WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ОСИПЕНКОВА Ольга Валерьевна

РОЛЬ РЕТРОГРАДНЫХ ПЛАСТИДНЫХ СИГНАЛОВ

В ЭКСПРЕССИИ ЯДЕРНЫХ ГЕНОВ СТРЕССОВЫХ БЕЛКОВ ELIP1 И ELIP2

У Arabidopsis thaliana

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории биохимии хлоропластов Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Н.П. ЮРИНА

Официальные оппоненты: доктор биологических наук И.В. ЕЛАНСКАЯ доктор биологических наук, профессор В.В. КУЗНЕЦОВ

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского при МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 18 2009 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Хлоропласты являются не только центрами фотосинтетической деятельности растительных тканей, но принимают участие также в биосинтезе аминокислот, витаминов, пиримидинов, начальных этапах биосинтеза абсцизовой кислоты, восстановлении сульфатов и ряде других процессов. Хотя хлоропласты имеют собственный геном, большинство белков, необходимых для их функционирования, кодируется ядерным геномом и только небольшая часть кодируется геномом органелл (Leister, 2003; Одинцова и Юрина, 2003). Координированная экспрессия генов ядра и пластид, необходимая для развития и функционирования растительной клетки, достигается путем внутриклеточных взаимодействий ядра и пластид с помощью антероградного (от ядра к пластидам) и ретроградного (от пластид к ядру) механизмов регуляции (Taylor, 1989; Rodermel and Park, 2003). Важная роль ретроградных пластидных сигналов показана для биосинтеза хлорофилла, транспорта белков в органеллы и ответных реакций растений на стрессовые воздействия (Strand et al., 2003; Юрина и Одинцова, 2006). Роль таких сигналов выполняют продукты синтеза белка в пластидах, тетрапирролы (интермедиаты биосинтеза хлорофилла), а также редокс-состояние пула пластохинонов фотосинтетической электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) пластид (Leister, 2003; Strand et al., 2003; Beck, 2005; Погульская и др., 2006;

Юрина и Одинцова, 2006; Осипенкова и др., 2007). Для исследования ретроградных пластидных сигналов используют genome uncoupled (gun) мутанты Arabidopsis с нарушенной передачей пластидных сигналов (Strand et al., 2003). Идентифицированы пять неаллельных gun мутантов, у которых экспрессия кодируемых ядром генов хлоропластных белков, таких как Lhcb1 и RbcS, увеличивалась на свету в присутствии гербицида норфлуразона, подавляющего синтез каротиноидов и вызывающего значительные фотоокислительные повреждения хлоропластов из-за образования активных форм кислорода (АФК).

Клонированные гены соответствовали пяти оригинальным локусам GUN1-GUN5, четыре из которых (GUN2-GUN5) кодировали белки, участвующие в метаболизме тетрапирролов (Mochizuki et al., 2001; Larkin et al., 2003). Было высказано предположение, что высшие растения могут использовать Mg-протопорфирин IX (Mg-Proto) и его монометиловый эфир (Mg-ProtoMe) в качестве сигнальных молекул хлоропластов (Woodson and Chory, 2008), хотя до сих пор этот вопрос остается спорным.

Так как растения постоянно подвергаются воздействию неблагоприятных факторов внешней среды, особый интерес приобретает исследование экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP (Early Light-Inducible Proteins), которые играют важную роль в защитных реакциях растений в ответ на действие стрессовых факторов. Эти белки синтезируются на ранних этапах зеленения этиолированных проростков, в условиях светового стресса, засухи и действия низких температур (Grimm and Kloppstech, 1987;

высокомолекулярный (ELIP2) белки, относящиеся к мультигенному семейству светособирающих хлорофилл a/b-связывающих (LHC) белков, кодируются ядром, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, и в форме предшественников посттрансляционно транспортируются в хлоропласты (Montane and Kloppstech, 2000).

Имеющиеся данные о ретроградных сигналах не позволяют судить о том, какие соединения являются сигнальными молекулами и как влияют пластидные сигналы на экспрессию генов белков светового стресса. Изучение экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов Arabidopsis поможет получить информацию о роли пластидных сигналов в регуляции транскрипции ядерных генов фотосинтеза.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы было изучение роли ретроградных пластидных сигналов в экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP с помощью gun и hy (аллельных gun) мутантов Arabidopsis thaliana, характеризующихся нарушениями биосинтеза тетрапирролов.

В соответствии с указанной целью были поставлены следующие экспериментальные задачи:

1. Изучить влияние нарушений передачи тетрапиррол-медиированного ретроградного пластидного сигнала на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2, а также корреляцию между экспрессией этих генов и содержанием хлорофилла на разных стадиях развития hy и gun мутантов Arabidopsis.

2. Выяснить роль предшественников биосинтеза тетрапирролов в экспрессии генов ELIP у hy и gun мутантов с помощью ингибиторного анализа и увеличения содержания Mgпротопорфирина IX. Определить содержание предшественников тетрапирролов (протопорфирина IX, Mg-протопорфирина IX и его монометилового эфира).

3. Изучить действие других типов пластидных сигналов (активных форм кислорода и редокс-состояния пула пластохинонов) на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2.

4. Изучить влияние некоторых сигнальных систем клетки (световой, гормональной и углеводной) на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

Научная новизна. Впервые показано, что нарушения в HY1, HY2 и GUN4 (но не GUN5) сигнальных путях приводят к изменению экспрессии генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2. Ретроградные пластидные сигналы негативно регулируют экспрессию этих генов. Выявлены различия в световой и пластидной регуляции экспрессии генов близкородственных белков ELIP и Lhcb и генов, кодирующих ферменты биосинтеза хлорофилла. Впервые показано, что интермедиаты биосинтеза тетрапирролов - Mg-Proto и его монометиловый эфир - влияют на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2, возможно, опосредованно через АФК и редокс-состояние компонентов электрон-транспортной цепи (ЭТЦ) хлоропластов. Эти тетрапирролы непосредственно не участвуют в регуляции экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. Обнаружена обратная корреляция между экспрессией генов ELIP1 и ELIP2 и содержанием хлорофилла у gun мутантов. Показано, что белки ELIP модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, фотоокислительный стресс.

Научно-практическая ценность. Детальное изучение молекулярных механизмов экспрессии генов и путей передачи сигналов, регулирующих экспрессию генов, необходимых для функционирования ядра и хлоропластов, является перспективным.

Биохимические и молекулярно-биологические методы и подходы, используемые при изучении этих механизмов, не уступают мировому уровню и являются пионерскими.

Выявление процессов, участвующих в генерации и передаче пластидных сигналов, имеет не только самостоятельный научный интерес, но и позволяет расширить представления о механизмах передачи сигналов и координированной регуляции экспрессии ядерных генов пластид. Молекулярная характеристика индивидуальных компонентов, участвующих в передаче сигналов, необходима для дальнейших исследований в этом направлении. Эти результаты могут быть использованы для регуляции процессов фотосинтеза, который определяет продуктивность сельскохозяйственных растений.

международных симпозиумах «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Россия, Татарстан, Казань, 2006); “Photosynthesis in the post-genomic era:

structure and function of photosystems” (Россия, Пущино, 2006); «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященном 100-летию акад. Н.М. Сисакяна (Россия, Дубна, 2007; Армения, Ереван, 2007) и на международной конференции FEBS "Origin and evolution of mitochondria and chloroplasts" (Италия, Маратея, 2007), а также на VI съезде общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Россия, Коми, Сыктывкар, 2007) и семинаре кафедры физиологии растений университета им. А. Гумбольдта «Retrograde signaling in plants» (Германия, Берлин, 2008).

Публикации. Опубликовано 2 статьи в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ, 1 статья в сборнике и 6 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы ( главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников). Диссертация изложена на страницах, содержит рисунков и таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В обзоре литературы дана общая характеристика антероградных и ретроградных сигналов. Детально рассмотрены современные представления о роли тетрапирролов, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии ядерных генов белков пластид. Дан краткий обзор биосинтеза тетрапирролов. Приведено краткое описание некоторых сигнальных систем клетки и их роли в экспрессии ядерных генов белков, участвующих в фотосинтезе, а также структуры и функций белков ELIP.

Растения и условия выращивания.

В работе были использованы мутанты (hy, gun) и растения дикого типа (ДТ) Arabidopsis thaliana (Arabidopsis): gun5 мутанты были предоставлены проф. Дж. Чори (The Salk Institute for Biological Studies, USA); gun5-1 и gun4 мутанты были получены от ABRC (Ohio State University, USA); hy1 (gun2) и hy2 (gun3) мутанты были получены от проф. А.

Смит (University of Cambridge, UK). Поверхностно стерилизованные семена растений проращивали в стерильных чашках Петри на 2xMС (Murashige and Scoog) среде в течение дней при режиме 8 ч свет/ 16 ч темнота, низкой освещенности (LL) (30 µмоль м-2 с-1) и температуре 20-23° С. Для экспериментов со взрослыми растениями проростки растили в земле в течение 30 дней на свету стандартной интенсивности (SL) (70 µмоль м-2 с-1).

Некоторые чашки с семенами подвергали 30-мин экспозиции на свету (70 µмоль м-2 с-1) и затем помещали в темноту для прорастания в течение 10 дней. Семена ячменя (Hordeum vulgare L) проращивали в чашках Петри на смоченной водой фильтровальной бумаге при 20С в темноте или при освещении (12 ч свет/ 12 ч темнота) в течение 7 дней. Растения перед всеми опытами выставляли на свет высокой интенсивности (HL) (350 или 550 µмоль м2 с-1), либо холод (10° С) на 2 ч для индукции белков светового стресса пластид ELIP.

Обработка растений.

Норфлуразон (НФ) добавляли в среду для выращивания растений в концентрации µМ, или растения опрыскивали на свету ежедневно в течение одной недели раствором НФ той же концентрации. С 5 мМ 2,2'-дипиридила (ДП) растения инкубировали в течение 8 ч ( ч при 20-23° C и 2 ч при 10° C). Ацифлуорфен (АФ) добавляли в среду (0.05 µM) или опрыскивали им растения (1, 5, 10, 20, 30 и 50 µM) в течение трех дней. В опытах с интермедиатами тетрапирролов инкубацию листьев проводили в водном растворе 50 µМ MgProto в течение 5 ч (3 ч при 20-23° C и 2 ч при 10° C). Инкубацию с 1 мM 5аминолевулиновой кислоты (АЛК) проводили в течение 2 ч в условиях HL. Для ингибирования фотохимической активности фотосистемы 2 (ФС2) растения инфильтрировали водным раствором 120 µМ 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевины (диурон). Для опытов с абсцизовой кислотой (АБК) или глюкозой растения в течение 4 дней выращивали на стерильных бумажных фильтрах, погруженных в 2хMС среду, содержащую 2% сахарозу. Затем их переносили на среду, содержащую 5 M АБК или 7% глюкозу, и выращивание продолжали еще в течение 6 дней. Семена ячменя замачивали в водном растворе меламиновой соли бис(оксиметил)-фосфиновой кислоты (мелафена) различной концентрации (0.5х10-10 М; 0.5х10-8 М; 0.5х10-5 М; 0.5х10-3 М) в течение 2 ч.

Выделение РНК.

Из гомогенизированных образцов растений с помощью набора «RNeasy Plant Mini kit»

(«QIAGEN», Германия), «TRIsure» («BIOLINE», Германия) или «YellowSolve» («Клоноген», Санкт-Петербург, Россия) выделяли суммарную РНК в соответствии с рекомендациями производителей. Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Электрофорез проводили при напряжении 70 В в течение 1 ч в 1хМОРS буфере (0.2 М MOPS; 50 мМ ацетат Na; 1 мМ ЭДТА, рН 8.0). РНК предварительно смешивали с 10 µл буфера для нанесения «LoadingMix» (10хMOPS - 10 µл, 37% формальдегид - 35 µл, 100% формамид - 100 µл, стерильная вода - 53 µл, 0.5 µг/мл этидий бромид (EthBr - 2 µл), прогревали при 65° С в течение 5 мин и наносили на 1.5% агарозный гель. Флуоресценцию комплекса РНК-EthBr обнаруживали в УФ-свете (трансиллюминатор ТСР-15М «Vilber Lourmat», Франция) и анализировали с использованием видеосистемы «DNA Analyzer» («Хеликон», Россия) и «AlphaEaseFS StandAlone» («Alpha INNOTECH», «BIOZYM», Германия).

Подбор праймеров.

Праймеры для последовательностей генов ELIP1, ELIP2, 18S рРНК, UBQ10, ChlH, Lhcb2, HEMA1 и HEMA2 Arabidopsis и ячменя выбирали с помощью программы «Primer Input 0.4.0» (http://frodo.wi.mit.edu) и заказывали у фирм «БиоТехЛит» (Россия) или «SIGMAAldrich» (Германия). Последовательности праймеров представлены в таблице 1.

Таблица 1. Специфические праймеры, использованные для ПЦР.

ELIP HVLP ELIP клон HVLP Получение комплементарной ДНК (кДНК) с помощью реакции обратной транскрипции (ОТ).

кДНК синтезировали, используя набор «Синтез первой цепи кДНК (базовый)»

(«СилексМ», Россия) или «Omniscript RT kit» («QIAGEN», Германия), согласно рекомендациям производителей. Для проведения реакции использовали Олиго-дТ или специфические праймеры. Реакцию ОТ проводили на амплификаторе «ДНК ТП-4ПЦР- Терцик» («ДНК-Технология», Россия) или «T3 THERMOCYCLER» («Biometra», Германия).

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени («Real-time» ПЦР).

«Real-time» ПЦР проводили на роторном анализаторе «Rotor-Gene (RG) 3000»

(«Corbett Research», Англия) с реакционной смесью, которая содержала: 2х «ImmoMix» (с 1. мМ MgCl2) («BIOLINE», Германия) – 10 µл; 35 мМ MgCl2 («BIOLINE», Германия) – 2 µл;

50xSYBR Green («QIAGEN», Германия) – 0.4 µл; 10 мМ прямого и обратного праймеров – по 1 µл; кДНК – 2 µл; стерильная вода – 2.6 µл. Реакцию проводили по следующей схеме:

1. Начальная денатурация - 94°С, 3 мин – 1 цикл. 2. Амплификационный цикл ( повторов): денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров - 61° С, 30 с; элонгация - 72° С, 15 с.

3. Достраивание цепей ДНК - 72° С, 3 мин – 1 цикл.

Кривую плавления строили, устанавливая базовую линию и порог амплификации в соответствии с рекомендациями производителя роторного анализатора. Полученные данные анализировали с помощью программного обеспечения LinRegPCR (Pfaff, 2001; Ramakers, 2003). Относительное содержание транскриптов нормализировали по UBQ10. Для подтверждения отсутствия примесей проводили реакции «негативного контроля» без добавления кДНК со всеми используемыми праймерами.

Стандартная ПЦР.

Для ПЦР использовали наборы «ОТ-ПЦР базовый» («СилексМ», Россия) и «BIOTAG PCR Kit» («BIOLINE», Германия). Реакционные смеси (25 µл) готовили согласно рекомендациям производителей. Реакцию амплификации проводили по следующей схеме:

1. Начальная денатурация - 94°С, 3 мин – 1 цикл. 2. Амплификационный цикл ( повторов): денатурация - 94°С, 30 с; отжиг праймеров - 54 (61)° С (в зависимости от используемых праймеров), 30 с; элонгация - 72° С, 15 с. 3. Достраивание цепей ДНК - 72° С, 5 мин – 1 цикл. 4. Хранение – 4°С.

Было выбрано оптимальное число циклов ПЦР. Контролем, подтверждающим нанесение равных количеств суммарной кДНК, служили 18S рРНК и UBQ10. Параллельно проводили реакции без добавления полимеразы для доказательства отсутствия примесей.

Электрофорез ПЦР-продуктов.

Амплифицированные фрагменты разделяли с помощью электрофореза в 1.5% (для фрагментов 300 п.н.) и 2% (для фрагментов 300 п.н.) агарозном геле, содержащем 1хТАЕ буфер (0.04 М Трис-ацетат, 2 мМ ЭДТА) в присутствии 0.5 µг/мл EthBr при напряжении 120В в течение 25 мин. Размер продукта амплификации определяли сравнением с маркерами длин фрагментов. Гель фотографировали и анализировали, как описано выше. Рестрикция амплифицированного фрагмента ДНК ферментами HindIII и BamHI являлась доказательством, что амплификация прошла корректно.

Определение содержания интермедиатов биосинтеза тетрапирролов.

Содержание протопорфирина IX (Proto), Mg-Proto и Mg-ProtoМе определяли по методу, описанному в литературе (Alawady and Grimm, 2005).

Измерение фотохимической активности ФС2.

Флуоресценцию хлорофилла a измеряли на импульсном флуориметре РАМ (РАМ 101/PDA, Heinz Walz, Effeltrich, Германия).

1. Участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков ELIP1 и ELIP2 у Arabidopsis.

1.1. Экспрессия генов ELIP и содержание хлорофилла у hy и gun мутантов на разных стадиях развития растений.

Рис. 1. Уровень экспрессии ELIP1 и ELIP2 у 10- и 30-дневных hy и gun участвующий в регуляции активности Mgмутантов Arabidopsis. Содержание транскриптов определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у ДТ фермента).

растений, который принимали за 100%.

Анализ ОТ-ПЦР показал, что уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных gun5 и gun5-1 мутантов (полиморфизм в экзоне 3) сходны с уровнем экспрессии этих генов у растений дикого типа. Однако уровень экспрессии генов ELIP у hy1, hy2 мутантов увеличивался на 30-40%, а у gun4 мутантов на 50-60% по сравнению с растениями дикого типа. Уровень экспрессии ELIP2 был ниже, чем ELIP1, как у мутантов, так и у растений дикого типа (рис. 1).

Для того чтобы исследовать экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 в процессе развития растений, был проведен эксперимент со взрослыми растениями hy и gun мутантов Arabidopsis. ОТ-ПЦР анализ содержания транскриптов генов ELIP у 30-дневных растений показал, что различия в уровнях экспрессии этих генов у мутантов и растений дикого типа сходны с различиями, наблюдающимися у 10-дневных растений (рис. 1).

Исследование содержания хлорофилла в хлоропластах hy и gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis показало, что растения с мутациями, повреждающими пластидные ферменты биосинтеза тетрапирролов, характеризуются пониженным содержанием хлорофилла (у gun4, hy1 и hy2 мутантов накапливалось ~ 50% хлорофилла; у gun5-1 (gun5) ~ 80%, по сравнению с растениями дикого типа). Различия по содержанию хлорофилла между мутантами и диким типом не зависят от возраста растений. В то же время у взрослых растений хлорофилла накапливалось больше (~ в 2 раза), чем у 10-дневных проростков (рис. 2).

Таким образом, было показано, что HY1, HY2 и GUN4 пластидные сигналы позитивно регулируют экспрессию генов ELIP независимо от возраста растений. Эти факты свидетельствуют о том, что экспрессия генов ELIP находится под влиянием пластидных сигналов, генерируемых биосинтезом тетрапирролов. Обнаруженная обратная корреляция между накоплением транскриптов ELIP и содержанием хлорофилла у gun мутантов с нарушениями биосинтеза тетрапирролов, по-видимому, указывает на то, что белки ELIP модулируют синтез хлорофилла, предотвращая накопление свободного пигмента и, таким образом, защищая клетки от фотоокисления.

1.2. Действие норфлуразона на экспрессию генов ELIP у hy и gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.

Для того чтобы изучить участие интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, как пластидных сигналов, в регуляции экспрессии генов ELIP, были проведены опыты с gun мутантами и ДТ растениями Arabidopsis в присутствии НФ. Как известно, обработка растений НФ - ингибитором биосинтеза каротиноидов, приводит к нарушению функционирования хлоропластов (Mayfield and Taylor, 1987) и подавлению пластидного сигнала (Woodson and Chory, 2008).

Анализ пигментного состава пластид растений, обработанных НФ, показало полное отсутствие хлорофилла и каротиноидов у 10-дневных проростков. Исследование содержания транскриптов ELIP1 и ELIP2 с помощью ОТ-ПЦР и ПЦР в режиме реального времени у растений дикого типа показало, что полная дисфункция пластид (при обработке НФ) приводит к значительному ингибированию (на 80-90%) экспрессии ELIP (рис. 3). Однако у НФ-обработанных hy и gun мутантов Arabidopsis наблюдалось только частичное ингибирование экспрессии этих генов (на 40-50%).

Рис. 3. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных растений hy и gun мутантов и ДТ Arabidopsis, выросших в присутствии 5 µM НФ (+) и без добавления ингибитора (-). (A) ОТ-ПЦР анализ накопления ELIP. (Б, В) ПЦР анализ в режиме реального времени. UBQ использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у контрольных растений, который принимали за 100%.

Для того чтобы изучить изменяется ли действие ретроградного сигнала на экспрессию ELIP в процессе развития растений, было изучено действие НФ на 30-дневные растения Arabidopsis. Результаты, полученные с помощью ОТ-ПЦР, показали, что экспрессия ядерных генов стрессовых белков ELIP1 и ELIP2 у НФ-обработанных растений дикого типа была подавлена (на 80-90%), а у hy и gun мутантов практически не изменялась (рис. 4).

Рис. 4. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у НФ-обработанных (+) и контрольных (-) 30-дневных hy и gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Таким образом, результаты, полученные при исследовании мутантов с нарушениями в передаче пластидного сигнала, и с помощью ингибиторного анализа, показали, что пластидные сигналы, индуцируемые интермедиатами биосинтеза тетрапирролов, участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов хлоропластных белков ELIP в зависимости от возраста растений.

1.3. Влияние экзогенного и эндогенного Mg-Proto на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у gun5 мутантов и растений дикого типа Arabidopsis.

Ранее было высказано предположение, что Mg-Proto и Mg-ProtoМе – интермедиаты биосинтеза тетрапирролов могут выступать в роли молекул, передающих сигнал от пластид к ядру. Мы проверили, существует ли зависимость между накоплением этих молекул и содержанием транскриптов ядерных генов ELIP с помощью увеличения их содержания эндогенно (добавлением гербицида ДП) и экзогенно (добавлением Mg-Proto). Как известно, ДП ингибирует биосинтез тетрапирролов на стадии превращения Mg-ProtoМе в протохлорофиллид, в результате чего происходит избыточное накопление Mg-ProtoМе.

ДП в условиях фотодеструкции, вызванной НФ, приводил к значительному подавлению экспресии генов ELIP, как у растений дикого типа, так и у gun5 мутантов (рис. 5А). Как было сказано выше, экспрессия этих же генов у растений, которые были обработаны одним НФ, была только частично подавлена у мутантов (рис. 5Б). Следовательно, повышение содержания Mg-Proto в хлоропластах коррелирует с экспрессией генов ELIP. Кроме того, дополнительным доказательством было значительное снижение экспрессии генов ELIP у растений дикого типа и gun5 мутантов при действии самого Mg-Proto на клетки растений (рис. 5В).

Рис. 5. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 после обработки НФ, ДП и Mg-Proto (+) у gun5 (gun5-1) мутантов и ДТ растений Arabidopsis и контрольных растений (-). (А) 10дневные растения инкубировали с раствором 5мM ДП. (Б) Растения росли на НФ-среде. (В) Листья 30-дневных растений инкубировали с 50 µM Mg-Proto. UBQ10 и 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Эти данные и данные литературы позволяли предполагать, что Mg-Proto может выступать в роли сигнальной молекулы, которая участвует в передаче сигналов от хлоропластов к ядру, регулируя экспрессию ядерных генов белков хлоропластов ELIP1 и ELIP2.

1.4. Содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов у gun мутантов и растений дикого типа Arabidopsis, выращенных в присутствии или без НФ.

Для того чтобы выяснить, коррелирует ли содержание интермедиатов биосинтеза тетрапирролов с уровнем экспрессии ядерных генов белков пластид ELIP, было изучено содержание предшественников хлорофилла (Proto, Mg-Proto и Mg-ProtoMe) в присутствии НФ у проростков Arabidopsis в условиях светового стресса.

Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) показали, что в отсутствие ингибитора уровень Proto был выше у gun5-1 и gun4 мутантов по сравнению с ДТ (рис. 6А). В присутствии НФ накопление Proto было подавлено ~ на 100% у gun4 мутантов и ДТ растений, и у gun5-1 мутантов ~ на 50%. Содержание Mg-Proto и Mg-ProtoMe у необработанных gun5-1, gun4 мутантов не отличалось от их уровня у растений дикого типа.

Видимо, gun мутации не влияют на накопление этих интермедиатов у растений. В присутствии НФ содержание Mg-Proto и Mg-ProtoMe снижалось как у ДТ растений, так и у gun мутантов. Как следует из рис. 6Б, в присутствии НФ экспрессия генов ELIP была подавлена у растений дикого типа и частично восстановлена у gun5-1 и gun4 мутантов.

Таким образом, прямое определение содержания Mg-Proto и Mg-ProtoMe с помощью HPLC не выявило корреляции между уровнем накопления Mg-Proto и Mg-ProtoМе в условиях фотодеструкции, вызванной НФ, и экспрессией генов ELIP. Следовательно, эти интермедиаты биосинтеза тетрапирролов не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро.

Рис. 6. Содержание тетрапирролов (А) и транскриптов ELIP1 и ELIP2 (Б) у 10-дневных gun4, gun5-1 мутантов и ДТ растений Arabidopsis, выросших на НФ-среде (+) или на среде без ингибитора (-). СВ - сырой вес. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии генов ELIP1 у ДТ растений, который принимали за 100%.

Это, однако, не означает, что тетрапирролы вообще не участвуют в передаче пластидного сигнала. Не исключено, что деградация Mg-Proto приводит к образованию побочных продуктов (например, АФК) или к сдвигу редокс-состояния ЭТЦ пластид, которые и могут выступать в качестве ретроградных сигналов. Кроме того, возможно побочное действие ингибиторов (НФ, ДП), поскольку эти гербициды влияют на различные биологические процессы в клетке, которые также могут участвовать в регуляции экспрессии ядерных генов. Несмотря на большое количество полученных данных, остается неясным, как нарушение метаболизма тетрапирролов может приводить к восстановлению транскрипции ELIP, и каков механизм передачи пластидного сигнала, Для того чтобы это выяснить, необходимы дальнейшие исследования.

2. Влияние других типов пластидных сигналов на экспрессию генов ELIP при нарушении биосинтеза тетрапирролов у hy и gun мутантов.

Для того чтобы изучить участие АФК, как возможных пластидных сигналов, в экспрессии генов ELIP использовали ацифлуорфен, который ингибирует протопорфириноген-оксидазу (ППО) и приводит к образованию АФК (Matringe et al., 1989).

Обработка АФ растений дикого типа и gun5-1, hy1, hy2 мутантов Arabidopsis на разных стадиях их развития показала, что взрослые растения более АФ-толерантны, чем молодые растения, причем толерантность растений на HL выше, чем на LL. Была обнаружена также повышенная резистентность к АФ у молодых проростков gun5-1 мутантов, имеющих дефект в Н-субъединице Mg-хелатазы, что указывает на участие этого фермента в резистентности к гербициду.

С помощью ОТ-ПЦР было показано, что содержание транскриптов ELIP1 и ELIP было снижено у 30-дневных растений дикого типа, обработанных 50 µM ингибитора, и составляло всего около 30% и 15%, соответственно. Обработка 30 µM АФ приводила к снижению уровня экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 на ~ 50% и ~ 65%, соответственно (рис.

7А).

Рис. 7. Уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 у 30- (А) и 10-дневных (Б) растений Arabidopsis, обработанных АФ. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 определяли относительно уровня экспрессии у ДТ растений, который принимали за 100%.

Изучение экспрессии этих генов у молодых растений, развитие которых было подавлено гербицидом, показало, что экспрессия генов ELIP у 10-дневных проростков ДТ и hy мутантов, выращенных на АФ-среде, подавляется на 80-90%. У АФ-обработанных gun5- мутантов было обнаружено снижение экспрессии генов ELIP только ~ на 30% (рис. 7Б).

Таким образом, АФ влияет на экспрессию генов ELIP у растений Arabidopsis, причем увеличение концентрации АФ приводит к более сильному ингибированию экспрессии генов ELIP1 и ELIP2. В основе этой регуляции, вероятно, лежит е накопление Proto, которое ведет к образованию АФК. По-видимому, можно говорить о негативной регуляции экспрессии генов ELIP пластидным сигналом с участием АФК. Однако нельзя исключить возможного побочного действия АФ, что может приводить к накоплению других соединений, которые также могут участвовать в экспрессии ядерных генов ELIP.

Для того чтобы изучить экспрессию ядерных генов ELIP1 и ELIP2 при накоплении интермедиатов биосинтеза тетрапирролов, в условиях, когда хлоропласты подвержены фотоокислению, была использована АЛК. При действии АЛК на HL избыточное накопление тетрапирролов в клетках приводит к индукции АФК (рис. 8). У мутантов с нарушенной передачей сигнала содержание транскриптов ELIP коррелирует с фотоокислением клеток и заметно ниже (10-20% от контроля), чем у растений дикого типа (60-80% от контроля) после воздействия АЛК (рис. 8).

Рис. 8. ОТ-ПЦР анализ накопления транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 30- окислительного стресса, что может являться дневных gun4, gun5-1 мутантов и растений дикого типа (ДТ) Arabidopsis, инкубированных с 1 растений.

мМ АЛК на HL (2 ч). UBQ регуляции экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis были проведены опыты со специфическим ингибитором, блокирующим транспорт электронов от ФС2 к ПП, диуроном. Этот ингибитор препятствует восстановлению пула пластохинонов и приводит к накоплению окисленных форм ПП.

Наши данные показали, что действие диурона приводит к снижению транскрипции генов ELIP и подавлению фотохимической активности ФС2 (Осипенкова и др., 2007).

Обработка растений ячменя диуроном с помощью опрыскивания приводила к снижению уровня транскрипции генов ELIP на 70-80%, с помощью инфильтрации - к значительному ингибированию (~ на 90%) экспрессии этих генов (рис. 9).

Нарушение биосинтеза тетрапирролов (у gun5 мутантов) не влияло на экспрессию генов ELIP при обработке диуроном. Фотохимическая активность ФС2 у 7-дневных растений ячменя, обработанных диуроном, была подавлена ~ на 30% (Осипенкова и др., 2007).

Таким образом, эти результаты подтверждают, что редокс-состояние пула пластохинонов хлоропластов может выступать в роли негативного пластидного сигнала при экспрессии генов ELIP у растений ячменя и Arabidopsis.

3. Влияние некоторых сигнальных систем клетки на экспрессию генов ELIP при нарушении пластидного сигнала у gun мутантов Arabidopsis.

3.1. Действие пластидного сигнала при разной интенсивности света на экспрессию генов мультигенного семейства белков LHC: ELIP1, ELIP2 и Lhcb2 и экспрессию генов, кодирующих ферменты биосинтеза тетрапирролов (HEMA1, HEMA и ChlH).

Был проведен анализ экспрессии генов стрессовых белков хлоропластов ELIP и близкородственного гена Lhcb2 с генами, кодирующими ферменты биосинтеза тетрапирролов (HEMA1, HEMA2 и ChlH) у hy и gun мутантов при разной интенсивности света, для того чтобы сравнить участие ретроградной регуляции и света в их экспрессии.

Изучение влияния пластидного сигнала на экспрессию Lhcb2, HEMAs и ChlH показало, что, в противоположность экспрессии генов ELIP, HY1 и HY2 пластидные сигналы участвуют в негативной регуляции экспрессии генов Lhcb2 и HEMA1, снижая ее (на 30-50%) и не влияют на экспрессию генов HEMA2 и ChlH (рис. 10).

Кроме того, GUN4 мутация, приводящая к активации экспрессии генов ELIP и подавлению экспрессии гена ChlH (~ на 50%) не влияла на экспрессию генов HEMAs и Lhcb2. Мутация GUN5-1 не влияла на экспрессию изученных генов, кроме гена ChlH, содержание транскриптов которого было понижено (на 70-80%) у gun5-1 мутантов.

Таким образом, экспрессия генов ELIP1 и ELIP2 регулируется пластидным сигналом противоположно генам Lhcb2, HEMA1 и ChlH. Пластидная регуляция не вовлечена в экспрессию генов HEMA2.

Было показано, что при увеличении интенсивности освещения уровень экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 увеличивается (~ в 3 раза), а генов Lhcb2 и HEMA1 снижается (более чем вдвое). Световой сигнал не влияет на экспрессию генов HEMA2 и ChlH.

Рис. 10. Накопление транскриптов ELIP1, ELIP2, Lhcb2, HEMA1, HEMA2 и ChlH у тому же семейству, они регулируются поgun и hy мутантов и растений дикого типа (ДТ) Arabidopsis. UBQ10 использовали для стандартизации ОТ-ПЦР. а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и HEMA1), регулируются сходным образом, что согласуется с литературными данными (McCormac and Terry, 2002; Ruckle et al., 2007).

3.2. Влияние регуляторов роста растений и углеводов на экспрессию генов ELIP.

Изучение действия природного гормона - абсцизовой кислоты, ингибирующей рост растений, на экспрессию генов ELIP показало, что сигналы, индуцируемые АБК, в условиях светового стресса позитивно регулируют экспрессию генов ELIP, приводя к ее повышению в 2-2.5 раза (рис. 11).

Исследование участия АБК в передаче ретроградных сигналов с помощью gun мутантов показало, что у мутантов наблюдается некоторое снижение экспрессии этих генов.

В условиях фотодеструкции, вызванной НФ, АБК значительно ингибировала (на 80-90%) экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа и частично (~ на 50%) у gun мутантов (рис. 11).

Таким образом, АБК в условиях светового стресса позитивно регулирует экспрессию генов ELIP1 и ELIP2 у растений дикого типа Arabidopsis, что согласуется с современными представлениями о механизме влияния АБК на экспрессию генов стрессовых белков (Wierstra and Kloppstech, 2000; Shen et al., 2006; Koussevitzky et al, 2007). Наши данные об экспрессии генов стрессовых белков при АБК-обработках gun5 мутантов, свидетельствуют в пользу ранее высказанных предположений о том, что ChlH (GUN5) участвует в передаче пластидных сигналов и восприятии АБК-сигналов (Shen et al., 2006). Поскольку у gun мутантов отсутствует рецептор сигналов, индуцируемых АБК, поэтому не было обнаружено повышения экспрессии ELIP при действии абсцизовой кислоты. Однако остается неясным, как СhlH выполняет роль посредника между пластидными и АБК-сигналами, участвуя в регуляции экспрессии генов. На основании этих данных можно также говорить о наличии связи между пластидными и АБК-сигналами.

Так как природный фитогормон АБК, ингибирующий развитие и рост растений, Рис. 12. Содержание транскриптов генов ELIP1 и ELIP2 у растений в разных концентрациях. 18S стандартизации ОТ-ПЦР. повышению экспрессии гена высокомолекулярного высокие концентрации мелафена негативно влияют на экспрессию этого гена (рис. 12). При этом не было обнаружено влияния мелафена на экспрессию гена, кодирующего стрессовый белок пластид ELIP1. Во всех использованных концентрациях мелафен не влиял на содержание хлорофилла и каротиноидов (Осипенкова и др., 2008). Наши данные показали, что регулятор роста растений мелафен, повышая экспрессию генов стрессового белка хлоропластов ELIP2, видимо, влияет на биогенез хлоропластов и приводит к усилению защиты растений от различных стрессовых воздействий.

Таким образом, различные по механизму действия регуляторы роста растений могут сходно влиять на экспрессию генов ELIP.

Для того чтобы изучить участие углеводов в экспрессии ядерных генов стрессовых Рис. 13. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у растений gun мутантов и дикого типа Arabidopsis, выращенных на среде с 2% или 7% глюкозой. 18S рРНК использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

Рис. 14. Содержание транскриптов ELIP1 и ELIP2 у 10-дневных gun мутантов и ДТ растений Arabidopsis, выросших в присутствии НФ (+) и без добавления ингибитора (-) на среде без сахарозы. UBQ использовали для стандартизации ОТ-ПЦР.

условиях фотодеструкции. Как было сказано выше, экспрессия генов ELIP была значительно подавлена у НФ-обработанных растений дикого типа и восстанавливалась у gun5-1, gun мутантов, выращенных на среде, содержащей 2%-ную сахарозу (рис. 3, 4). Содержание транскриптов у тех же растений, обработанных ингибитором, но выращенных на среде без сахарозы, отличалось от содержания транскриптов генов ELIP у проростков, выращенных на содержащей сахарозу среде. Не наблюдалось восстановления транскрипции ELIP1 и ELIP2 у gun мутантов, обработанных НФ и выращенных на среде без сахарозы. Результаты ОТ-ПЦР показали, что у ДТ растений в этих же условиях подавляется экспрессия генов ELIP1 и ELIP только на 70-80% по сравнению с растениями, выращенными на НФ-среде с 2%-ной сахарозой (рис. 14).

Можно предположить, что при фотодеструкции на транскрипцию ядерных генов не только влияют нарушения биосинтеза тетрапирролов, но и углеводный статус, что предполагает связь этих двух сигнальных путей. Наши данные согласуются с ранее опубликованными данными о регуляции экспрессии ядерных генов Lhcb и HEMA1 сахарами и GUN4, GUN5 ретроградными сигналами (McCormac and Terry, 2004).

Таким образом, нами показано, что экспрессия ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2 регулируется гормональными сигналами. Так, фитогормон АБК и регулятор роста мелафен на свету повышают экспрессию ядерных генов ELIP. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP.

Ретроградные пластидные сигналы координируют экспрессию ядерного и органелльного геномов и влияют на экспрессию ядерных генов белков хлоропластов в зависимости от функционального состояния этих органелл. Мы исследовали экспрессию ELIP1 и ELIP2 у gun и hy мутантов, имеющих нарушения в передаче пластидного сигнала.

Было обнаружено, что ретроградные пластидные сигналы, зависящие от HY1, HY2 и GUN белков (но не GUN5), влияют на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2, негативно регулируя их экспрессию. Кроме того, было обнаружено, что пластидные сигналы по-разному регулируют экспрессию родственных генов ELIP и Lhcb2, и генов биосинтеза тетрапирролов HEMA1, ChlH: у gun мутантов экспрессия ELIP1 и ELIP увеличивается, а экспрессия Lhcb2, HEMA1, ChlH уменьшается. На экспрессию гена HEMA пластидные сигналы не влияют. Экспрессия генов ELIP, Lhcb2 и HEMA1 зависит также от интенсивности освещения: увеличение интенсивности освещения приводит к повышению экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 и снижению экспрессии генов Lhcb2, HEMA1. Световой и пластидный сигналы взаимодействуют друг с другом. На экспрессию генов HEMA2 и ChlH интенсивность освещения не влияет. Исследования gun мутантов Arabidopsis с помощью ингибиторного анализа (норфлуразон, дипиридил) и экзогенного добавления Mg-Proto указывают на участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии ядерных генов пластидных белков ELIP. Однако такие предшественники биосинтеза тетрапирролов, как Mg-Proto и Mg-ProtoMe, по-видимому, не являются сигнальными молекулами, индуцирующими пластидный сигнал. Обнаружена обратная зависимость между содержанием хлорофилла и экспрессией генов ELIP, что указывает на возможное участие белков светового стресса ELIP в регуляции биосинтеза хлорофилла и/или защите хлоропластов от фотоокисления.

Подавление экспрессии генов ELIP при использовании ингибиторов (ацифлуорфен) и предшественника биосинтеза тетрапирролов (5-аминолевулиновая кислота), приводящих к накоплению активных форм кислорода свидетельствует о том, что эти молекулы вовлечены в передачу пластидного сигнала и являются негативными регуляторами экспрессии этих генов. Изучение участия редокс-состояния компонентов ЭТЦ фотосинтеза показало, что этот тип ретроградного сигнала также негативно влияет на транскрипцию генов ELIP. При ингибировании (с помощью диурона) транспорта электронов от ФС2 к пулу пластохинонов в хлоропластах, приводящем к окислению пула пластохинонов, экспрессия генов ELIP снижается.

Кроме пластидных сигналов на экспрессию ядерных генов ELIP действуют сигналы, индуцируемые гормонами и углеводами. Действие регуляторов роста растений с разным механизмом действия (абсцизовая кислота и мелафен) приводит к активации экспрессии генов ELIP на свету. Углеводы подавляют экспрессию генов ELIP.

На основе наших данных можно говорить, что на экспрессию генов ELIP действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (ретроградные сигналы, гормоны, углеводы).

Поскольку наши результаты показали, что молекулы Mg-Proto и Mg-ProtoMe не являются сигнальными, возможно, что эти интермедиаты биосинтеза тетрапирролов могут связываться с компонентами Mg-хелатазного мультибелкового комплекса (в частности, с субъединицей ChlH и/или белком GUN4), которые участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов. Кроме того, изменения Mg-хелатазного комплекса могут приводить к индукции пластидного сигнала. Известно, что фактор транскрипции ABI4 вовлечен в экспрессию генов белков фотосинтеза (Koussevitzky et al., 2007). Поскольку общие принципы работы сигнальных систем, по-видимому, универсальны в клетках, не исключено, что ABI влияет на экспрессию генов ELIP1 и ELIP2. Возможно, что ABI4 может обеспечивать связь ретроградных сигналов хлоропластов с углеводными сигналами и сигналами, индуцируемыми абсцизовой кислотой, которые также участвуют в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2.

Таким образом, в клетках существует сложная сигнальная сеть, регулирующая координированную экспрессию ядерных генов, при этом различные типы пластидных сигналов могут конвергировать друг с другом и с другими сигнальными системами клетки и ингибировать (или активировать) транскрипцию ядерных генов ELIP1 и ELIP2.

1. Показано, что нарушения ретроградных пластидных сигналов, зависящие от HY1, HY2 и GUN4 белков (но не GUN5), у мутантов Arabidopsis позитивно влияют на экспрессию ядерных генов стрессовых белков пластид ELIP1 и ELIP2.

2. При исследовании hy и gun мутантов Arabidopsis впервые обнаружена обратная свидетельствует о том, что белки ELIP1 и ELIP2 участвуют в защите хлоропластов от фотоокисления.

3. Показано участие тетрапирролов в ретроградной регуляции экспрессии генов ELIP и ELIP2. Mg-протопорфирин IX и его монометиловый эфир, по-видимому, не являются сигнальными молекулами при передаче ретроградного пластидного сигнала в ядро, поскольку их содержание не коррелирует с уровнем экспрессии генов ELIP.

4. Подавление экспрессии генов ELIP1 и ELIP2 ацифлуорфеном и 5аминолевулиновой кислотой свидетельствует о том, что возникающие активные формы кислорода участвуют в передаче пластидного сигнала. Ингибирование экспрессии генов ELIP диуроном указывает на то, что ретроградный сигнал зависит от редокс-состояния компонентов электрон-транспортной цепи в хлоропластах Arabidopsis.

5. Сравнение действия тетрапиррол-медиированного пластидного сигнала на экспрессию близкородственных генов (ELIP1, ELIP2 и Lhcb2) показало, что они регулируются этими сигналами по-разному, а гены, относящиеся к различным семействам (Lhcb2 и HEMA1), регулируются сходным образом. У hy и gun мутантов световой сигнал, подобно пластидному, увеличивает экспрессию генов ELIP и снижает экспрессию генов Lhcb2 и HEMA1.

6. Так как регуляторы роста (абсцизовая кислота и мелафен) усиливают, а углеводы подавляют экспрессию генов ELIP, высказано предположение, что на экспрессию генов стрессовых белков ELIP Arabidopsis наряду с пластидными сигналами действуют сигналы экзогенного (свет) и эндогенного происхождения (гормональные и углеводные).

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Осипенкова О.В., Рахимбердиева М.Г., Карапетян Н.В., Юрина Н.П. Участие двух пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерного гена хлоропластного белка ELIP.

Доклады Российской Академии наук, 2007, т. 416, № 4, с. 546-549.

2. Осипенкова О.В., Ермохина О.В., Белкина Г.Г., Фаттахов С.Г., Юрина Н.П. Влияние мелафена на экспрессию генов белков светового стресса хлоропластов Elip1 и Elip2 у ячменя. Прикладная биохимия и микробиология, 2008, т. 44, № 6, с. 701-708.

Статьи в сборниках:

3. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Влияние ретроградных сигналов на экспрессию ядерных генов стрессового белка пластид Elip и генов белков фотосинтеза Lhcb1, RbcS. Труды III Международного симпозиума «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященного 100-летию акад. Н.М. Сисакяна, 2007, с. 184-186.

Тезисы докладов:

4. Юрина Н.П., Погульская Е.Н., Осипенкова О.В., Олескина Ю.П., Белкина Г.Г. Роль пластидных сигналов в регуляции экспрессии ядерных генов стрессовых белков Elip и Hsp у ячменя. Второй Международный симпозиум «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете». Россия, Казань, 2006, с. 142-143.

5. Osipenkova O., Pogulskaya E., Yurina N. Regulation of nuclear gene expression of plastid stress protein Elip by tetrapyrrole biosynthesis intermediates and chloroplast redox activity. International Meeting «Photosynthesis in the post-genomic era: structure and function of photosystems». Россия, Пущино, 2006, с. 211.

6. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Влияние ретроградных сигналов на экспрессию ядерных генов стрессового белка пластид Elip и генов белков фотосинтеза Lhcb1, RbcS. III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М. Сисакяна. Россия, Дубна, 2007, с. 205-206.

7. Осипенкова О.В., Юрина Н.П. Хлоропластные сигналы и экспрессия ядерных генов, кодирующих стрессовые белки хлоропластов. III Международный симпозиум «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», посвященный 100-летию акад. Н.М.

Сисакяна. Армения, Ереван, 2007, с. 100.

8. Osipenkova O.V., Yurina N.P. Chloroplasts regulate the expression of nuclear genes encoding ELIP in barley. FEBS Advanced Lecture Course: «Origin and Evolution of Mitochondria and Chloroplasts». Италия, Маратея, 2007, с. 79.

9. Юрина Н.П., Осипенкова О.В. Пластидные сигналы: регуляция экспрессии ядерных генов. VI съезд общества физиологов растений России - Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем». Россия, Сыктывкар, 2007, с.

225-226.

«Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и стипендии FEBS.

АБК - абсцизовая кислота АЛК – 5-аминолевулиновая кислота АФ - ацифлуорфен АФК – активные формы кислорода Диурон – [3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевина] ДП – 2,2’-дипиридил ДТ – дикий тип Arabidopsis НФ – норфлуразон п.н. – пара нуклеотидов ПП – пул пластохинонов ФС2 – фотосистема ЭТЦ – электрон-транспортная цепь HL – свет высокой интенсивности LL – свет низкой интенсивности Mg-Proto – магний протопорфирин IX Mg-ProtoMe – монометиловый эфир магний протопорфирина IX SL – стандартное освещение

 


Похожие работы:

«КАШЕВАРОВ Глеб Сергеевич СТРУКТУРА И ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДРИФТА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ РЕК МЁША, КАЗАНКА И НОКСА (РЕСПУБЛИКА ТАТАРСТАН) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена на кафедре биоресурсов и аквакультуры (ранее кафедра зоологии позвоночных) Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный...»

«БАБОША АЛЕКСАНДР ВАЛЕНТИНОВИЧ МНОГОФАЗНЫЙ ХАРАКТЕР КОНЦЕНТРАЦИОННОЙ ЗАВИСИМОСТИ ДЕЙСТВИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА РОСТ РАСТЕНИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К ФИТОПАТОГЕНАМ Специальность: 03. 01. 05 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина Российской академии наук (ГБС РАН)...»

«КРИВОКОНЕВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА АГРОЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПЛОДОРОДИЯ ЧЕРНОЗЕМОВ ЦЕНТРАЛЬНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ (НА ПРИМЕРЕ КИРОВСКОГО РАЙОНА СТАВРОПОЛЬСКОГО КРАЯ) 03.00.27 – почвоведение 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена на кафедре Кадастра и мониторинга земель ФГОУ ВПО “Новочеркасская государственная мелиоративная академия” Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук,...»

«Селиванова Мария Александровна ВЛИЯНИЕ НА ЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ БАКТЕРИИ БЕТА- И АЛЬФАИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ НА ПРИМЕРЕ ТРИТИЯ И АМЕРИЦИЯ-241 03.01.02 – биофизика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 2 Работа выполнена на кафедре биофизики Института фундаментальной биологии и биотехнологии ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет, г. Красноярск. Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор...»

«КАЗАЗАЕВА Маргарита Тимофеевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕН НОСТИ И РАЗНООБРАЗИЕ ОРХИДНЫХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ И СОСТОЯНИЕ ГЕНОФОНДА 03.00.05. – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 Работа выполнена на кафедре ботаники Бурятского государственного университета, г. Улан -Удэ. Научный руководитель : кандидат биологических наук, профессор Бардонова Людмила Капитоновна Официальные оппоненты :...»

«ВОЙКИНА АННА ВЛАДИМИРОВНА НАКОПЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ В КОМПОНЕНТАХ ЭКОСИСТЕМ ТАГАНРОГСКОГО И ЯСЕНСКОГО ЗАЛИВОВ АЗОВСКОГО МОРЯ И ИХ АДДИТИВНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГИДРОБИОНТОВ 03.02.08 — экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в ФГУП Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (АзНИИРХ), г. Ростов-на-Дону и на кафедре экологии и природопользования Южного...»

«МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2008 год Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Государственного учреждения Медико-генетический научный центр РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович Официальные оппоненты :...»

«РЫЛЬНИКОВ Валентин Андреевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ СИНАНТРОПНЫХ ВИДОВ ГРЫЗУНОВ (на примере серой крысы Rattus norvegicus Berk.) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2007 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Научно-исследовательский институт дезинфектологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и...»

«НЕФЕДОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ ЖИВОТНЫХ К АНТРОПОГЕННЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ (НА ПРИМЕРЕ РЯЗАНСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.08 – экология 0З.03.01 – физиология автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск - 2011 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Рязанский государственный агротехнологический университет имени П.А. Костычева Научный консультант доктор сельскохозяйственных наук, профессор Иванов Евгений...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«ИНДЖГИЯ ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ФЕРМЕНТНЫМИ СИСТЕМАМИ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS В ПРИСУТСТВИИ МЕДИАТОРОВ ФЕРРОЦЕНОВОГО РЯДА 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2010 Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. кандидат химических наук, доцент Научный руководитель :...»

«Цыремпилов Энхэ Галсанович ПОЧВЫ БАРГУЗИНСКОЙ КОТЛОВИНЫ: РАЗНООБРАЗИЕ, ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И РАЦИОНАЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2013 Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экспериментальной агрохимии ФГБУН Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН и ФГБОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р....»

«ШЕВЦОВ Александр Станиславович АНТРОПОГЕННАЯ ЭЛИМИНАЦИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре ботаники, зоологии и общей биологии ФГАОУ ВПО Северо-Кавказский федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент Ильюх Михаил Павлович Официальные оппоненты : Бабенко...»

«Кляйн Ольга Ивановна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ С ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова...»

«Степанова Нина Юрьевна ФЛОРА КУМО-МАНЫЧСКОЙ ВПАДИНЫ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в лаборатории Гербарий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН Научный руководитель : ИГНАТОВ МИХАИЛ...»

«ДЕНИСОВА Ольга Николаевна ОСОБЕННОСТИ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА РАСТЕНИЙ ПРИДОРОЖНОЙ ЗОНЫ В УСЛОВИЯХ ОСТАТОЧНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ СВИНЦОМ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ–2006 Работа выполнена на кафедре химии ФГОУ ВПО Марийский государственный технический университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Винокурова Раиса Ибрагимовна Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор...»

«АНДРЕЯНОВ Олег Николаевич ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИРКУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТРИХИНЕЛЛЕЗА В ЦЕНТРАЛЬНОМ РЕГИОНЕ РОССИИ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕР БОРЬБЫ Специальность: 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Москва – 2014 2 Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина Россельхозакадемии Научный консультант : - член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор...»

«МАРКОВ Денис Игоревич Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1 миозина и влияние малых белков теплового шока на процесс агрегации Специальность 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Д....»

«МИГУНОВА Варвара Дмитриевна БИОЦЕНОТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕГУЛЯЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ ФИТОПАРАЗИТИЧЕСКИХ НЕМАТОД Специальность 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории фитогельминтологии ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им. К.И. Скрябина (ВИГИС). Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Шестеперов Александр Александрович...»

«ЗЕЛЕНИХИН ПАВЕЛ ВАЛЕРЬЕВИЧ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ РИБОНУКЛЕАЗЫ КАК ИНДУКТОРЫ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНЫХ ТОКСИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ КЛЕТОК РАЗЛИЧНОГО УРОВНЯ ОРГАНИЗАЦИИ 03.00.07 – микробиология 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2006 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета Казанского государственного университета им. В.И. УльяноваЛенина. доктор биологических наук, профессор Научные руководители:...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.