WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На правах рукописи

ПАНИНА Яна Сергеевна

МОДУЛИРОВАНИЕ ИНДУЦИРОВАННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ И

ВОСПРИИМЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ

03.00.04 – биологическая химия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологическпих наук

Москва 2005 2

Работа выполнена в лаборатории биохимии фитоиммунитета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор ОЗЕРЕЦКОВСКАЯ Ольга Леонидовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор ПАСЕШНИЧЕНКО Валентина Артуровна доктор биологических наук, профессор ФЕОФИЛОВА Елена Петровна

Ведущая организация: Институт фитопатологии РАСХН

Защита состоится «13» декабря 2005 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии имени А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский пр-т, 33, корп. 2.

C диссертационной работой можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, г. Москва, Ленинский проспект, д. 33, кор. Автореферат разослан «»2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук Орловский А.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы Одной из важнейших проблем современного сельскохозяйственного производства является защита растений от патогенов и вредителей, которые ежегодно уносят от 20 до 40 % урожая (данные ФОС, 2004). До сих пор для защиты растений в основном применяются химические методы, среди которых преобладает обработка пестицидами. Пестициды, бесспорно, обладают высокой эффективностью, но вместе с тем имеют ряд серьезных недостатков, к которым относится негативное воздействие на окружающую среду, способность аккумулироваться в тканях растений, а также необходимость многократной обработки для достижения необходимого эффекта.





Альтернативой применению пестицидов являются биологические методы защиты растений, среди которых, в первую очередь, следует назвать индуцирование устойчивости (Cruickshank, Perrin, 1968; Метлицкий, Озерецковская, 1968, 1985; Kuc, 1977; Albertsheim, 1992; Ryals et al., 1996; Озерецковская, 2002; Metraux et al., 2002; Durrant, Dong, 2004).

Индуцированная устойчивость является временной фенотипической устойчивостью, основанной на экспрессии множества защитных генов и поэтому является неспецифической.

Вещества фитопатогенов, вызывающие такую устойчивость, называются биогенными элиситорами (Keen, 1972). Обработка растений элиситорами нацелена не на уничтожение патогенов, как это имеет место при использовании пестицидов, а на индуцирование защитных свойств самого растения. Однако эффективность действия элиситоров не всегда достигает достаточно высокого уровня индуцирования устойчивости растений, поэтому в последнее время активизировались попытки усовершенствовать их защитное действие, для чего стало необходимым понимание механизмов индукции (Озерецковская и др., 1994; Тарчевский, 2001; Озерецковская, 2002; Тютерев, 2002).

Но для того, чтобы паразитировать, патогенам необходимо подавлять (супрессировать) иммунные ответы своего растения-хозяина. Иммуносупрессия является неотъемлимым свойством паразитизма, а иммуносупрессоры служат естественными антагонистами элиситоров и индуцируют в тканях растений восприимчивость к болезням (Ouchi, Oku, 1981;

Ouchi et al., 1983; Васюкова и др., 1989; Озерецковская и др., 2001; Heath, 2000). Под влиянием иммуносупрессоров ранее устойчивые растения превращаются в восприимчивые и начинают поражаться авирулентными к ним расами паразитов и даже непатогенами данных растений.

Сигнальные системы, которые функционируют между первичными агентами элиситорами и иммуносупрессорами - и конечными защитными ответами, лишь в самое последнее время стали предметом исследования ученых (Тарчевский, 2001, 2002). В наибольшей мере это касалось механизма действия элиситоров, использование которых обещало большие практические перспективы. Возможно, в силу этого ученые в первую очередь сосредоточились на познании механизмов индуцированной устойчивости и на интенсификации защитного действия элиситоров.

Что касается механизмов формирования индуцированной восприимчивости с помощью иммуносупрессоров, то это направление оставалось практически «за бортом»

фитоиммунологии. Исключение составляют работы по исследованию расоспецифического иммуносупрессора -1,2--1,6-глюкана и его неспецифического аналога - ламинарина (Леонтьева и др., 1979; Doke et al., 1979; Garas et al., 1979; Васюкова и др., 1981, 1985, 1987, 1989).

Весьма вероятно, что исследование механизмов действия иммуносупрессоров, как антагонистов элиситоров, позволило бы составить полное представление о механизмах, определяющих иммунный статус растения. Кроме того, детальное их изучение могло бы положить начало принципиально новому подходу к биологической защите растений путем блокирования механизмов иммуносупрессии.

Рядом исследователей показано, что в процессе индуцирования устойчивости растений принимает участие салициловая кислота (СК) (Meuwly et al., 1995; Molders et al., 1996; Yu et al., 1997; Coquoz et al., 1998; Васюкова и др., 1999; McDowell, Dungl, 2000; Alvares, 2002;





Тарчевский, 2002). Некоторые исследователи подразделяют пути формирования иммунных ответов растений на СК-зависимые и СК-независимые, которые функционируют в растительных тканях, взаимно влияя друг на друга и составляя комплексную сеть регуляторных взаимоотношений (Сhen, Sylva, 1993; Lee, Leon, 1995; Yu, Liu, 1997; Kunkel et al., 2002; Nibble et al., 2002). Однако до сих пор не существует достаточно ясных представлений о том, каким образом СК принимает участие в механизмах индуцирования устойчивости, и, тем более, восприимчивости растений (Lawton et al., 1995; Mur et al., 1996;

Shirasu et al., 1997; Wees et al., 1997; Vidal et al., 1998; Chеn, Klessig, 1999; Huckelhoven et al., 1999).

Цели и задачи работы. Цель исследования заключалась в сравнительном изучении механизмов действия в тканях клубней картофеля антагонистических иммуномодуляторов – элиситора и иммуносупрессора, а также сопоставление этих механизмов с процессом формирования устойчивости и восприимчивости картофеля, инфицированного совместимыми и несовместимыми расами Phytophthora infestans (Mont.) de Bary. Основное внимание в работе уделяли влиянию инфицирования и обработки иммуномодуляторами на функционирование некоторых компонентов НАД(Ф)Н-оксидазной сигнальной системы.

В работе ставились следующие задачи:

1. Провести скрининг по биологической активности фракций хитозана с различными химическими и физико-химическими характеристиками с целью выявить хитозан с наибольшими элиситорными свойствами.

2. Исследовать влияние процесса индуцирования устойчивости (с помощью элиситора – хитозана и несовместимой расы P. infestans), а также процесса индуцирования восприимчивости (с помощью иммуносупрессора - ламинарина и совместимой расы P.

infestans) на уровень свободной и коньюгированной форм СК в клубнях картофеля.

3. Исследовать влияние процесса индуцирования устойчивости (с помощью элиситора и несовместимой расы P. infestans), а также процесса индуцирования восприимчивости (с помощью иммуносупрессора и совместимой расы P. infestans) на активность каталазы клубней картофеля.

4. Изучить способность экзогенной СК ингибировать активность каталазы клубней картофеля, а также выяснить способность СК ингибировать активность каталаз, выделенных из интактных (контрольных), иммунизированных и иммуносупрессированных клубней.

5. Исследовать на клубнях картофеля индуцирующие свойства перекиси водорода – наиболее стабильной из активных форм кислорода.

6. На основании полученных экспериментальных данных предложить модели функционирования в тканях клубней картофеля механизмов индуцирования фитофтороустойчивости элиситором - хитозаном и индуцирования восприимчивости супрессором - ламинарином.

7. Провести ингибиторный анализ, подтверждающий или опровергающий предположения автора относительно цепи событий, предшествующей формированию индуцированной устойчивости и восприимчивости.

8. Исследовать возможность повышения индуцирующей активности хитозана путем добавления к нему компонентов, участвующих в формировании механизмов устойчивости.

Научная новизна работы. Впервые проведено сравнительное изучение механизмов формирования индуцированной устойчивости и индуцированной восприимчивости тканей клубней картофеля и сопоставление их с механизмами возникновения устойчивости и восприимчивости при инфицировании возбудителем фитофтороза. Предполагается, что элиситор (хитозан) индуцирует в клетках клубня картофеля окислительный взрыв, способствующий иммунизации, тогда как иммуносупрессор (ламинарин) снижает концентрацию активных форм кислорода, предотвращая тем самым развитие иммунного ответа. Впервые показано, что активность каталазы - основного фермента расходного канала баланса перекиси водорода - в тканях клубней картофеля при развитии устойчивости, вызываемой хитозаном и несовместимой расой P. infestans, снижается, а под действием ламинарина и совместимой расы P. infestans - возрастает. Установлено, что СК является эффективным ингибитором активности каталазы в клубнях картофеля.

Впервые установлено, что применение низкомолекулярного, водорастворимого хитозана в композиции с СК усиливает и ускоряет защитное действие элиситора. Выдвинуто предположение о механизмах элиситорного и супрессорного действия (хитозана и ламинарина) в клубнях картофеля, что подтверждается результатами проведенного ингибиторного анализа.

Теоретическая и прикладная значимость работы. Изучен механизм индуцирования устойчивости в тканях клубней картофеля хитозаном и механизм индуцирования восприимчивости его антагонистом - ламинарином. Разработан композиционный перепарат, сочетающий в себе хитозан и СК, который обладает более сильным и быстрым защитным действием, чем собственно элиситор.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на VII Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана» (Санкт-Петербург, Репино, 2003, симпозиальный доклад); на VI Симпозиуме по фенольным соединениям (Москва, 2004, симпозиальный доклад).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка публикаций по теме диссертации.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследований служили клубни картофеля сорта Истринский с геном фитофтороустойчивости R1 и расы возбудителя фитофтороза P. infestans, две из которых (1. и 1) совместимы с указананным сортом, тогда как две другие (3.4 и 3) – несовместимы.

Фитофтороустойчивость картофеля индуцировали низкомолекулярным, водорастворимым хитозаном со средневязкостной молекулярной массой 2-6 кДа и степенью деацетилирования 85%, который был получен энзиматическим гидролизом хитина крабов.

Ферментативный гидролиз осуществляли комплексом хитиназ из Streptomytes kursanovii (Варламов, Ильина, 2000)*.

*Различные фракции хитозана были получены в Центре «Биоинженерия» РАН и любезно предоставлены нам д.б.н., профессором В.П. Варламовым и к.х.н. А.В. Ильиной.

Для подавления иммунных ответов картофеля использовали неспецифический иммуносупрессор - ламинарин (-1,3--1,6-глюкан) («Sigma»), способность которого подавлять фитофтороустойчивость была показана ранее (Озерецковская и др., 1982).

Испытания биологической активности препаратов проводили на дисках, вырезанных из клубней картофеля (h – 7, d - 16 мм), на поверхность которых наносили по 50 µл испытуемых препаратов, и спустя 2 часа инфицировали зооспорами паразита при нагрузке 104 спор/мл. Контролем служили диски, на поверхность которых наносили воду. При инфицировании дисков несовместимыми расами образовывались некротизированные клетки, число которых через 72 часа после заражения подсчитывали под микроскопом.

Количество некротизированых клеток, меньшее, чем в контрольном варианте, свидетельствовало об индуцировании устойчивости, в то время как число некротизированных клеток, превышающее контрольное значение, являлось признаком ослабления устойчивости или развития восприимчивости (Чаленко и др., 1980). При заражении картофеля совместимыми расами патогена учитывали глубину проникновения его гиф в ткани дисков. Контрольные и опытные диски инкубировали в чашках Петри на увлажненной подложке.

Развитие устойчивости или восприимчивости выражали в % иммуномодулирующего эффекта, при условии, что контроль принимается за 0%. Таким образом, иммунизирующий эффект выражался как положительное значение, а иммуносупрессорный эффект – как отрицательное.

Для определения активности ферментов диски обрабатывали иммуномодулирующими агентами, как описано выше. Через определенные промежутки времени с обработанной поверхности дисков срезали верхний слой ткани (3 мм), из которого получали ацетоновые препараты. В экстратах ацетоновых препаратов определяли активность каталазы и бензоатгидроксилазы (БК-2-Г). Экстракцию проводили, соответственно, с помощью 67 mM К-Na - фосфатного буфера (pH 7.0) и 20 mM ТЭА-буфера (рН 7,4), содержащих 1 mM ЭДТА и 5mM аскорбата натрия (Garcia-Limones, 2002). Экстракты отфильтровывали через двойной слой марли и центрифугировали, а полученные супернатанты использовали для определения активности ферментов.

Активность каталазы (ЕС 1.11.1.6) определяли по падению концентрации перекиси водорода (Luck H., 1965; Garcia-Limones, 2002). Реакционная среда (конечный объем 0,5 мл) содержала 67 mM К-Na - фосфатного буфера (pH 7.0), 20 mM перекиси водорода, и 30 µл ферментного экстракта. Определения проводили на спектрофотометре «Backman Coulter – 2000» при 240 нм ( = 43,6). Удельную активность каталазы выражали в µМ перекиси водорода на мг белка в минуту.

Реакционная смесь для определения активности БК-2-Г (конечный объем 0.5 мл) содержала 10 µМ ТЭА-буфера (рН 7.4), 1 µМ бензойной кислоты, 1 µМ НАД(Ф)Н и 200 µл ферментного экстракта (Leon еt al., 1993). Смесь инкубировали в течение 30 мин при 300С.

Реакцию останавливали, добавляя 15% ТХУ. Спустя 10 мин осадок удаляли центрифугированием при 5000 g в течение 15 мин. СК дважды экстрагировали смесью этилацетат – циклогексан (1:1 об/об), смесь разделяли на делительной воронке, из органической фазы выделяли СК, количество которой определяли методом ВЭЖХ.

Активность БК-2-Г выражали в нг СК в минуту на мг белка.

Содержание белка определяли по Брэдфорду (Bradford, 1976).

СК экстрагировали из обработанной ткани дисков картофеля в два этапа (Meuwly, Metraux, 1993). На первом этапе проводили экстракцию свободной формы СК. Ткань замораживали жидким азотом, растирали и экстрагировали 70% этанолом. Экстракт центрифугировали, супернатант отделяли, ресуспендируя осадок в 90% этаноле, и вновь центрифугировали при 10000g в течение 15 минут. Супернатанты объединяли. Спирт удаляли под вакуумом, к оставшейся водной фазе добавляли 5% ТХУ. Осадок удаляли центрифугированием, а супернатант дважды экстрагировали смесью этилацетат – циклогексан (1:1 об/об). Верхний циклогексановый слой упаривали под вакуумом, сухой остаток перерастворяли в подвижной фазе, используемой для ВЭЖХ.

последующим центрифугированием гидролизной смеси. Из супернатанта смесью этилацетат - циклогексан (1:1 об/об) выделяли фракцию, содержащую СК. Количество СК определяли с помощью ВЭЖХ.

Определение СК с помощью ВЭЖХ проводили на приборе «Стайер» (Россия) на колонке Luna - C 18(2) «Phenomenex» (США) (250мм х 4,6 мм х 5 мкм), петля 50 µл. Для разделения применяли изократическую элюцию с помощью Н3РО4 (0,43 %) и ацетонитрила в соотношении 55: 45%%, соответственно.

Для ингибиторного анализа диски клубней картофеля обрабатывали следующими веществами (50 µл на диск): 5 µM дифенилениодиниум хлорида (ДПИ) (Alvares et al., 1998), µM апоцинина* (4-гидрокси-2-метоксиацетофенон) оба вещества - ингибиторы НАД(Ф)Н-оксидазы), а также 10 mM 3-амино-1,2,4-триазола (АТ) - ингибитора каталазы; и 30 mM 1,3-диметил-2-тиомочевины (ДМТМ) - вещества, которое связывает перекись водорода в тканях растения и которое условно можно называть «перехватчиком» перекиси водорода (Van Den Worm, 2001; Raymond et al., 2003).

* Апоцинин был предоставлен нам д.б.н., профессором Ю.А. Лабасом; ДМТМ, ДПИ и АТ д.б.н., профессором А.А. Аверьяновым, которым мы выражаем искреннюю признательность После обработки ингибиторами ткани клубней заражали зооспорами P. infestans и оценивали результаты инфицирования.

Статистическую обработку данных проводили с помощью компьютерного анализа по программе “STRAZ” (Сагитов, Перевертин, 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В первую очередь, нами был проведен скрининг фракций низкомолекулярного водорастворимого хитозана по их способности индуцировать в тканях картофеля защитные восстанавливающего или невосстанавливающего конца, степени деацетилирования (СД) по аминогруппе, а также средневязкостной молекулярной массы.

Иммуномодулирующий эффект, % от контроля Показано, что при наличии у молекулы хитозана восстанавливающего конца его активность несколько снижалась (рис. 1). Вероятно, это объясняется тем, что присутствие свободного гликозильного гидроксила делает хитозан более реакционноспособным – в том числе к реакциям с другими углеводами, что может приводить к снижению или потере его индуцирующей активности.

На следующем этапе скрининга сравнивали индуцирующую активность хитозанов, различающихся по СД по аминогруппе. Было установлено, что индуцирующие свойства хитозана с большей СД (85%) превосходили таковые у хитозана с меньшей СД (42%) (рис.

2). Таким образом, на основании полученных данных для скрининга по молекулярной массе мы использовали только нередуцирующие фракции хитозана со СД 85%.

Иммуномодулирующий эффект, % от контроля На следующем этапе анализировали индуцирующую активность хитозанов с различной средневязкостной молекулярной массой. Установлено, что наибольшей индуцирующей активностью обладали хитозаны с молекулярной массой 2 и 5 кДа (табл. 1).

Таким образом, в результате скрининга было установлено, что наиболее эффективным индуктором фитофтороустойчивости клубней картофеля являлся низкомолекулярный, водорастворимый, нередуцирующий хитозан со средневязкостной молекулярной массой 2 и кДа и степенью деацетилирования 85% в концентрации 100µг/мл (табл. 1).

В качестве иммуносупрессора клубней картофеля использовали ламинарин (рис. 3), иммуносупрессоров, обладающих специфической активностью к различным расам P.

infestans, поскольку вышеназванные глюканы ингибировали защитные механизмы картофеля картофеля рас возбудителя фитофтороза (Озерецковская и др., 1982; Васюкова и др., 1989).

По строению ламинарин (степень полимеризации около 30 глюкозных единиц) подобен этим глюканам, однако, в отличие от них, не обладает расоспецифичностью. Ламинарин подавляет защитные реакции картофеля (синтез фитоалексинов, ингибиторов протеиназ, процессы раневой репарации), поэтому его относят к разряду иммуносупрессоров.

Таблица Индуцирующая активность хитозанов с различной Рис. Строение ламинарина – супрессора иммунных ответов картофеля При изучении иммуносупрессорных свойств оказалось, что наибольшую иммуносупрессирующую активность ламинарин проявляет в концентрации 300 µг/мл (табл.

2, 3). При обработке ламинарином усиливается степень поражения клубней картофеля совместимыми расами патогена (табл. 2). Под действием супрессора клубни начинают поражаться несовместимыми расами P. infestans (табл. 3) и даже непатогенами картофеля (Медведева и др., 1985). Показано также, что ламинарин обладает антиэлиситорным действием: индуцирование устойчивости элиситором в его присутствии затруднено (данные не приводятся).

Влияние ламинарина на инфицирование клубней картофеля Влияние ламинарина на инфицирование клубней картофеля Выше уже упоминалось, что одним из участников сигнальных систем, ответственных за формирование фитоиммунитета, является СК (Сhen, Sylva, 1993; Lee et al., 1995; Yu et al., 1997; Nibble et al., 2002). В растениях СК находится как в свободной, так и в связанных формах, среди которых преобладает ее О--D-глюкозид. Особо следует подчеркнуть, что СК участвует в индуцировании устойчивости только в свободной форме; связанные формы СК таким свойством не обладают, но выступают неким резервом, обеспечивающим запас СК в тканях (Raskin, 1992; Lee et al., 1995). Что касается формирования иммуносупрессии, то роль СК в этом процессе до сих пор остается неясной.

Нами было исследовано влияние инфицирования совместимыми и несовместимыми расами P.infestans на уровень свободной и связанной форм СК в тканях клубней картофеля.

На рис. 4 представлены фотографии клеток клубней картофеля, пораженных несовместимой и совместимой расами возбудителя фитофтороза, а выше – их схематическое изображение.

Содержание СК в тканях клубней картофеля, инфицированных P.infestans В несовместимой комбинации хозяина и паразита в области заражения содержатся отмершие клетки, погибшие в процессе сверхчувствительной реакции, с остатками разрушенных гиф патогенного оомицета. Наибольшее их количество сосредоточено в поверхностных слоях инфицированной ткани. Согласно полученным данным, в несовместимой комбинации СК накапливается вокруг СВЧ-области. Известно, что образующаяся в результате биосинтеза СК довольно быстро превращается в связанную форму, что согласуется с наблюдаемой одновременной аккумуляцией как свободных, так и конъюгированных форм СК (Raskin, 1992).

При развитии восприимчивости (в совместимой комбинации хозяина и паразита) клетки картофеля заполнены живыми, хорошо развитыми гифами P.infestans, которые к наблюдалось снижение общего уровня СК, которое выражалось, прежде всего, в уменьшении концентрации ее связанных форм (рис. 4).

оказалось, что под воздействием хитозана содержание свободной СК значительно возрастало, тогда как под влиянием ламинарина – практически не изменялось (рис. 5). Концентрация же конъюгироваванной формы СК, напротив, снижалась значительно под воздействием хитозана, и лишь слегка уменьшалась под влиянием ламинарина (рис. 6) Количество СК, нг/г сырой ткани хитозана возрастание уровня свободной СК сопровождалось снижением количества ее связанной формы, возникает вопрос, является ли аккумуляция СК результатом гидролиза конъюгатов, или же наряду с процессом гидролиза происходит и ее синтез de novo. Для ответа на этот вопрос определяли активность фермента, ответственного за синтез СК из бензойной кислоты – бензоат-2-гидроксилазы (БК-2-Г). Согласно полученным данным, индуцирование восприимчивости ламинарином - снижением активности БК-2-Г (табл. 4). Из этого следует, что в процессе элиситации активизируется как высвобождение СК из связанных форм путем их гидролиза, так и ее непосредственный синтез из бензойной кислоты, в то время как при развитии иммуносупрессии оба процесса подавлены.

связан с ее способностью ингибировать активность некоторых растительных каталаз (Chen et al., 1992; Ruffer et al., 1995; Tenhaken, Rubel, 1997), в результате чего в клетках накапливается перекись водорода, способная активировать экспрессию защитных генов (Doke et al., 1996; Alvarez et al., 1998; Suzuki et al., 2005).

Активность каталазы, % Активность каталазы, % от контроля снижалась по сравнению с контролем, тогда как под воздействием ламинарина, напротив, несколько возрастала (рис. 8). Особенно ярко эта тенденция проявлялась при экспозиции ч, где наблюдалось максимальное снижение активности каталазы в иммунизированных тканях и наибольшее возрастание ее активности под воздействием иммуносупрессора.

Из данных литературы известно, что СК, ее химические производные и миметики обладают способностью ингибировать активность железосодержащих ферментов, в том числе некоторых (но далеко не всех) растительных каталаз (Chen et al., 1992; Ruffer et al., 1995; Tenhaken, Rubel, 1997). Имеются данные о том, что янтарная кислота (ЯК), которая является естественным миметиком СК, обладает одинаковой с СК способностью ингибировать активность каталазы печени быка (Тарчевский и др., 2000).

Ингибирование активности каталазы Концентрация Степень ингибирования, % Ингибирование активности каталазы клубней картофеля ЯК Концентрация Степень ингибирования, % обладала способностью ингибировать Степень ингибирования, % иммунизированных хитозаном клубней, была значительно выше, чем чувствительность этого фермента, выделенного из клубней, обработанных ламинарином (табл. 7). Возможно, что под воздействием ламинарина происходила интенсификация экспрессии гена изоформы каталазы, обладающей пониженной чувствительностью к СК.

Результатом ингибирования активности каталазы СК в тканях клубней картофеля, по видимому, является накопление перекиси водорода – наиболее стабильной из всех АФК.

Иммуномодулирующий эффект, % от контроля устойчивости.

Основываясь на полученных данных, мы попытались предположить гипотетическую модель индуцирования устойчивости с помощью хитозана (рис. 11) и восприимчивости – с помощью ламинарина. Согласно модели индуцирования устойчивости, при иммунизации тканей клубней картофеля хитозаном функционирует следующая регуляторная цепочка: в процессе элиситации происходит накопление свободной формы СК, которая ингибирует активность каталазы, в результате чего происходит накопление перекиси водорода («окислительный взрыв»), и формируется индуцированная устойчивость (рис. 11).

При индуцировании восприимчивости ламинарином не происходит накопления СК, чувствительность каталазы к СК снижается, и активность фермента возрастает. В результате процесс формирования индуцированной восприимчивости не сопровождается накоплением перекиси водорода, более того – за счет возрастания активности каталазы уровень ее несколько понижается. Снижение концентрации АФК в клетках не позволяет развиться устойчивости, и клубни становятся восприимчивыми к патогенам.

устойчивости и восприимчивости клубней картофеля нами был проведен ингибиторный анализ (табл. 8). Оказалось, что после обработки ингибиторами НАДФ(Н)-оксидазы в тканях картофеля индуцировалась восприимчивость к патогену, причем более специфичный ингибитор (апоцинин) провоцировал гораздо более сильную супрессию иммунных ответов, чем менее специфичный ДПИ. Блокирование активности НАДФ(Н)-оксидазы приводило к снижению уровня АФК в тканях, и, как следствие, к индуцированию восприимчивости тканей картофеля к фитофторозу.

Гипотетическая модель индуцирования устойчивости клубней картофеля Каталаза ГвПО и др. ПО

ИНДУЦИРОВАННАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ

СК-салициловая кислота; ПК-протеинкиназы; ПЛ – плазмалемма; ФРТ - факторы регуляции транскрипции; ферменты, продуцирующие Н2О2: СОД – супероксиддисмутаза, рНПО кс – рН-зависимая пероксидаза клеточной стенки, КО – ксантиноксидаза, ГОгликолатоксидаза, ДАО - диоаминооксидаза; ферменты, продуцирующие Н2О2: АПОаскорбатпероксидаза, ГлР- глутатионредуктаза, ГвПО – гваяколпероксидаза; ПО-пероксидазы Таблица Воздействие ингибиторов на устойчивость клубней картофеля к P. infestans Вариант Концентрации Некротизированные Иммуномодулирующий (вода) Апоцинин (ингибитор НАД(Ф)Ноксидазы) (ингибитор НАД(Ф)Ноксидазы) (ингибитор активности каталазы) ДМТМ («перехватчик»

перекиси) Ингибирование активности каталазы с помощью АТ приводило к индуцированию устойчивости тканей клубня к возбудителю фитофтороза, что свидетельствует об участии перекиси водорода в процессе иммунизации. Доказательством этому также служила обработка тканей ДМТМ - перехватчиком перекиси водорода - которая способствовала индуцированию восприимчивости.

Вторым подтверждением предложенной модели служит создание композиционного препарата, сочетающего в себе хитозан и СК (10-8 г/мл). Оказалось, что композиционный препарат усиливает и (что не менее важно) ускоряет возникновение иммунизирующего эффекта (рис. 12). Так, при обработке композиционным препаратом защитный эффект в центре клубня картофеля развивался уже на 2-е сутки, в то время как при обработке хитозаном – лишь на 6-е сутки (рис. 12). Кроме того, добавление СК позволяет снизить эффективную концентрацию хитозана, необходимую для иммунизации клубней: если ранее использовался хитозан в концентрации 100 µг/мл, то при добавлении СК достаточно применить концентрацию 10 µг/мл (рис. 13).

Иммуномодулирующий эффект, % от контроля воздействием интенсифицируются аккумуляция СК и снижается активности каталазы (рис.

Уровень свободной формы СК в тканях клубней картофеля под действием композиционного Количество СК, нг/г сырой ткани Таким образом, исследование механизмов формирования индуцированной устойчивости с помощью хитозана и индуцированной восприимчивости с помощью ламинарина, позволило нам предложить модель их функционирования и подтвердить ее существование ингибиторным анализом и созданием композиционного препарата с более эффективным, чем у собственно хитозана, защитным действием.

ВЫВОДЫ

1. Процессы, происходящие в клубнях картофеля под влиянием элиситора и иммуносупрессора, в целом соответствуют процессам, имеющим место при инфицировании картофеля несовместимой и совместимой расами P. infestans, соответственно.

2. В процессе индуцирования устойчивости в тканях клубней картофеля происходит накопление СК. Аккумуляция свободной формы СК происходит в результате интенсификации ее биосинтеза de novo и возможного гидролиза связанных форм СК.

3. В процессе индуцирования восприимчивости происходит снижение интенсивности биосинтеза СК из бензойной кислоты, но существует вероятность некоторого пополнения «пула» свободной СК за счет разложения ее связанных форм.

4. При индуцировании устойчивости активность каталазы клубней картофеля снижается, результатом чего, по-видимому, является накопление перекиси водорода («окислительный взрыв»).

5. При индуцировании восприимчивости активность каталазы клубней картофеля возрастает, следствием чего является снижение уровня перекиси водорода (предотвращение «окислительного взрыва»).

6. СК является эффективным ингибитором активности каталазы в контрольных и иммунизированных клубнях картофеля. В процессе индуцирования восприимчивости способность каталазы клубней ингибироваться СК снижается.

7. Показана способность экзогенной перекиси водорода индуцировать фитофтороустойчивость клубней картофеля в установленных концентрациях.

8. Предлагаемая модель индуцирования устойчивости клубней картофеля хитозаном и восприимчивости - ламинарином подтверждается:

А. Результатами ингибиторного анализа Б. Усилением защитного эффекта хитозана путем создания его композиционного препарата с СК.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Валуева Т.А., Герасимова Н.Г., Панина Я.С., Озерецковская О.Л. Регуляция иммунных ответов картофеля ламинарином. Прикл.биохимия и микробиол. 2003. №6.С.697- 2. Васюкова Н.И., Зиновьева С.В., Удалова Ж.В., Панина Я.С., Озерецковская О.Л..

Участие салициловой кислоты в системной нематодоустойчивости томатов. Доклады АН.

2003. Т. 391, С. 343-345.

3. Васюкова Н.И., Панина Я.С., Зиновьева С.В, Удалова Ж.В., Озерецковская О.Л., Участие салициловой кислоты в системной устойчивости томатов к Meloidogyne incognita.

Материалы седьмой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». С.- Петербург, Репино, 15-18 сентабря 2003 г. ВНИРО. С.

73-76.

4. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Изменение активности каталазы клубней картофеля под действием иммунорегуляторов. Доклады АН. 2004. Т. 395. №5. С.

348-352.

5. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Ингибирование активности каталазы клубней картофеля салициловой и янтарной кислотами. Доклады АН. 2004. Т. 397.

С. 307-311.

6. Озерецковская О.Л., Варламов В.П., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Герасимова Н.Г., Панина Я.С. Воздействие системных сигнальных молекул на скорость распространения по тканям картофеля иммунизирующего эффекта элиситоров. Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. №1. С. 252-256.

7. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Чаленко Г.И., Озерецковская О.Л. Салициловая кислота и индуцированная устойчивость растений. Материалы 6-го симпозиума по фенольным соединениям. Москва, 28-30 апреля 2004 г., с. 8. Панина Я.С., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л. Свободная и коньюгированные формы салициловой кислоты: содержание и роль в картофеле. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. Т. 41. №3. С. 1-4.

9. Панина Я.С, Герасимова Н.Г., Чаленко Г.И., Васюкова Н.И., Озерецковская О.Л.

Салициловая кислота и фенилалаланин-аммиак-лиаза в картофеле, инфицированном возбудителем фитофтороза. Физиология растений. 2005. Т. 52. №4. С. 573-577.



 
Похожие работы:

«ПОСКРЯКОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ 03.00.23 - биотехнология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2007 Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы и метаболиты почвенных и ризосферных Ферменты микроорганизмов (номер государственной регистрации ГР № 01200210612) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Логинов Олег...»

«АВТУХ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ СИСТЕМАТИКА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА KRIBBELLA 03.02.03 Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино – 2012 Работа выполнена в отделе Всероссийская коллекция микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна Научный консультант :...»

«ЧУЙКИН Илья Александрович МЕХАНИЗМЫ АНТИПРОЛИФЕРАТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНГИБИТОРОВ ДЕАЦЕТИЛАЗ ГИСТОНОВ НА ЭМБРИОНАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ МЫШИ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2006 Работа выполнена в Институте цитологии РАН, Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Поспелов Валерий Анатольевич Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург...»

«Добровольский Олег Павлович ИЗМЕНЕНИЯ В СОСТАВЕ ОХОТНИЧЬИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ В ПОСЛЕДНИЕ ДЕСЯТИЛЕТИЯ Специальность 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре зоологии ФГАОУ ВПО Южный Федеральный университет доктор сельскохозяйственных наук, Научный руководитель : профессор Миноранский Виктор Аркадьевич Официальные оппоненты :...»

«Демидова Айгуль Тагировна ЭКОЛОГИЯ И ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ШМЕЛЕЙ (HYMENOPTERA, APIDAE, BOMBINI) СРЕДНЕОБСКОЙ НИЗМЕННОСТИ Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2012 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии животных ГОУ ВПО Сургутский государственный университет ХМАО – Югры Научный руководитель : доктор педагогических наук, кандидат биологических наук, профессор Тюмасева Зоя Ивановна...»

«Ашихмин Александр Александрович Каротиноиды светособирающих комплексов пурпурной серной бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Пущино – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН) Научный руководитель : доктор биологических наук Москаленко Андрей Анатольевич...»

«Растегаев Олег Юрьевич ХИМИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КОНТРОЛЯ И МОНИТОРИНГА ПРИ УНИЧТОЖЕНИИ ХИМИЧЕСКОГО ОРУЖИЯ Специальность: 03.02.08 – экология (химия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена в ФБУ Государственный научно-исследовательский институт промышленной экологии Ростехнадзора (ФБУ ГосНИИЭНП), г. Саратов Научный консультант : - доктор физико-математических наук, профессор Чупис Владимир...»

«Альфрайхат Махмуд Хасан УСТОЙЧИВОСТЬ ПОЧВ ВЫСОКОГО ПЛАТО ИОРДАНИИ И ЕГО ОБРАМЛЕНИЯ Специальность: 03.00.27-почвоведение Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва-2009 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения и земледелия Российского университета дружбы народов Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ларешин Вячеслав Григорьевич. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ганжара Николай...»

«РИЗАЕВА Елена Петровна БИОХИМИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ - 1998 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета. Научный руководитель : кандидат химических наук,...»

«ТИХОМИРОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ СРЕДЫ НА ГАЗООБМЕН И ПРОДУКТИВНОСТЬ РАСТЕНИЙ Salicornia europaea L., КАК ВОЗМОЖНОЙ СОСТАВНОЙ ЧАСТИ ФОТОТРОФНОГО ЗВЕНА СИСТЕМЫ ЖИЗНЕОБЕСПЕЧЕНИЯ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск-2006 Работа выполнена в Институте биофизики СО РАН (г. Красноярск) Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Ушакова Софья Аврумовна...»

«Рабжаева Арюна Николаевна ОСОБЕННОСТИ НАКОПЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ THYMUS BAICALENSIS SERG. В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ 03.00.05 – ботаника 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2010 2 Работа выполнена в Байкальском институте природопользования СО РАН Научный руководитель : доктор химических наук, профессор Раднаева Лариса Доржиевна кандидат биологических наук Жигжитжапова...»

«Головина Екатерина Олеговна Петрофитные степи западной части Ононской Даурии 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в Лаборатории географии и картографии растительности Учреждения Российской академии наук Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Сафронова Ирина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«ТЕРЕЩЕНКО ОЛЕСЯ ЮРЬЕВНА ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПРИЗНАКОВ АНТОЦИАНОВОЙ ОКРАСКИ У ИЗОГЕННЫХ И ИНТРОГРЕССИВНОЙ ЛИНИЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ (TRITICUM AESTIVUM L.) 03.02.07 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 1 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики и цитогенетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики Сибирского отделения Российской...»

«РАЧЕНКО МАКСИМ АНАТОЛЬЕВИЧ ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ СОРТОВ ЯБЛОНЬ В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО ПРЕДБАЙКАЛЬЯ Специальность 03.02.01 – ботаника (биологические наук и) 03.02.08 – экология (биологические науки) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2011 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Иркутской государственной сельскохозяйственной академии Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Худоногова Елена Геннадьевна...»

«Семёнов Михаил Александрович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКОСИСТЕМНОГО БИОРАЗНООБРАЗИЯ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ЛЕСОВОССТАНОВЛЕНИИ (НА ПРИМЕРЕ ЦНИНСКОГО ЛЕСНОГО МАССИВА) 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж – 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Воронежская государственная лесотехническая академия Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Харченко Николай Николаевич Официальные оппоненты :...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Цыремпилов Энхэ Галсанович ПОЧВЫ БАРГУЗИНСКОЙ КОТЛОВИНЫ: РАЗНООБРАЗИЕ, ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И РАЦИОНАЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2013 Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экспериментальной агрохимии ФГБУН Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН и ФГБОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р....»

«ЧЕРЕПКОВА Оксана Анатольевна ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин...»

«ЛУБЯНОВ Александр Александрович МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУНА И ЕГО ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА В УСЛОВИЯХ КАДМИЕВОГО СТРЕССА Специальность 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Яхин Олег Ильдусович Научный консультант :...»

«БОЛДАРЕВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА АЭРОБНЫЕ АНОКСИГЕННЫЕ ФОТОТРОФНЫЕ БАКТЕРИИ ЩЕЛОЧНЫХ МЕСТООБИТАНИЙ Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2008 2 Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН доктор биологических наук Научный руководитель : В.М. Горленко доктор биологических наук Официальные оппоненты : Л.М. Герасименко доктор биологических наук Р.Н. Ивановский...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.