WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Никитина Оксана Викторовна

ВНЕКЛЕТОЧНЫЕ ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ

ЛИГНИНОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА

БАЗИДИАЛЬНОГО ГРИБА

TRAMETES PUBESCENS (SCHUMACH.) PILT

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2006

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель кандидат биологических наук, С. В. Шлеев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Р. А. Звягильская кандидат технических наук Е. Н. Ефременко

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН Черноголовка, Московская обл.

Защита состоится 25 апреля 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последнее десятилетие большое число работ посвящено поиску и изучению новых штаммов базидиальных грибов – продуцентов лигнинолитических ферментов, а также поиску ферментов с новыми физико-химическими свойствами, что связано с широкими прикладными аспектами их использования. Внеклеточные ферментные системы дереворазрушающих грибов, как правило, включают спектр множественных форм оксидоредуктаз следующих трех основных структурных типов: гем-содержащие, флавинсодержащие и медьсодержащие ферменты.

Среди лигнинразрушающих грибов широко распространено явление образования множественных форм ферментов, однако его физиологическая роль до настоящего времени точно не установлена.





Лакказа (Lc) является одним из основных ферментов лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов. Однако, несмотря на большое число публикаций, касающихся фундаментальных исследований этого фермента, роль Lc в деградации лигнина до конца не ясна. Современные исследования базидиальных грибов в этой области показали, что Lc в сочетании с другими лигнинолитическими ферментами, марганецпероксидазой (MnP) или лигнинпероксидазой (LiP), может выполнять существенно более значимые функции при деградации лигнина, чем простое окисление его фенольных подструктур. В связи с этим интересно было исследовать возможные взаимосвязи, возникающие между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиальных грибов.

Известно, что наличие ионов металлов переменной валентности в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительно-восстановительных ферментов.

Особенно важным в этом отношении является наличие ионов марганца.

Именно Mn (II) является основным субстратом MnP, а также может играть значительную роль в каталитическом цикле LiP. Недавние исследования показали, что Mn (II) является также нетипичным субстратом Lcs базидиальных грибов и может обеспечивать наличие кооперативного действия Lc и MnP. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с Lcs из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов и изучение кооперативного действия Lc с другими лигнинолитическими ферментами. Кроме того, изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (Lc, LiP и MnP) в присутствии ионов марганца, как природного медиатора, может прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили.

Базидиомицет Trametes pubescens является хорошим объектом исследования. Ранее было показано, что он может секретировать в культуральную жидкость несколько внеклеточных ферментов в детектируемых количествах, в частности: Lc, LiP и CDH. Известно также, что штамм 923- лекарственного базидиального гриба T. pubescens является промышленным штаммом-продуцентом биомассы, из которой получают биологически активные добавки. После отделения биомассы фильтрат культуральной жидкости не используют и потенциально он может служить источником внеклеточных ферментов.

Понимание роли отдельных ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса при деградации лигнина, во-первых, открывает возможные пути оптимизации переработки этого полимера. Во-вторых, исследование множественных форм ферментов лигнинразрушающих грибов на примере базидиомицета Trametes pubescens представляет несомненный интерес как с точки зрения изучения метаболизма грибов белой гнили, так и с позиции применения данного организма для получения препаратов, которые могут использоваться в различных областях биотехнологии.

Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в исследовании свойств и закономерностей действия основных компонентов лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens – Lc, LiP и MnP. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:





1. Разработка метода очистки и получение гомогенных препаратов основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens: Lc, LiP и MnP.

2. Изучение основных физико-химических свойств выделенных ферментов.

3. Проведение сравнительных исследований множественных форм Lcs базидиомицета T. pubescens.

4. Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов базидиального гриба T. pubescens при деградации модельных соединений лигнина. Установление роли каталитического окисления ионов Mn2+ до Mn3+ Lc в присутствии хелатирующих агентов.

5. Разработка вариантов возможного использования лигнинолитических ферментов базидиомицета T. pubescens для создания биосенсоров.

Научная новизна работы. Проведенные исследования позволили впервые изучить механизм кооперации Lc, LiP и MnP базидиального гриба Trametes pubescens в процессе деградации лигнина. Предложена схема кооперации ферментов лигнолитического комплекса данного базидиомицета.

Впервые очищены до гомогенного состояния и частично охарактеризованы LiP и MnP гриба T. pubescens. Проведено детальное сравнительное исследование двух новых, ранее не описанных множественных форм Lcs базидиомицета T.

pubescens. Электрохимическим методом доказана возможность окисления ионов Mn2+ до Mn3+ высокопотенциальными Lcs базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов и определены основные параметры данной реакции.

Практическая ценность работы. Результаты исследования некоторых физико-химических свойств Lc, ее субстратной специфичности и механизма действия фермента вносят вклад в понимание механизма катализа многоядерными медьсодержащими оксидоредуктазами. На основе частично очищенного препарата Lcs базидиомицета T. pubescens разработан амперометрический биосенсор для определения соединений фенольной структуры.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались на научных конференциях: 8-ой Международной Пущинской Школе-Конференции «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005), International Conference Fundamentals & Applications “Biocatalysis – 2005” (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в числе которых 3 статьи в российских и зарубежных научных журналах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 129 страницах. Список цитируемой литературы включает наименований. Иллюстративный материал содержит 29 рисунков и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный внеклеточным ферментативным системам базидиальных грибов. Рассматриваются строение, свойства и механизмы действия основных ферментов, входящих в состав лигнинолитического комплекса базидиомицетов. В последнем разделе собраны факты, описывающие ферментативные системы базидиальных грибов рода Trametes.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования.

Объекты исследования. В качестве объектов исследования использовали внеклеточные ферменты: Lc, LiP и MnP – лигнинолитического комплекса штамма базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilt (Syn.:

Coriolus pubescens (Schum. ex Fr.) Qul.) ВСБ 923-2 семейства Polyporaceae.

культуральной жидкости с высоким содержанием Lc и LiP-активности проводили путем глубинного культивирования штамма-продуцента в литровом ферментационном аппарате “Marubishi” (Япония) при избыточном давлении 0,4 атм. Аэрация воздухом в стерильных условиях составляла 1 л/1л в мин с механическим перемешиванием 250 об/мин мешалкой турбинного типа на среде следующего состава, г/л: глюкоза – 20,0; (NH4)2SO4 – 2,5; KH2PO4 – 1,2; мочевина – 0,7; кукурузный экстракт сгущенный – 10; вода водопроводная.

Культивирование осуществляли в условиях рН-статирования при рН 3,5 и температуре +26оС. Продолжительность культивирования составила 114 часов.

Получение культуральной жидкости с высоким содержанием Lc и MnPактивности проводили путем глубинного культивирования того же штамма гриба в колбах Эрленмейера, объемом 750 мл, с объемом среды 150 мл на круговой качалке (200 об/мин) при температуре +26°С и исходном рН-среды 5,8 на среде следующего состава, г/л: меласса – 30; NH4NO3 – 3; KH2PO4 – 1,2;

мочевина – 0,7. Продолжительность культивирования составила 72 часа.

Выделение и очистка ферментов. Все виды колоночной хроматографии низкого давления проводили с помощью комплекта стандартного оборудования для жидкостной хроматографии низкого давления фирмы “Pharmacia LKB Biotechnology” (Швеция) при температуре +4°С. Жидкостную хроматографию среднего и высокого давления проводили с использованием системы ЖХВД “Стайер” фирмы “Аквилон” (Россия) при комнатной температуре.

Контроль активности ферментов. Контроль активности ферментов в процессе выделения и очистки осуществляли спектрофотометрическими методами. Активность ферментов выражали в международных единицах – единица активности соответствовала такому количеству фермента, которое катализировало превращение 1 мкмоля субстрата или образование 1 мкмоля продукта за 1 минуту. Активность Lc регистрировали, используя в качестве субстрата 10 мМ раствор пирокатехина ( = 410 нм; = 740 M-1 см-1) в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 4,5. Контроль активности LiP осуществляли по окислению вератрового спирта, измеряя изменение оптического поглощения при 310 нм ( = 9300 M-1 см-1) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 3,0.

Активность MnP регистрировали, используя в качестве субстрата MnSO4 при 238 нм ( = 6500 M-1 см-1) в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0, в присутствии 0,1 мМ Н2О2.

Кинетические измерения и рН-зависимость. Кинетические измерения при определении каталитических параметров ферментативных реакций Lc для пирокатехина, гидрохинона, гваякола и K4Fe(CN)6, а также измерение рНзависимости Lcs проводили на кислородном электроде типа Кларка по изменению концентрации O2 в системе. Определение кинетических параметров и измерение рН-зависимости реакции окисления АБТС осуществляли в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 4,5, при длине волны 436 нм.

Регистрацию окисления ионов Mn2+ до Mn3+, катализируемое Lc, осуществляли в 0,1 М Na-тартратном буфере, рН 5,0 ( = 238 нм) и в 0,1 М Naоксалатном буфере, рН 5,0 ( = 270 нм) в присутствии 0,1 мМ MnSO4.

Образование H2O2 в системе, содержащей Lc, ионы Mn2+ и хелатор, регистрировали с помощью LiP по окислению АБТС. Реакционную смесь, содержащую 2.10-7 М Lc и 0,1 мМ МnSO4 в 0,1 М Na-тартратном или Naоксалатном буфере, рН 5,0, инкубировали в течение 120 мин при комнатной температуре, затем подвергали ультрафильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 12 кДа путем центрифугирования в течение 30 мин при об/мин для удаления Lc. Концентрацию Н2О2 определяли по увеличению оптической плотности в реакции окисления АБТС, катализируемой LiP.

Возможное образование супероксиданион-радикала регистрировали по восстановлению нитросинего тетразолия (0,2 мМ) при 560 нм.

Спектральные исследования. Все спектры записывали в 50 мМ фосфатном буфере, рН 6,5. Спектры оптического поглощения регистрировали на спектрофотометре Coulter DU 650 “Beckman” (Германия); спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции записывали с помощью спектрофлуофотометра RF-5301 PC “Shimadzu” (Япония). Регистрацию спектров ЭПР осуществляли на ЭПР-спектрометре ESC-106 фирмы “Bruker” (Германия). Спектры кругового дихроизма регистрировали на спектрофотометре Jasco J-715 (Япония). Параметры вторичной структуры белков рассчитывали с использованием компьютерной программы «ProteinCD», версия 1,5 (Москва, Россия).

Масс-спектроскопические исследования проводили с использованием лазер десорбционно-ионизирующей (MALDI) масс-спектрометрии на массспектрометрическом анализаторе “Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer” MALDI time-of-flight (TOF) (США). Гидролизаты белков также анализировали с использованием четырех полюсной ионной ловушки Bruker Esquire (Германия) в сочетании с нанораспылителем для их ионизации (ESIQIT-MS анализ).

Электрохимические исследования.

Приготовление электродов. Исследования проводили на электродах двух типов: спектроскопическом графитовом электроде (Ringsdorff Werke GmbH, Bonn, Germany) и стеклоуглеродном электроде фирмы “BAS”. Поверхность стеклоуглеродного рабочего электрода перед экспериментами полировали Al2O3, затем промывали деионизированной водой. Поверхность спектроскопического графитового электрода полировали на влажной наждачной бумаге (Tufback Durite P1200), промывали бидистиллированной водой и высушивали. Модификацию графитового электрода осуществляли следующим образом: каплю раствора лакказы (10 мкл; 0,7 мг/мл) или препарата культурального фильтрата наносили на полированную поверхность электрода и оставляли в течение 20 минут для адсорбции, избыток фермента(ов) осторожно смывали деионизированной водой.

Циклические вольтамперограммы записывали с использованием вольтамперометрического анализатора CV-50W фирмы “BAS” (США) с использованием трехэлектродной электрохимической ячейки в широком интервале потенциалов и при варьировании скорости сканирования.

Амперометрические исследования биосенсоров проводили с использованием трехэлектродного потенциостата (Zata Electronics, Лунд, Швеция) в проточно-инжекционной системе. В качестве рабочего электрода использовали модифицированный спектроскопический графитовый электрод.

Поток создавали с помощью перистатического насоса Gilson (Франция) 0,1 М растворами цитрат-фосфатного буфера. Анализируемую пробу объемом 50 мкл вносили в поток, используя шестиканальный инжектор ((LabPRO Rheodyne injection, PR700-100-01, Rheodyne, США). Регистрацию данных осуществляли с помощью самописца (Kipp and Zonen, тип BD111, Delft, Нидерланды).

Электродом сравнения во всех случаях являлся AgAgCl3М NaCl электрод (BAS, 210 мВ vs. NHE), а вспомогательным электродом служила платиновая проволока диаметром 1 мм.

Определение окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) Т центра лакказы осуществляли методом редокс-титрования, используя октоцианомолибдат (IV) калия в качестве медиатора. Электрохимическое потенциометрическое титрование вели в спектроэлектрохимической ячейке, (золотой капилляр с рабочим объемом 0,7 мкл), потенциал которого контролировали с помощью трехэлектродного потенциостата BAS LC-3E. В данных исследованиях насыщенный хлорсеребряный (AgAgClKClsat; 200 мВ vs. NHE) и платиновый электроды использовались в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода, соответственно. Спектр поглощения регистрировали с помощью PC2000-UV-VIS и миниатюрного оптоволоконного спектрометра Ocean Optics (Dunedin, FL, USA).

Все потенциалы в работе приведены относительно нормального водородного электрода (vs. NHE), рН 7,0; 25С.

В третьей главе представлены собственные результаты.

Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trametes pubescens.

Сравнительное исследование качественного состава ферментов лигнинолитического комплекса при глубинном культивировании базидиомицета T. pubescens, штамм 923-2, на базовой глюкозо-аммонийной среде с кукурузным экстрактом и на комплексной среде (мелассе) показало, что в первом случае продуцировались значительные количества Lc- и LiPактивностей и обнаруживались лишь следовые количества MnP-активности. В то время как при глубинном культивировании того же штамма гриба на мелассе наблюдался максимум MnP и Lc-активностей, а LiP-активность практически не детектировалась. Поэтому для выделения основных лигнинолитических ферментов гриба T. pubescens (Lc, LiP и MnP) были использованы культуральные фильтраты двух типов, полученные при выращивании данного штамма гриба на вышеописанных средах.

Для изучения физико-химических и биохимических характеристик ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens разработан метод получения ферментов в количествах, достаточных для решения поставленных в работе задач. Он включал в себя следующие стадии:

осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония в диапазоне насыщения 0-90% и ионообменную хроматографию низкого давления на носителях Сервацел ДЕАЕ 52 и Toyopearl DEAE 650М. В результате был получен препарат «голубой» лакказы (в дальнейшем Lc1), а также комплекс ферментов, обладающих оксидазной и пероксидазной активностями, для разделения которых была разработана схема очистки, представленная на рисунке 1. Комплекс ферментов удалось разделить введением дополнительных стадий очистки с использованием гельфильтрационной, адсорбционной и гидрофобной хроматографии. В результате, после стадий гидрофобной хроматографии, были получены гомогенные препараты двух форм Lcs: Lc1 с удельной каталитической активностью (Ауд) – 75,1 мкмоль/мин на 1 мг белка и общим выходом по активности (по пирокатехину) в результате очистки – 10,7%, и Lc2 с Ауд = 66,7 мкмоль/мин на 1 мг белка и общим выходом по активности (по пирокатехину) в результате очистки – 14,6%; а также LiP или MnP, в зависимости от типа исходного культурального фильтрата. LiP и MnP имели следующие удельные каталитические активности: 15,5 мкмоль/мин на мг белка и 40,0 мкмоль/мин на 1 мг белка соответственно.

Рисунок 1. Схема очистки ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens.

Осаждение белков из культуральной жидкости (NH4)2SO4 (0-90%) Ионообменная хроматография на носителях:

(Phenyl Sepharose) Таким образом, использованный в настоящей работе штамм гриба T.

pubescens 923-2 при соответствующих вышеописанных условиях культивирования продуцировал три лигнинолитических фермента: Lc, LiP и MnP. Из образцов культурального фильтрата в гомогенном состоянии были выделены две формы Lc, а также впервые получены гомогенные препараты LiP и MnP. Было показано, что Lc2, в отличие от Lc1, образует весьма прочный комплекс с LiP или же MnP (в зависимости от условий культивирования), который удавалось разрушить только с использованием гидрофобного носителя на последней стадии очистки.

Физико-химические свойства ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens.

Выделенные препараты ферментов изучали в сравнении с другими известными ферментами по следующим параметрам: молекулярная масса, изоэлектрическая точка, состав и строение углеводной части, спектральные характеристики ферментов.

Показано, что Lc1 и Lc2 базидиомицета T. pubescens представляли собой мономерные белки с близкой молекулярной массой около 67 кДа. Обе выделенные Lcs являлись гликопротеинами, их углеводная часть составляла приблизительно 13% от массы белка. В состав углеводной части Lc T. pubescens входили: N-ацетил-глюкозамин, манноза и ксилоза. Показано, что среднее содержание меди в молекулах Lc1 и Lc2 гриба T. pubescens составляло 3,9 и 3, иона металла на одну молекулу белка, соответственно, что является типичным значением для «голубых» оксидаз.

LiP имела молекулярную массу 45 кДа, а молекулярная масса MnP составляла 54 кДа. Изученные Lc1, Lc2 и LiP являлись кислыми белками с изоэлектрическими точками 5,3; 5,1 и 4,2 соответственно. Основные биохимические характеристики лигнинолитических ферментов базидиомицета T. pubescens представлены в таблице 1.

Таблица 1. Основные биохимические характеристики гомогенных препаратов ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Примечания: Результаты рассчитаны как среднее значение по трем измерениям; н.о. – параметр не определяли. MW – молекулярный вес. * – активность по пирокатехину, ** – активность по вератровому спирту, *** – активность по MnSO4.

Для выяснения строения активного центра оксидоредуктаз базидиомицета T. pubescens были проведены спектральные исследования ферментов. Спектры поглощения Lc1 и Lc2 типичны для нативных «голубых»

Lcs базидиальных грибов, и в них присутствовали сигналы обоих центров меди, а именно Т1 (пик 610 нм) и Т3 (плечо в области 330 нм). Спектры поглощения LiP и MnP типичны для гем-содержащих ферментов и характеризовались ярко выраженными максимумами поглощения в области 407 нм и 403 нм, соответственно (полоса Соре), а также полосами поглощения в областях 500 нм и 635 нм.

В спектре ЭПР LiP наблюдался сигнал при g 6,0, характерный для высокоспинового иона железа (Fe3+) в гем-содержащих ферментах. Для Lc1 и Lc2 получены близкие спектры ЭПР, типичные для «голубых» Lcs. Рассчитаны значения компонент g- тензора и А-тензора: для Т1 центра: g|| = 2,20, А|| = 90.10см-1 и для Т2 центра: g|| = 2,25, А|| = 188.10-4 см-1.

Изучение вторичной структуры ферментов проводили с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Показано, что Lc1 и Lc2 имели незначительные отличия во вторичной структуре белка, в то время как КДспектр LiP значительно отличался от двух спектров лакказ. Он имел четкий максимум поглощения при 210 нм и плечо в области 222 нм, что хорошо согласуется с литературными данными.

КД-спектры лакказ базидиомицета T. pubescens были математически обработаны в области длин волн от 190 до 250 нм. Параметры вторичной структуры белков были рассчитаны с использованием компьютерной программы «Protein-CD», версия 1,5. Программа сравнивает КД-спектры интересующих нас ферментов (Lc1 и Lc2) с КД-спектрами имеющихся в базе данных белков. Наилучшая корреляция КД-спектров исследуемых ферментов (Lc1 и Lc2) с КД-спектрами, имеющимися в базе данных, была получена для кластера, состоящего из 18 белков с известной вторичной структурой.

Результаты расчетов показали, что обе формы Lc содержат около 2-3% спиральных участков, 45-46% -структуры, 20% изгибов и 33-34% представлено нерегулярной структурой.

Таким образом, в результате проведенных исследований, были детально охарактеризованы основные физико-химические свойства двух форм Lcs, а также частично исследованы гомогенные препараты ферментов LiP и MnP.

Показано сходство биохимических и спектральных параметров двух форм Lcs с лакказами других базидиальных грибов.

Сравнительные исследования двух множественных форм лакказ базидиомицета Trametes pubescens.

Ввиду того, что лакказа является одним из основных ферментов, необходимых для деградации лигнина, интересно было провести детальные сравнительные исследования физико-химических свойств лакказ T. pubescens.

Изучены зависимости начальной скорости гомогенной каталитической реакции от концентрации различных субстратов Lc в стационарных условиях. В таблице 2 представлены значения каталитических констант (kкат) ферментативных реакций по различным субстратам-донорам для Lc1 и Lc2, значения констант Михаэлиса (КМ), а также отношение этих величин, характеризующее эффективность каталитического процесса. Как видно из таблицы 2, Lc2 обладала более высокими значениями каталитических констант по отношению к нефенольным субстратам (ABTS, K4Fe(CN)6), в то время как Lc1 обладала высокими скоростями окисления субстратов фенольной структуры (гидрохинон и гваякол). При этом, сродство Lc1 по отношению к гидрохинону ниже такового по сравнению с Lc2, тогда как эффективность каталитической реакции окисления пирокатехина выше для Lc1 за счет низкого значения константы Михаэлиса (Таблица 2).

Оптимум рН обеих Lcs практически совпадал и находился в интервале 4, – 4,5 при использовании пирокатехина в качестве субстрата ферментов. В присутствии K4Fe(CN)6 активность ферментов при возрастании рН раствора от 2,5 до 6,0 сначала практически не изменялась, а затем монотонно падала.

При инкубации Lc1 базидиомицета T. pubescens при 37С фермент терял лишь около 25% от своей первоначальной активности за 72 часа, в то время как лакказа из широко описанного в литературе базидиомицета Trametes hirsuta теряет около 40%. Таким образом, Lc1 гриба T. pubescens весьма термостабильна, что делает привлекательным ее возможное использование в биотехнологических процессах.

Таблица 2. Кинетические параметры Lc1 и Lc2 базидиомицета Гидрохинон K4Fe(CN) Примечания: кинетические константы были рассчитаны как средние значения по трем измерениям, ошибка измерения не превышала 10%. Условия:

0,1 М цитрат-фосфатный буфер, рН 4,5; 20°С.

Рисунок 3. Спектроэлектрохимическое окислительновосстановительное титрование лакказ Trametes pubescens (0,022 мM Lc1 и 0,018 мM Lc2; 0,2 мM K4Mo(CN)6; 100 мM фосфатный буфер, pH 6,5).

(A) Изменение спектра поглощения Lс1 в процессе редокс-титрования.

1 – 5 спектры поглощения фермента при потенциалах раствора 900, 800, 750, 700, и 600 мВ соответственно. Вставка: Кривые титрования Нернста Lc1 и Lc в логарифмических координатах. (Б) Спектроэлектрохимические кривые титрования, показывающие зависимость поглощения растворов Lc при 614 нм (отражающее окислительно-восстановительное состояние меди Т1), относительно редокс-потенциала среды.

Определены окислительно-восстановительные потенциалы (ОВП) Т медного центра двух форм лакказ. На рисунке 3А представлены спектры поглощения, регистрируемые в процессе окислительно-восстановительного титрования Lc1 базидиомицета T. pubescens. Такие же изменения спектра наблюдались и в случае другой формы лакказы (Lc2). Восстановление Т медного центра сопровождалось практически полным исчезновением поглощения в «голубой» области спектра. Кривые окислительновосстановительного титрования двух форм Lcs представлены на рисунке 3Б.

Показано, что ОВП Lc1 и Lc2 незначительно отличаются друг от друга и составляют 746 ± 5 и 730 ± 5 мВ, соответственно. Угол наклона кривых титрования составил 61 мВ и 65 мВ для Lс1 и Lс2, соответственно (Рисунок 3A, вставка), что соответствует одноэлектронному восстановлению ионов меди Т1 центра.

Проведено сравнительное изучение биоэлектрокаталитических свойств Lcs базидиомицета T. pubescens. В присутствии субстрата фермента, молекулярного кислорода, показана возможность прямого электронного переноса с электрода на молекулу фермента с последующим электрокаталитическим восстановлением дикислорода на графитовых электродах. При адсорбции на электродах обе формы лакказы сильно снижают потенциал, необходимый для электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Электрокаталитический ток электродов, модифицированных Lc1 и Lc2, регистрировался уже при потенциале около + 870 мВ со значением потенциала полуволны электровосстановления дикислорода +745 мВ и +735 мВ для Lc1 и Lc2, соответственно.

Исследована зависимость плотностей электрокаталитических токов от значения рН раствора в области рН 2,5 – 6,0. Показано, что рН-зависимости электровосстановления молекулярного кислорода для двух форм Lcs очень близки как в случае ферментов, адсорбированных на электродах, так и в случае гомогенного катализа.

Для двух форм ферментов (Lc1 и Lc2) показано ингибирование электрокаталитической активности галогенид-ионами (за исключением иодиданионов), что хорошо согласуется с литературными данными. Также нами были изучены каталитические параметры биоэлектрохимических реакций, в частности зависимость скорости биоэлектрохимической реакции от концентрации растворенного молекулярного кислорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований можно сделать вывод о значительном сходстве биохимических, физико-химических, а также электрохимических свойств обоих форм лакказ. Для выяснения вопроса о том, являются ли выделенные ферменты продуктами одного гена, были проведены масс-спектроскопические исследования Lc1 и Lc2.

Анализ гидролизатов Lc1 и Lc2 методом MALDI в области масса/заряд (m/z) 500–5000 показал практически полное сходство аминокислотных последовательностей данных белков (рисунок 4). Исходя из этого можно предположить, что выделенные ферменты Lс1 и Lс2 являются, скорее всего, продуктами одного гена, т.е. множественными формами одного и того же фермента. Для сравнения был проведен аналогичный анализ ранее изученной Lc Trametes hirsuta. Продукты гидролиза этого фермента сильно отличались от таковых у исследуемых и охарактеризованных Lс1 и Lс2 базидиомицета T.

pubescens. Следует отметить, что пять полученных пептидов Lc1 и Lc совпадали с основными пептидами Lc Trametes versicolor. При этом аминокислотная последовательность Lc1 и Lc2 отличалась от данных, имеющихся в литературе по первичной структуре двух изоформ лакказ T.

pubescens (база данных NCBI, AAM18408 и AAM18407). Таким образом, выделенные нами ферменты являются новыми, ранее не описанными множественными формами Lc T. pubescens.

Рисунок 4. Суммарный масс-спектрометрический анализ продуктов гидролитического расщепления Lс1 и Lс2.

Изучение синергизма действия лигнинолитических ферментов гриба Trametes pubescens при деградации модельных соединений лигнина.

Как было сказано выше, Lc2, в отличие от Lc1, образует весьма прочный комплекс с LiP или же MnP (в зависимости от условий культивирования) и ее достаточно сложно получить в гомогенном состоянии. Это обстоятельство, а также большое сходство свойств двух форм Lcs определили выбор объекта наших дальнейших исследований. В последующих экспериментах использовали в основном препарат Lc1, однако для сравнения результатов и контрольных экспериментов использовали оба препарата Lcs (Lc1 и Lc2) базидиомицета T. pubescens.

Одной из задач нашей работы являлось исследование возможных взаимосвязей, возникающих между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens. Ранее было показано, что Lc из базидиомицета T. versicolor катализировала окисление ионов Mn2+ до Mn3+ в присутствии хелатирующего агента – Na-пирофосфата.

Использование анионов оксалата и малоната в качестве комплексонов трехвалентного марганца приводило к образованию супероксиданион-радикала с последующим его превращением в Н2О2. Была также предложена схема взаимодействия Lc и MnP. В этой связи важным представляется выявление возможности протекания этих реакций с Lcs из других источников для установления роли этого фермента при функционировании лигнинолитического комплекса дереворазрушающих грибов.

Одним из основных параметров, от которого зависит скорость окисления субстратов Lc, является различие в потенциалах донора и первичного акцептора электронов фермента. Как было показано выше, Lcs базидиомицета T. pubescens можно отнести к группе высоко-редокс-потенциальных ферментов, так как значение ОВП Т1 центра для обоих ферментов составляло около мВ, в то время как редокс-потенциал пары Mn2+/Mn3+ (аква-комплекс) составляет 1100 мВ. Таким образом, высокая разность в значениях редокспотенциалов делает термодинамически невозможным процесс окисления ионов Mn(II) Т1 центром Lcs. Однако, образование комплексов марганца с хелатирующим агентом (например, анионом дикарбоновых или – оксикарбоновых кислот) может значительно понижать редокс-потенциал этой пары. Это было показано прямым электрохимическим экспериментом.

На рисунке 5 представлена циклическая вольтамперограмма, записанная с использованием стеклоуглеродного электрода в Na-тартратном буферном растворе, содержащем ионы Mn2+. Потенциал средней точки, равный +940 мВ, соответствует ОВП тартратного комплекса пары Mn2+/Mn3+. При более положительных потенциалах наблюдалось некоторое необратимое окисление аква-комплекса Mn2+ вплоть до потенциала 1100 мВ. По-видимому, существует равновесие между ионами марганца в составе водного комплекса и ионами металла, хелатированными тартрат-анионами, и только последние могут принимать участие в ферментативной реакции. При этом равновесие смещено в сторону водного комплекса ионов марганца.

Таким образом, полученное экспериментальным путем значение редокспотециала тартратных комплексов марганца указывает на термодинамическую возможность их медленного окисления высокоредокс-потенциальными Lcs базидиальных грибов. Для проверки данного предположения была спектрофотометрически изучена реакция ферментативного окисления ионов Mn2+, катализируемая Lc1 гриба T. pubescens, в присутствии хелатирующих агентов (анионов тартрата и оксалата).

Рисунок 5. Циклические вольтамперограммы, записанные на стеклоуглеродном электроде, в присутствии (1) и в отсутствии (2) 0,2 мМ MnSO4 в 0,1 М тартратном буфере (скорость сканирования - 50 мВ/с;

начальный потенциал 210 мВ).

Исследование зависимости начальной скорости гомогенной каталитической реакции от концентрации ионов Mn в стационарных условиях показало, что кинетика реакции хорошо описывается классическим уравнением Михаэлиса-Ментен. Однако, эффективность ферментативного процесса (kкат/КМ = 0,043 мМ-1с-1) при окислении ионов Mn2+ в присутствии анионов татрата существенно ниже, чем при окислении традиционных субстратов Lcs (таблица 2). Обращает на себя внимание тот факт, что оптимум рН реакции окисления ионов Mn2+ сдвинут в нейтральную область, по сравнению с типичными субстратами Lcs, и находится в интервале рН 5,5 – 6,0.

Исследованы продукты реакции ферментативного окисления ионов Mn2+ Lcs гриба T. pubescens в присутствии анионов оксалата или тартрата в качестве хелаторов. Показано, что одним из продуктов реакции являлся пероксид водорода. Кроме того, возможное присутствие супероксиданион-радикала косвенно показано по восстановлению нитросинего тетразолия в системе, содержащей Lc, Na-оксалатный или Na-тартратный буфер и ионы Mn2+.

Участие супероксиданион-радикала во вторичных химических реакциях или же его диспропорционирование в растворе приводит к образованию пероксида водорода.

Таким образом, в результате проведенных исследований доказана возможность протекания и изучена реакция окисления ионов Mn2+, катализируемая Lcs базидиомицета T. pubescens, в присутствии хелатирующих агентов. Аналогичные результаты были получены с использованием Lc другого базидиального гриба T. hirsuta. На основании литературных данных и проведенных исследований можно предположить, что указанная реакция характерна для большинства Lcs базидиальных грибов.

Было показано, что в реакционной смеси, содержащей Lc, MnP, Mn2+ и хелатор, без добавления Н2О2, наблюдалось резкое увеличение скорости образования комплекса Mn(III) с тартрат-анионом. В отсутствие Lc эта реакция не протекает, то есть Lc действительно может являться инициатором MnP- и LiP-реакций.

Высокий редокс-потенциал хелатированной пары Mn2+/Mn3+ позволяет также проводить непосредственное окисление нефенольных подструктур лигнина, например, вератрового спирта. Методом циклической вольтамперометрии показано, что в присутствии ионов Mn и хелатора наблюдалось увеличение анодного тока на 25% в области потенциалов окисления Mn(II) по сравнению с фоновой реакцией. То есть окисление вератрового спирта происходило с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. Помимо электрохимических экспериментов в работе было проведено спектрофотометрическое детектирование ферментативного окисления вератрового спирта Lcs T. pubescens в присутствии комплекса Mn(II).

В процессе реакции наблюдалось увеличение оптической плотности в области 310 нм – максимуме поглощения вератрового альдегида, основного продукта окисления вератрового спирта.

Заключительным этапом нашей работы являлось исследование возможности использования выделенных и охарактеризованных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens при создании биосенсора для анализа фенольных соединений.

Разработка амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата базидиомицета Trametes pubescens.

В настоящей работе при создании биосенсора использовали частично очищенный ферментный препарат лакказ базидиомицета T. pubescens.

Оптимизацию амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens проводили при использовании пирокатехина в качестве модельного субстрата ферментов. В качестве рабочего электрода использовали спектральный графит с нанесенным на его поверхность ферментным препаратом. Детекцию осуществляли при потенциале рабочего электрода, соответствующего электровосстановлению продукта ферментативной реакции. Показано, что оптимальная концентрация ферментного препарата для адсорбции составляла около 100 мкг/мл. Воспроизводимость результатов для шести изготовленных ферментных электродов составляла приблизительно 88%, что хорошо согласуется с литературными данными для биосенсоров на основе лакказамодифицированных электродов.

Исследована зависимость изменения отклика биосенсора от приложенного потенциала. Показано, что для потенциалов ниже +385 мВ ток пика не зависит от приложенного потенциала. В дальнейших экспериментах электровосстановление окисленных фенольных соединений проводили при потенциале +160 мВ, так как этот потенциал удобен для практического использования и оказывает наименьшее влияние на превращение различных соединений в комплексных системах. Наиболее интенсивный ответ биосенсора наблюдался при скорости потока 0,5 мл/мин. Изучение влияния рН буферного раствора на отклик биосенсора показало, что оптимальное значение рН для детекции пирокатехина составляло 5,0.

В оптимизированных условиях были определены амперометрические отклики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens с использованием проточно-инжекционной системы для ряда фенольных соединений. Чувствительность, предел детекции, линейный динамический диапазон, а также коэффициент корреляции рассчитывали, используя уравнение Михаэлис-Ментен для электрохимических систем. Характеристики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens представлены в таблице 3.

Таблица 3. Характеристики амперометрических биосенсоров на основе ферментного препарата базидиомицета Trametes pubescens по соединение п-Крезол Конифериловый альдегид Сравнивая полученные нами данные для электродов, модифицированных ферментными препаратами из базидиомицета T. pubescens, с известными литературными данными для электродов, модифицированных лакказами T.

versicolor и T. hirsuta, можно сделать вывод, что разработанный биосенсор обладал более широким линейным диапазоном детекции для большинства использованных фенольных соединений (таблица 3).

ОБСУЖДЕНИЕ

В результате проведенных исследований разработана схема очистки лигнинолитических ферментов базидиального гриба T. pubescens. Показано, что использованный в настоящей работе штамм базидиомицета T. pubescens 923- при выбранных условиях культивирования продуцировал в детектируемых количествах следующие лигнинолитические ферменты: две формы лакказы (Lc1 и Lc2), LiP и MnP, которые были выделены и очищены до гомогенного состояния. Проведено комплексное исследование оксидоредуктаз базидиомицета T. pubescens, включающее изучение биохимических, спектральных, каталитических и электрохимических свойств ферментов.

Основное внимание в работе уделяли изучению Lcs базидиомицета T.

pubescens, так как Lc является одним из основных ферментов утилизации лигнина. Наши исследования показали сходство биохимических, спектральных и электрохимических параметров Lc1 и Lc2. Определены ОВП Т1 ионов меди обоих форм ферментов, последние были отнесены к группе высокоредокспотенциальных Lcs. Обе формы Lc катализировали реакции электровосстановления молекулярного кислорода, протекающего по четырехэлектронному безмедиаторному механизму. Результаты электрохимических экспериментов по электровосстановлению молекулярного кислорода (гетерогенная система) хорошо согласуются с результатами гомогенной кинетики ферментативного восстановления дикислорода.

Результаты электрохимических экспериментов подтверждают ранее предложенный механизм функционирования лакказы на угольных электродах.

Впервые было показано, что данный механизм справедлив в отношении множественных форм лакказ, выделенных из одного штамма базидиомицета.

Исследование кинетических характеристик Lc1 и Lc2 позволило выявить некоторые различия в кинетических параметрах данных ферментов (Таблица 2). Наблюдались значительные различия эффективности каталитического окисления и сродства к разным субстратам Lc1 и Lc2 несмотря на их принадлежность к одной окислительно-восстановительной группе – высокоредокс-потенциальных лакказ. Это может служить примером усложнения регуляции процесса деградации лигнина. Например, низкое сродство при высокой специфичности системы (конститутивные формы Lc, подобно Lc1 и Lc2 базидиомицета T. pubescens) необходимо при наличии низкого уровня субстрата. В то время как высокое сродство при низкой специфичности системы (индуцируемые формы лакказ) необходимо в случае избытка субстрата. Таким образом, наличие множественных форм ферментов, вероятно, является необходимым эволюционным ответом на способность грибов белой гнили деградировать твердый жесткий субстрат (лигнин) в различных условиях окружающей среды, которые могут изменяться в течение жизненного цикла грибов.

На основании результатов масс-спектрометрических исследований можно предположить, что Lc1 и Lc2 представляют собой два продукта одного гена, т.е.

являются конститутивными множественными формами одного фермента, которые образуются в результате пост-трансляционной модификации белка.

Интересно было также исследовать возможные взаимосвязи, возникающие между отдельными ферментами, входящими в состав лигнинолитического комплекса базидиомицета T. pubescens. Первоначально необходимо было ответить на вопрос: что может обеспечивать наличие синергетического действия основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиальных грибов?

Из литературных данных известно, что наличие ионов металлов (особенно, марганца, меди и железа) в древесине является необходимым условием для нормального функционирования грибных окислительновосстановительных ферментов. Именно Mn (II) является основным субстратом MnP, а также может играть значительную роль в каталитическом цикле LiP.

Недавние исследования показали, что Mn (II) является также нетипичным субстратом Lcs базидиальных грибов и может обеспечивать наличие кооперативного действия Lc и MnP.

Мы предположили, что изучение согласованного действия основных ферментов лигнинолитического комплекса (Lc, LiP и MnP) на примере базидиомицета T. pubescens в присутствии ионов марганца, как природного медиатора, может помочь прояснить ферментативный и неферментативный механизмы деградации лигнина грибами белой гнили. Как было показано, данный металл действительно может играть роль связующего звена между тремя основными ферментами лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens.

Методом циклической вольтамперометрии доказана возможность протекания ферментативной реакции окисления ионов Mn (II) высокопотенциальными Lcs базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов (анионов органических кислот). Были определены условия протекания (насыщающая концентрация фермента и субстрата (Mn (II)), подобраны хелатирующие агенты и рН буферного раствора) и исследованы продукты данной реакции. Показано, что образование Mn3+тартратного или Mn3+-оксалатного комплекса в ходе ферментативного окисления запускает цепь реакций, ведущих к возможному образованию супероксиданион-радикала, и, в конечном итоге, пероксида водорода.

Действительно, из литературных источников известно, что окисление анионов органических кислот (щавелевая, глиоксалевая и яблочная кислоты) ионами Mn(III) может являться одним из путей образования внеклеточного пероксида водорода. Например, установлена следующая последовательность реакций, протекающих при окислении щавелевой кислоты:

Mn3+ + COOH-COOH = Mn2+ + CO2 - + CO2 + 2H+ Пероксид водорода, в свою очередь, может участвовать в качестве окислительного субстрата для основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиальных грибов. Этот путь является одним из возможных путей образования внеклеточного пероксида водорода.

Таким образом, в настоящей работе мы подтвердили схему кооперации лакказы и MnP, предложенную ранее немецкой группой ученых [Schlosser and Hofer, 2002], дополнив и расширив ее на все основные ферменты лигнинолитического комплекса базидиального гриба T. pubescens: Lc, LiP и MnP (Рисунок 6).

Рисунок 6. Предполагаемая схема взаимодействия основных ферментов лигнинолитического комплекса базидиомицета Trametes Наличие прочного комплекса, образуемого Lc и LiP (или MnP, в зависимости от условий культивирования), позволяет предположить следующую схему кооперации лигнинолитических ферментов базидиомицета T. pubescens. Lc катализирует окисление ионов Mn2+ молекулярным кислородом в присутствии анионов органических кислот. В результате реакции образуется комплекс Mn(III) с анионами органических кислот, который участвует в серии неферментативных процессов, ведущих к образованию пероксида водорода.

Последний, в свою очередь, может использоваться в качестве окислительного субстрата, как LiP, так и MnP.

Кроме того, высокий редокс-потенциал хелатированной пары Mn2+/Mn3+ позволяет также непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина, например, вератровый спирт, а в присутствии Lc пара Mn2+/Mn3+ может выполнять роль усилителя действия фермента. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о существенно более важной роли Lcs в составе лигнинолитического комплекса при разрушении древесины, чем предполагалось ранее.

На заключительном этапе работы была показана принципиальная возможность использования лигнинолитических ферментов гриба T. pubescens в биотехнологии. Разработан амперометрический биосенсор на основе частично очищенного препарата культурального фильтрата гриба T. pubescens для определения соединений фенольной структуры, который имел более широкий линейный диапазон детекции для большинства использованных субстратов.

ВЫВОДЫ

1. Выделены в гомогенном состоянии и детально охарактеризованы две новые, ранее не описанные множественные формы лакказы базидиомицета Trametes pubescens. Впервые получены в гомогенном состоянии и частично охарактеризованы лигнинпероксидаза и марганецпероксидаза базидиального гриба Trametes pubescens.

электрохимических характеристик лакказы 1 и лакказы 2 базидиомицета Trametes pubescens между собой и другими высокопотенциальными лакказами.

Однако две множественные формы лакказы гриба Trametes pubescens имеют различное значение эффективности каталитического окисления и сродства к разным субстратам.

3. Электрохимически доказана возможность протекания реакции каталитического окисления ионов двухвалентного марганца высокопотенциальными лакказами базидиальных грибов в присутствии хелатирующих агентов (анионов тартрата и оксалата). Предложена расширенная схема кооперации ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens.

4. На основе частично очищенного препарата культурального фильтрата базидиомицета Trametes pubescens разработан амперометрический биосенсор для определения соединений фенольной структуры, который имеет широкий линейный диапазон детекции для большинства использованных фенольных соединений.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Shleev S.V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. Comparison of physico-chemical characteristics of four laccases from different basidiomycetes.

(2004) Biochimie, 86, 693-703.

2. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Сереженков В.А., Бурбаев Д.Ш., Беловолова Л.В., Ярополов А.И. Выделение и очистка ферментов лигнинолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach.) Pilt и исследование их свойств. (2005) Биохимия. Т. 70, вып. 11, с. 1548-1555.

3. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С. Русинова Т.В., Ярополов А.И. Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнинолитических ферментов базидиального гриба Trametes pubescens. (2005) Вестн. Моск. Ун-та, Сер. 2. Химия. Т. 46, № 4, с. 272-278.

4. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина Е.С., Русинова Т.В., Ярополов А.И. Лакказа базидиального гриба Trametes pubescens // Тезисы докладов международной конференции 8-ой Международной Пущинской Школы-Конференции “Биология - наука XXI века”, 17-21 Май 2004, Пущино, Россия, С. 272.

5. Никитина О.В., Русинова Т.В., Шлеев С.В. Ионы двухвалентного марганца – нетипичный субстрат лакказы базидиального гриба Trametes pubescens // Материалы Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов - 2005». Секция «Химия», т. 1, 12 – 15 апреля, Москва, 2005, С. 94.

6. Nikitina O.V., Shleev S.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V. and Yaropolov A.I. A role of Mn2+ in the function of ligninolytic enzymes from Trametes pubescens basidiomycete // International Conference Fundamentals & Applications “Biocatalysis – 2005”, June, 19 – 23, 2005, C. 95.



 
Похожие работы:

«Ахмадуллина Юлия Рафисовна РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У ПОТОМКОВ ПЕРВОГО ПОКОЛЕНИЯ, ОТЦЫ КОТОРЫХ ПОДВЕРГЛИСЬ ХРОНИЧЕСКОМУ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ 03.01.01 – радиобиология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2014 1 Работа выполнена на базе Федерального государственного учреждения науки Уральского научно-практического центра радиационной медицины Федерального медико-биологического агентства...»

«БИРЮКОВ Сергей Александрович ПАРАМФИСТОМИДОЗ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ХОЗЯЙСТВАХ СЕВЕРО-ЗАПАДА НЕЧЕРНОЗЕМНОЙ ЗОНЫ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Специальность 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Москва – 2014 Работа выполнена на факультете ветеринарной медицины и биотехнологий ФГБОУ ВПО Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина Научный руководитель : ЛЕМЕХОВ Полиэкт Анатольевич...»

«ШИБАНОВА Алена Алексеевна РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОКРОВ ПОЙМЫ ВЕРХНЕЙ ОБИ (В ПРЕДЕЛАХ АЛТАЙСКОГО КРАЯ) 03.00.05. – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Терехина Татьяна Александровна Официальные оппоненты : член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Седельников...»

«КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна ИНДУКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PODOSPORA ANSERINA (RABENH.) NIESSL В ПРОЦЕССЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОГО ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Специальность 03.02.12 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного...»

«ИЛЬИЧЕВА Екатерина Юрьевна МЕХАНИЗМЫ ВЛИЯНИЯ ИОНОВ СЕРЕБРА НА МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург, 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Цымбаленко...»

«Петухова Дарья Юрьевна БИОМОРФОЛОГИЯ СТОЛОННО-РОЗЕТОЧНЫХ ГИДРОФИТОВ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар, 2008 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Вятский государственный гуманитарный университет (г. Киров) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Савиных Наталья Павловна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Загирова Светлана...»

«МАЛХАНОВА Елена Владимировна ЭМИССИЯ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА МЕРЗЛОТНЫМИ ПОЧВАМИ ЮГА ВИТИМСКОГО ПЛОСКОГОРЬЯ 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2007 Работа выполнена на кафедре почвоведения и экспериментальной биологии ФГОУ ВПО Бурятский государственный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«ВОЙКИНА АННА ВЛАДИМИРОВНА НАКОПЛЕНИЕ ПЕСТИЦИДОВ В КОМПОНЕНТАХ ЭКОСИСТЕМ ТАГАНРОГСКОГО И ЯСЕНСКОГО ЗАЛИВОВ АЗОВСКОГО МОРЯ И ИХ АДДИТИВНОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ НА ГИДРОБИОНТОВ 03.02.08 — экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в ФГУП Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства (АзНИИРХ), г. Ростов-на-Дону и на кафедре экологии и природопользования Южного...»

«Кашина Ольга Викторовна АНАЛИЗ И СИНТЕЗ РЕСУРСОСБЕРЕГАЮЩИХ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СИСТЕМ ВОДНОГО ХОЗЯЙСТВА МАСЛОЖИРОВЫХ ПРОИЗВОДСТВ Специальность 03.00.16 - Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Иваново-2008 Работа выполнена в ГОУВПО Ивановский государственный химикотехнологический университет на кафедре общей химической технологии. Научный руководитель : доктор технических наук, доцент Невский Александр Владимирович...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Зотов Александр Александрович ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДОЛГОНОСИКОВ ПОДСЕМЕЙСТВА LIXINAE (COLEOPTERA, CURCULIONIDAE): ЭКОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в отделе аридной экологии ФГБУН Институт аридных зон Южного научного Центра РАН доктор биологических наук, Научный руководитель : Арзанов Юрий Генрихович Замотайлов Александр...»

«КАЗАКОВ Василий Иванович Ретропозоны Alu-семейства и их роль в геноме человека 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ Самойлов Владимир Олегович...»

«Суворов Анатолий Прохорович ВОЛК В БАССЕЙНЕ ЕНИСЕЯ (БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ УПРАВЛЕНИЯ ПОПУЛЯЦИЯМИ) 03.00.32 - биологические ресурсы АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск 2004 Работа выполнена на кафедре охотничьего ресурсоведения и заповедного дела Красноярского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Смирнов Марк Николаевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Салеем Кайд Мохаммед Абдулла ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.00.16 –экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук 2 МОСКВА 2003 г. Работа выполнена в Российском государственеом университете нефти и газа им. И. М. Губкина на кафедре промышленной экологии. Научный...»

«ВОЛКОВА Наталья Александровна ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ ЭКСПРЕССИИ РЕКОМБИНАНТНЫХ ГЕНОВ В ОРГАНИЗМЕ ТРАНСГЕННЫХ ЖИВОТНЫХ 03.00.23 – Биотехнология 03.00.13 – Физиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук п. Дубровицы, Московская обл. 2008 1 Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики животных Государственного научного учреждения Всероссийский научноисследовательский институт животноводства Российской академии...»

«НИКОЛАЕВ Кирилл Евгеньевич ОСОБЕННОСТИ РЕАЛИЗАЦИИ ЖИЗНЕННЫХ ЦИКЛОВ ТРЕМАТОД СЕМЕЙСТВ ECHINOSTOMATIDAE И RENICOLIDAE В ЛИТОРАЛЬНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ КАНДАЛАКШСКОГО ЗАЛИВА БЕЛОГО МОРЯ 03.02.11 – паразитология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Зоологический Институт Российской Академии Наук Научный руководитель : Галактионов Кирилл Владимирович,...»

«АБАТУРОВА АННА МИХАЙЛОВНА Изучение механизмов взаимодействия компонентов фотосинтетической цепи транспорта электрона методами компьютерного моделирования Специальность: 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : Доктор физико-математических наук, профессор...»

«БОБОЕВ ИЛХОМДЖОН АБДУШУКУРОВИЧ БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ Punica granatum L. И Diospyros lotus L. В УСЛОВИЯХ ТАДЖИКИСТАНА 03.02.01 - ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2014 1 Работа выполнена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений АН Республики Таджикистан Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук, профессор, Шарипов Зариф член-корреспондент АН Республики...»

«СУЛЕЙМАНОВА АЛИЯ ДАМИРОВНА НОВАЯ ГИСТИДИНОВАЯ КИСЛАЯ ФИТАЗА PANTOEA VAGANS: ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Шарипова...»

«Дмитриев Павел Александрович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПСАММОФИТНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ПЕСЧАНЫХ МАССИВАХ БАССЕЙНА ДОНА (В ГРАНИЦАХ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре генетики и в Научно-исследовательском институте биологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, доцент...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.