующих клеток. Кроме того, известно, что нестин участвует в транспортировке мономеров виментина [Michalczyk, Ziman, 2005].

Сопоставляя многочисленные данные, можно предположить следующий механизм изменения состава ПФ. В эмбриогенезе в малодифференцированных клетках нервной ткани ПФ состоят из виментина и нестина. При этом нестин взаимодействует с другими компонентами цитоскелета, обуславливая возможность перестройки ПФ при делении и миграции. Во время митоза происходит фосфорилирование обоих белков cdc2-киназой [Chou et al., 2003], что приводит к диссоциации виментиновых филаментов. Новообразованные клетки, вступив на путь дифференцировки, начинают экспрессировать типоспецифические белки ПФ (GFAP, например). А роль нестина заключается в транспортировке белков ПФ (составляющих с ним гетеродимеры).

Кроме того, нестиновые ПФ могут являться матрицей, на которой происходит смена одного белка ПФ на другой. Иллюстрацией к высказанным предположениям являются клетки субэпендимного слоя, которые сразу после рождения имеют следующий иммуногистохимический профиль — ПФ состоят из виментина и нестина, но не GFAP (нестин+/виментин+/GFAP–), изменяющийся в процессе дифференцировки на и, наконец, у взрослых животных — GFAP+/нестин–/виментин–.

Схематично:

Транзиторная общая ишемия головного мозга также приводит к изменению состава ПФ в клетках конечного мозга крыс. В области поражения (гиппокамп и кора головного мозга) через 1–2 недели реперфузии появляется множество активированных астроцитов (рис 3и, к), ПФ которых наряду с GFAP, содержат нестин и виментин (рис. 3е, ж). В ответ на ишемическое повреждение в SVZ эпендимоциты начинают синтезировать нестин (рис. 3д) и GFAP (рис. 3л), а затем снова становятся виментин+/нестин–/ GFAP–. Клетки SubE изменяют свой состав ПФ следующим образом:

из GFAP+/нестин–/виментин– они становятся виментин+/нестин+/ GFAP+, а в отдаленный период после ишемии профиль белков ПФ в клетках SubE снова изменяется и они снова становятся GFAP+/нестин–/виментин–.

Схематично:

Таким образом, изменения в составе ПФ в ранний постнатальный период онтогенезе аналогичны изменениям в отдаленные сроки после ишемии.

Таким образом, в настоящей работе нами получены новые данные об экспрессии белка промежуточных филаментов нестина клетками конечного мозга на отдельных этапах онтогенеза и после ишемического воздействия.

Изучено пространственно-временное распределение клеток, содержащих нестин, в ранний постнатальный период онтогенеза, и показано, что существует зависимость экспрессии нестина от фазы развития формаций мозга, степени зрелости структур. Кроме того, продемонстрированы изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в ранний постнатальный период онтогенеза.

Определены морфологические типы и локализация нестин+ клеток после ишемического повреждения ЦНС и установлено, что транзиторная общая ишемия головного мозга приводит к индукции синтеза нестина преимущественно в астроцитах в очаге поражения и вне его. Проведен сравнительный анализ изменения профиля белков ПФ в клетках конечного мозга крыс в постишемический период с изменениями, имеющими место в ранний постнатальный период и установлен факт, что эти изменения носят сходный характер.

В соответствии с полученными данными можно заключить, что необходимо дальнейшее изучение нестина. Остается недоказанным предположение о том, что нестин+ клетки в гиппокампе являются глиобластами, а в коре головного мозга — нейробластами. Также необходимо уточнить направление дифференцировки выявленных нестин+/GFAP– клеток после ишемии головного мозга. Кроме того, еще предстоит выяснить, действительно ли в эпендимном слое боковых желудочков располагаются стволовые клетки, а в SubE — пролиферирующие клетки-предшественники.

Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ 05-04-49397.

ВЫВОДЫ

1. В ранний постнатальный период онтогенеза нестин экспрессируется в коре головного мозга, гиппокампе, субвентрикулярной зоне боковых желудочков в радиальных глиоцитах, астроцитах, низкодифференцированных делящихся и эндотелиоцитах. По мере созревания нервной ткани в конечном мозге крыс происходит снижение экспрессии нестина.

2. У взрослых интактных животных нестин экспрессируется в клетках субэпендимной области субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга, менингоцитах, эндотелиоцитах.

3. После транзиторной общей ишемии головного мозга нестин экспрессируется в астроцитах в очаге поражения, клетках субэпендимного слоя субвентрикулярной зоны боковых желудочков мозга, эпендимоцитах, неидентифицируемых нестин-иммунопозитивных/GFAP-иммунонегативных клетках, эндотелиоцитах, менингоцитах.

4. В центральной нервной системе популяция нестиниммунопозитивных клеток гетерогенна как в раннем постнатальном периоде онтогенеза, так и у взрослых животных.

5. Нестин не следует рассматривать в качестве специфического маркера пролиферирующих клеток нейральной дифференцировки, поскольку, наряду с различными популяциями нейральных клеток, нестин экспрессируется в клетках стенки капилляров 6. С помощью выявления нестина, учета морфологии и локализации нестин-иммунопозитивных клеток, а также сочетания методов световой и конфокальной микроскопии и использования других маркеров возможно определение популяции нейральных стволовых клетках in situ. Таким образом, нестин можно использовать для определения нейральных стволовых клеток в комбинации с другими методами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Коржевский, Д. Э. Нестин в клетках головного мозга крысы после кратковременной общей ишемии / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Сб. тез. и лекций 13 Международного совещания и 6 школы по эволюц. физиологии. — СПб. : ВВМ, 2006. — С. 113.

2. Коржевский, Д. Э. Оптимизация метода иммуноцитохимического выявления нестина для парафиновых срезов головного мозга крысы / Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров // Морфология. — 2006. — Т. 130. — №6. — С. 78–80.

3. Коржевский, Д. Э. Реверсия эмбрионального фенотипа глиальных клеток под влиянием кратковременной общей ишемии головного мозга / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Морфология. — 2006. — Т. 129.

4. Гиляров, А. В. Нестин в клетках головного мозга крыс / А. В. Гиляров, А. А. Шмонин // Морфология. — 2006. — Т. 129.

5. Коржевский, Д. Э. Индукция синтеза нестина в части клеток головного мозга крысы под влиянием ишемического повреждения / Д. Э. Коржевский, О. В. Кирик, А. В. Гиляров, М. В. Ленцман, Т. Д. Власов // Морфология. — 2007. — Т. 131.

6. Гиляров, А. В. Нестин в клетках центральной нервной системы / А. В. Гиляров // Морфология. — 2007. — Т. 131. — №1. — С. 85– 7. Гиляров, А. В. Источники нейральных стволовых клеток в ранний постнатальный период головном мозге крыс / А. В. Гиляров // Сб. тез. к научн-практич. конф. молодых ученых. — СПб. : издание МАПО, 2007. — С. 60.

8. Коржевский, Д. Э. Постишемическое изменение состава промежуточных филаментов в клетках гиппокампа крысы / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, О. В. Кирик // им. И. П. Павлова. — М., 2007. — С. 278.

9. Гиляров, А. В. Реакция белков промежуточных филаментов в клетках центральной нервной системы крыс в ответ на ишемическое повреждение / А. В. Гиляров, А. А. Шмонин // Сб. тез. межинститут. конф. молодых ученых. — СПб. : Ин-т физиол. им. И.П. Павлова РАН, 2007. — С. 28.

10. Коржевский, Д. Э. Отсутствие тенденции к восстановлению утраченной популяции нейронов области СА1 гиппокампа в отделенные сроки после ишемического повреждения / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, О. В. Кирик // Сб. Структурно-функциональные, нейрохимические и пластичности мозга. — М. : Издательство «Икар», 2007. — 11. Коржевский, Д. Э. Морфологические проявления локальной кратковременной общей ишемией головного мозга / Д. Э. Коржевский, М. В. Ленцман, А. В. Гиляров, В. Б. Косткин, В. А. Отеллин // Журн. эвол. биохим. и физиол. — 2007. — Т. 43.

12. Коржевский, Д. Э. Белки промежуточных филаментов в клетках нервной ткани / Д. Э. Коржевский, А. В. Гиляров, О. В. Кирик // Морфология. — 2008. — Т. 133. — №2. — С. 66.

13. Гиляров А. В. Нестин и другие белки промежуточных филаментов в клетках головного мозга крысы / А. В. Гиляров // Сб. трудов 4-й Международного междисциплинарного конгресса.

— М. : МАКС Пресс, 2008. — С. 99.

Подписано в печать 16.11.2008 г. Заказ № Формат бумаги 60 84/16. Тираж 100 экз. Усл. п. л. 1, Типография ООО «ЛАДОГА», Санкт-Петербург,

 
Похожие работы:

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«Сперанская Анна Сергеевна ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТИПА КУНИТЦА ИЗ КАРТОФЕЛЯ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Специальность 03.00.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА 2008 Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Института биохимии им А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА Татьяна Александровна Официальные оппоненты : доктор химических наук РОТАНОВА...»

«ФИЛИППОВ Дмитрий Андреевич СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЭКОСИСТЕМ ПОЙМЕННЫХ БОЛОТ БАССЕЙНА ОНЕЖСКОГО ОЗЕРА (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.16 – экология 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор БОЛОТОВА Наталья Львовна доктор биологических наук,...»

«Волошин Сергей Александрович ЗНАЧЕНИЕ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ У БАКТЕРИЙ MICROCOCCUS LUTEUS И RHODOCOCCUS RHODOCHROUS ДЛЯ ИНИЦИАЦИИ РОСТА. Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва-2005 Работа выполнена в лаборатории Биохимии стрессов микроорганизмов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович Официальные...»

«БЕЛЯЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА МИКРОБИОТА КИШЕЧНИКА КОРЕННОГО ЖИТЕЛЯ ЦЕНТРАЛЬНОГО ФЕДЕРАЛЬНОГО ОКРУГА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕГИОНАЛЬНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2014 Работа выполнена в Государственном Бюджетном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального Образования Тверская государственная медицинская академия Министерства...»

«ИСАБАЕВ Берик Мухтарович СОСТОЯНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ ПОБЕРЕЖЬЯ КАСПИЙСКОГО МОРЯ В УСЛОВИЯХ РАЗРАБОТКИ НЕФТЯНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ 03.02.01 — Ботаника, 03.02.08 — Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург 2011 2 Работа выполнена на кафедре экологии Актюбинского государственного университета им. К. Жубанова и на кафедре ботаники и физиологии растений ГОУ ВПО Оренбургский государственный педагогический...»

«Головатских Инна Васильевна ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ НЕКОТОРЫМИ БИОЭЛЕМЕНТАМИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ И ЙОДА У ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ЮЖНОГО РЕГИОНА БАШКИРИИ (НА ПРИМЕРЕ Г.МЕЛЕУЗА И МЕЛЕУЗОВСКОГО РАЙОНА) 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск — 2014 2 Работа выполнена на кафедре биологической химии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007 Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»

«ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP1 И ELIP2 У Arabidopsis thaliana 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА Официальные оппоненты : доктор...»

«Свинарева Людмила Владимировна Влияние модифицированных ДНК- и РНКолигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2010 Работа выполнена в ГУЗ Московском НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы и на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии...»

«ХОМИЧЕНКО Алексей Анатольевич МОДИФИКАЦИЯ ЭКЗОГЕННОЙ ГИББЕРЕЛЛОВОЙ КИСЛОТОЙ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ У TRADESCANTIA (КЛОН 02), ИНДУЦИРОВАННЫХ ОБЛУЧЕНИЕМ В МАЛЫХ ДОЗАХ 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 2 Работа выполнена в Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор Зайнуллин Владимир Габдуллович...»

«МОСИН ОЛЕГ ВИКТОРОВИЧ РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ БЕЛКОВ, АМИНОКИСЛОТ И НУКЛЕОЗИДОВ, МЕЧЕННЫХ 2 Н (D) И 13С, С ВЫСОКИМИ СТЕПЕНЯМИ ИЗОТОПНОГО ОБОГАЩЕНИЯ. 03.00.23-Биотехнология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук Москва -1996 2 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской ордена Трудового Красного Знамени Государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова. Научные...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«Илюшкина Любовь Николаевна БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ ПОЧВ УРБОЛАНДШАФТОВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ И Г. АЗОВА 03.00.27 – почвоведение 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии Южного федерального университета Научныe руководители: доктор биологических наук, профессор Внуков В.В. кандидат биологических наук, доцент Полякова А.В. Официальные оппоненты :...»

«БОЛТОВИЧ ИРИНА МИХАЙЛОВНА КЛИНИКО-БИОРИТМОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ КОМБИНИРОВАННЫХ ОРАЛЬНЫХ КОНТРАЦЕПТИВОВ У ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН 03.00.13 - Физиология 14.00.01 – Акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень – 2007 Работа выполнена в БУ ВПО Ханты-Мансийского автономного округа - Югры Ханты-Мансийский государственный медицинский институт Научный руководитель : доктор медицинских наук Соловьёв Сергей Владимирович...»

«ЗАГУРНАЯ ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТАЦИИ НА ВИДОВОЕ БОГАТСТВО И СОСТАВ ФИТОЦЕНОЗОВ ШИРОКОЛИСТВЕННЫХ ЛЕСОВ ЗАПАДНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2010 2 Работа выполнена на кафедре экологии и защиты окружающей среды Майкопского государственного технологического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Акатов Валерий Владимирович Официальные...»

«ДЕНИСОВА Ольга Николаевна ОСОБЕННОСТИ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА РАСТЕНИЙ ПРИДОРОЖНОЙ ЗОНЫ В УСЛОВИЯХ ОСТАТОЧНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ СВИНЦОМ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ–2006 Работа выполнена на кафедре химии ФГОУ ВПО Марийский государственный технический университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Винокурова Раиса Ибрагимовна Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор...»

«Непряхина Ольга Константиновна Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : директор НИИ ФХБ им....»

«РОГОЗА Татьяна Михайловна Поиск структурного гена нехромосомного детерминанта [ISP+] с помощью скрининга инсерционного банка генов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae Специальность 03.02.07 - Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 2 Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного...»

«ПОЛЕНОГОВА Ольга Викторовна ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВО И ПРОЯВЛЕНИЕ ПОЛИЭДРОЗА У НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (Lymantria dispar L.) 03.02.05. - энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный доктор биологических наук руководитель: Ильиных Александр Васильевич...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.