WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Горбачева Марина Анатольевна

Биокаталитические свойства лакказ из различных источников

Специальность 03.00.04 биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2009

1

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук С.В. Шлеев

Официальные оппоненты: доктор химических наук И.Н. Курочкин кандидат химических наук Т.В. Тихонова

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится «28» мая 2009 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, строение 1.

Автореферат разослан «27» апреля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Лакказа является одним из ключевых ферментов, входящих, наряду с лигнинпероксидазой и марганецпероксидазой, в лигнолитический комплекс древоразрушающих грибов. Этот фермент также входит в состав сока лакового дерева Rhus vernicifera. В последние годы лакказо-подобные медьсодержащие оксидазы были обнаружены и в бактериях. Все названные оксидазы из различных источников объединяет способность катализировать реакции окисления широкого круга органических и неорганических субстратов молекулярным кислородом с восстановлением последнего непосредственно до воды, минуя стадию образования пероксида водорода. Это обстоятельство, а так же разнообразие физиологических функций, выполняемых лакказами в различных организмах, делает их привлекательными объектами для фундаментальных и прикладных исследований.

Движущей силой реакций окисления, катализируемых лакказами, является разность редокс-потенциалов субстрата-донора и первичного акцептора электронов Т1 центра лакказ. От разности этих потенциалов в отсутствии влияния стерического фактора зависит скорость реакции окисления субстратов. В связи с этим было интересно исследовать реакции переноса электронов с субстратов, имеющих одинаковое строение, но отличающиеся значениями редокс-потенциалов, на активный центр лакказ с различными значениями потенциалов Т1 центров, а так же влияние разнообразных факторов на возможность протекания реакций окисления соединений с различной структурой и редокс-потенциалами.





Лакказы способны катализировать реакции безмедиаторного восстановления молекулярного кислорода на электродах. Поскольку в настоящее время активно исследуется возможность создания биокатодов и биоанодов, в том числе и с использованием лакказ, изучение влияния редокс-потенциала иона меди Т1 лакказ, выделенных из различных источников, а так же рН и состава раствора на эффективность прямого биоэлектрокатализа является в настоящее время весьма актуальным.

Высоко редокс-потенциальные лакказы из базидиальных грибов Trametes hirsuta и Cerena maxima, низко редокс-потенциальная растительная лакказа Rhus vernicifera, а так же рекомбинантный бактериальный фермент Bacillus halodurans, экспрессированный в E. coli, являются хорошими объектами для этих исследований. Кроме того, исследование механизма функционирования указанных выше ферментов представляет несомненный интерес с точки зрения возможности и/или ограниченности их использования в биотехнологических процессах.

Научная новизна работы. Сравнительное исследование катализа реакций окисления субстратов с различными окислительно-восстановительными потенциалами высоко и низко редокс-потенциальными лакказами позволило выдвинуть предположение о возможных причинах различий физиологической роли этих ферментов в реакциях образования и деструкции лигнина с участием природных редокс-медиаторов. Впервые показан эффект прямого биоэлектрокатализа с участием рекомбинантной лакказо-подобной медьсодержащей оксидазы B. halodurans. Установлено, что для функционирования этого фермента необходимо наличие в реакционной среде ионов двухвалентной меди. В отличие от грибных и древесной лакказ, оксидаза B. halodurans способна катализировать реакции электровосстановления молекулярного кислорода при нейтральных значениях рН раствора в присутствии ионов хлора.

Показано, что низкопотенциальная растительная лакказа R. vernicifera может катализировать окисление органических субстратов – доноров атомов водорода при нейтральных и слабощелочных значениях рН раствора, в отличие от высокопотенциальных грибных лакказ. Этот растительный фермент проявляет электрокаталитическую активность в реакциях безмедиаторного электровосстановления молекулярного кислорода как при кислых, так и нейтральных значениях рН раствора и в присутствии анионов хлора.

Практическая значимость работы. Сравнение электрокаталитических свойств лакказ из различных источников в реакциях восстановления молекулярного кислорода вносит вклад в понимание механизма прямого безмедиаторного биоэлектрокатализа лакказами, что дает возможность проведения направленного мутагенеза лакказ для получения электрокатализаторов, отвечающих требованиям, предъявляемым к биокатализатору катода имплантированного биотопливного элемента. Результаты исследований эффективности катализа лакказами в зависимости от значения их редокс-потенциалов показали, что только высоко редокс-потенциальные ферменты могут быть использованы в свободно – радикальной реакции окислительной полимеризации анилина с целью получения электропроводящего полимера.





Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось: сравнение гомогенных каталитических и гетерогенных биоэлектрокаталитических характеристик высоко редокс-потенциальных грибных лакказ и низко редокспотенциальной растительной лакказы, а так же определение некоторых биохимических и электрокаталитических свойств бактериальной медьсодержащей лакказо-подобной оксидазы;

выяснение возможности использования этих ферментов в качестве биокатализатора реакции электровосстановления молекулярного кислорода на биокатоде топливного элемента и для проведения свободно–радикальной окислительной полимеризации анилина. Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

1. Провести сравнительное изучение эффективности биокаталитического окисления цианидных комплексов переходных металлов, имеющих различные значения стандартных редокс-потенциалов, грибной и древесной лакказами, а так же реакций электровосстановления молекулярного кислорода на электродах из углеродных материалов, модифицированных лакказами из различных источников, при различных значениях рН и составах рабочего раствора.

2. Сравнить эффективность реакций окисления ионов двухвалентного марганца, хелатированных анионами дикарбоновых кислот, в присутствии лакказ T. hirsuta, C. maxima и R. vernicifera и выяснить возможность окисления нефенольных подструктур лигнина комплексами двух и трехвалентного марганца.

3. Выяснить возможность проведения биокаталитического синтеза водной дисперсии наночастиц электропроводящего полианилина и поли-(2-акриламидо-2метил-1-пропансульфоновой) кислоты с участием высоко- и низкопотенциальных лакказ.

4. Определить некоторые биохимические характеристики лакказо-подобной оксидазы из B. halodurans и исследовать ее биоэлектрокаталитические свойства.

5. Выяснить возможность использования лакказ и лакказо-подобной оксидазы в качестве катализаторов реакции электровосстановления молекулярного кислорода на катоде биотопливного элемента, протекающей по прямому безмедиаторному механизму.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях: Международной конференции "Биокатализ-2007" 17- июня 2007, Москва-С. Петербург РФ и IV Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в числе которых 2 статьи в зарубежном и 2 в отечественных журналах, 2 тезисов докладов и 1 статья в сборнике МГУИЭ.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит рисунков и _ таблиц. Список цитируемой литературы включает наименований.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава представляет собой обзор литературы, посвященный описанию основных физико-химических и биохимических свойств трех групп изучаемых в настоящее время лакказ: растительных, грибных и бактериальных. Рассматривается строение активных центров ферментов, механизм катализа, возможные пути использования лакказ для фундаментальных и прикладных исследований.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Объектами исследования являлись лакказы из грибов Trametes hirsuta и Cerena maxima, фермент из сока лакового дерева Rhus vernicifera и медьсодержащий лакказо-подобный рекомбинантный фермент Bacilus halodurans.

Очистка ферментов. Частично очищенный ферментный препарат растительной лакказы R. vernicifera был любезно предоставлен профессором Б.

Рэйнхаммером (Швеция). Ферменты из культуральной жидкости T. hirsuta и C. maxima были очищены путем осаждения сульфатом аммония с последующей очисткой методом ионообменной хроматографии низкого давления. Лакказы T. hirsuta, C. maxima и R. vernicifera были очищены до гомогенного по данным ДДС-электрофореза состояния на гельфильтрационной колонке BioSep-SEC-S Phenomenex (США) с использованием ВЭЖХ – системы «Стайер» («Аквилон», Россия). Бактериальный фермент B. halodurans был любезно предоставлен проф.

Дитмаром Халтрихом (Австрия) и использовался без дополнительной очистки.

Коммерческий препарат лакказы Myceliophthora termophila фирмы «Novozymes»

был очищен по описанной ранее методике для коммерческого препарата Deni-Lite.

Исследование рН-зависимости скорости реакций и кинетические измерения. Определение каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых лакказами, проводили на кислородном электроде типа Кларка, используя анализатор BAS CV-50W («BAS», США).

Скорость ферментативной реакции рассчитывали по изменению тока при потенциале –600 мВ, используя анализатор BAS CV-50W («BAS», США). Отклик электрода пересчитывали на изменение концентрации кислорода в системе.

Кинетические параметры ферментативных реакций вычисляли по уравнению Михаэлиса-Ментен, используя компьютерную программу Microcal Origin (версия 5.0). При расчете константы скорости (kкат) и эффективности катализа (kкат/KМ) учитывали стехиометрию реакции. Исходную концентрацию дикислорода в буферном растворе принимали равной 0.26 мМ. При определении каталитических констант ферментативных реакций в качестве субстратов – доноров электронов использовали K4Fe(CN)6, K4Mo(CN)8, K4W(CN)8, K4Os(CN)6, АБТС, а в качестве субстратов – доноров атомов водорода – гидрохинон, гваякол, серингалдазин.

Исследование рН зависимости скорости реакций проводили как с использованием кислородного электрода, так и спектральным методом с использованием спектрофотометра «Hitachi-557»(Япония) в диапазоне рН 3.0–9.0 в 0.04 М универсальном буфере.

катализируемого лакказами. Реакцию окисления Mn2+, катализируемую лакказами, проводили в 0.1 М Na-тартратном и Na-оксалатном буферах рН 5.0 в присутствии 0.1 мМ MnSO4. Продукт реакции - трехвалентный марганец образует низкостабильные комплексы с тартрат- и оксалат-анионами, имеющие максимум поглощения при 238 (238=6500 М-1см-1) и 270 нм (270=5500 М-1см-1), соответственно. Образование продуктов реакции – ионов трехвалентного марганца регистрировали спектрофотометрически.

Электрохимические исследования. Циклические вольтамперограммы записывали в интервале потенциалов 0 1200 мВ, используя анализатор BAS CV 50W(США), функционирующий в трехэлектродном режиме. В качестве рабочего электрода использовали графитовый и стеклоуглеродный электроды. Перед проведением экспериментов поверхность стеклоуглеродного электрода последовательно полировали суспензией Al2O3 и промывали бидистиллированной водой. Поверхность графитового электрода многократно полировали на влажной наждачной бумаге (Tufback Durite P1200, США), затем промывали бидистиллированной водой и высушивали.

В третьй главе приводятся собственные результаты и их обсуждение.

Эффективность биокаталитического окисления цианидных комплексов переходных металлов с различными редокс-потенциалами с участием высокопотенциальной лакказы T. hirsuta и низкопотенциального фермента Одной из важнейших движущих сил реакций окисления субстратов лакказ является разность редокс-потенциалов субстрата и Т1 центра фермента. Для выяснения зависимости эффективности катализа лакказами от разности окислительно-восстановительных потенциалов были выбраны комплексы переходных металлов сходного строения: K4Fe(CN)6, K4W(CN)8, K4Os(CN)6, K4Mo(CN)8 с известными значениями стандартных окислительновосстановительных потенциалов. Такой выбор был обусловлен тем, что реакции окисления этих субстратов не сопровождаются перестройкой их молекул в отличие от объектов органической природы. Кроме того, при использовании этих соединений не возникает проблем с растворимостью субстратов, поскольку цианидные комплексы хорошо растворимы в водных растворах, что позволяет исследовать параметры реакций в одинаковых условиях.

Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами T. hirsuta (Е=780 мВ) и R. vernicifera (Е=420 мВ) по ряду гомологичных субстратов представлены в таблице 1. Из таблицы видно, что лакказа R. vernicifera не может катализировать окисление субстратов с потенциалом выше 640 мВ.

Табл. 1. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами* Субстрат (отн.

Для обеих лакказ показана линейная зависимость логарифма эффективности катализа (kкат/KМ) от разности редокс-потенциалов Т1 центров исследованных ферментов и цианидных комплексов переходных металлов (рис.1). Это свидетельствует о том, что скорость-лимитирующая стадия окисления этих соединений включает внешнесферный механизм переноса электронов, предложенный Маркусом. На основании полученных экспериментальных данных можно сделать вывод, что, в основном, соединения с редокс-потенциалами, превышающими значение редокс-потенциалов Т1 центра лакказ более чем на 220 мВ не являются «прямыми» субстратами этих ферментов.

lg(kкат/KM) Так же были измерены константы Михаэлиса по кислороду для обеих лакказ.

Нами было показано, что КМ ферментов по кислороду для лакказы T. hirsuta составляет 100 мкМ, а для лакказы R. vernicifera – 200 мкМ при использовании в качестве субстрата ферроцианида калия.

Окисление ионов Mn2+, хелатированных тартратными и оксалатными анионами, в присутствии грибных и древесной лакказ.

Марганец в микроколичествах присутствует в различных лигноцеллюлозных материалах. Среднее содержание марганца в растениях приблизительно равно 0.001 %. Марганец служит катализатором процессов дыхания растений, принимает участие в процессе фотосинтеза. В еловой древесине присутствует большая группа переходных металлов; в наибольшей концентрации марганец и железо содержатся в ксилеме. Так, содержание марганца достигает 3.9 мг на 100 грамм абсолютно сухой древесины. Ионы трехвалентного марганца являются сильными окислителями и способны непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина, приводя к его деполимеризации. Дикарбоновые и -оксикарбоновые кислоты являются оптимальными природными комплексонами двух и трехвалентных ионов марганца.

Как уже было отмечено ранее, редокс-потенциал Т1 центров грибных лакказ практически вдвое превышает редокс-потенциал древесной лакказы. В то же время редокс-потенциал пары Mn2+/Mn3+ составляет 1510 мВ (отн. НВЭ), что существенно превышает потенциал первичных акцепторов электронов изучаемых ферментов.

Это делает процесс окисления ионов марганца термодинамически невозможным.

Прямым электрохимическим методом было показано, что образование комплекса марганца с хелатирующими агентами снижает редокс-потенциал пары Mn2+/Mn3+. Потенциал средней точки пары Mn2+/Mn3+ в тартратном буфере составляет +940 мВ (НВЭ), что можно принять за редокс-потенциал этой пары.

Таким образом, полученное экспериментальным путем значение редокс-потенциала тартратных комплексов марганца указывает на принципиальную возможность их медленного окисления высокопотенциальными лакказами.

Для проверки этого предположения была изучена реакция ферментативного окисления хелатированных ионов двухвалентного марганца в присутствии лакказ T. hirsuta и R. vernicifera. На рис. 2. показаны спектры образования оксалатного комплекса трехвалентного марганца в процессе ферментативной реакции, катализируемой лакказой T. hirsuta. На вставке к рисунку приведена зависимость увеличения оптического поглощения продуктов реакции во времени. Скорость ферментативного окисления комплексов ионов двухвалентного марганца невелика и с увеличением времени наблюдается отклонение от линейной зависимости, что возможно связано с нестабильностью образующихся продуктов реакции. Обращает на себя внимание тот факт, что оптимум рН активности реакции окисления ионов двухвалентного марганца сдвинут в нейтральную область и находится в интервале рН 5.0-6.0, в то время как для цианидных комплексов переходных металлов рН-оптимум располагается в более кислой области.

В связи с тем, что два вышеупомянутых фермента грибная и древесная лакказы в природе выполняют различные функции, а именно, высокопотенциальная грибная лакказа T. hirsuta участвует в реакциях синтеза и деструкции лигнина, а фермент из сока лакового дерева R. vernicifera участвует в реакциях образования лигнина, было высказано предположение, а впоследствии и показано, что лакказа R. vernicifera из-за низкого значения редокс-потенциала Т1 центра не катализирует реакцию окисления хелатированных ионов двухвалентного марганца.

Поглощение, ое Рис. 3. Профиль элюции с колонки «Luna C18» (обратнофазовая гидрофобная хроматография высокого давления) продуктов окисления вератрового спирта.

А – хроматограмма вератрового спирта (1), вератровой кислоты (2) Б – хроматограмма продуктов, образующихся в результате окисления вератрового спирта в системе, содержащей лакказу T. hirsutа и хелатированные ионы марганца.

Условия: 0.1 М тартратный буфер рН 5.0, 1·10-6 М T. hirsutа, 1 мМ MnSO4, 0.5 мМ вератровый спирт. Время реакции 10 дней. Элюирование проводили линейным градиентом 5-95% ацетонитрила в 0.086% фосфорной кислоте со скоростью 1 мл/мин. в Косвенным свидетельством различий физиологических ролей является тот факт, что система, содержащая лакказу T. hirsutа и хелатированные ионы трехвалентного марганца, способна катализировать окисление одного из многих нефенольных компонентов лигнина–вератрового спирта до вератровой кислоты, что было показано спектральным и хроматографическим методом (рис. 2, 3). Древесная лакказа не катализирует реакцию окисления хелатированных ионов марганца и, соответственно, она не катализирует реакцию окисления вератрового спирта.

Сравнение рН-зависимости реакций окисления субстратов-доноров электронов и доноров атомов водорода высоко- и низкопотенциальными Согласно существующим представлениям, все субстраты лакказ можно разделить на две группы: доноры электронов и доноры атомов водорода. Было показано, что грибные лакказы катализируют окисление обеих групп субстратов только при кислых значениях рН раствора (рис. 4.А). В то же время, лакказа R. vernicifera катализирует окисление субстратов – доноров атомов водорода, таких как гваякол, гидрохинон, которые являются структурными единицами лигнина, в нейтральных и слабощелочных растворах, а окисление субстратов – доноров электронов – K4Fe(CN)6 и АБТС – в кислых (рис. 4.Б).

A/A0*100% Рис. 4. Зависимость относительной активности реакций окисления субстратов-доноров от рН реакционной среды при катализе лакказами В настоящее время мы не можем однозначно объяснить этот эффект, однако на основании имеющихся литературных данных можно предположить, что различия в рН – зависимостях по субстратам – донорам электронов и донорам атомов водорода для обеих лакказ связано с протеканием реакций окисления второй группы субстратов, катализируемой лакказой R. vernicifera, по другому механизму.

Возможность синтеза электропроводящего полианилина с участием Одним из возможных направлений практического использования лакказ является органический синтез. Поэтому в качестве модели для исследования такой возможности нами была выбрана реакция получения электропроводящего полианилина. В настоящей работе было проведено сравнение результатов свободно-радикальной окислительной полимеризации анилина с участием лакказ из различных источников, имеющих различные редокс-потенциалы Т1 центров ферментов.

Полианилин (ПАНИ) относится к группе электропроводящих полимеров, которые интенсивно исследуются в последние годы, что связано с широкими возможностями их практического использования Полианилин можно получать тремя способами: химическим (в подавляющем большинстве), электрохимическим и ферментативным с участием пероксидаз или лакказ. При ферментативном синтезе реакция образования ПА происходит в результате окисления мономера кислородом воздуха в присутствие лакказ по следующей схеме:

В качестве катализатора реакции полимеризации анилина использовали высоко редокс-потенциальную лакказу из базидиального гриба T. hirsuta, низкопотенциальный фермент из сока лакового дерева R. vernicifera и для сравнения с ними коммерческий препарат рекомбинантного фермента Myceliophthora termophila фирмы «Novozymes».

Задачей, поставленной в этой части работы, являлось выяснение различий в эффективности катализа реакции полимеризации анилина этими ферментами. Для получения водной дисперсии электропроводящего полианилина использовали поли(2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновую) кислоту – ПАМПС, структурная формула которого приведена на рис. 5. При синтезе полианилина ПАМПС выполняет двойную функцию: является одновременно матрицей для полимеризации мономера и кислым допантом ПАНИ.

Рис. 6. УФ-видимые спектры водных дисперсий наночастиц ПАНИ/ПАМПС, синтезированых с использованием различных лакказ.

А - R. vernicifera; Б- M thermophila; В- T. hirsuta (разбавление водной Условия: 50 мМ цитратно-фосфатный буфер рН 4.5, 3.65 мг/мл R. vernicifera, 3.65 мг/мл M thermophila, 0.008 мг/мл T. hirsuta. Время синтеза 100 часов УФ–видимые спектры водных дисперсий ПАНИ/ПАМПС, полученных с использованием ферментных препаратов из различных источников, представлены на рис. 6. Образование допированного электропроводящего полианилина проявляется на электронных спектрах тремя полосами поглощения (рис. 6, В).

Первая полоса в области ~330 нм соответствует * переходу внутри бензоидных сегментов. Вторая (~420 нм) и третья (~750 нм) полосы соответствуют допированной электропроводящей форме полианилина и указывают на образование полярона.

Первой стадией окисления анилина является образование катион-радикала.

Процесс окисления анилина на электроде при значениях рН, соответствующих условиям синтеза, начинается при потенциале ~950 мВ (отн. НВЭ). Редокс потенциал Т1 центра высокопотенциальной грибной лакказы T. hirsuta составляет 780 мВ (отн. НВЭ). Благодаря небольшой разнице редокс-потенциалов реакция окисления анилина с участием лакказы T. hirsuta может протекать с достаточно большой скоростью (см. рис. 6, В). Лакказа R. vernicifera имеет редокс-потенциал первичного акцептора электронов - Т1 центра фермента ~420 мВ отн. НВЭ. Разница в потенциалах начала окисления анилина и Т1 центра этого фермента составляет ~530 мВ, что делает невозможным протекание реакции окислительной полимеризации анилина (рис. 6, А).

Потенциал Т1 центра лакказы M. thermophila фирмы «Novozymes» по литературным данным составляет ~480-640 мВ (отн. НВЭ). Достаточно высокая разность потенциалов начала окисления анилина и Т1 центра рекомбинантного фермента приводит к низкой степени превращения мономеров, что видно на рис. 6, Б. При этом необходимо отметить, что представленный на рисунке спектр водной дисперсии интерполимерного комплекса полианилина, синтезированный с использованием высокопотенциальной лакказы T. hirsuta (рис. 6, В), записан при 10-кратном разбавлении раствора, т.е. при использовании лакказы T. hirsuta выход конечного продукта синтеза - полианилина во много раз выше, чем при синтезе с участием рекомбинантного фермента M. termophila. Помимо этого, концентрация белка в реакционной смеси при использовании лакказы T. hirsuta составляла 8·10-3 мг/мл, в то время как концентрация рекомбинантного фермента при синтезе составляла 3.65 мг/мл. Электропроводимость образца полианилин/ПАМПС, синтезированного с использованием лакказы T. hirsuta, измеренная стандартным электропроводности полианилина, полученного традиционным химическим методом с использованием персульфата аммония. Таким образом, эффективную полимеризацию анилина можно осуществить только с использованием высоко редокс-потенциальных лакказ.

Биоэлектрокаталитическое восстановление молекулярного кислорода на углеродных электродах с участием лакказ T. hirsuta,C. maxima и R. vernicifera.

В 1978 году советскими учеными был открыт эффект «прямого безмедиаторного биоэлектрокатализа» реакций восстановления молекулярного кислорода на электродах с адсорбированной на них лакказой из гриба Trametes versicolor. Суть этого явления состоит в том, что электрод заменяет субстрат-донор электронов лакказы в каталитической реакции. С учетом появившихся в последнее время данных по структуре многих лакказ схематически этот процесс можно представить следующим образом (рис. 7.):

Из общих соображений, эффективность биоэлектрокатализа лакказой может зависеть от следующих факторов: каталитической активности фермента; редокспотенциала Т1 центра; рI белковой глобулы; величины углеводной части и заряда поверхности электрода. Основные биохимические характеристики исследуемых в настоящей работе лакказ, за исключением бактериальной лакказо-подобной оксидазы B. halodurans, представлены в табл.2.

Однако, наибольший вклад в эффективность биоэлектрокаталитического восстановления молекулярного кислорода, по-видимому, вносит величина редокспотенциала ионов меди Т1 центра лакказ, а так же рН и состав среды. Методом циклической вольтамперометрии было проведено сравнение электрохимических реакций восстановления молекулярного кислорода с участием лакказ T. hirsuta, C. maxima и R. vernicifera, адсорбированных на электродах из спектрального графита. Влияние расстояния внутримолекулярного переноса во всех исследованных лакказах не учитывалось и считалось, что оно мало влияет на общую эффективность биоэлектрокаталитического процесса.

Некоторые биохимические характеристики грибных и растительной лакказ.

T. hirsuta C. maxima R. vernicifera Рис. 8. Циклические вольтамперограммы реакций электровосстановления молекулярного кислорода, записанные на графитовых электродах, модифицированных различными лакказами.

1-иммобилизованная лакказа; 2-фон в отсутствие фермента.

Условия: 40 мМ универсальный буфер, скорость развертки потенциала электрода 10 мВ/сек., начальный потенциал электрода 1200 мВ.

немодифицированных и модифицированных лакказами электродов из спектрального графита.

электровосстановления молекулярного кислорода на электродах с иммобилизованной лакказой зависит от значения редокс-потенциала Т1 центра ферментов. Для электрохимической реакции с участием высокопотенциальных грибных лакказ из T. hirsutа (Е=780±10 мВ) и C. maxima (Е=750±10 мВ) при рН 4. начало реакции электровосстановления молекулярного кислорода различается незначительно, и коррелирует с небольшой разницей в значениях редокспотенциалов их Т1 центров (рис. 8).

Для низкопотенциальной древесной лакказы при рН 4.0 потенциал начала электрохимического восстановления молекулярного кислорода смещен в область отрицательных значений приблизительно на 350 мВ по сравнению с грибными лакказами (рис. 8). Это согласуется с литературными данными по потенциометрическому титрованию Т1 центров лакказ.

Реакции электровосстановления молекулярного кислорода на электродах, модифицированных лакказами, ингибируются ионами хлора и фтора. При кислых значениях рН рабочего раствора (4.0) ингибирование электрокаталитических реакций ионами хлора составляет приблизительно 30% для лакказ T. hirsutа и R. vernicifera при значении потенциала 0.2 В (отн. НВЭ) относительно исходной электрокаталитической активности (рис. 9).

Следует отметить, что при таком же рН рабочего раствора биоэлектрокаталитическая реакция восстановления молекулярного кислорода как для высоко-, так и для низкопотенциальных лакказ полностью ингибируется ионами фтора при концентрации последних свыше 1 мМ.

Данные, полученные при исследовании биоэлектрокаталитического процесса подтверждаются результатами экспериментов по ингибированию этих лакказ хлорид- и фторид-ионами в гомогенных реакциях. Было показано, что в гомогенных реакциях ингибирование лакказы T. hirsutа ионами хлора и фтора при рН 4. протекает по различным механизмам: конкурентному для хлорид-ионов и неконкурентному для ионов фтора. Константа ингибирования грибной лакказы T. hirsutа ионами хлора составила 1.5 мМ, а фторид-ионами–0.04 мМ при использовании в качестве субстрата ферроцианида калия.

Рис. 9. Ингибирование биоэлектрокаталитической реакции R. vernicifera 1-иммобилизованная лакказа; 2-иммобилизованная лакказа и 100 мМ Условия: 40 мМ универсальный буфер, 100 мМ NaCl, скорость развертки потенциала электрода 10 мВ/сек., начальный потенциал электрода Важным отличием реакций электрокатализа высоко- и низкопотенциальными лакказами является различие в электрокаталитической активности при разных значениях рН раствора, в котором протекает ферментативная реакция.

На рис. 10. приведена зависимость влияния рН среды на относительную эффективность реакции электрокаталитического восстановления молекулярного кислорода на графитовом электроде, модифицированном лакказами C. maxima и R. vernicifera, в интервале рН от 3.0 до 8.0 при потенциале электрода 400 мВ отн. НВЭ.

Из рисунка видно, что рН-оптимум реакции электровосстановления молекулярного кислорода на электроде с высокопотенциальной грибной лакказой смещен в область кислых значений рН раствора по сравнению с электродом, модифицированным древесной лакказой. При рН 7.0 электрод, модифицированный грибной лакказой C. maxima практически электрохимически неактивен, в то время, как рН-оптимум электрокаталитической активности электрода с лакказой R. vernicifera находится в нейтральной области при рН 6.5-7.0. Найденный оптимум рН активности древесной лакказы в гетерогенной биоэлектрокаталитической системе подобен аналогичному рН-оптимуму этого фермента в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров атомов водорода.

низкопотенциальной лакказы при рН 7.6 так же ингибируется ионами хлора приблизительно на 30% по сравнению с ее первоначальной активностью, в то время как электрокаталитической активности грибных лакказ при этом значении рН раствора не наблюдалось вообще (рис. 9).

Электрокаталитические свойства бактериальной медьсодержащей лакказо-подобной оксидазы Bacillus halodurans.

В последнее десятилетие в литературе появились описания бактериальных лакказо-подобных медьсодержащих оксидаз, которые обладают лакказной активностью, но имеют существенные отличия в физиологических и биохимических свойствах по сравнению с грибными и растительными лакказами.

Считается, что эти бактериальные ферменты способны катализировать реакции окисления различных субстратов при нейтральных значениях рН раствора и в присутствии значительных концентраций хлорид-ионов. Поэтому эти ферменты являются интересными объектами для изучения с целью создания катода имплантируемого биотопливного элемента.

В качестве объекта настоящего исследования мы использовали рекомбинантный фермент B. halodurans, любезно предоставленный нам проф.

Дитмаром Халтрихом (Австрия) в рамках выполнения совместных исследований.

Препарат фермента имел невысокую удельную активность 0.025 U/мг, измеренную по окислению АБТС.

биоэлектрокаталитических системах были определены ее некоторые биохимические характеристики, необходимые для подбора условий функционирования фермента на электроде. Бактериальная медьсодержащая оксидаза имела характерное для классических голубых лакказ поглощение в области =610 нм. Молекулярная масса полученного фермента равнялась 56 кДа.

Относительная активность, % использовании в качестве субстрата серингалдазина, имела колоколообразный вид, характерный для грибных лакказ, но максимум активности был смещен в область нейтральных и слабощелочных значений рН раствора (рис. 11). Отличительной чертой исследуемого фермента являлась активация оксидазы ионами хлора, что хорошо видно на рис. 12.

При увеличении в растворе концентрации NaCl вплоть до 100 мМ наблюдалось двухкратное увеличение активности бактериального фермента.

Дальнейшее повышение концентрации ионов хлора в растворе не давало положительного эффекта.

Хочется отметить, что бактериальная оксидаза проявляла каталитическую активность лишь в присутствии ионов двухвалентной меди в концентрации 1 мМ, что возможно связано со слабым взаимодействием ионов меди активного центра с апоферментом и их возможной потерей белковой глобулой фермента в растворе.

Была показана возможность быстрого и обратимого восстановления и окисления фермента на золотом электроде путем прямого электронного транспорта между золотым электродом и исследуемой бактериальной оксидазой B. halodurans в отсутствие редокс медиатора. Редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента, определенный методом потенциометрического редокс-титрования равнялся 325±10 мВ (отн. НВЭ). Таким образом, фермент B. halodurans относится к группе низко редокс-потенциальных лакказ.

Относительная активность, % Была исследована возможность прямого электронного переноса между оксидазой из B. halodurans и графитовым электродом в аэробных условиях. При насыщении раствора молекулярным кислородом на модифицированном оксидазой электроде наблюдалась биокаталитическая реакция электровосстановления молекулярного кислорода (рис. 13).

Следует отметить, что потенциал начала электровосстановления молекулярного кислорода находится примерно на 120 мВ положительнее редокспотенциала Т1 центра фермента, рассчитанного по данным редокс титрования.

Биоэлектрокаталитическая активность фермента B. halodurans была незначительной при отсутствии в рабочем растворе ионов двухвалентной меди. Эти результаты хорошо согласуются с данными по измерению каталитической активности исследуемого фермента в гомогенной системе.

Константа Михаэлиса по кислороду, рассчитанная для лакказо-подобной медьсодержащей оксидазы B. halodurans в гомогенной системе с использованием в качестве донора электронов ферроцианида калия, составила ~50 мкМ и была близка по значению к константе по кислороду для этого же фермента, полученной для гетерогенной биоэлектрохимической системы при потенциале 300 мВ (отн. НВЭ).

Эти константы бактериальной оксидазы в несколько раз ниже по сравнению с аналогичными КМ по кислороду, полученными для грибных и древесной лакказ.

Таким образом, было показано, что бактериальная медьсодержащая лакказоподобная оксидаза из B. halodurans, адсорбированная на электроде, катализирует реакцию электровосстановления молекулярного кислорода по механизму прямого электронного переноса в нейтральных растворах, содержащих NaCl и ионы двухвалентной меди. Однако, этот фермент относится к низко редокспотенциальным оксидазам и, поскольку, начало реакции электровосстановления молекулярного кислорода коррелирует с редокс-потенциалом активного центра, стационарный потенциал такого катода существенно ниже равновесного кислородного потенциала, что и является существенным недостатком для использования этого бактериального фермента в качестве катализатора на катоде биотопливного элемента.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты исследования возможности использования лакказ для создания катода биотопливного элемента.

Одной из целей настоящей работы являлось выяснение возможности использования лакказ и лакказо-подобной оксидазы в качестве катализаторов реакции электровосстановления молекулярного кислорода на катоде биотопливного элемента по прямому безмедиаторному механизму.

Необходимым условием функционирования имплантированного биотопливного элемента является физиологическое значение рН раствора 7.0-7.2, присутствие ионов хлора в концентрации около 100 мМ и перенапряжение менее 0.65 В.

В настоящей работе было показано, что лакказа R. vernicifera отвечает некоторым требованиям для создания вышеуказанных источников тока, а именно, она может функционировать при нейтральных значениях рН и в присутствии анионов хлора. Бактериальная медьсодержащая лакказо-подобная оксидаза из B. halodurans так же способна функционировать в нейтральных растворах и не ингибируется, а даже активируется ионами хлора. Однако, этот фермент относится к группе низко редокс-потенциальных оксидаз, что является главным препятствием при создании биокатода с их использованием. Кроме того, бактериальная оксидаза для проявления каталитической активности требует присутствия в реакционной среде дополнительно внесенных ионов меди.

Грибная лакказа T. hirsuta относится к группе высокопотенциальных ферментов, по этой причине, а так же из-за своей высокой стабильности и каталитической активности она является перспективным объектом исследований с целью создания биосенсоров, датчиков и катода биотопливного элемента.

Иммобилизованная на электроде лакказа T. hirsuta способна осуществлять реакции прямого электронного переноса, что было показано нами ранее.

Однако, исследования по ингибированию этого фермента в гетерогенных реакциях показали, фермент ингибируется на 30% хлорид-анионами при рН 4.0, а в нейтральных растворах он каталитически неактивен.

Таким образом, можно сделать вывод, что в настоящее время не найдены хорошие биокатализаторы реакции электровосстановления молекулярного кислорода в физиологических условиях, удовлетворяющие всем требованиям, предъявляемым к биокатализатору топливного элемента, а именно:

функционирование в нейтральных и слабощелочных растворах, при концентрации хлорид ионов 0.1 М. В связи с этим, для создания катода биотопливного элемента необходимо продолжить поиск новых ферментов, отвечающих всем функциональным требованиям, целенаправленно модифицировать уже изученные, например, генно-инженерными или химическими методами, либо подбирать условия иммобилизации и иной модификации поверхностей и самих ферментов с целью повышения стабильности разрабатываемых электродов.

1. Грибная и древесная лакказы катализируют реакцию электровосстановления молекулярного кислорода на электродах из углеродных материалов по механизму прямого переноса электрона. Древесная лакказа способна катализировать эту реакцию при нейтральных значениях рН раствора со слабой степенью ингибирования анионами хлора. Грибная лакказа, напротив, обладает высокой биоэлектрокаталитической активностью только в кислой среде, при этом ферментативная активность значительно ингибируется ионами хлора.

2. Установлено, что бактериальная лакказо-подобная медьсодержащая оксидаза Bacillus halodurans является низко редокс-потенциальным ферментом, проявляющим каталитическую активность при нейтральных и слабощелочных значениях рН раствора в присутствии ионов хлора и двухвалентной меди по механизму прямого электронного переноса.

3. Показано, что эффективность катализа (kкат/KM) высоко- и низкопотенциальных лакказ по отношению к субстратам-доноров электронов близкого строения линейно зависит от «движущей силы реакции», т.е. от разности редокс-потенциалов субстрата и Т1 центра фермента.

4. Экспериментально доказано, что хелатированные ионы двухвалентного марганца могут являться природными субстратами грибных лакказ и образующиеся в результате ферментативной реакции окисления с участием лакказ хелатированные ионы трехвалентного марганца способны к неферментативному окислению модельного соединения лигнина, вератрового спирта, до вератровой кислоты в присутствии ферментов. Таким образом, хелатированные ионы марганца являются природными редокс-медиаторами грибных лакказ.

5. Показана способность высоко редокс-потенциальных грибных лакказ катализировать свободно-радикальную реакцию полимеризации анилина, а также отсутствие такой возможности при использовании низко редокс-потенциальных ферментов.

Список публикаций 1. М.А.Горбачева, Г.П.Шумакович, О.В.Морозова, А.В.Стрельцов, Е.А.Зайцева, С.В.Шлеев, А.И.Ярополов. «Сравнительное изучение биокаталитических реакций с участием высоко- и низкопотенциальных грибных и древесной лакказ в гомогенных и гетерогенных реакциях» Вестник МГУ, Сер. 2.

Химия, 2008, 49, с. 117-122.

2. Sergey Shleev, Yan Wang, Marina Gorbacheva, Andreas Christenson, Dietmar Haltrich, Roland Ludwig, Tautgirdas Ruzgas, Lo Gorton «Direct heterogeneous electron transfer reactions of Bacillus halodurans bacterial blue multicopper oxidase».

Electroanalysis, 2008, № 9, 963-969.

3. О.В Морозова, Г.П. Шумакович, М.А. Горбачева, С.В. Шлеев, А. И.

Ярополов ««Голубые» лакказы» Биохимия, 2007, т. 70, № 5, с. 1396-1412.

4. M.A.Gorbacheva, O.V.Morozova, G.P.Shumakovich, A.V.Streltsov, S.V.Shleev, A.I.Yaropolov «Enzymatic oxidation of manganese ions catalysed by laccase », Bioorganic Chemistry, 2009, № 37, 1-5.

Статья в сборнике МГУИЭ:

1. Е.С. Горшина, Т.В. Русинова, Н.С. Марьина, Н.А. Шкурина, В.В. Бирюков, И.Н. Щеблыкин, М.А.Горбачева, О.В. Морозова, С.В. Шлеев, А.И. Ярополов «Биосинтез грибной лакказы – фермента для экологически безопасных производств» Сборник трудов МГУИЭ, 2006, с. 116-123.

Тезисы докладов:

1. М.А.Горбачева, Н.С. Марьина, Т.В. Русинова, Е.С. Горшина, С.В. Шлеев «Сравнение каталитических свойств грибной лакказы Trametes hirsuta и растительной лакказы Rhus vernicifera» Материалы IV Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007 г., ч. 2, с. 2. M.A.Gorbacheva, O.V.Morozova, G.P.Shumakovich, A.I.Yaropolov, S.V.Shleev "Comparative studies of high and low redox potential laccase in homogeneous and heterogeneous biocatalytic reactions" Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2007" June, 17-22, 2007, Moscow-St.Peterburg, Russian Federations, P. 96.



 
Похожие работы:

«ОВЧИННИКОВА АННА БОРИСОВНА ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КУЛЬТУРНЫХ ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИМОРФИЗМА ЯДЕРНЫХ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ И ИЗМЕНЧИВОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ 03.02.07. – Генетика 03.02.01. – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт – Петербург - 2011 -2 Работа выполнена в отделе биотехнологии и в отделе агроботаники и сохранения in situ генетических ресурсов растений Государственного научного учреждения...»

«Зайцева Юлия Анатольевна ПАРТЕНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ АКТИВАЦИЯ И ХИМИЧЕСКАЯ ЭНУКЛЕАЦИЯ ООЦИТОВ КРЫС. ПРОЦЕССЫ ДЕМЕТИЛИРОВАНИЯ ДНК У РАННИХ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ КРЫС И МЫШЕЙ 03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в Центре молекулярной медицины имени Макса Дельбрюка (Берлин) и в Институте цитологии Российской акдемии наук (Санкт-Петербург) Научные...»

«ЗАГУРНАЯ ЮЛИЯ СЕРГЕЕВНА ВЛИЯНИЕ ФРАГМЕНТАЦИИ НА ВИДОВОЕ БОГАТСТВО И СОСТАВ ФИТОЦЕНОЗОВ ШИРОКОЛИСТВЕННЫХ ЛЕСОВ ЗАПАДНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2010 2 Работа выполнена на кафедре экологии и защиты окружающей среды Майкопского государственного технологического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Акатов Валерий Владимирович Официальные...»

«ПРОКОФЬЕВА Мария Юрьевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ СЕМЯН В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КОРНЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в группе специализированного метаболизма корней Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва....»

«Мальцев Александр Владимирович АГРОЛАНДШАФТНОЕ ОБОСНОВАНИЕ АГРОТЕХНИКИ НА ЧЕРНОЗЕМЕ ОБЫКНОВЕННОМ В ОТРОГАХ ДОНЕЦКОГО КРЯЖА 03.00.27 - почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2008 Работа выполнена на кафедре земледелия и мелиорации Донского государственного аграрного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Калиниченко Валерий Петрович Официальные оппоненты : доктор...»

«ЛАТОНОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА ТЕХНОЛОГИЯ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ РЕАБИЛИТАЦИИ ЗАГРЯЗНЕННЫХ ГРУНТОВ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ Специальность 03.02.08 – Экология (в химии и нефтехимии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва – 2011 2 Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный университет инженерной экологии (ФГБОУ ВПО МГУИЭ). Научный...»

«КОВПАК НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ КОРЮШКОВЫХ РЫБ РОССИИ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени Владивосток – 2010 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Скурихина Любовь Андреевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Фролов Сергей...»

«ЧЕПИНОГА Виктор Владимирович ФЛОРА БАССЕЙНОВ РЕК ИЯ И ОКА (В ПРЕДЕЛАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.00.05. - ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Иркутск, 2000 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики Иркутского государственного университета. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент А. М. Зарубин Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор, Л.И. Малышев кандидат биологических наук, М.Г....»

«БАБАСАНОВА Ольга Бадмажаповна АЭРОБНЫЕ ОРГАНОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА 03.00.16 – экология 03.00.07– микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2007 2 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Бархутова Дарима Дондоковна Научный консультант : кандидат биологических наук Намсараев Зоригто Баирович...»

«МУЗЫКАНТОВ Алексей Александрович АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM S6) К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ 03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань-2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук Чернова Ольга Александровна...»

«ВОЛКОВА Наталья Александровна ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 03.00.23 – Биотехнология 03.00.13 – Физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук п. Дубровицы, Московская обл. 2008 1 Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научноисследовательский институт животноводства Российской академии...»

«БЛИНОВА Илона Владимировна БИОЛОГИЯ ОРХИДНЫХ НА СЕВЕРО-ВОСТОКЕ ФЕННОСКАНДИИ И СТРАТЕГИИ ИХ ВЫЖИВАНИЯ НА СЕВЕРНОЙ ГРАНИЦЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ Специальность 03. 00. 05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук в Полярноальпийском ботаническом саду-институте им Н. А. Аврорина (ПАБСИ КНЦ РАН) Официальные оппоненты : доктор биологических наук Коломейцева Галина...»

«Степанченко Наталья Сергеевна Исследование взаимодействия сигнальных путей этилена и абсцизовой кислоты в контроле пролиферации культивируемых клеток арабидопсиса 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ внутриклеточной регуляции Учреждения Российской академии наук Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН, г. Москва...»

«ПЛОТНИКОВА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНА ВЛИЯНИЕ МЕТИЛФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ОСНОВНЫЕ ЗВЕНЬЯ ГОМЕОСТАЗА БЕЛЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Российский научный центр Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова (РНЦ ВТО) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный...»

«ДЕНИСОВА Ольга Николаевна ОСОБЕННОСТИ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА РАСТЕНИЙ ПРИДОРОЖНОЙ ЗОНЫ В УСЛОВИЯХ ОСТАТОЧНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ СВИНЦОМ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ–2006 Работа выполнена на кафедре химии ФГОУ ВПО Марийский государственный технический университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Винокурова Раиса Ибрагимовна Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор...»

«Головатских Инна Васильевна ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ НЕКОТОРЫМИ БИОЭЛЕМЕНТАМИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ И ЙОДА У ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ЮЖНОГО РЕГИОНА БАШКИРИИ (НА ПРИМЕРЕ Г.МЕЛЕУЗА И МЕЛЕУЗОВСКОГО РАЙОНА) 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск — 2014 2 Работа выполнена на кафедре биологической химии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»

«Тимошкина Ольга Александровна ВЛИЯНИЕ ВЫРУБОК И КОНТРОЛИРУЕМОГО ВЫЖИГАНИЯ ПОРУБОЧНЫХ ОСТАТКОВ НА СООБЩЕСТВА ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ И ПТИЦ ВОСТОЧНОГО САЯНА) 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2004 Работа выполнена на кафедре охотничьего ресурсоведения и заповедного дела Красноярского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Соколов...»

«Закария Давидович Гинтури Псиллиды (Hemiptera, Psylloidea) междуречья рек Малого Лиахви и Меджуды: фауна, биология, результаты использования инсектицидов - энтомология 03.00.09 АВТОРЕФЕРАТ диссертации представленной на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук _ 2006 Тбилиси Диссертационная работа выполнена на кафедре зоологии Тбилисского Государственного Университета им. Ив. Джавахишвили. Научный...»

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом...»

«ПОЛЯКОВ АРТЕМ ИГОРЕВИЧ ВЛИЯНИЕ ВЫРУБКИ ЛЕСА НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГОРНЫХ ПОЧВ ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Южного федерального университета Научный руководитель : доктор географических наук, профессор Казеев Камиль Шагидуллович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.