WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЧЕРКАШИН

Евгений Александрович

СТРУКТУРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

ЛАККАЗ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ

Специальность: 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва – 2009 «Молекулярные

Работа выполнена в лаборатории основы биотрансформаций» Учреждения Российской академии наук Института биохимии имени А.Н. Баха РАН и на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор В. И. Тишков доктор биологических наук, профессор О. В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор А. П. Синицын доктор биологических наук А. А. Леонтьевский

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 18 2009 года в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу: Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.

Автореферат разослан “_” _2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф.Орловский

-2ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Разработка эффективных технологий «зеленой»

химии, способных заменить существующие химические технологии, обуславливает возрастающее внимание к поиску ферментов и созданию на их основе альтернативных и новых биокаталитических процессов. Одним из таких ферментов является лакказа (п-дифенол: кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2). Лакказа принадлежит к семейству медьсодержащих оксидаз и катализирует реакцию восстановления молекулярного кислорода различными органическими и неорганическими соединениями до воды, минуя стадию образования пероксида водорода.





На сегодняшний день выделено и охарактеризовано более ферментов этого типа из различных источников: грибов, растений, насекомых, бактерий. Большая часть лакказ выделена из базидиальных грибов, где этот фермент участвует в процессах деструкции лигнина, синтеза пигментов, детоксификации и синтеза гуминоподобных веществ. Функция лакказы в растениях связана с процессом образования лигнина. В насекомых лакказа участвует в процессе склеротизации, а также играет важную роль при окислении токсичных соединений. Согласно данным ряда исследователей лакказы или лакказоподобные ферменты присутствуют в бактериях и вовлечены в синтез белка оболочки эндоспор.

Наиболее консервативной частью лакказы является активный центр, содержащий четыре иона меди и координирующие их аминокислотные лиганды, формирующие уникальную структуру, определяющую спектральные и каталитические характеристики фермента. Следует отметить, что в процессе эволюции медьсодержащих белков архитектоника медных центров изменилась незначительно, что позволяет рассматривать активный центр лакказы как модельную систему для изучения механизма действия таких медьсодержащих оксидаз, как аскорбатоксидаза и церрулоплазмин.

Ионы меди в биологических системах классифицируют согласно их оптическим и магнитным свойствам на три типа: T1, Т2 и Т3. В активном центре лакказы присутствуют все три типа, однако, несмотря на консервативность его строения, каталитические характеристики различных лакказ значительно отличаются, что, по мнению ряда авторов, определяется значением как окислительновосстановительного потенциала иона меди первого типа, так и строением белковой и углеводной частей фермента. В этой связи, особый интерес для исследования представляет группа лакказ с высоким значением окислительно-восстановительного потенциала иона меди первого типа Т1.

В настоящее время получены и опубликованы данные по структуре более лакказ из различных источников. Однако даже наличие структурных данных все еще механизмом его действия и ответить на важные с практической и фундаментальной точки зрения вопросы, такие как: 1) что обеспечивает ферменту высокий окислительно-восстановительный потенциал медного центра (T1); 2) какова роль отдельных аминокислотных остатков, формирующих этот центр; 3) что обеспечивает широкую субстратную специфичность фермента на структурном и молекулярном уровнях. Таким образом, изучение генетической организации лакказ и установление структурно-функциональных особенностей данных ферментов является актуальным медьсодержащих оксидаз), так и с практической точки зрения (создание рекомбинантных ферментов и их биотехнологическое применение).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было сравнительное изучение генетической и структурной организации высоко и средне редокс-потенциальных лакказ базидиомицетов.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) Клонирование генов лакказ из базидиомицетов Coriolus hirsutus, Cerrena maxima, Coriolus zonatus, Coriolopsis fulvocinerea, Antrodiella faginea и Pleurotus ostreatus с хромосомной ДНК и определение их полных нуклеотидной и аминокислотной последовательностей.





2) Определение экзон-интронной структуры генов исследуемых лакказ и их сравнительный анализ.

3) Уточнение ранее полученных структур базидиальных лакказ из C.hirsutus, C.maxima и C.zonatus на основе полученных аминокислотных последовательностей.

4) Моделирование структур лакказ из C.fulvocinerea и P.ostreatus на основе полученных аминокислотных последовательностей.

5) Структурный анализ окружения активного центра ионов меди Т1 и определение аминокислотных остатков, которые могут влиять на каталитические свойства фермента.

Научная новизна. Впервые проведено систематическое исследование геномной организации высоко и средне редокс-потенциальных лакказ из C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A.faginea и P.ostreatus. Установлено, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 9-10 интронов, причем их длина и положение совпадают. Средне редокс-потенциальные лакказы характеризуются наличием большего числа интронов. Высказана гипотеза о существовании консервативных и вариабельных интронов в генах лакказ базидиомицетов.

Установлена локализация трех интронов, характерная только для лакказ базидиальных грибов. Анализ базы данных GenBank подтвердил высказанную гипотезу. Показано, что разделение лакказ на группы в зависимости от величины окислительно-восстановительного потенциала подтверждается особенностями депонирована в банк данных [GenBank Accession code: ACC43989].

Проведен сравнительный анализ аминокислотных остатков в активном центре Т1. Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении остатков Asn или Asp, а так же наличие водородной связи между остатками Glu460 и Ser113 (нумерация остатков приведена по структуре лакказы C.hirsutus).

Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

Практическая значимость работы. Результаты сравнительного исследования генетической организации генов высоко и средне редокс-потенциальных лакказ очень важны для поиска штаммов-продуцентов высоко потенциальных лакказ.

Разработанные методы клонирования лакказ с хромосомной ДНК, являются быстрыми методами оценки типа лакказ (высоко, средне потенциальные), применимыми к широкому кругу базидиальных штаммов продуцентов. Проведенное исследование геномной организации лакказ является основой для проведения экспериментов по белковой инженерии данных ферментов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development” (Moscow, Russia, 2007), Международные конференции «Ломоносов – 2006», «Ломоносов – 2007» (Москва, Россия, 2006, 2007), 15 Международный микологический конгресс «XV Congress of Europian Mycologist» (C.-Петербург, Россия, 2007), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007), Международная конференция «Биокатализ-2007» (С. -Петербург, Россия, 2007), IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008), 4th European meeting in Oxizymes (Helsinki, Finland, 2008), The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development” (Moscow, Russia, 2009).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 9 тезисов конференций. Обе статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация содержит_страниц печатного текста,_ рисунков, таблиц и _ ссылок.

-5РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор штаммов для исследования. В качестве объекта исследования были выбраны следующие штаммы - продуценты лакказ из коллекции Ботанического Института им. Комарова РАН (ЛЕ(БИН)):

Coriolus hirsutus (Trametes hirsuta (Wulfen), Pilat, 1939);

Coriolus zonatus (Trametes ochracea (Pers.), Gilbe&Ryvarden, 1897);

Cerrena maxima (Trametes maxima (Mont.), A. David&Rajchenb, 1985);

Coriolopsis fulvocenerea (Coriolopsis caperata, Murrill, 1908);.

Pleurotus ostreatus ((Jacq.), P. Kumm&Pilzk,1871);

Androdiella faginea (Vampola et Pouzar, 1996);

Xerula radicata (Relhan&Drfelt, 1975).

Следует отметить, что классификация базидиальных грибов достаточно запутана и поэтому в работе будет использовано то название штамма, которое он имеет в коллекции ЛЕ(БИН)а со ссылкой на современное название согласно CABI Bioscience и базе данных CBS (www.indexfungorum.org).

По предварительным биохимическим исследованиям лакказы, продуцируемые базидиомицетами C. hirsutus, C.zonatus, C.maxima, A.faginea и C.fulvocenerea, являются высоко редокс-потенциальными и имеют потенциал иона меди Т мВ [Buldrian P. et al., 2006]. В то время как лакказы, продуцируемые базидиомицетами P.ostreatus, и X.radicata, имеют средний редокс-потенциал.

Определение наличия генов лакказ в геномах базидиальных грибов.

Лакказы базидиальных грибов кодируются сложным семейством генов, причем в одном штамме может содержаться как один, так и несколько генов изоформ фермента. Несмотря на ограниченное количество публикаций о геномной организации грибных лакказ, общей чертой лакказных генов можно считать высокую гомологию участков нуклеотидной последовательности, кодирующих аминокислотное окружение ионов меди активного центра фермента. Проведенный анализ более 100 аминокислотных последовательностей лакказ, имеющихся в базе данных GenBank, позволил выделить 4 консервативных для всех лакказ участка, причем аминокислотные остатки, входящие в их состав, отвечали за координацию ионов меди. На основании нуклеотидных последовательностей этих участков были сконструированы и синтезированы праймеры (табл. 1).

Праймеры LacA1 For и LacA1L For были сконструированы на один и тоже же участок гена и отличались только в 6 триплете TT(TC) и (CT)T(GC) соответственно.

Синтез двух практически одинаковых праймеров обусловлен наличием с равной вероятностью в указанном положении как остатка фенилаланина, так и остатка лейцина.

Универсальные праймеры на высоко консервативные участки гена лакказ.

LacA1 For 5'-CA(CT) TGG CA(CT) GG(AT) TT(TC) (CT)T(GC) CA(AG)-3' LacA1L For 5'-T(TA)(TC) TGG TA(TC) CA(CT) (TA)(CG)T CA(CT) (CT)TA-3' LacA2 For LacA4 Rev 5'-(AG)TG (AG)AA (AG)TC·(AGT)AT·(AG)TG·(AG)CA·(AG)TG-3' LacA5 Rev Вышеуказанные праймеры были использованы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на геномной ДНК исследуемых штаммов. В результате для всех исследуемых штаммов за исключением X.radicata были получены соответствующие ПЦР-продукты. Полученные данные свидетельствовали об отсутствии генов лакказы у X.radicata. Для подтверждения результатов ПЦР, было проведено поверхностное и глубинное культивирование исследуемых штаммов на оптимизированной для максимальной продукции лакказ среде. Все изученные штаммы, за исключением X.radicata, секретировали при культивировании лакказу в культуральную жидкость, из которой были выделены очищенные препараты фермента.

Разработанная ПЦР-методика является универсальной для детекции генов лакказ в различных штаммах базидиомицетов и позволяет в короткий срок определять наличие или отсутствие гена лакказы, его частичную нуклеотидную последовательность, и, как следствие, оценить уровень гомологии этой последовательности с уже известными данными. Это позволяет применять ее для экспресс-метода поиска грибных продуцентов лакказ.

Неоспоримым достоинством данной методики, следует также считать, возможность определения с помощью инвертной ПЦР полной последовательности гена лакказы, включая интроны даже в случаях, когда неизвестны ни аминокислотная, ни нуклеотидная последовательности.

Определение полной нуклеотидной последовательности, с использованием геномной ДНК обладает рядом достоинств по сравнению с методом определения последовательности через клонирование кДНК, поскольку исключает возможные ошибки, которые могут возникнуть при проведении реакции обратной транскрипции.

Кроме того, данный метод позволяет определить экзон-интронную структуру гена лакказы.

Определение аминокислотной последовательности лакказы C.hirsutus клонированием гена с хромосомной ДНК. Для определения полной нуклеотидной -7последовательности лакказы из базидиомицета C.hirsutus было проведено амплифицирование полноразмерного гена этого фермента с хромосомы при помощи ПЦР.

Участок аминокислотной последовательности C.hirsutus, полученный путем трансляции нуклеотидной последовательности с кДНК, был использован для поиска гомологичных аминокислотных последовательностей в базе данных GenBank.

Высокий уровень гомологии (более 90%) наблюдался для аминокислотных последовательностей высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.maxima и T.versicolor, определенных на основании данных рентгено-структурного анализа [PDB code:2H5U,1KYA]. Для конструирования праймеров был проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей этих лакказ и выявлены консервативные аминокислотные участки. На основе анализа и данных по частоте встречаемости кодонов для C.hirsutus, был проведен дизайн вырожденных праймеров, которые кодируют консервативные участки аминокислотной последовательности лакказ. Нуклеотидная последовательность лакказы из C.hirsutus, полученная секвенированием кДНК, и последовательность сигнального пептида для T.versicolor были использованы для синтеза вырожденного праймера, который с высокой степенью вероятности применим для определения нуклеотидных последовательностей, кодирующих сигнальные пептиды лакказ других штаммов.

Таким образом, были разработаны и синтезированы 8 праймеров для определения нуклеотидной последовательности лакказы из C.hirsutus, которые могут быть использованы и для определения нуклеотидных последовательностей других высоко потенциальных лакказ (табл. 2).

Разработанные праймеры были использованы для получения ПЦР-фрагментов, нуклеотидные последовательности которых были определены методом секвенирования. Поскольку не все пары праймеров давали выход целевого ПЦРпродукта, определить полную нуклеотидную последовательность гена лакказы не удалось, что вызвало необходимость синтеза дополнительных праймеров комплементарных к уже определенным участкам гена лакказы из C.hirsutus.

Нуклеотидные последовательности ПЦР-фрагментов, полученных с помощью последовательность гена лакказы из последовательность гена лакказы имела длину 2120 пар нуклеотидов. По данным кДНК и рентгено-структурного анализа аминокислотная последовательность лакказы из C.hirsutus состоит из 500 аминокислотных остатков, что составляет 1500 пар нуклеотидов. Следовательно, 620 нуклеотидов в гене фермента локализованы в интронах, что составляет около 30% от общей длины последовательности.

Полученная таким образом нуклеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную. Для определения правильной рамки считывания при трансляции использовались аминокислотные последовательности, определенные с помощью локализовали на основании GT-AG сайтов сплайсинга в интронах [Mount S. et al., 1982]. Таким образом, установлено, что ген лакказы из C.hirsutus состоит из экзонов и 10 интронов.

редокс-потенциальных лакказ.

Сигнальный N-конец гена С-конец гена Дополнительные праймеры для клонирования гена лакказы из C.hirsutus.

LacН1For Lac10For Lac11Rev Lac8HRev редокс-потенциальных лакказ C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea. Для определения полной нуклеотидной последовательности лакказ из базидиомицетов C.maxima, C.zonatus и C.fulvocinerea использовали ту же стратегию клонирования и те же праймеры, как и в случае лакказы из C.hirsutus.

В результате исследований было установлено, что гены лакказ из C.maxima и C.fulvocinerea содержат по 10 интронов каждый, а фермент из C.zonatus - интронов. Аминокислотная последовательность (без сигнального пептида) лакказы из C.maxima включает 499, а лакказ из C.fulvocinerea и C.zonatus - аминокислотных остатков. В случае лакказы из C.maxima удалось установить и последовательность сигнального пептида, длина которого составила аминокислотный остаток.

Определение аминокислотной последовательности средне редокспотенциальной лакказы из P.ostreatus. Для средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus использование праймеров для клонирования высоко редокспотенциальных лакказ не давало выхода целевого ПЦР-продукта, и в дальнейшей работе использовали универсальные праймеры для лакказ (табл. 1). Для пары праймеров LacA1 For- LacA4 Rev был получен ПЦР-фрагмент размером 1200 п.н.

Определение нуклеотидной последовательности этого фрагмента показало, что он обладает 100% гомологией с лакказой POX1 [GenBank Accession code: Z22591] из Pleurotus sp. 'Florida'. Поэтому для разработки праймеров использовали имеющуюся в банке данных нуклеотидную последовательность лакказы POX1. В результате были синтезированы праймеры на 5’- и 3’- участки гена (табл. 4).

Праймеры, использованные для клонирования лакказы из P.ostreatus.

Сигнальный LacPO1 For LacPO4 For LacPO4 Rev LacPO5 For LacPO5 Rev С-конец гена LacPO11 Rev последовательность лакказы из P.ostreatus, которая полностью совпала с последовательностью лакказы POX1, определенной ранее [GenBank Accession code:

Z22591]. Длина нуклеотидной последовательности составляет 2756 п.н.

Аминокислотная последовательность лакказы была получена прямой трансляцией с нуклеотидной последовательности. Анализ полученной последовательности показал, что она содержит 20 экзонов и 19 интронов.

Определение аминокислотной последовательности лакказы из A.faginea Базидиомицет A.faginea, а так же экспрессируемая им лакказа, в литературе описаны ранее не были. Поэтому для определения нуклеотидной и аминокислотной последовательности лакказы из этого организма использовалась методика инвертного ПЦР. Для реализации данного подхода ключевым шагом является определение нуклеотидной последовательности внутренней области ДНК исследуемого образца (300-500 п.н). В качестве праймеров для получения внутренней области гена использовали пару универсальных праймеров для лакказLacA1 For-Laca5 Rev. В результате амплификации были получены два ДНКфрагмента длиной около 1100 п.н. и 1300 п.н. После секвенирования этих фрагментов, были обнаружены значительные отличия в их нуклеотидной последовательности. Фрагмент размером 1100 п.н имел 94% гомологию с лакказой из T.versicolor [GenBank Accession code:AY081188]. Фрагмент размером 1300 п.н.

содержал многочисленные «вставки» в нуклеотидной последовательности, которые не встречались в полных нуклеотидных последовательностях генов изучаемых лакказ. Поэтому было проведено клонирование гена содержащего более легкий ПЦР-фрагмент. Для этого были разработаны и синтезированы новые праймеры, обеспечивающие проведение инвертного ПЦР (табл. 5).

Праймеры для проведения инвертного ПЦР (лакказа из A.faginea).

LacAf1 For

5'-TGG AGG TCA ACA TTG ACG CGT TAT GTC ACA ACA AAG-3'

LacAf3 Rev LacAf4 For LacAf1 Rev LacAf6 Rev Гидролиз геномной ДНК проводили рестриктазами HindIII, EcoRI, BamHI и Pst в стандартных условиях. В результате в случае рестриктаз HindIII и EcoRI при амплификации с инвертными праймерами были получены ПЦР-фрагменты, которые были высокогомологичны лакказе из T.versicolor. Таким образом, была полностью нуклеотидная последовательность была транслирована в аминокислотную. Анализ базы данных GenBank показал, что полученные нуклеотидная и аминокислотная последовательности были гомологичны на 94 и 98% соответствующим последовательностям лакказы из базидиомицета T.versicolor. Полная длина гена составила 2002 п.н., организованных в 9 экзонов и 8 интронов.

Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ.

Сравнение аминокислотных последовательностей исследуемых лакказ с последовательностями средне редокс-потенциальных лакказ из Coprinus cinereus и Rigidoporus lignosus приведено на (рис. 1). Видно, что высоко редокс-потенциальные ферменты имеют высокий уровень гомологии между собой (80%). Средне редокспотенциальная лакказа из P.ostreatus имеет более низкий уровень гомологии 63% по аминокислотной последовательности по отношению к ферменту из C.hirsutus и характеризуется заметными отличиями (делеции/вставки) в аминокислотной последовательности. Различия имеют преимущественно точечный характер и, как показал анализ структур, находятся вдали от активного центра фермента.

Интересно также отметить, что дипептид Ala-Ala 452-453, который присутствует в лакказах из C.hirsutus, C.maxima и A.faginea (T.versicolor) характерен только для семейства Trametes (Coriolus).

Экзон-интронная структура генов исследуемых лакказ. Большинство нуклеотидных последовательностей генов лакказ, имеющихся в базе данных, получены секвенированием кДНК и не содержат интронов. Последовательностей, полученных клонированием с хромосомной ДНК, описано около 30. Анализ экзон-интронной структуры генов исследуемых лакказ показал, что для высоко редокс-потенциальных лакказ характерно наличие меньшего числа интронов (8-10), чем для средне редокс-потенциальных. Эти данные хорошо согласуются с результатами анализа экзон-интронной структуры для других высоко и средне редокс-потенциальных ферментов. Так средне редокс-потенциальные лакказы из С.cinereus, P.ostreatus (PoxC) и R.lignosus содержат 19, 21 и 12 интронов соответственно. Все исследованные в данной работе лакказы имеют в трех положениях интроны, идентичные по локализации и длине (положения 80, 90 и 210) (рис. 2). Анализ базы данных показал, что данные интроны характерны для всех базидиальных лакказ с описанной экзон-интронной структурой. У лакказ из аскомицетов интроны в данных положениях не обнаружены, что позволяет высказать предположение об общности экзон-интронного строения генов у базидиомицетов. Также следует отметить наличие у исследованных в данной работе высоко редокс-потенциальных лакказ четырех интронов, не характерных для средне редокс-потенциальной лакказы из P.ostreatus (положения 160, 240, 330 и 370) (рис. 2). Анализ последовательностей средне редокс-потенциальных лакказ из них интронов в этих положениях это свидетельствует о том, что эти четыре интрона характерны только для высоко редокс-потенциальных лакказ.

C.max 1 -....................-.........---------............................................................ C.zon 1 ------......N..I.....-..D......--------- GF....IT.. K..N..I........................K..........V......A A.fag 1 -GI......A.SN........-.........--------- G.....IT.. K..N...........................K.................S C.ful 1 -CI..I.....SN.DI.....-.........--------- G.....IT.. K..............................K..........V......A P.ost 1 -.I..TG.MY.VNED......-T.S...AR SDPTTNGTSE TLT.V..Q.. K..N.....L NQ.SDT.... T..........S.ST.......V.....AS R.lig 1 -.ATVAL..H.LN.NLD... TGA.S..TAE.--------- T.IA..IT...D....I....Q..DAN.RR A..........A..TEM.....V.....I. C.cin 1 AI.NS.DTM. L.N.N......-T.AGIL...--------- -VH...IR.G KN.N.E...V ND.D.P...R P.......L..R.......A DGV.......

C.hir 90 GHSFLYDFQV PDQAGTFWYH SHLSTQYCDG LRGPFVVYDP NDPHASRYDV DNDDTVITLA DWYH----TA AKLGPRFPGG ADATLINGKG RAPSDSPA-E

C.max 90................................................................----..........L................TT.-. C.zon 85.N..............................................................----V......AI..............S..NLN.-. A.fag 90.N....N....................................S.DL.................----V......A..L............S..TTT.-D C.ful 90.N..............................................................----..........L................TT.-. P.ost 99.N......N..........................I.... S...L.L.....A..I...E....----VV.PQNAVL.T-..S........FAGGPTS-A R.lig 91 NE..V...V..G....Y................A..........L.L....DAS....I.....SLSTVL FPNPNKA.PA P.T.....L..NSANPS.GQ C.cin 90..A...K.TP AGH.........FG..........M.I..D.....AL..E.DEN.I........-----I PAPSIQGAAQ P..........YVGGPA.-.

C.hir 185 LSVIKVTKGK RYRFRLVSLS CNPNHTFSID GHNLTIIEVD SVNSQPLEVD SIQIFAAQRY SFVLDANQAV DNYWIRANPN FGNVGFDG-- --GINSAILR

C.max 185.....................D................................................................N.-- --........ C.zon 180.A..T................D..Y..................T...V...................... N...............T.-- --........ A.fag 185.A..S..A.............D..YV.......M....T..I.T...V................E.....................T.-- --........ C.ful 185.....................D...........W..........X..................VV.D.P. N......... V..K..T.-- --........ P.ost 193.A..N.ESN.......I.M..D..F.......S.QV..A. A..IV.IV........G.......N...T........D.. L.ST....-- --D....... R.lig 191.A.VS.QS.......I..T..F..YA......RM.V.... G.SH...T...LT...G....V.VE..... G........S N.RN..T.-- --......F. C.cin 184..IVN.EQ.. K..M..I....D..WQ......E....... GELTE.HT.. RL...TG...........P........Q.. K.RN.LA.TF AN.V......

C.hir 281 YDGAPAVEPT TNQTTSVKPL NEVDLHPLVS TPVPGSPSSG GVDKAINMAF NFNGSNF--F INGASFVPPT VPVLLQILSG AQTAQDLLPS GSVYVLPSNA

C.max 281.........................................................--......................................... C.zon 276.....P.....V.PP..I.M V.A..TTFEE R.A....VP....L.L...........--..................V....A...........S..... A.fag 281....A.I....T....TQ.....N.....A.A.....VA....L..........T..--.......T..........I....N...........S..... C.ful 281.....P.....V.PP..I.M V.A..TTFDE R.A..R.VP....L.L.LL. S......--.......................A...........S..A.. P.ost 289.A..TEDD...TSS..T-.. E.TN.V.PEN PGA..PAVP..A.IN..L.M A.DVT..ELT...SP.KA.. A..........T..AS......I.S.EASK R.lig 287.Q..AVA....S.NSGT-A...AN.I..IN PGA..N.VP..A.INL.LRI GR.ATTADFT....P.I............. VTNPN....G.A.IS..A.Q C.cin 284.A..ANAD...SANPNPAQ...A...A.ID PAA..I.TP. AA.VNLRFQL G.S.GR.--T...TAYES.S..T....M....S.N....A....E..R.Q

C.hir 379 SIEISFPATA AAPGAPHPFH LHGHTFAVVR SAGSTVYNYD NPIFRDVVST GTPAAGDNVT IRFDTNNPGP WFLHCHIDFH LEGGFAVVMA EDTPDVKAVN

C.max 379.................................................................................................... C.zon 374 D....L..S.....F...................ST...A..VY.......S.--........R.D................A.........I...A... A.fag 379 D........T..............A......................................R.D................A.....F...I...ASA. C.ful 379 D....L..S.....F...................ST...A..VY.......S.--........R.D................A.........I...A... P.ost 388 VV...I..L. -–V.G...........D.I......T..F. T.AR....N...D-.N.......V.D............W...I.L...F...VTSIT.P- R.lig 386 V....I.G-- ---.GN........N.D... TP..S....V..VR.....I.GG--..... F..V.D............W...A.L...F...I.NIPIA. C.cin 382 VV.LVV..G- -VL.G.........A.S.......ST..FV..VK.....L.VT--..E.....V.D......F....E...MN.L.I.F...MANTVDA. C.hir 479 PVPQAWSDLC PTYDALDPND Q----- C.max 479...............----- ------ C.zon 472.............------- ------ A.fag 479...........I......S..----- C.ful 477.............N.......----- P.ost 483 --.A..D....I....SDS. KGGIA- R.lig 479 AISP..D....K.N.NN.DS GLA--- C.cin 478 NP.VE.AQ.. EI..D.P.EA TSIQTV Рис.1. Выравнивание аминокислотных последовательностей лакказ.

- 14 VSPDGFSRQ----AVNIXXXXGDRTSIXXXXHWHGFFQHGTNWAD----GPAFINQCPISPGHSFL----YNFQVP C.hirsutus VSPDGFSRQ----AVNIXXXXGDRTSIXXXXHWHGFFQHGTNWAD----GPAFINQCPISPGHSFL----YDFQVP C.maxima ISPDGFSRD----AVNKXXXXGDNTSIXXXXHWHGFFQKGTNWAD----GPAFVNQCPISAGNSFL----YDFQVP C.zonatus ISPDGFSRQ----AVNKXXXXGDRTSIXXXXHWHGFFQKGTNWAD----GPAFVNQCPISAGNSFL----YDFQVP C.fulvocinerea VSPDGFSRQ----AVNKXXXXGDNTSIXXXXHWHGFFQKGTNWAD----GPAFINQCPISSGNSFL----YNFQVP A.faginea

VSPDGFTRSXXXXAVNKXXXXGDNTSIXXXXHWHGFFQSGSTWADXXXXGPAFVNQCPIASGNSFLXXXXYDFNVP

P.ostreatus..|....|.....|....|.......|....|....|....|....|....|....|...|....|.......|.

DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHTAAKLGPRFPXXXXGGAGKRXXXXYRSVNSQP

C.hirsutus

DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHTAAKLGPRFPXXXXLGAGKRXXXXYRSVNSQP

C.maxima DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHVAAKLGPAIPXXXXGGAGKR----YRSVNTQP C.zonatus

DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHTAAKLGPRFPXXXXLGAGKRXXXXYRSVNSQP

C.fulvocinerea

DQAXXXXGTFWYPFVV----YDNXXXXDDTVITLADW----YHVAAKLGPAFPXXXXLGAGKRXXXXYRSINTQP

A.faginea

DQAGTFXXXXWYPFIVXXXXYDNXXXXADTIITLEDWXXXXYHVVAPQNAVLPT-----ANKR----YRAVNIVP

P.ostreatus...|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.....|....|.|....|....

LE-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLDANQAVDNYWIRANPNFGNV----GFNGPVXXXXPGSPSFXXXXNGSNF

C.hirsutus

LE-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLDANQAVDNYWIRANPNFGNV----GFNGPVXXXXPGSPSFXXXXNGSNF

C.maxima

LV-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLDANQAVNNYWIRANPNFGNV----GFTGPAXXXXPGSPVFXXXXNGSNF

C.zonatus

LE-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXVVADQPVNNYWIRANPNVGNK----GFTGPAXXXXPGRPVFXXXXNGSNF

C.fulvocinerea LV-----VDSIQIFAAQRYSFVXXXXLEANQAVDNYWIRANPNFGNV----GFTGAVXXXXPGSPVFN----GTNF A.faginea

IVXXXXXVDSIQIFAXXXXGQRYSFVLNANQTVDNYWIRADPNLGSTXXXXGFDG--NPGAPGPAVFDVTNFELTI

P.ostreatus |....|....|....|.....|....|....|....|....|....|....|....|....|...|....|....| FIN---GASFVPPT----VPAPG--APHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEG----GFATPDVKAVN-PVP C.hirsutus FIN---GASFVPPT----VPAPG--APHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEG----GFATPDVKAVN-PVP C.maxima FIN---GASFVPPT----VPAPG--FPHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEA----GFAIPDVAAVN-PVP C.zonatus FIN---GASFVPPT----VPAPG--FPHPFHLHGXXXXHTWFLHC----HIDFHLEA----GFAIPDVAAVN-PVP C.fulvocinerea FIN---GASFTPPT----VPAPG--APHPFHLHG----HAWFLHC----HIDFHLEA----GFAIPDVASAN-PVP A.faginea

NXXXXXGSPFKAPTXXXXAPGGPXXXXHPFHLHGXXXXHTWFLHCXXXXHIDWHLEIXXXXGLAVTSITAPPXXXX

P.ostreatus Рис.2. Экзон-интронная структура исследуемых лакказ.

из семи базидиальных штаммов, продуцирующих лакказу при росте на жидких и твердых средах (согласно данным из коллекционного фонда - ЛЕБИН), X.radicata не содержала ген лакказы, а в случае P.ostreatus и A.faginea гены лакказ были гомологичны генам, кодирующим данный фермент из других базидиомицетов, было проведено определение видовой принадлежности базидиомицетов методом ДНК-типирования. Для проведения ПЦР с хромосомной ДНК исследуемых штаммов были использованы праймеры на консервативные участки генов рибосом ITS1F и ITS4B (рис. 3).

ПЦР-продукты были секвенированы, и полученные нуклеотидные последовательности ДНК сравнивались с последовательностями, имеющимися в банке данных GenBank с целью определения наиболее близкородственного штамма к исследуемому организму. В случае, если уровень гомологии превышал 98%, можно сделать вывод, что исследуемый штамм идентичен имеющемуся в банке данных. В результате была определена видовая принадлежность следующих штаммов базидиальных грибов (табл. 6) Рис. 3. Схема кластера ДНК, кодирующего рибосомальные субъединицы.

Стрелками обозначены праймеры для ПЦР.

Таксономическое определение штаммов базидиальных грибов.

коллекции ЛЕБИН Coriolus hirsutus Coriolus zonatus Cerrena maxima Coriolus fulvocinerea Pleurotus ostreatus Pleurotus sp. 'Florida' (188765) Antrodiella faginea Trametes versicolor(5325) Xerula radicata результатами клонирования генов лакказ, что позволило выдвинуть предположение об ошибочном определении видовой принадлежности по данным морфологических исследований и анализу характера базидиом.

Структурные исследования лакказ. В результате проведенных экспериментов по кристаллизации исследуемых в работе лакказ, были получены кристаллы трех лакказ C.hirsutus, C.maxima и C.zonatus, пригодные для РСА.

Получить кристаллы лакказ из C.fulvocinerea и P.ostreatus не удалось, что может быть связано с высокой степенью гликозилирования этих ферментов. Проведенный рентгено-структурный анализ выращенных кристаллов позволил получить трехмерные структуры ферментов. Для C.hirsutus были получены две структуры с разрешениями 1.8 (рис. 4) и 1.2, в случае структур лакказ из C.maxima и C.zonatus достигнутое разрешение составило 1.9 и 2.6 соответственно. Наложение основного хода полипептидной цепи и анализ аминокислотного окружения активных центров показали высокую степень сходства всех трех структур.

Рис. 4. Структура лакказы из C.hisutus, полученная с Поскольку трехмерная структура для лакказы из T.versicolor была получена последовательности и определенной по данным РСА составил 91%, то для дальнейшего анализа структуры активного центра использовали структуру фермента из T.versicolor.

Получить кристаллы лакказы из P.ostreatus и C.fulvocinerea не удалось, поэтому было проведено математическое моделирование данных структур на основе bank) структур ферментов были выделены наиболее гомологичные по аминокислотной последовательности структуры. Для моделирования структуры лакказы из P.ostreatus была использована структура фермента из T.versicolor (PDB1GYC), полученная с разрешением 1.9. Уровень аминокислотной гомологии между лакказами из P.ostreatus и T.versicolor составил 66%. Моделирование лакказы из C.fulvocinerea проводили на основе структуры из C.hirsuta (PDB3FPX), полученной с разрешением 1.8. Данная структура была выбрана как модельная, поскольку уровень аминокислотной гомологии между ферментами из C.fulvocinerea и C.hirsuta составил 86%.

Анализ аминокислотного окружения Т1 медного центра лакказ. Активный центр лакказ сформирован четырьмя ионами меди и состоит из двух медьсодержащих центров: мономолекулярного «голубого» иона меди (Т1 центр), координированного двумя остатками гистидина и одним остатком цистеина, и трехъядерного медного кластера Т2/Т3, который содержит один ион меди типа Т2, координированный двумя гистидинами, и два иона меди типа Т3, координированные тремя остатками гистидина каждый (рис. 5).

Рис. 5. Структуры каталитических центров Т1 и Эффективность катализа у лакказ зависит от окислительно-восстановительного потенциала иона меди Т1 (первичного акцептора электронов) и может быть обусловлена несколькими параметрами, главными из которых являются структура субстрат-связывающего кармана и состав формирующих его аминокислотных остатков, а также аминокислотного окружения иона меди Т1. Единого мнения по поводу того, какие же аминокислотные остатки могут оказывать существенное еще не существует.

Для выявления аминокислотных остатков, которые могут влиять на ОВП, и как следствие, на каталитические свойства фермента, был произведен анализ аминокислотного окружения Т1 центра лакказ с использованием трехмерных структур ферментов. Для анализа использовали полученные в работе структуры высоко редокс-потенциальных лакказ из C.hirsutus (разрешение 1.2 и 1.85) C.maxima (разрешение 1.9), C.zonatus (разрешение 2.6) и T.versicolor (разрешение 1.9). Для анализа аминокислотного окружения Т1 центра были также использованы структуры двух средне редокс-потенциальных лакказ из R.lignosus (PDB1V10, разрешение 1.7) и C.cinereus (PDB1HFU, разрешение 1.68) с ОВП 700мВ и 550 мВ соответственно.

Наложение полипептидных цепей выбранных, а также смоделированных структур лакказ показало, что ход цепи этих ферментов практически полностью совпадает. Отличия наблюдаются лишь в нескольких местах, причем отличающиеся структурные элементы представлены в основном петлями. Ход полипептидной цепи непосредственно вблизи от активных центров практически идентичен.

В литературе были выдвинуты две гипотезы о влиянии аминокислотных остатков на ОВП меди Т1. Согласно первой гипотезе для высоко редокспотенциальных лакказ характерно наличие остатка фенилаланина в ближайшей координации иона меди Т1, в то время как для средне и низко редокспотенциальных в данном положении находится остаток лейцина или метионина.

Согласно второй гипотезе, различие в ОВП связано с существованием водородной связи между боковыми цепями остатка глутамата 460 (нумерация остатков приведена по последовательности лакказы из C.hirsutus) из третьего домена фермента и остатка серина 113, входящего в первый домен (рис. 5). Эта водородная связь может влиять на ОВП активного центра, поскольку с уменьшением ее длины подвижность петли, которая содержит глутамат 460 и координирующий ион меди Т гистидин 458 снижается. Данное взаимодействие наблюдается у лакказ из C.мaxima, C.hirsutus, C.zonatus, T.versicolor и R.lignosus, которые имеют ОВП 700-800 мВ, причем для высоко редокс-потенциальных ферментов при увеличении расстояния между этими остатками происходит уменьшение ОВП (рис. 6), однако прямой корреляции не наблюдается. У лакказы из C.cinereus, обладающей самым низким потенциалом из известных грибных ферментов, такое взаимодействие отсутствует, поскольку в данных положениях у нее находятся остатки глицина 113 и метионина 459 (нумерация остатков приведена по последовательности лакказы из C.cinereus).

Рис. 6. Взаимодействие Glu460 и Ser113 вблизи активного центра T1 структуры Ион меди в центре Т1 непосредственно координируется двумя остатками His395 и His458 и остатком Cys453, которые являются строго консервативными у всех лакказ. Кроме того, в ближайшую сферу окружения попадают также консервативный у всех лакказ остаток Ile455 и остаток Phe337 у высоко редокспотенциальных лакказ (нумерация остатков по последовательности лакказы из C.hirsutus), который замещен на остаток лейцина у средне редокс-потенциальных лакказ и на остаток метионина у низко редокс-потенциальных.

Аминокислотные остатки Phe337 (нумерация по последовательности лакказы C.hirsutus) и замещающий его остаток лейцина для высоко и средне редокс-потенциальных лакказ соответственно находятся на расстоянии превышающем 3,5 от иона меди Т1. Поэтому прямое взаимодействие с ионом меди представляется маловероятным, и, как следствие, наличие остатка фенилаланина в данном положении может быть только маркером для высоко редокс-потенциальных ферментов, но не одним из ключевых остатков, влияющим на ОВП лакказы. Это предположение было доказано в работе Ф. Ксу, показавшего отсутствие изменения редокс-потенциала лакказы из Myceliophthora thermophila при замене остатка метионина на остаток фенилаланина в этом положении.

Следовательно, для поиска аминокислотных остатков, которые могут оказывать влияние на ОВП, необходимо рассматривать вторичную сферу окружения активного центра Т1, а именно, остатки находящиеся на расстояниях до 8.

Анализ второй координационной сферы меди Т1. Для выявления влияния остатков второй координационной сферы окружения иона меди Т1, сформированной в случае лакказы из C.hirsutus остатками Phe162, Cys205, Asn206, Phe330, Phe337, Ala390, Pro391, Gly392, Ala393, Pro394, His395, Pro396, Phe397, Thr428, His452, детальное сравнение структур исследованных в работе лакказ. Сравнение проводили путем наложения структур лакказ из C.hirsutus, C.maxima, R.lignosus и C.cinereus по ходу полипептидной цепи. Далее был произведен анализ местоположения и возможных взаимодействий этих аминокислотных остатков в наложенных структурах. В итоге были выделены места в структуре, отличающиеся у этих лакказ. Все эти отличия находятся в предполагаемом субстрат-связывающем кармане для фенольных субстратов.

Анализ окружения иона меди Т1 у лакказ C.hirsutus и C.maxima показал, что оно практически идентично. Было обнаружено лишь единственное отличие - это замена в лакказе из C.maxima остатка Asn206 на остаток аспарагиновой кислоты. При этом ОВП этих ферментов отличается на 50 мВ, что может быть объяснено этой заменой.

У других лакказ, рассматриваемых в работе, в данном положении находится остаток аспарагиновой кислоты (рис. 1). Этот остаток аспартата (аспарагина) принимает участие в связывании фенольных субстратов. Исключение составляет лишь фермент из R.lignosus, в котором в этом положении обнаружен фенилаланин. Для этой лакказы замена аспартата на фенилаланин сопряжена с заменой Phe (нумерация по последовательности лакказы из C.hirsutus), характерного для остальных исследуемых в работе лакказ, на остаток аспарагина, Этот остаток в лакказе из R.lignosus играет роль якорного остатка в субстратсвязывающем кармане.

Рис.7. Петли, формирующие вход в субстрат-связывающий карман лакказы. Желтый цвет - структура Сравнение структур показало большие отличия у высоко и средне потенциальных лакказ в петлях, формирующих вход в субстрат-связывающий карман (остатки 157-161, 332-343, 386-394, нумерация по последовательности лакказы из C.hirsutus) (рис. 7). Для всех высоко редокс-потенциальных ферментов средне редокс-потенциальных, где в зависимости от фермента могут наблюдаться отличия как по составу, так и по положению этих петель.

ВЫВОДЫ

1. Определены полные нуклеотидные и аминокислотные последовательности пяти высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов C.hirsutus, C.maxima, C.zonatus, C.fulvocinerea, A.faginea(T.versicolor) и одной средне редокспотенциальной из P.ostreatus.

2. Определена экзон-интронная структура генов лакказ. Показано, что высоко редокс-потенциальные лакказы содержат 8-10 интронов, в то время как средне редокс-потенциальные более 10. Для всех базидиальных грибов обнаружено наличие трех интронов в положениях 80, 90 и 210. Установлены интроны, характерные только для высоко редокс-потенциальных лакказ (положения 160, 240, 330 и 370).

3. Определено филогенетическое положение исследуемых штаммов базидиомицетов.

5. Проведено сравнение центров Т1 высоко и средне редокс-потенциальных лакказ, структуры которых получены РСА и математическим моделированием.

Показано, что на редокс-потенциал может влиять наличие в положении 206 остатков аспарагина или аспартата, а также наличие в структуре водородной связи между остатками Glu460 и Ser113.

6. Показано, что основные структурные отличия между высоко и средне потенциальными лакказами связаны с особенностями третичной структуры фермента - петлями, формирующими вход в субстратсвязывающий карман.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Lyashenko AV, Zhukhlistova NE, Gabdoulkhakov AG, Zhukova YN, Voelter W, Zaitsev VN, Bento I, Stepanova EV, Kachalova GS, Koroleva OV, Cherkashyn EA, Tishkov VI, Lamzin VS, Schirwitz K, Morgunova EY, Betzel C, Lindley PF, Mikhailov AM. Purification, crystallization and preliminary X-ray study of the fungal laccase from Cerrena maxima.// Acta Crystallogr., Sect F. 2006, V.62, pp. 954-7.

2. E. A. Черкашин, Е. В. Степанова, Е. O. Ландесман, O. В. Королева, В. И.

Тишков. Сравнительный анализ последовательностей генов трех высоко редокс-потенциальных лакказ из базидиомицетов.// Доклады Академии Наук, 2007, Т. 417, с. 348–351.

1. Черкашин Е.А., Степанова Е.В., Королева О.В., Тишков В.И. Клонирование гена лакказы из базидиомицета Cerrena maxima.// Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов – 2006». М., 2006, с. 61.

2. Черкашин Е.А., Степанова Е.В., Королева О.В., Тишков В.И. Сравнительный анализ последовательности генов трех лакказ из базидиомицетов Cerrena maxima, Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus.// Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов – 2007». М., 2007, с. 472.

3. Cherkashyn E.A., Stepanova E.V., Landesman E.O., Koroleva O.V., Tishkov V.I.

Comparative analysis of full gene sequences of laccases from white-rot fungi Cerrena maxima, Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus. // The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development”. М., 2007, р.

267.

4. Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Landesman, Е.О., Tishkov V.I., Koroleva О.V.

Gene structure analysis of high redox potential laccases from basidiomycetes Cerrena maxima, Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus.// XV Congress of European Mycologists.

S.-Pb. 2007, p. 184.

5. Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Landesman, Е.О., Koroleva О.V., Tishkov V.I.

Сomparative analysis of gene sequences of three high redox potential laccases from basidiomycetes. //Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetic. Kiev, 2007, p. 55.

6. Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Landesman, Е.О., Koroleva О.V., Tishkov V.I.

Comparative analysis of gene sequences of three high redox potential laccases from basidiomycetes Cerrena maxima, Coriolus hirsutus и Coriolus zonatus.// Abstracts of International Conference «Biocatalysis-2007» M. 2007, p. 89.

7. Королева О.В., Степанова Е.В., Курзеев С.А., Черкашин Е.А., Федорова Т.В., Поляков К.М., Тишков В.И. Молекулярная и структурная организация «голубых»

лакказ.// IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов.

Новосибирск 2008, с. 40.

8. Koroleva O.V., Polyakov K.M., Kurzeev S.A., Fedorova T.V., Cherkashin Е.А., Stepanova Е.V., Tishkov V.I. Comparative analysis of 3D structures of laccases from Coriolus hirsutus at resolution 1.85 and 1.2. // 4th European meeting in Oxizymes.

Helsinki, 2008.

9. Koroleva O.V., Loginov D.S., Cherkashin E.A., Fedorova T.V., Stepanova E.V., Chulkin A.M., Abianova A.R., Vavilova E.A., Benevolensky S.V. Novel approaches for design of industrial enzymes.// The Fifth Moscow International Congress "Biotechnology:

State of the art and prospects of development”. М., 2009, р. 274.



 
Похожие работы:

«МАЛХАНОВА Елена Владимировна ЭМИССИЯ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА МЕРЗЛОТНЫМИ ПОЧВАМИ ЮГА ВИТИМСКОГО ПЛОСКОГОРЬЯ 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2007 Работа выполнена на кафедре почвоведения и экспериментальной биологии ФГОУ ВПО Бурятский государственный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«Липчанская Мария Анатольевна ОЦЕНКА ФАКТОРОВ РИСКА ВОЗНИКНОВЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ У НАСЕЛЕНИЯ СЕВЕРО-КАЗАХСТАНСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2012 Работа выполнена в Институте водных и экологических проблем СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Пузанов Александр Васильевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сысо Александр...»

«Тихомирова Людмила Ивановна ОСОБЕННОСТИ ИНДУЦИРОВАННОГО МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ У РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЭКСПЛАНТОВ IN VITRO КУЛЬТИВАРОВ ВИДОВ РОДА IRIS L. Специальность 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул, 2011 2 Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Научно-исследовательский институт садоводства Сибири имени М.А. Лисавенко Российской академии сельскохозяйственных наук (НИИСС)...»

«СКВОРЦОВ Алексей Николаевич МЕХАНИЗМ ПОСТУПЛЕНИЯ ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С УЧАСТИЕМ СИСТЕМЫ ТРАНСПОРТА МЕДИ 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургский государственный политехнический университет, Учреждении Российской академии наук Институт...»

«Круглик Ольга Витальевна Реакция организма здоровых животных и животных с асцитной карциномой Эрлиха на воздействие сверхвысокочастотного электромагнитного излучения Специальность – 03.02.08 (экология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск, 2014 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет и ФГБУН Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук,...»

«ТОРШИЛОВА АЛЛА АНАТОЛЬЕВНА РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ Dioscorea nipponica Makino (Dioscoreaceae) 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 2 Работа выполнена в Лаборатории эмбриологии и репродуктивной биологии Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, член-корреспондент РАН Батыгина Татьяна Борисовна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«ВАСИЛЬЧЕНКО Алексей Сергеевич ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ БАКТЕРИЙ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.02.03 – микробиология Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет на кафедре микробиологии и в Центре коллективного пользования приборным оборудованием Институт микро- и нанотехнологий доктор медицинских...»

«ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«СИМОНОВИЧ ЕЛЕНА ИЛЬИНИЧНА ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ПРИМЕНЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ АКТИВИЗАТОРОВ ПОЧВЕННОГО ПЛОДОРОДИЯ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена на кафедре зоологии и в НИИ Биологии Южного Федерального университета доктор биологических наук, профессор Научный консультант : Казадаев Анатолий Анисимович доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты :...»

«СОЛОВЬЕВА ИРИНА ВЛАДЛЕНОВНА МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗНОЙ МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА 03.02.08 – экология (биология) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Нижний Новгород 2013 2 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«ФАТЬЯНОВА Елена Витальевна РАЗВИТИЕ КРОНЫ ХУРМЫ КАВКАЗСКОЙ (DIOSPYROS LOTUS L., EBENACEAE) В УСЛОВИЯХ ЧЕРНОМОРСКОГО ПОБЕРЕЖЬЯ КАВКАЗА 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена на кафедре геоботаники и экологии растений СанктПетербургского государственного университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Антонова Ирина Сергеевна Официальные оппоненты : доктор...»

«ЕЛИЗАРЬЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИКА ЮЖНОГО УРАЛА OXYTROPIS GMELINII FISCH. EX BORISS. (FABACEAE) В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 2 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности в Учреждении РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный...»

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«ЧУЙКИН Илья Александрович МЕХАНИЗМЫ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ ДЕАЦЕТИЛАЗ ГИСТОНОВ НА ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МЫШИ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2006 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург...»

«ХАРЬКОВА Ольга Юрьевна ОРНИТОФАУНА ЮГА СРЕДНЕРУССКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ: ВИДОВОЙ СОСТАВ, ДИНАМИКА И ОХРАНА 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Диссертация выполнена на кафедре зоологии позвоночных Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Беме Ирина Рюриковна Официальные оппоненты : доктор...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»

«Александрова Елена Александровна Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1. Специальность – 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 Работа выполнена в группе геномного анализа сигнальных систем клетки Учреждения Российской...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«Тукмачева Елена Васильевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА ADENOPHORA FISCHER НА КУЗНЕЦКОМ АЛАТАУ 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2009 Работа выполнена на кафедре ботаники, физиологии растений и растительных ресурсов ГОУ ВПО Томский сельскохозяйственный институт филиал Новосибирского государственного аграрного университета и в лаборатории флоры и растительных ресурсов ОСП НИИ биологии и...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.