WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЧУЛКИН АНДРЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

CREA – ЗАВИСИМАЯ УГЛЕРОДНАЯ КАТАБОЛИТНАЯ РЕПРЕССИЯ В

PENICILLIUM CANESCENS

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена в лаборатории оптимизации экспрессии генов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН (ИНБИ РАН).

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, ИНБИ РАН, г. Москва Беневоленский Сергей Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ФГУП «ГосНИИГенетика», г. Москва Миронов Александр Сергеевич кандидат биологических наук, Институт биологии гена РАН, г. Москва Захарова Елена Сергеевна

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ, г. Москва

Защита диссертации состоится « » 2012 года в « » часов на заседании Диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИГенетика») по адресу: 117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при ФГУП «ГосНИИГенетика».

Реферат разослан « » декабря 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Углеродная катаболитная репрессия (CCR, от Carbon Catabolite Repression) – это механизм, который позволяет микроорганизмам осуществлять последовательную утилизацию источников углерода, начиная с более предпочтительных (быстро утилизируемых и более энергетически выгодных). Обычно это достигается блокированием синтеза ферментов, вовлеченных в метаболизм менее предпочтительных источников углерода.

Мицелиальные грибы – микроорганизмы, используемые в промышленном производстве ферментов для пищевой, целлюлозно-бумажной промышленности, в производстве кормов и биотоплива. Они продуцируют широкий спектр секретируемых ферментов, необходимых для деградации стенок растительных клеток, таких как глюканазы, ксиланазы, ксилозидазы, ферулоил-эстеразы, арабинофуранозидазы, глюкуронидазы, пектинлиазы и др. Продуктами этих ферментов являются моно-, ди- и олиго- сахариды, причем последние, впоследствии также преобразуются в моно- или ди- сахариды, которые при их избытке, вызывают репрессию транскрипции ферментов этих ферментов, используя механизм CCR.

Такая система регуляции выгодна для микроорганизма, однако для промышленного производства ферментов создает большую проблему, так как ограничивает спектр используемых источников углерода при культивирования грибных продуцентов.

Penicillium canescens F178 –почвенный изолят, который был выделен как природный продуцент -галактозидазы. Он характеризуется большой продукцией внеклеточного белка (до 5 г/л), высокой скоростью роста и низким количеством секретируемых протеиназ.

Кроме -галактозидазы, этот штамм на среде со свекловичным жомом производит до 100 ед./мл эндо-1,4-бета-ксиланазы. Гены bgaS и xylA, кодирующие эти белки были клонированы и секвенированы ранее.

Амплификация этих генов в P. canescens приводила к 8-12 кратному увеличению продукции целевых ферментов. Кроме того, сильные промоторы этих генов использовались для экспрессии генов фитазы phyA, эндоглюканаз egl2 и egl P. canescens и лакказы lac1 Trametes hirsuta.

Показано что транскрипция с этих промоторов индуцируется арабинозой и подвержена углеродной катаболитной репрессии.

Таким образом, изучение регуляции углеродной катаболитной репрессии в P. canescens является ключевым моментом для его использования как промышленного продуцента ферментов и других белковых молекул.

Цель работы: изучение мокулярно-генетических механизмов углеродной катаболитной репрессии в мицелиальном грибе P. canescens.

1. Клонировать ген creA P.canescens, кодирующий репрессор транскрипции генов, подверженных углеродной катаболитной репрессии;

2. Изучить его регуляцию на уровне транскрипции и локализацию белкового продукта;

3. Определить сайты связывания репрессора CreA с промоторами генов – 4. Получить и охарактеризовать мутантные по углеродной катаболитной репрессии штаммы P. canescens.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Клонированы и секвенированы гены creA и gpdA глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы P. canescens.

Показано, что транскрипция гена репрессора creA авторегулирована, однако увеличение транскрипта creA, в отсутствии проверенных источников углерода, не приводит к репрессии регулируемых им генов, и, таким образом, регуляция транскрипции creA не является ключевым фактором в углеродной катаболитной репрессии генов в P. canescens.

Изучена внутриклеточная локализация гибридного белка CreA::GFP при выращивании на средах с различными источниками углерода. Локализация CreA в клетках P. canescens являлась внутриядерной независимо от источника углерода и концентрации глюкозы в среде.

Идентифицированы сайты связывания CreA с промоторами генов bgaS, xylA и creA.

катаболитной репрессии, основанная на устойчивости к антибиотику «гигромицин Б».

Получены и охарактеризованы мутанты P. canescens по углеродной катаболитной репрессии.

Получены мутантные штаммы мицелиального гриба P. canescens, не требующие индуктора для экспрессии генов, активируемых арабинозой в штамме дикого типа.

Мутантные штаммы могут быть использованы, как для гомологичной, так и для гетерологичной сверхпродукции различных белков и полипептидов в промышленном масштабе.

Апробация работы. Работа была представлена на международной конференции «IMC9 THE BIOLOGY OF FUNGI» (Эдинбург, Великобритания, 1- августа, 2010), и на совместном заседании межлабораторного семинара Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИгенетика» декабря 2011 года.

Публикации. По основным результатам диссертации опубликовано 6 работ, из них 3 статьи в рецензируемых российских журналах, 2 тезиса в сборниках материалов конференций и 1 патент РФ.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована рисунками и таблицами. Список литературы содержит источника.

Сокращения, принятые в тексте: ДДС –додецилсульфат натрия, ПААГ – полиакриламидный гель, EMSA - Electrophoretic Mobility Shift Assay, ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция во времени.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Клонирование гена creA P. canescens.

CCR в мицелиальных грибах осуществляется, главным образом, репрессором транскрипции CreA, кодируемым геном creA. Было решено выяснить, есть ли в P. canescens ген, гомологичный creA и клонировать его.

Для этого были синтезированы вырожденные праймеры CREAD и CREAR на консервативные участки генов creA мицелиальных грибов:

CREAD: 5`-CATGCCTGYCARTTCCCIGGCTG-3`;

CREAR: 3`-GGGTTGAGIGGGTTGAGITGICGAG-5`.

Амплифицированный фрагмент ДНК P. canescens, длиной около 550 п.н., был клонирован в плазмидном векторе pUC18 и секвенирован. Сравнение полученной нуклеотидной последовательности с генами creA и его аналогами в мицелиальных грибах показало высокую степень гомологии.

Полученный фрагмент ДНК creA P. canescens был использован в качестве зонда для гибридизации по Саузерну геномной ДНК P. canescens. Показано, что в геноме P. canescens присутствует единственная область с высокой степенью нуклеотидной гомологии с геном creA.

Впоследствии этот зонд был использован для гибридизации с полученным нами геномным банком P. canescens в фаговом векторе EMBL4.

В результате скрининга фаговой библиотеки выбран клон, содержащий фрагмент ДНК длиной около 12 т.п.н. с кодирующей частью гена creA и протяженными 3'- и 5'- нетранслируемыми областями.

Фрагмент ДНК этого фагового клона, размером около 5.5 т.п.н., был клонирован в плазмидном векторе pBluescript KSII(+) (плазмида pPCcreA) и частично секвенирован (рис. 1). Таким образом, клонирован полный ген creA P.

canescens.

Рис. 1. Карта плазмиды pPCcreA Анализ нуклеотидной последовательности (GenBank: FJ695603) выявил, что ген creA P. canescens не содержит интронов в кодирующей части, которая имеет длину 1242 п.н. Трансляция нуклеотидной последовательности показала, что зрелый белок, состоящий из 413 а.к., имеет молекулярную массу 44.6 кДа и значение изоэлектрической точки равное 9.41. Сравнение нуклеотидной и транслированной аминокислотной (рис. 2) последовательностей гена creA P.

canescens с генами углеродной катаболитной репрессии других мицелиальных грибов и их белковыми продуктами показало значительную гомологию (до 85% и 92%, соответственно).

Из рисунка видно, что CreA P. canescens, также как и его гомологи в других мицелиальных грибах, содержит ДНК – связывающий домен с двумя цинковыми пальцами типа Cys2His2 и консервативную С-область, богатую остатками серина, треонина и пролина, что характерно для регуляторных белков. В области цинковых пальцев имеются аминокислотные замены, причем гомология с A.

nidulans наиболее сильная.

AAB01677 (1) MQRAQSAVDFSNLLNPTSAAG--------------QDSGAMSTAAVTVIKPNGPIPGTQSTETANELPRP

CAA04425 (1) MQRASSAVDFNSLLNPQSTQEREHQAARQKLALIQQQQQHQREAEMAAISMMPAMVGGHHGDDRQDLPRP

CBF69992 (1) MPQPGSSVDFSNLLNPQ---NNTAIPAEVSNA----TASATMASGASLLPPMVKGARPAAEEARQDLPRP

P.c. CREA (1) -MSPPTSVGFSNLLNPQEAADSASPATAQPTS----SPSSDMASSVSLLPPLMKGARPANEEVRQDLPRP

AAB01677 (57) YKCPLCDKAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACQFPGCSKKFSRSDELTRHSRIHSNPNSRRGNKGQQQHQL

CAA04425 (71) YKCPLCEKAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACLFPGCTKRFSRSDELTRHSRIHNNPNSRRSNK---TQQA

CBF69992 (64) YKCPLCERAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACQFPGCSKRFSRSDELTRHSRIHNNPNSRRGNKAQHLAAA

P.c. CREA (66) YKCPLCDRAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACQFPGCTKRFSRSDELTRHSRIHNNPNSRRSNKAQHLAAA

AAB01677 (127) HHQGMP-----HPMHVDGLMHPPAAPKAIRSAPPSTLVSPNVSPPHSYSSFVMPHG-PISHYGRGN---CAA04425 (138) PQMGVP-----MHSESMATMMPPPNKNITRSAPPSAIGSPNVSPPHSYTSYSSNHLSSLNPYGRSLGGSP

CBF69992 (134) AAAAAANQDGSAMANNAGSMMPPPSKPITRSAPVSQVGSPDISPPHSFSNYANHMRSNLSPYSRTSERAS

P.c. CREA(136) AAAAAG---QDAAMVNAANMMPPPSKPITRSAPVSQIGSPDVSPPHSFSNYANHMRSNLGPYSRTSERAS

AAB01677 (187) --------DITMLAKAANQIERETLSGGPSNHNSRHHPYFGQGVPGSR-GHPSLSSYHMARAHSNDEDDH

CAA04425 (203) NNGQAPLTDINMLATAATQVERDSSTTANHYSQARHQPYYSHSNHNSRTHLPSLQAYAMTRAYSHEEDDH

CBF69992 (204) SG-----MDINLLATAASQVERDESFGFRSGQRSHHMYGPRHGSRGLPSLSAYAISHSMSRSHSHEDEDS P.c. CREA(203) SG-----MDINLLATAASQVERDDHMGFHGSR--HHMYGSRHHSRGLPSLSAYAISQNMTRSHSNDDDDG

AAB01677 (248) YHGSLRHAKRSRPNSPNSTAPSSPTFRTDSLSPTPDHTPIATPAHSPRLRPFSG--YELPSLRNLSLQHN

CAA04425 (273) YAH--RHAKRSRPNSPMSTAPSSPTFSHDSLSPTPDHTPLATPAHSPRLRPYGGG-YDLPGIRNLSLHHCBF69992 (269) YAS--HRVKRSRPNSPNSTAPSSPTFSHDSLSPTPDHTPLATPAHSPRLKPLSPSELHLPSIRHLSLHHP.c. CREA(266) YG---HRVKRSRPNSPNSTAPSSPTFSHDSLSPTPDHTPLATPAHSPRLRPLGANELHLPSIRHLSLQHConsensus (281) YA RRVKRSRPNSPNSTAPSSPTFSHDSLSPTPDHTPLATPAHSPRLRPLSG EYHLPSIRNLSLQH

AAB01677 (316) TTPALAPMEPHLDAPQFHPQLQANTTRSP---GMSLTDIISRPDGSQRKLPVPQVPKVAVQDLLSDG--V

CAA04425 (339) -TPALAPMEPQHLDGQYHATSTTTTATSAPRMGLTISDIMSRTDGSTRKLPVPQAP-VAVQDLSSPGEIG

CBF69992 (336) -TPALAPMEPQAEGPNYYNP-------NQPHVGPSISDIMSRPEGAQRKLPIPQVPKVAVQDMLNP---S P.c. CREA(332) -TPALAPMEPQPEGPNYYSP-------GQGHMGPSITDIMSKPDGTQRKLPVPQVPKVAVQDMLNPP--T Consensus (351) TPALAPMEPQ EGPNYHAP T SQPHMGPSISDIMSRPDGSQRKLPVPQVPKVAVQDLLSPG S AAB01677 (381) FPNSGRSSTTGSLAGGDLMDRMCAA04425 (407) FNTSGQSSTTGSVAGNDLADRMI CBF69992 (395) GFTSVSSSTANSVAGGDLAERFP.c. CREA(392) GFYSMYSSANNSVAGGDLADRFConsensus (421) GFTSG SSTTNSVAGGDLADRM Рис. 2. Выравнивание аминокислотных последовательностей белка-репрессора CreA и его гомологов в мицелиальных грибах: CAA04425 –CRE1 Sclerotinia sclerotiorum, AAB01677 –Cre1 Trichoderma reesei, CBF69992 – CreA Aspergillus nidulans, P.c. CREA – CreA P. canescens. Рамкой выделены последовательности «цинковых пальцев».

глицеральдегид 3-фосфат дегидрогеназы P. canescens Для последующего исследования транскрипции генов методом ПЦР-РВ и анализа локализации CreA в клетках P. canescens была определена нуклеотидная последовательность конститутивно транскрибирующегося гена gpdA P. canescens глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH) (EC 1.2.1.12).

Для этого были синтезированы олигонуклеотиды на консервативные участки генов глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназ мицелиальных грибов:

PCGPDD2: 5’- ATGTWCGTYATGGGTGTCAAC -3’;

PCGPDR1: 3’- ACCATGCTYTTGCTCACCC -5’.

С использованием этой пары праймеров и ДНК P. canescens в качестве матрицы, был получен ПЦР-фрагмент длинной около 550 п.н., секвенирование которого показало значительную гомологию с генами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ других грибов.

На последовательность полученного внутреннего фрагмента были синтезированы два прямых и два обратных праймера, с помощью которых методом «ПЦР для неклонированной геномной ДНК» были амплифицированы протяженные 5’- и 3’- концевые фрагменты, которые впоследствии были секвенированы, и таким образом определена нуклеотидная последовательность полного гена (GenBank: GQ996946).

Сильный промотор гена gpdA P. canescens с введенным сайтом PscI, перекрывающимся с инициирующим ATG – кодоном, был клонирован в плазмидном векторе и использован в дальнейшем для конститутивной экспрессии creA в клетках P. canescens, а синтезированная пара праймеров на экзон 4 гена gpdA P. canescens, была использована для анализа транскрипции генов методом ПЦР-РВ, где gpdA служил референсным геном.

3. Анализ транскрипции creA P. canescens при росте культуры на средах с различными источниками углерода методом ПЦР-РВ.

В мицелиальных грибах T. reesei и A. nidulans гены creA (cre1) авторегулированы и имеют более низкие уровни транскрипции в условиях репрессии по сравнению с дерепрессирующими условиями, тогда как в Aspergillus chrysogenum и S. sclerotiorum уровни транскрипции creA (cre1) имеют прямую корреляцию с внеклеточной концентрацией глюкозы.

Так как существуют различия в регуляции транскрипции creA и его гомологов в T. reesei и A. nidulans по сравнению с Aspergillus chrysogenum и S.

sclerotiorum, было решено изучить регуляцию транскрипции creA P. canescens при росте на различных источниках углерода методом ПЦР-РВ.

Для получения препаратов РНК, штамм P. canescens F178 выращивали в жидкой среде, после чего мицелий переносили в среды с различными источниками углерода или без них. Полученная затем кДНК использована для некоторых случаях, на ген bgaS P. canescens.

конститутивной транскрипции gpdA, а изменение транскрипции измерялось относительно образца, инкубированного в присутствии 50 мМ D-глюкозы.

Результаты ПЦР-РВ анализа представлены в таблице 1.

ПЦР-РВ анализ транскрипции генов creA на различных источниках углерода.

* - глюкоза добавлена на 30 мин после 150 мин инкубации без источников углерода.

** - данные образца были использованы в качестве «sample probe» при вычислении CT.

Из полученных данных видно:

В присутствии всех проверенных источников углерода транскрипция creA уменьшается (L-арабиноза не утилизируется штаммом F178).

В отсутствии D-глюкозы транскрипция bgaS увеличивается в 90-180 раз, а добавление индуктора (1 мМ L-арабинозы) в 3000-5500 раз увеличивает транскрипцию bgaS, несмотря на значительное (17-30 раз) увеличение транскрипции creA.

Добавление D-глюкозы к голодающему по углероду мицелию P. canescens не приводит к увеличению транскрипции creA.

Таким образом, в P. canescens имеет место авторегуляция гена creA.

Результаты ПЦР-РВ наглядно демонстрируют уменьшение транскрипции в присутствии проверенных источников углерода. Тем не менее, увеличение транскрипции creA в присутствии 1мМ L-арабинозы, являющейся индуктором секретируемой бета-галактозидазы, не приводит к репрессии транскрипции гена bgaS и говорит о том, что регуляция на уровне транскрипции creA P. canescens не является ключевым механизмом углеродной катаболитной репрессии в P.

canescens.

Есть данные, что добавление репрессирующих или дерепрессирующих моносахаридов в среду с мицелием вызывает быстрое и кратковременное увеличение транскрипции creA. Это увеличение зависит от моносахаридной восприимчивости и, как предполагают, находится под контролем гена creB. Нам не удалось увидеть этого эффекта в P. canescens, добавив на 30 мин глюкозу к голодающему мицелию.

4. Анализ локализации CreA в клетках P. canescens.

Субклеточным фракционированием было доказано, что локализация гомолога CreA (CRE1) в S. sclerotiorum зависит от присутствия источника углерода в среде. Кроме того, внутриклеточная локализация белка GFP::CRE1 S.

sclerotiorum экспрессирущегося под контролем промотора cre1 S. sclerotiorum менялась в зависимости от концентрации глюкозы в клетках A. nidulans. Однако CreA::GFP A. nidulans, экспрессирущийся под контролем промотора gpdA A.

nidulans находится в ядрах клеток A. nidulans как в репрессирующих, так и дерепрессирующих условиях и не зависит от количества глюкозы в среде.

Ввиду вышеуказанных различий в изменении локализации CreA и его гомологов, было решено изучить локализацию CreA P. canescens в клетках P.

canescens. С этой целью нами была сконструирована плазмида pGPD::creA::GFP (рис. 3), несущая гибридный ген creA::sGFP под контролем конститутивного промотора гена gpdA P. canescens, которая была введена в геном P. canescens трансформацией.

Рис. 3. Карта плазмиды pGPD::creA::GFP.

На селективной среде отобрано 20 клонов трансформантов, среди которых 11 имели GFP-флуоресценцию после проращивания спор на среде MM.

Споры трех штаммов, имеющих GFP-флуоресценцию, были высеяны на агаризованную среду MM содержащую различные источники углерода, после чего образцы подвергли микроскопии. Результаты представлены на рис. 4.

Из рисунка видно, что гибридный белок CreA::GFP находится в ядрах клеток P. canescens, и его локализация, также как и в A. nidulans, является внутриядерной вне зависимости от концентрации глюкозы и от источника углерода. Полученные данные можно объяснить тем, что у грибов локализация CreA регулируется по-разному и существуют различные механизмы активации CreA, либо локализация CreA в клетке не является ключевым механизмом регуляции углеродной катаболитной репрессии.

5. Определение сайтов связывания CreA P. canescens с промоторами генов bgaS, xylA и creA.

Для связывания репрессора транскрипции CreA необходимо присутствие в промоторе репрессируемого гена консервативной последовательности 5' SYGGRG - 3'. Однако наличие этой последовательности не является достаточным условием связывания CreA и его гомологов в других мицелиальных грибах с промоторами. Так, в промоторе гена alcA A. nidulans, функциональны только два из семи предполагаемых сайтов связывания CreA, а в alcR промоторе - четыре из девяти.

Было решено выяснить, какие из предполагаемых сайтов связывания CreA в промоторах генов creA, xylA и bgaS взаимодействуют с репрессором транскрипции. С этой целью мы экспрессировали полный ген creA P. canescens и нуклеотидную последовательность ДНК-связывающего домена в клетках E. coli с помощью pET – системы и проанализировали взаимодействие полученных белковых продуктов с фрагментами промоторов генов creA, xylA и bgaS длинной около 250 п.н. с помощью EMSA, а затем с короткими (40 п.н.) двуцепочными олигонуклеотидами содержащими консенсусную последовательность связывания.

Для экспрессии гена creA в клетках E.coli были сконструированы две экспрессионные плазмиды: pETcreA и pETZFcreA, содержащие полную кодирующую последовательность creA или только домен цинковых пальцев (рис.

5).

Плазмиды были введены в клетки E.coli, и после индукции, растворимые фракции лизатов клеток наносили на колонку с Ni-NTA Agarose.

Рис. 5. Карты плазмид pETcreA и pETZFcreA. Указаны использованные сайты рестрикции.

CreA ZnF BL21(DE3)/pETcreA (2) после CreA Связавшиеся белки элюировали линейным градиентом имидазола, и фракции, содержащие нужные белки были объединены и нанесены на денатурирующий ПААГ (рис. 6).

На рисунке отчетливо видны мажорные полосы соответствующие белкам CreA и ZnF-CreA с расчетной молекулярной массой 48 и 16 кДа, соответственно.

Для первичного анализа промоторов был проведен EMSA-анализ белков CreA и ZnF-CreA c 5'-32P-мечеными ПЦР-фрагментами промоторов генов xylA, bgaS и creA P. canescens. Для этого получены ПЦР-фрагменты промоторов длиной около 250 п.н., перекрывающие весь промотор каждого гена (рис. 7 (А)). На рис. (Б) показаны результаты предварительного EMSA-анализа взаимодействия ZnFCreA с промоторами. Из приведенных данных видно, что ZnF-CreA P. canescens взаимодействует с промотором xylA P. canescens в областях -500 -750, -1000 - и -1500 -1760, с промотором bgaS P. canescens в областях -250 -500, -750 -1000 и с промотором creA -250 -500, причем, судя по разнице сдвига, количество сайтов связывания различно. Также заметно исчезновение полосы соответствующей фрагменту 0 -250 промотора гена xylA, что, однако не приводит появлению четкой полосы сдвига и говорит о нестабильном связывании в этой области.

Рис. 7. Схема предварительного EMSA-анализа промоторов генов bgaS, xylA и creA P.canescens (А) и его результаты (Б). Указаны положения праймеров (BD1BR7, XD1-XR7, CD1-CR2), предполагаемые сайты связывания CreA (CREA) и ПЦР-фрагменты (BPCR1-BPCR7, XPCR1-XPCR7, CPCR1-CPCR2). (-) – препарат белка ZnF-CreA не добавлен в пробу, (+) – добавлено 2 нг ZnF-CreA.

Для детального анализа промоторов синтезированы пары комплементарных олигонуклеотидов, находящиеся в связывающихся с CreA ПЦР-фрагментах, содержащих предполагаемые сайты узнавания CreA (5 '-SYGGRG-3'), и проведен EMSA - анализ с фрагментом CreA, содержащим домен «цинковых пальцев» [рис.

8 (А)].

Данные EMSA [рис. 8 (Б)] показывают, что CreA связывается с олигонуклеотидами BC1, BC2, BC4 и BC5 промотора bgaS, с XC1, XC3, XC4, XC промотора xylA и с CC2 промотора creA, причем сила связывания различна.

Рис. 8. Схема EMSA-анализа ПЦР-фрагментов генов bgaS, xylA и creA P.canescens (А) и его результаты (Б). Указаны ПЦР-фрагменты, предполагаемые сайты связывания CreA (CREA) и двухцепочечные олигонуклеотиды (BC1-BC5, XC1XC5, CC1-CC2). (1) – препарат белка ZnF-CreA не добавлен в пробу, (2), (3), (4) – добавлено 0.3, 1, 3 нг ZnF-CreA, соответственно.

В результате EMSA - анализа были локализованы четыре сайта связывания CreA с промотором bgaS из восьми, соответствующих консенсусной последовательности связывания CreA в мицелиальных грибах 5 '-SYGGRG-3', и четыре сайта из восьми в промоторе гена xylA. В промоторе самого creA идентифицирован один сайт связывания с CreA, что подтверждает авторегуляцию транскрипции creA отрицательной обратной связью (рис. 9).

6. Получение мутантов по углеродной катаболитной репрессии P.

canescens.

Мутанты по углеродной катаболитной репрессии в A. nidulans были получены при супрессии areA мутации, на среде, содержащей пролин или ацетамид в присутствии D-глюкозы. Полученные штаммы имели мутацию, либо в гене creA, что приводило к дерепрессии в присутствии всех источников углерода, либо в генах creB и creC, где дерепрессия происходила лишь на нескольких источниках углерода. Кроме того, мутантные creA аллели показывали неиерархическую гетерогенность к дерепрессии различных систем. Так, смысловая мутация creA30 приводила к сильной дерепрессии alc - системы, в отличие от нонсенс - мутации creA220. Обратная ситуация происходила с дерепрессией системы ферментов, ответственных за утилизацию пролина.

Для получения мутантов по углеродной катаболитной репрессии была разработана система, основанная на прямой селекции по устойчивости к антибиотику «гигромицин Б».

Как указано выше, экспрессия генов xylA и bgaS в штамме F178 P.canescens подвержена репрессии D-глюкозой и индуцируется L-арабинозой.

Была сконструирована экспрессионная плазмида pXHPH, несущая ген hph гигромицин Б фосфотрансферазы E. coli, обеспечивающий устойчивость к антибиотику «гигромицин Б», под контролем промотора гена xylA P. canescens и терминатор гена trpC A. nidulans (рис. 10).

Плазмида была введена в геном P.canescens трансформацией, после чего трансформанты приобрели способность расти в присутствии антибиотика в условиях индукции промотора xylA, однако в условиях репрессии промотора xylA рост отсутствовал. Один из трансформантов (PCA-10-4) был использован для мутагенеза.

Рис. 10. Карта плазмиды pXHPH Грибные споры обрабатывались ультрафиолетом, после чего высевались на агаризованную среду, содержащую гигромицин и индуктор в присутствии глюкозы. Также в среду добавляли X-gal, позволяющий тестировать активность секретируемой - галактозидазы BgaS P. canescens по окрашиванию агаризованной среды в синий цвет.

Получено около 1500 клонов, имеющих устойчивость к гигромицину в присутствии глюкозы. В 14 из этих клонов также присутствовала активность галактозидазы. Эти клоны проверяли на активность эндоксиланаз в условиях индукции и репрессии, используя чашечный тест.

Результаты скрининга отобранных мутантов представлены в таблице 2. Два мутантных штамма (PCA-10-4/I-7 и PCA-10-4/II-29) были выбраны для дальнейшего анализа. Оба мутанта имели измененную морфологию, компактный замедленный рост и плохое спорообразование.

7. Анализ продукции эндо-1-4-бета-ксиланазы XylA в мутантных по углеродной катаболитной репрессии штаммах.

Для количественной оценки результатов мутагенеза, мутантные штаммы и штамм дикого типа выращивали в колбах с индуктором в присутствии глюкозы, и измеряли активность эндоксиланазы, остаточный сахар в культуральной жидкости и сухой вес мицелия (рис. 11).

Сравнительный анализ мутантов и штамма дикого типа при росте на агаризованной среде в присутсвии индуктора и глюкозы.

* - диаметр колонии в присутствии гигромицина Б.

** - диаметр окрашенной зоны в присутствии X-gal.

*** - диаметр зоны просветления при чашечном тесте на активность эндоксиланаз.

Из представленных графиков видно, что глюкоза является репрессирующим источником углерода для эндоксиланазы в штамме дикого типа, т. к. синтез ксиланазы начинается только при исчерпании глюкозы в среде. В мутантных штаммах репрессия глюкозой эндоксиланазы сильно снижена или отсутствует, и синтез ксиланазы начинается одновременно с увеличением биомассы или незначительно отстает. Кроме того конечная активность эндокиланазы в культуральной жидкости мутантных штаммов приблизительно в 3 раза превышает активность в штамме дикого типа, при одинаковом количестве потребленной глюкозы.

8. Анализ мутации в штаммах Для проверки, несут ли полученные штаммы мутацию по гену creA, мы трансформировали мутантные штаммы плазмидой pPCcreA, несущей полноразмерный ген creA P.canescens. У полученных трансформантов наблюдалась реверсия морфологии к дикому типу (рис. 12), что позволило предположить наличие мутации в гене creA.

Для детального анализа мутаций мутантные аллели гена creA штаммов PCAI-7 и PCA-10-4/II-29 были амплифицированы и секвенированы. Анализ нуклеотидных последовательностей показал наличие точечных мутаций типа «сдвиг рамки» с делецией одного нуклеотида в позиции +468 в мутанте PCA-10I-7, и в позиции +609 в мутанте PCA-10-4/II-29, что приводило к изменению Сконца белка CreA (рис. 13). Как видно из рисунка, мутации не затрагивали ДНК – связывающий домен CreA, однако приводили к изменению консервативного домена.

PCA-10 (1)MSPPTSVGFSNLLNPQEAADSASPATAQPTSSPSSDMASSVSLLPPLMKGARPANEEVRQDLPRPYKCPL

PCA-10-4/I-7 (1)MSPPTSVGFSNLLNPQEAADSASPATAQPTSSPSSDMASSVSLLPPLMKGARPANEEVRQDLPRPYKCPL

PCA-10-4/II-29 (1)MSPPTSVGFSNLLNPQEAADSASPATAQPTSSPSSDMASSVSLLPPLMKGARPANEEVRQDLPRPYKCPL

PCA-10 (71)CDRAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACQFPGCTKRFSRSDELTRHSRIHNNPNSRRSNKAQHLAAAAAAAA

PCA-10-4/I-7 (71)CDRAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACQFPGCTKRFSRSDELTRHSRIHNNPNSRRSNKAQHLAAAAAAAA

PCA-10-4/II-29 (71)CDRAFHRLEHQTRHIRTHTGEKPHACQFPGCTKRFSRSDELTRHSRIHNNPNSRRSNKAQHLAAAAAAAA

PCA-10 (141)GQDAAMVNAANMMPPPSKPITRSAPVSQIGSPDVSPPHSFSNYANHMRSNLGPYSRTSERASSGMDINLL

PCA-10-4/I-7 (141)GQDAAMVNAANMMPPP------ASPL------------L--DLR--------LFLRSALRMFLRLTLSPT PCA-10-4/II-29(141)GQDAAMVNAANMMPPPSKPITRSAPVSQIGSPDVSPPHSFSNYANHMRSNLGPYSRTSERASS------PCA-10 (211)ATAASQVERDDHMGFHGSRHHMYGSRHHSRGLPSLSAYAISQNMTRSHSNDDDDGYGHRVKRSRPNSPNS

PCA-10-4/I-7 (183)MPTTCALTWAPIRAPRSVLLLVWTSICWLLQPRRLSGMTTWASTDRDTTCTDRAITVVVCLRSPPTRSLK

PCA-10-4/II-29(204)---------------------VWTSICWLLQPRRLSGMTTWASTDRDTTCTDRAITVVVCLRSPPTRSLK

PCA-10 (281)TAPSSPTFSHDSLSPTPDHTPLATPAHSPRLRPLGANELHLPSIRHLSLQHTPALAPMEPQPEGPNYYSP

PCA-10-4/I-7 (253)T--------------------------------------------------------------------PCA-10-4/II-29(253)T---------------------------------------------------------------------

PCA-10 (351)GQGHMGPSITDIMSKPDGTQRKLPVPQVPKVAVQDMLNPPTGFYSMYSSANNSVAGGDLADRF

PCA-10-4/I-7 (254)--------------------------------------------------------------PCA-10-4/II-29(254)--------------------------------------------------------------- Рис. 13. Сравнение транслированных нуклеотидных последовательностей генов creA штаммов PCA-10, PCA-10-4/I-7 и PCA-10-4/II-29.

9. Анализ транскрипции генов xylA и creA в мутантных штаммах Для изучения транскрипции генов xylA и creA штаммы P. canescens PCA-10PCA-10-4/I-7 и PCA-10-4/II-29 выращивали в присутствии индуктора на среде с глюкозой. При достижении концентрации глюкозы в среде 30-35 мМ мицелий собирали фильтрованием для выделения РНК, а полученную затем кДНК использовали для проведения ПЦР-РВ.

конститутивной транскрипции гена gpdA P. canescens (рис. 14).

Рис. 14. Анализ транскрипции генов xylA и creA в штаммах PCA-10-4, PCA-10-4/Iи PCA-10-4/II-29 в присутствии индуктора и 30-35 мМ глюкозы.

Как видно из представленных данных, в мутантных штаммах PCA-10-4/I-7 и PCA-10-4/II-29 значительно увеличен уровень транскрипции гена xylA. Также заметно увеличение транскрипции мутантных аллелей гена creA.

10. Получение мутантов по арабинозной индукции из мутантов по углеродной катаболитной репрессии P. canescens Как уже упоминалось, экспрессия генов xylA и bgaS в штамме гриба P.

canescens требует присутствия индуктора L-арабинозы. Таким образом, актуальной являлась задача получения мутантных культур гриба, у которых активационный уровень транскрипции целевых генов достигается в отсутствии Lарабинозы.

Полученные нами штаммы по CCR и наличие в них плазмиды pXHPH, несущей ген hph под контролем промотора гена xylA P. canescens, дали нам возможность прямой селекцией на среде с гигромицином отобрать мутанты, не требующие индуктора для экспрессии генов xylA и bgaS.

После повторного УФ - мутагенеза споры штамма PCA-10-4/I-7 были высеяны на агаризованную среду, содержащую глюкозу, гигромицин Б и X-gal, но не содержащую индуктора L- арабинозу.

Было получено около 2.5 104 клонов устойчивых к гигромицину при росте на глюкозе в отсутствии индуктора, среди которых отобрано 36 клонов, окрашивающих агаризованную среду с X-gal в синий цвет, которые впоследствии были пересеяны на агаризованную среду для повторного тестирования фенотипа.

По результатам этого тестирования выявлены клоны, продуцирующие галактозидазу на среде с глюкозой, с воспроизводимым фенотипом (Рис. 15).

Мутантный штамм PCA-10-4/I-7/12 был использован для дальнейшего анализа.

11. Анализ промоторной специфичности выделенных мутантов на модели промоторов xylA и bgaS.

С целью изучения промоторной специфичности мутации по арабинозной индукции, отобранной на предыдущем этапе, мы выращивали мутантный штамм в жидкой среде содержащей D-глюкозу в присутствии или отсутствии L-арабинозы, после чего определяли активность эндоксиланазы и -галактозидазы – продуктов экспрессии генов xylA и bgaS, соответственно в культуральной жидкости.

Результаты представлены в таблице 3.

Как видно из данных таблицы, в мутантном штамме PCA-10-4/I-7/ продукция как эндоглюканазы, так и -галактозидазы, происходит даже в отсутствии индуктора - L-арабинозы. При этом в исходном штамме секреция этих ферментов полностью зависит от добавления индуктора. Из представленных данных можно заключить, что мутация в штамме PCA-10-4/I-7/12 приводит к арабинозо-независимой индукции обоих генов: xylA и bgaS.

Продукция -галактозидазы и эндоксиланазы штаммами гриба P. canescens.

Штамм Присутствие L- Активность ферментов в культуральной PCA-10-4/I-7/ PCA-10-4/I- Спектр белков в культуральных жидкостях штаммов PCA-10-4/I-7 и PCAI-7/12, выращенных в присутствии или отсутствии арабинозы показан на рис.

16.

XylA Рис. 16. ДДС-ПААГ-электрофорез культуральных жидкостей штаммов PCA-10-4/I-7/12 (дорожки 1,2), PCA-10-4/I-7 (дорожки 3,4) и PCA- (дорожки 5, 6), выращенных в присутствии (дорожки 2, 4, 6) или отсутствии арабинозы (дорожки 1, 3, 5). Стрелками указаны полосы, соответствующие -галактозидазе (BgaS) и эдоксиланазе (XylA). М– маркер молекулярного веса.

ВЫВОДЫ

1. Клонирован и секвенирован ген creA P. canescens, кодирующий центральный регулятор углеродной катаболитной репрессии генов репрессор CreA.

2. Транскрипция гена creA авторегулирована и уменьшается в присутствии проверенных источников углерода, однако увеличение транскрипта в отсутствии источников углерода не приводит к репрессии транскрипции генов – мишеней.

3. Гибридный белок CreA::GFP имеет внутриядерную локализацию, независимо от источника углерода и от концентрации глюкозы в среде, и, таким образом, осуществлении CCR в P. canescens.

4. В промоторах генов bgaS, xylA и creA идентифицированы сайты связывания с белком CreA.

5. Получены мутантные по углеродной катаболитной репрессии штаммы мицелиального гриба P. canescens. Показано, что они содержат мутации в гене creA, приводящие к дерепрессии гена xylA и, собственно, creA на уровне транскрипции.

6. На основе creA мутанта получены штаммы c арабинозо – независимой экспрессией генов bgaS и xylA, перспективные для создания на их основе штаммов-продуцентов белков

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Чулкин А. М., Вавилова Е. А., Беневоленский С. В. Транскрипционный регулятор углеродной катаболитной репрессии CreA мицелиального гриба Penicillium canescens. Молекулярная биология. – 2010. - том 44 - стр. 1–11.

2. Чулкин А. М., Вавилова Е. А., Беневоленский С. В. Мутационный анализ углеродной катаболитной репрессии у мицелиального гриба Рenicillium canescens. Молекулярная биология. – 2011. - том 45 - стр. 1–8.

3. Абянова A.Р., Чулкин А.М., Вавилова Е.А., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Королева О.В., Беневоленский С.В. Гетерологичная продукция лакказы Trametes hirsuta в грибах Penicillium canescens. Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. - том 46 - стр. 342–347.

4. Королева О.В., Степанова Е.В., Федорова Т.В., Логинов Д.С., Черкашин Е.А., Беневоленский С.В., Вавилова Е.А., Чулкин А.М., Абянова А.Р., Бударина Ж.И., Юркова Т.В., Захарова М.В., Леонтьевский А.А., Солонин А.С., Пожидаева З.А. Рекомбинантная лакказа лигнинолитического гриба Trametes sp. и способ её получения. Патент РФ № 2394912 от 20.07.2010.

5. Чулкин А.М., Беневоленский С.В. Штамм гриба Penicillium canescens – продуцент секретируемой эндо-(1-4)-бета-ксиланазы с пониженной активностью эндоглюканаз. Материалы международного симпозиума "ЕСРоссия: преспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-й кн.:"Биотехнология будущего", C. 100-102.

6. Chulkin A.M, Vavilova E.A., Benevolensky S.V. Transcriptional regulator of carbon catabolite repression CreA in filamentous fungus Penicillium canescens.

IMC9 THE BIOLOGY OF FUNGI, Edinburgh, UK, 1-6 august 2010.



 


Похожие работы:

«ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP1 И ELIP2 У Arabidopsis thaliana 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА Официальные оппоненты : доктор...»

«ТЛЕХАС ЗАРА РАМАЗАНОВНА ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВ РЕСПУБЛИКИ АДЫГЕЯ ПРИ ХИМИЧЕСКОМ ЗАГРЯЗНЕНИИ 03.00.27 – почвоведение 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2008 2 Работа выполнена на кафедре землеустройства Майкопского государственного технологического университета Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор Колесников Сергей Ильич доктор биологических наук,...»

«Тишин Денис Владимирович ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАДИАЛЬНЫЙ ПРИРОСТ ОСНОВНЫХ ВИДОВ ДЕРЕВЬЕВ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ Специальность 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2006 2 Работа выполнена в лаборатории биомониторинга Института экологии природных систем АН РТ, г. Казань Научный руководитель : кандидат биологических наук Аськеев Олег Васильевич Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«Горобцова Ольга Николаевна Экологическая оценка уровня загрязнения почв и растительности 3,4-бенз(а)пиреном в зоне влияния Новочеркасской ГРЭС 03.00. 27 – почвоведение 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2007 2 Работа выполнена на кафедре агроэкологии и физиологии растений Донского государственного аграрного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Назаренко Ольга...»

«КОРМИЛЬЦЕВА ИННА ПЕТРОВНА ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ПРИ ВНЕСЕНИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет. Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Куриненко Борис Михайлович Официальные оппоненты :...»

«Шелковникова Татьяна Александровна Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории нейрохимии физиологически активных веществ и в лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Учреждения Российской академии наук Института...»

«КОТОВА Яна Николаевна Исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович Официальные оппоненты : доктор медицинских наук,...»

«Хикматуллина Гульшат Радиковна СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ ЛИСТЬЕВ ДРЕВЕСНЫХ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ УРБАНИЗИРОВАННОЙ СРЕДЫ Специальность 03.02.08 - экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 1 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии растений ФГБОУ ВПО Удмуртский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Баранова Ольга Германовна ФГБОУ ВПО...»

«Каплан Игорь Борисович Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов 03.02.02 – Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и на кафедре фитопатологии Корнельского университета (г. Итака, США) Научный консультант : доктор биологических наук, профессор, академик РАН...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«БИРЮКОВ Сергей Александрович ПАРАМФИСТОМИДОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ХОЗЯЙСТВАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА НЕЧЕРНОЗЕМНОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 2014 Работа выполнена на факультете ветеринарной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина Научный руководитель : ЛЕМЕХОВ Полиэкт Анатольевич...»

«ЗАГУРНАЯ ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТАЦИИ НА ВИДОВОЕ БОГАТСТВО И СОСТАВ ФИТОЦЕНОЗОВ ШИРОКОЛИСТВЕННЫХ ЛЕСОВ ЗАПАДНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2010 2 Работа выполнена на кафедре экологии и защиты окружающей среды Майкопского государственного технологического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Акатов Валерий Владимирович Официальные...»

«БАЖЕНОВ Юрий Александрович МЛЕКОПИТАЮЩИЕ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ (ФАУНА, НАСЕЛЕНИЕ, ЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СООБЩЕСТВ) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН, Федеральном государственном бюджетном учреждении...»

«РАЧЕНКО МАКСИМ АНАТОЛЬЕВИЧ ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СОРТОВ ЯБЛОНЬ В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО ПРЕДБАЙКАЛЬЯ Специальность 03.02.01 – ботаника (биологические наук и) 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2011 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Иркутской государственной сельскохозяйственной академии Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Худоногова Елена Геннадьевна...»

«ТРУШКОВА Марина Александровна СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЛАНДШАФТАХ РАЗЛИЧНОГО РАНГА (на примере Нижегородского Поволжья) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 2 Работа выполнена на кафедре зоологии и общей биологии естественно-географического факультета ГОУ ВПО Нижегородский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических...»

«Азнаурьян Диана Карповна ИЗМЕНЕНИЕ ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПОЧВ ЮГА РОССИИ ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ НЕФТЬЮ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования ФГОУ ВПО Южный федеральный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Колесников Сергей Ильич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Зубкова...»

«АШИБОКОВА ЛИАНА РАШИДОВНА ЭКОЛОГО-ЦЕНОТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДГОРНЫХ СТЕПЕЙ КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕСИИ И ИХ ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена в ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхозакадемии Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Дзыбов Джантемир Сосренович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Акатов...»

«Альфрайхат Махмуд Хасан УСТОЙЧИВОСТЬ ПОЧВ ВЫСОКОГО ПЛАТО ИОРДАНИИ И ЕГО ОБРАМЛЕНИЯ Специальность: 03.00.27-почвоведение Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва-2009 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения и земледелия Российского университета дружбы народов Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ларешин Вячеслав Григорьевич. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ганжара Николай...»

«Сибгатуллина Гузель Валерьевна РЕДОКС-МЕТАБОЛИЗМ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО МОРФОГЕННОЙ СПОСОБНОСТИ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук...»

«КИРИЛЮК Ольга Кузьминична ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ СЕТИ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ ЭКОРЕГИОНА ДАУРСКАЯ СТЕПЬ Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Хабаровск – 2011 Работа выполнена в лаборатории эколого-экономических исследований Института природных ресурсов, экологии и криологии СО РАН и Государственном природном биосферном заповеднике Даурский...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.