WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

СОКОЛОВ Александр Вячеславович

РОЛЬ КАРОТИНОИДОВ В АНТИОКСИДАНТНОЙ

ЗАЩИТЕ ГРИБНОЙ КЛЕТКИ.

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2004

Работа выполнена в отделе Биохимии и биотехнологии низкомолекулярных природных соединений Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Н.Н. Гесслер

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Е.П. Феофилова кандидат биологических наук А.И. Деев

Ведущая организация:

Институт Биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино).

Защита диссертации состоится «08» июня 2004 г. в «» часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект,33, корп.1.

Автореферат разослан «»2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. У нефотосинтезирующих организмов каротиноиды выполняют роль фотопротекторов и антиоксидантов. Кроме того, в биологических системах каротиноиды также выступают предшественниками сигнальных молекул, таких как витамин А у животных, абсцизовая кислота у растений и триспоровые кислоты у мукоровых грибов. Широкое применение каротиноидов в медицине и сельском хозяйстве, использование в качестве красителей и стабилизаторов пищевых продуктов и косметических средств делает актуальным исследованием функций этих соединений в живой клетке.

Способность синтезировать каротиноиды обнаружена у многих представителей царства грибов. Показано, что каротиногенез может стимулироваться условиями выращивания или химическими соединениями, повышающими уровень активных форм кислорода (АФК) в клетке, что указывает на важную роль каротиноидов в защите клетки от окислительного стресса и тесную связь их синтеза с процессами дифференцировки.





Исследование функций каротиноидов в грибной клетке и их участие в системе антиоксидантной защиты является важным моментом в регуляции жизнедеятельности грибов.

Работа в основном выполнена на культуре гриба Blakeslea trispora (промышленном продуценте -каротина), а также на каротиноидсинтезирующем грибе Neurospora crassa и модельном объекте - бактерии Е.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза -каротина.

Цели и задачи работы. Настоящая работа направлена на изучение функциональной активности каротиноидов и их роли в системе антиоксидантной защиты (АОЗ) грибной клетки при окислительном стрессе, а также на выявление причины феномена «сверхсинтеза» -каротина у B.trispora.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1. Характеристика системы АОЗ у B.trispora - активность антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы, содержание -каротина у разных штаммов.

2. Сравнительный анализ реакции компонентов системы АОЗ на окислительный стресс у представителей разных классов грибов B.trispora и N.crassa.

3. Изучение участия -каротина в защите клетки от окислительного стресса на примере E.coli со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза -каротина.

4. Изучение начальных этапов синтеза триспоровых кислот (ТСК) из каротина у B.trispora. Связь синтеза предшественников ТСК с окислительным стрессом.

Научная новизна. При сравнении реакции компонентов системы АОЗ на окислительный стресс у представителей разных классов грибов B.trispora и N.crassa впервые было показано отсутствие Cu,Zn-СОД у B.trispora. У B.trispora каротиноиды выступали в роли основного активируемого компонента системы АОЗ, в отличие от N.crassa, у которой синтез каротиноидов происходил только в ответ на действие света. Впервые показано, что наличие каротина в клетке рекомбинантной бактерии Е.coli предупреждало активацию СОД под действием редокс-медиаторов, что подтверждает участие каротиноидов в системе АОЗ in vivo. Впервые обнаружено, что под действием белковых препаратов, выделенных из мицелия гриба B.trispora, происходило окисление -каротина по 4 углеродному атому -иононового кольца с образованием изокриптоксантина. Выявлено, что образующийся в результате окислительной деградации -каротина -апо-13-каротинон является более предпочтительным субстратом для гидроксилирования -иононового кольца, чем -каротин. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от стадии развития гриба.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на 5-ой Пущинской конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века»

(Пущино, 2001г.), Международной конференции «Signaling systems of plant cell» (Москва, 2001г.), Международном симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2001г.), 3-ем съезде фотобиологов России (Воронеж, 2001г.), Международном симпозиуме «Plant under environmental stress» (Москва, 2001г.), 1-ом съезде микологов России (Москва, 2002г.), Международной конференции «Neurospora 2002» (Asilomar, California, USA, 2002г.), 6-ой международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2002г.), Международной конференции «Микология и альгология 2004»





(Москва, 2004г.), 16-ой зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Работа изложена на … страницах, включает в себя 16 рисунков, 8 таблиц и схему. Список цитируемой литературы включает … наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования были штаммы мукорового гриба B.trispora 1521 (+), (-), предоставленные Е.С. Морозовой (ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, Москва), и штаммы 811(-) и 666(+) из Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, Москва.

В работе использовали штамм аскомицета N.crassa дикого типа (RL3-8A) [FGSC № 2218], любезно предоставленный Fungal Genetics Stock Center (FGSC, University of Kansas, Kansas City, USA). В качестве модельных объектов были использованы штаммы E.coli (TOP-10) и E.coli (TOP-10 + pAC-BETA) со встроенной плазмидой, несущей гены синтеза -каротина. Данные штаммы были любезно предоставлены Фрэнсисом Каннингамом мл. (Department of Plant Biology, University of Maryland, USA).

Выделение и частичную очистку белков, проявляющих СОД активность осуществляли после разрушения мицелия замораживанием в жидком азоте с последующей обработкой гомогената ультразвуком (прибор УЗДТ-2Н). Белки, полученные из бесклеточного экстракта высаливанием (NH4)2SO4 при 80-ти % насыщении, последовательно фракционировали на колонках с QAE-сефадексом А- и ДЕАЕ-целлюлозой.

Активность СОД определяли по ингибированию окисления кверцетина (Костюк с соавт., 1990). Расчет активности проводили графически с применением регрессионного анализа (пробит – анализ) (Eldred et al., 1981).

Определение активности каталазы в экстрактах проводили перманганатным методом (Белозерский, 1951).

Электрофорез СОД в ПААГ проводили на пластинках по методу Дэвиса с модификацией, заключающейся в том, что рибофлавин входил в состав как концентрирующего, так и разделяющего геля. Окрашивание геля после электрофореза проводили в водном растворе тетразолиевого нитросинего (Beauchamp et al., 1971).

Белковый препарат из мицелия B.trispora, выращенного на жидкой среде (2,5 сут), получали из бесклеточного экстракта путем осаждения белков сульфатом аммония при 80-ти % насыщении.

Идентификацию апокаротиналей, образующихся из -каротина, и определение соотношения их максимумов поглощения проводили после их преобразования в трифторуксусные производные (Dugan R. et. al, 1964).

Окислительную деградацию -каротина в условиях генерации супероксидного анион-радикала проводили в присутствии ксантина и ксантиноксидазы.

Получение 4-кето--апо-13-каротинона. -апо-13-каротинон в гексане наносили на колонку с MnO2, элюцию проводили серным эфиром. Полученные соединения очищали на окиси алюминия методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (гептан:ацетон, 1:1), и анализировали спектрофотометрически.

Синтез изокриптоксантина Изокриптоксантин синтезировали из -каротина с эфератом трифторида бора (L. Zeichmeister et al. 1956), с последующей очисткой на окиси алюминия методом ТСХ.

Синтез 4-метокси--каротина Метилирование проводили в смеси хлороформ метанол с добавлением хлористого водорода в хлороформе, с последующей очисткой продукта методом ТСХ.

Выделение триспоровых кислот проводили по методу Bu`Lock J.D. (1971) путем экстракции из культуральной жидкости хлороформом с последующей очисткой.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. СРАВНЕНИЕ РЕАКЦИИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС

ОТДЕЛЬНЫХ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ

1.1. Характеристика системы антиоксидантной защиты у B.trispora.

Проведено сравнительное исследование основных компонентов системы АОЗ (СОД, каталазы, уровня каротиноидов и ТСК) в процессе развития B.trispora. Наиболее активное накопление ТСК и -каротина в мицелии B.trispora были выявлены при переходе (+/-) культуры к стационарной фазе роста к началу 2-х сут (рис.1). Следует отметить, что повышение каталазной и СОД активности на фоне некоторого снижения уровня - каротина и увеличения количества ТСК отмечалось на стадии массового образования прогаметангиев в совместном (+/-) мицелии (рис. 1).

Каталаза Рис.1. Активность СОД, каталазы, уровень -каротина и содержание ТСК в совместной 666/811 (+/-) культуре B.trispora при выращивании в жидкой среде на качалке.

Эти же параметры исследовали на стационарной фазе роста у разных штаммов B.trispora при выращивании на жидкой среде как раздельных (+) и (-) культур, а так и в виде совместной (+/-) культуры. На рис. 2 показано, что в совместно выращиваемой культуре на стационарной фазе роста наблюдалось увеличение уровня -каротина и ТСК у всех исследованных пар B.trispora.

Рис. 2. Сравнение компонентов системы АОЗ на стационарной стадии роста у разных штаммов B.trispora, выращенных на жидкой среде.

В табл. 1 приведены данные относительно реакции B.trispora на добавление в колбы с совместно выращиваемым (+/-) мицелием на стационарной фазе роста ингибитора СОД диэтилдитиокарбамата натрия, ингибитора дыхания азида натрия или редокс-медиатора менадиона. Как видно из представленных данных, ингибиторы дыхания и СОД вызывали увеличение уровня -каротина при снижении СОД активности, что, по-видимому, связанно с его участием в дезактивации АФК, образующихся в процессе метаболизма.

Действие ингибиторов дыхания и СОД, а также и редокс-медиатора на Контроль Известно, что редокс-медиаторы увеличивают образования супероксидных радикалов в клетке и, как следствие, вызывают возрастание активности СОД.

Наблюдающееся снижение СОД активности в ответ на введение менадиона у B.trispora свидетельствует, по-видимому, о том, что дисмутазная активность у гриба B.trispora обусловлена не действием супероксиддисмутаз, а присутствием других антиоксидантов. Следует отметить, что у микроорганизмов, дефицитных по СОД, наблюдается повышенная чувствительность к действию редокс-медиаторов.

Данные, отражающие изменение состояния компонентов АОЗ у B. trispora (активность СОД, каталазы и уровень -каротина) под действием света при выращивании на агаризованной среде, представлены в табл. 2. Результаты табл.

2 указывают на более высокую стабильность ферментов АОЗ у отдельно растущего (+) мицелия B.trispora по сравнению с совместно выращиваемым мицелием, хотя и в этом случае свет вызывал частичное ингибирование каталазы. Одновременно у (+/-) культуры под действием света уровень каротина увеличивался более чем в 3 раза (табл. 2).

Влияние света на активности СОД, каталазы и накопление -каротина у (+) и (+/-) культур B.trispora при выращивании на агаризованной среде* Вариант опыта ед./мг белка (мкмоль/мг белка) мкг/мг белка * Освещение проводилось с помощью люминесцентной лампы (15 вт/м2) в течение 3 часов.

Полученные данные указывают на то, что совместная (+/-) культура B.trispora в стационарной фазе роста предпочтительно использует -каротин как средство защиты от действия света при снижении активности ферментов АОЗ.

На основании полученных данных можно предположить, что у гриба B.trispora при совместном выращивании (+) и (-) мицелиев на фоне развивающегося окислительного стресса под действием света и ингибиторов СОД -каротин функционировал как наиболее активный компонент в системе АОЗ клетки, тогда как активности СОД и каталазы снижались. Повышенная чувствительность B.trispora к действию менадиона, по-видимому, указывает на низкую активность СОД у этой культуры. Таким образом, из рассматриваемых компонентов АОЗ у B.trispora, вероятно, преобладает неэнзиматический способ защиты от окислительного стресса.

1.2. Изменение активности СОД, каталазы и уровня каротиноидов у N.сrassa при окислительном стрессе. При изучении реакции компонентов АОЗ на свет, а также соединения, увеличивающие уровень АФК, у представителя другого класса грибов – N.crassa, было выявлено, что при выращивании на поверхности агаризованной среды в темноте конститутивный уровень каротиноидов у данного гриба очень низкий (табл. 3). При освещении уровень каротиноидов возрастал на два порядка. В ответ на действие света отмечалось увеличение активности СОД более чем в 2 раза, а также каталазы в 1,5 раза. Таким образом, все три исследованных компонента системы АОЗ у N.сrassa активировались под действием света.

Влияние света на активность СОД, каталазы и накопление каротиноидов у * Освещение проводилось с помощью люминесцентной лампы (15 вт/м2) в течении 3 часов.

При действии на культуру N.crassa, выращенную на агаризованной среде в темноте, редокс-медиатора менадиона в концентрации 1мМ наблюдалось увеличение активности СОД в мицелии в 1,5 раза. В то же время количество каротиноидов оставалось без изменения. По-видимому, культура способна справляться с вызываемым окислительным стрессом путём активации СОД.

Таким образом, различия в изменении активности ферментов АОЗ у (+/-) B.trispora и N.crassa в ответ на действие света или других факторов, увеличивающих уровень АФК, свидетельствуют о неспособности B.trispora справляться с окислительным стрессом повышением СОД активности, и основным антиоксидантом у этой культуры выступает -каротин.

Глава 2. УЧАСТИЕ -КАРОТИНА В АОЗ КЛЕТКИ ПРИ

ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ.

В данном разделе нами проводилось исследование влияния окислительного стресса на активность СОД при наличии и отсутствии -каротина в клетке.

Работа проводилась на модельном объекте - штамме E.coli, способном синтезировать -каротин благодаря присутствию в клетке бактерии плазмиды pAC-BETA, несущей гены синтеза -каротина и устойчивости к хлорамфениколу. Наличие в среде антибиотика позволяло получать клетки с постоянным уровнем -каротина (0.1 мг/г сухого веса).

Окислительный стресс создавали введением в среду выращивания микроорганизмов редокс-медиаторов, таких как менадион или паракват (метилвиологен). Добавление менадиона в концентрации от 0,1 до 1 мМ в логарифмической фазе развития E.coli (штамм TOP-10, не содержащий -каротина) вызывало к часам роста культуры дозозависимое снижение скорости накопления биомассы и повышение активности СОД (рис.3). Наличие -каротина в клетках штамма E.coli (TOP-10 + рАС-BETA) в значительной мере предотвращало увеличение активности СОД вплоть до концентрации менадиона 1,0 мМ, но не снимало торможения роста (рис.3). Паракват в концентрации 0,1–0,2 мМ оказывал аналогичное действие на культуры E.coli, т.е. увеличение активности СОД в большей степени наблюдалось у штамма, не синтезирующего -каротин, тогда как торможение роста проявлялось у обоих штаммов.

Рис.3 Действие редокс-медиатора менадиона на рост культуры и активность СОД у E.coli TOP-10 и E.coli [TOP-10 + pAC-BETA] при выращивании в жидкой среде. 1 – биомасса TOP-10; 2 – биомасса [TOP-10 + pAC-BETA]; 3 – активность СОД у TOP- (ед.акт./мг белка); 4 – активность СОД у [TOP-10 + pAC-BETA] (ед.акт./мг белка).

Рис. 4 Изменение активности СОД у E.coli через 2.5 часа после введения редоксмедиаторов. 1- контроль; 2- менадион (0,5 мМ); 3- паракват (0,1 мМ) а) штамм TOPб) штамм [TOP-10 + pAC-BETA].

Изменение активности СОД у E.coli на стадии логарифмического роста исследовали при концентрации менадиона 0,5 мМ и параквата 0,1 мМ. У штамма E.coli, не содержащего -каротина, уже через 30-40 мин после введения редокс-медиаторов происходило изменение активности СОД, а через 2,5 часа активность СОД повышалась в 3-3,5 раза (рис.4), что хорошо согласуется с результатами других авторов. При наличии в клетках E.coli -каротина активность СОД увеличивалась лишь в 1,2-1,5 раза (рис.4).

Таким образом, наличие в клетках E.coli плазмиды, несущей гены синтеза каротина, не снимало действия редокс-медиаторов на рост культуры, но оказывало влияние на уровень СОД.

Суммируя полученные данные, можно сказать, что присутствие в клетке рекомбинантной E.coli -каротина в значительной мере снижало активацию СОД под действием редокс-медиаторов, что свидетельствует об активном участии -каротина в защите клетки от окислительного стресса.

Глава 3. ИЗУЧЕНИЕ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ У

Нами проведено сравнение супероксиддисмутазной активности в препаратах, выделенных из N.crassa и B.trispora, в ответ на действие ингибитора СОД (KCN) и хелатора металлов (фенантролин).

Действие ингибиторов СОД на препараты, проявляющие СОД активность, из N.crassa и B.trispora. (выращивание в колбах на качалке) Показано, что СОД активность выделенного и частично очищенного препарата из N.crassa полностью ингибировалась в присутствии 2 мМ KCN (табл. 4). Это совпадает с литературными данными, что у N.crassa основная супероксиддисмутазная активнось принадлежит ферменту Cu,Zn-СОД. Была также отмечена высокая чувствительность СОД, выделенной из N.crassa, к 1,10-фенантролину (табл. 4).

СОД активность в белковых препаратах из (+), (-) и совместного (+/-) мицелиев B.trispora была значительно ниже, чем в препаратах из N.crassa (табл. 4).

Ферментативная активность у данной культуры полностью инактивировалась в присутствии 2 мМ KCN, что характерно для Cu,Zn-СОД. Однако добавление хелатора металлов 1,10-фенантролина вплоть до конечной концентрации 10-5 М к белковому препарату, выделенному из мицелия B.trispora, не вызывало ингибирования СОД активности, что указывает на отсутствие металлов в белках, проявлявших активность СОД. Ингибирование СОД активности у B.trispora KCN не позволяет отнести данные ферменты к Mn-СОД.

Различная реакция ферментов, проявляющих СОД активность у B.trispora и N.crassa на стресс в условиях in vivo, а также данные ингибиторного анализа, заставили нас усомнится в наличии цитозольной Cu,Zn-СОД у B.trispora. Для проверки этого предположения было проведено электрофоретическое исследование изозимного состава СОД из мицелиев B.trispora и N.crassa (рис. 5).

Рис.5. Изучение изозимного состава СОД из B.trispora (а) и N.crassa (б). 1- B.trispora (+) (15 мг белка); 2- B.trispora (-) (12 мг белка); 3- B.trispora (+/-) (24 мг белка); 4N.crassa, мицелий выращенный в темноте (10 мкг белка); 5- СОД из эритроцитов быка (0,05 мкг белка); 6- митохондриальная фракция из N.crassa ( 7 мкг белка); 7N.crassa, мицелий после освещения (12 мкг белка).

* Препарат любезно предоставлен Исаковой Е.П., за что автор выражает ей благодарность) Результаты электрофореза белковых препаратов из B.trispora, проявляющих СОД активность, приведены на рис. 5а. Белки из (+) культуры B.trispora (трек 1) представлены на электрофореграмме одной зоной (Rm=0.96), белки из (-) культуры (трек 2) представлены тремя зонами (Rm=0.96; Rm=0.52; Rm=0.26), а из совместно выращенного (+/-) мицелия B.trispora (трек 3) - четырьмя зонами (Rm=0.96; Rm=0.68; Rm=0.52; Rm=0.26).

При электрофоретическом разделении белкового препарата из N.crassа (рис.

5б), выращенного в темноте (трек 4), СОД активность представлена двумя зонами, соответствующими Cu,Zn-СОД (зона Rm=0.37) и Mn-SOD (зона Rm=0.26), что было подтверждено сравнением этих зон по относительной подвижности с Cu,Zn-СОД из эритроцитов быка (трек 5) и с препаратом, выделенным из митохондрий N.crassа (трек 6). В экстракте мицелия N.crassа, подвергавшегося световому воздействию, при электрофоретическом разделении (трек 7) обнаружено появление дополнительной зоны (Rm=0.96), что может быть связанно с появлением при стрессе низкомолекулярных пептидов, проявляющих СОД активность. Следует отметить, что у B.trispora не обнаружена зона, соответствующая по электрофоретической подвижности Cu,Zn-СОД.

Рис.6 Обработка изозимов СОД из B.trispora, N.crassa, Saccharomyces cerevisiae и коммерческих препаратов ферментов Н2О2: (а) до обработки Н2О2 и (б) после обработки. 1, 7- B.trispora (+/-) (25 мг белка); 2, 8- N.crassa, мицелий выращенный в темноте (10 мкг белка); 3, 9- СОД из эритроцитов быка (0,05 мкг белка); 4, 10- лактатдегидрогеназа из сердца быка (65 мкг белка); 5, 11- дрожжевая алкогольдегидрогеназа (70 мкг белка); 6, 12- препарат из Saccharomyces cerevisiae (0,5 мг белка);

Препараты из N.crassа и B.trispora после разделения были подвергнуты обработке Н2О2 (рис. 6), при этом, как видно на электрофореграмме, исчезали зоны Cu,Zn-СОД из N.crassа и эритроцитов быка. После обработки Н2О препаратов из B.trispora интенсивность окраски зон на электрофореграмме не менялась, что вместе с данными ингибиторного анализа и различием в подвижности подтверждает факт отсутствия у данной культуры Cu,Zn-СОД.

Необходимо подчеркнуть, что высокая константа устойчивости комплексов Ni и Fe с 1,10-фенантролином, а также отсутствие снижения активности СОД в препаратах из B.trispora под действием перекиси водорода позволяет исключить Ni-СОД и Fe-СОД из числа возможных супероксиддисмутаз у B.trispora. В то же время на электрофореграммах белковых препаратов из (-) и (+/-) B.trispora присутствовала зона Rm=0.26. Относительная подвижность данной зоны соответствует подвижности Mn-СОД из N.crassа.

Метод выявления СОД активности в полиакриламидном геле с использованием тетразолиевого нитросинего, предложенный Beauchamp C. и Fridovich I., уже более 30 лет активно используется для выявления и идентификации различных типов супероксиддисмутаз. Однако, в наших опытах было обнаружено, что СОД-подобную активность при выявлении данным методом способны проявлять и некоторые дегидрогеназы. Как видно из рисунка 6а, ферменты лактатдегидрогеназа из сердца быка (Sigma, USA) и алкогольдегидрогеназа из дрожжей (“Reanal”, Венгрия) аналогично СОД препятствовали восстановлению тетразолиевого нитросинего до бисформазана в условиях образования супероксидных радикалов, что проявлялось на геле в виде неокрашенной зоны. Как видно на рисунке 6, в препаратах лактатдегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы нет зон, совпадающих по относительной подвижности с Cu,Zn-СОД или Mn-СОД. Известно (Красновский А.А., 1999), что все белки способны активировать дисмутацию супероксид-аниона, однако активность Cu,Zn-СОД значительно выше. Супероксиддисмутазная активность исследуемых нами дегидрогеназ проявляется на электрофореграмме при нанесении большего количества белка по сравнению с препаратом Cu,Zn-СОД из эритроцитов быка (Sigma) (рис. 6).

Важно отметить, что при обработке гелей с испытуемыми дегидрогеназами перекисью водорода СОД-подобная активность, проявляемая данными ферментами, не исчезала (рис. 6б). Этот факт объясняется тем, что использовавшиеся нами дегидрогеназы, в отличие от СОД, не содержат в активном центре металл с переменной валентностью, который при взаимодействии с перекисью водорода окисляется и, по-видимому, не способен более принимать участие в катализе.

Таким образом, зоны, получаемые при окрашивании геля с препаратами из B.trispora тетразолиевым нитросиним, могут являться не супероксиддисмутазами, а не содержащими металлов дегидрогеназами.

Известно, что на стационарной фазе роста у B.trispora происходит активный синтез -каротина и ТСК. Согласно литературным данным, мицелии (+) и (-) B.trispora отличаются друг от друга только набором ферментов синтеза ТСК, при этом только (-) штамм способен окислять 4-й атом -иононового кольца до кето группы. Различия в результате электрофоретического разделения препаратов из (+), (-) и совместного (+/-) мицелиев B.trispora может указывать на присутствие у (-) и совместного (+/-) мицелиев дегидрогеназы, осуществляющей данную реакцию. В работах Chempinski с соавторами (1996) показано, что 4-дегидрометилтриспоратдегидрогеназа из Mucor mucedo обладает молекулярной массой 33 кДа. Нами было проведено препаративное выделение белков из зоны Rm=0.52, проявляющих СОД-подобную активность, с последующим электрофоретическим разделением полученного экстракта в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата Na. Результаты электрофореза показали наличие белков с молекулярной массой в интервале 29 - 45 кДа, среди которых, по-видимому, присутствует 4-дегидрометилтриспоратдегидрогеназа.

Полученные нами данные показали, что у B.trispora, по-видимому, отсутствуют такие металлосодержащие СОД, как Cu,Zn; Fe или Ni, так как СОД-подобная активность сохранялась при концентрации фенантролина 10-5 М и в присутствии Н2О2. Предполагается, что СОД активность в препаратах B.trispora обусловлена присутствием в них ферментов дегидрогеназного типа, в том числе, возможно, 4-дегидрометилтриспоратдегидрогеназы, участвующей в синтезе ТСК.

Глава 4. НАЧАЛЬНЫЕ ЭТАПЫ СИНТЕЗА ТРИСПОРОВЫХ КИСЛОТ.

Исследование биотрансформации -каротина проводили в присутствии ферментного препарата из (+/-) мицелия B.trispora. Хроматографическое разделение продуктов метаболического превращения -каротина показало появление в инкубационной смеси соединений с Rf 0,5 и 0,3, не обнаруживаемых в контрольных пробах (ферментный препарат без -каротина и эмульсия каротина в буферном растворе). Инкубация -каротина с препаратами из отдельно растущих (+) и (-) культур приводила к образованию сходных по хроматографическим свойствам продуктов, но в меньших количествах. При использовании в качестве субстрата ретиналя синтеза каких-либо продуктов его биотрансформации в этих условиях обнаружено не было.

4.1. Обнаружение изокриптоксантина. Среди продуктов биотрансформации -каротина было обнаружено соединение с Rf 0,3 со спектром в видимой области, характерным для каротиноидов. Количество образующегося соединения составляло 0,02-0,04 мкг/мг белка за 4 часа.

Рис.7. Идентификация изокриптоксантина. а - выявление аллильной группировки:

спектр поглощения соединения с Rf 0,3 до (1) и после обработки HCl в хлороформе (2); б - масс-спектр метокси- производного соединения с Rf 0,3.

Полученное соединение в реакции с НСl в хлороформе давало базохромное смещение максимумов поглощения на 20 нм (рис.7), что указывало на присутствие аллильной группировки в структуре этого соединения и позволяло идентифицировать его как 4-окси--каротин (изокриптоксантин). Масс-спектр метокси-производного полученного соединения также указывал на присутствие гидроксильной группы. Сравнение продукта биотрансформации -каротина с синтезированным нами изокриптоксантином по спектральным, хроматографическим и химическим свойствам подтвердило их идентичность.

Таким образом, обнаружение изокриптоксантина среди продуктов биотрансформации -каротина позволяет высказать предположение о том, что синтез ТСК может начинаться с гидроксилирования -каротина.

4.2. Идентификация апокаротиналей. Исследование спектра зоны с Rf 0, выявило образование группы соединений, причем их максимумы поглощения в видимой области не разделялись. Под действием NaBH4 спектр поглощения этих соединений смещался в коротковолновую область, указывая на наличие альдегидной или кето групп в их структуре. Это позволило предположить образование апокаротиналей и апокаротинонов при биотрансформации каротина. Относительные величины оптической плотности в максимумах поглощения ТФУ-производных отдельных апокаротиналей, синтезирующихся из -каротина, представлены в таблице 5.

Рис. 8. Схема, иллюстрирующая образование апокаротиналей (а), спектр поглощения их ТФУ производных (б): 1 – -апо-13-каротинон; 2 - ретиналь; 3 - -апокаротиналь; 4 - -апо-12’-каротиналь; 5 - -апо-10’-каротиналь.

Состав апокаротиналей, полученных при инкубации -каротина в присутствии системы ксантин - ксантиноксидаза, сходен с таковым при инкубации под действием препарата из B. trispora. Низкое содержание ретиналя среди продуктов окислительного расщепления -каротина говорит о значительно большей вероятности расщепления полиеновой цепи не по центральной, а по соседним с ней двойным связям как при инкубации с ферментным препаратом из B.trispora, так и при деградации -каротина под действием АФК, создаваемых системой ксантин - ксантиноксидаза.

Соотношение максимумов поглощения ТФУ производных апокаротиналей, образовавшихся из -каротина Условия опыта Относительная величена оптической плотности Инкубация -каротина с 1,0 0,18+0,04 1,10+0,06 1,10+0,16 0,60+0, ферментным препаратом из B.trispora (n=14) Инкубация -каротина в 1,0 0,27+0,05 1,1+0,10 0,4+0,14 0,43+0, условиях генерации супероксид-анион радикала* (n=3) *Супероксидные анион-радикалы создавали в присутствии системы ксантин : ксантиноксидаза.

4.3. Биотранформация -апо-13-каротинона. Как видно из рис. 8, среди продуктов биотрансформации -каротина присутствует -апо-13-каротинон.

Ранее в опытах с культурой B.trispora было показано, что метка из -апо-13каротинона и его производных может переходить в ТСК. Учитывая это, мы исследовали превращение -апо-13-каротинона и его 4-гидрокси- производного под действием ферментных препаратов, выделенных из мицелия B.trispora в стационарной фазе роста (табл. 6).

Было обнаружено, что препараты из (-) B.trispora катализировали превращение -апо-13-каротинона в более полярное соединение с Rf 0,35, обнаруживаемое в ультрафиолете как темная зона. Образовавшееся соединение в этаноле давало поглощение с максимумом в области 328 нм и при обработке NaBH спектр смещался в УФ-область с максимумами поглощения 267 (плечо), 280 и 289 нм (рис. 9а). Характер изменения спектра соединения с Rf 0,35 при обработке NaBH4 сходен с изменением спектра 4-кето--апо-13-каротинона (рис. 10в).

Полученные данные позволяют предположить, что образовавшееся соединение с Rf 0,35 по своей структуре соответствует 4-кето- производному гипотетического предшественника ТСК.

Превращение -апо-13-каротинона и 4-гидрокси--апо-13-каротинона под действием ферментных препаратов из разных штаммов Blakeslea trispora 666 (+) (n=2) -апо-13 -каротинон не обнаружены 2, 1521 (+) (n=2) -апо-13 –каротинон не обнаружены 0, *-Соответствует 4-кето--апо-13-каротинону по хроматографическим и спектральным свойствам;

Препараты из (+) культуры B.trispora катализировали трансформацию апо-13-каротинона в соединение с Rf 0,25 и максимумом поглощения 328 нм (табл. 6, рис 10б). Меньшая подвижность продукта, получаемого с препаратами (+) культуры, указывает на более высокую полярность этого соединения по сравнению с продуктом (-) культуры. Обработка NaBH4 соединения с Rf 0, приводила к образованию соединения, сходного с получаемым при обработке NaBH4 соединения с Rf 0,35 (рис. 9а,б; 10б,в). На основании приведенных результатов можно предположить, что образующиеся из -апо-13-каротинона под действием ферментных препаратов (+) и (-) B.trispora соединения отличаются друг от друга только степенью окисленности 4 углеродного атома гидрокси группа в продукте (+) мицелия и кето группа в продукте (-) мицелия.

Рис. 9. Спектры поглощения продуктов биотрансформации -апо-13-каротинона при инкубации с ферментным препаратом из B.trispora до (1) и после (2) обработки NaBH4. а – соединение с Rf 0,35; б – соединение с Rf 0,25.

Рис. 10. Спектры поглощения -апо-13-каротинона и его производных до (1) и после (2) обработки NaBH4. а - -апо-13-каротинон; б – 4-гидрокси--апо-13-каротинон; в – 4-кето--апо-13-каротинон.

При инкубации препарата из (-) культуры с 4-гидрокси--апо-13каротиноном в качестве субстрата наблюдалось образование соединения с Rf 0,25 и спектральными свойствами, аналогичными продукту из (+) культуры.

Кроме того, при хроматографическом разделении было обнаружено соединение, по спектральным характеристикам и подвижности совпадающее с 4-кето--апо-13-каротиноном (табл.6). Эти результаты хорошо согласуются с литературными данными о наличии только у (-) штаммов ферментов, способных превращать 4-гидрокси- в 4-кето- группу.

Препараты из совместной (+/-) культуры B.trispora вызывали превращение -апо-13-каротинона в соединение с Rf 0,35 (табл. 6), как и препараты из (-)культуры.

Исследование биотрансформации -каротина и -апо-13-каротинона под действием препарата из совместной (+/-) культуры B.trispora показало, что за часа инкубации с -каротином в качестве субстрата в смеси образовывались изокриптоксантин (0,03+/-0,01мкг/мг белка) и -апо-13-каротинон (0,25+/-0, мкг/мг белка), а -апо-13-каротинон, внесенный в инкубационную смесь, превращался в 4-кето соединение (1 мкг/мг белка). Приведенные данные свидетельствуют, что в присутствии ферментного препарата биотрансформация -апо-13-каротинона происходит активнее, чем синтез изокриптоксантина из каротина.

4.4. Схема начальных этапов синтеза ТСК. На основании полученных результатов мы предположили, что синтез предшественников триспоровых кислот может осуществляться двумя путями (рис.11). Первый путь связан с ферментативным гидроксилированием -каротина по 4 углеродному атому иононового кольца с последующим несимметричным расщеплением полиеновой цепи. Второй путь обусловлен образованием -апо-13-каротинона при окислительном расщеплении -каротина в процессе его взаимодействия с АФК при окислительном стрессе. Как видно из приведенных данных, в присутствии ферментных препаратов из B.trispora окисление -апо-13каротинона протекает значительно активнее, чем гидроксилирование каротина.

Предлагаемая нами схема (рис.11) показывает, что выбор пути синтеза ТСК в культуре может определяться интенсивностью деградации -каротина.

Вероятно в отсутствии окислителей будет преобладать образование ТСК через изокриптоксантин, а при нарастании окислительного стресса и усилении окислительной деградации -каротина - через -апо-13-каротинон. Следует отметить, что в условиях деградации -каротина ретиналя образовывалось меньше, чем других апокаротиналей (рис.8). Учитывая, что у B.trispora синтез -каротина и ТСК тесно связан с процессами дифференцировки и сопряжен с увеличением уровня АФК, можно ожидать, что в этот период основная масса ТСК образуется из -апо-13-каротинона.

Окислительный Рис. 11. Гипотетическая схема начальных этапов синтеза ТСК.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование биологической роли -каротина у B.trispora показало тесную взаимосвязь выполняемых им функций: предшественника сигнальных молекул (ТСК) и антиоксиданта. Проведенная нами работа по определению роли каротина в системе АОЗ B.trispora позволила установить, что -каротин является основным активируемым при стрессе компонентом АОЗ. Активное участие каротиноидов в детоксикации АФК in vivo в условиях окислительного стресса подтверждено экспериментами на модельном объекте - E coli, несущем плазмиду со встроенными генами синтеза -каротина.

Реакция антиоксидантных ферментов на стресс у B.trispora существенно отличалась от их реакции у другого каротиноидсинтезирующего гриба N.crаssa, что позволило предположить конститутивное снижение активности СОД у B.trispora.

Полученные нами результаты электрофоретического разделения белковых препаратов из мицелия B.trispora и их сравнение с супероксиддисмутазами из N.crаssa показали наличие Mn-СОД и отсутствие Cu,Zn-СОД у B.trispora.

Полученные результаты хорошо коррелируют с данными других авторов об отсутствии Cu,Zn-СОД у дрожжей - сверхпродуцентов каротиноидов Phaffia rhodozyma и Rhodotorula mucilaginosa.

Показано, что основная СОД-подобная активность у B.trispora, повидимому, представлена несколькими не содержащими металлов ферментами дегидрогеназного типа, возможно, принимающими участие в синтезе ТСК. Это предположение подтверждается отсутствием зон Rm= 0,52 и Rm= 0,68, проявляющих СОД-подобную активность, в препаратах из (+) мицелия B.trispora, не способного превращать 4-окси группу в 4-кето.

Установлено, что синтезируемый культурой -каротин может окисляться по 4-ому атому углерода -иононового кольца с образованием изокриптоксантина, который, как мы предполагаем, является одним из возможных предшественников ТСК. С другой стороны, при взаимодействии с АФК каротин может подвергаться окислительной деградации с образованием ряда продуктов, среди которых присутствует -апо-13-каротинон. Как было нами показано, этот метаболит -каротина также может гидроксилироваться, причем реакция идет активнее, чем гидроксилирование -каротина с образованием изокриптоксантина. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от состояния культуры – в процессе роста малые количества ТСК могут образовываться через изокриптоксантин, а при окислительной деградации -каротина, сопряженной с развитием стресса, основное количество ТСК будет образовываться через -апо-13-каротинон.

Синтезируемые культурой на стадии дифференцировки ТСК выступают индукторами «сверхсинтеза» -каротина, усиливая тем самым АОЗ клетки.

Таким образом, на примере B.trispora хорошо прослеживается взаимосвязь функций -каротина как предшественника сигнальных молекул - синтез ТСК, так и роль -каротина как антиоксиданта. Потребность культуры в сверхсинтезе -каротина и его значительная роль в АОЗ клетки у B.trispora обусловлены, по-видимому, отсутствием Cu,Zn-СОД.

1. Проведено сравнительное исследование элементов системы АОЗ (СОД, каталаза, -каротин) и содержания триспоровых кислот – метаболитов -каротина у (+), (-) и совместного (+/-) мицелиев B.trispora на стационарной фазе роста, а также на разных стадиях развития (+/-) мицелия. Наиболее активно каротин и триспоровые кислоты накапливались у (+/-) мицелия при переходе к стационарной фазе роста на фоне снижения активности СОД и каталазы.

2. Исследование реакции системы АОЗ в ответ на действие света у грибов показало, что у B.trispora наблюдалось снижение активности ферментов АОЗ на фоне роста уровня -каротина, тогда как у N.crassa свет активировал СОД, каталазу и синтез каротиноидов.

3. Показано, что присутствие -каротина в рекомбинантных клетках E.coli предотвращало активацию СОД в ответ на действие стрессорных агентов.

Полученные данные подтверждают активное участие каротиноидов в детоксикации АФК в условиях окислительного стресса in vivo.

4. Электрофоретическое разделение выделенных и частично очищенных белков из B.trispora показало наличие Mn-СОД и отсутствие Cu,Zn-СОД.

5. Показано, что под действием белковых препаратов, выделенных из мицелия мукорового гриба B.trispora, -каротин окислялся по 4 углеродному атому иононового кольца с образованием изокриптоксантина – возможного предшественнника ТСК. Однако -апо-13-каротинон, образующийся в результате спонтанной окислительной деградации -каротина при окислительном стрессе, сопровождающем стационарную фазу роста, являлся более предпочтительным субстратом для гидроксилирования -иононового кольца и формирования предшественников ТСК, чем -каротин.

6. Полученные данные позволяют предположить наличие двух путей синтеза ТСК в зависимости от стадии развития B.trispora, а также показывают тесную взаимосвязь антиоксидантной функции -каротина с активацией синтеза ТСК в ходе дифференцировки.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, В.Я. Быховский, Т.А. Белозерская. Особенности антиоксидантной защиты у мукорового гриба Blakeslea trispora. Сборник трудов “Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования”.

Москва. Издательство Российского университета дружбы народов. 2001г. Т.1, стр.441-443.

- A.V. Sokolov, N.N. Gessler, V.Ya. Bykchovsky. Pathways of trisporic acids biosynthesis in Blakeslea trispora. Сборник тезисов международной конференции “Signalling systems of plant cell”. Москва. 2001г. 5-7 июня. стр. 109.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, В.Я. Быховский, Т.А. Белозерская. Активация систем антистрессовой защиты у грибов под действием света. Сборник тезисов 3-его съезда фотобиологов России. Воронеж. 2001г. 28 июня-4 июля. стр. 201.

- Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, В.Я. Быховский, Т.А. Белозерская. Активность супераксиддисмутазы и каталазы у каротиноидсинтезирующих грибов Blakeslea trispora и Neurospora crassa при окислительном стрессе. // Прикл.

биохим. микробиол., 2002, Т.38, №3, стр.237-242.

- Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская. Начальные этапы синтеза триспоровых кислот у Blakeslea trispora. // Прикл. биохим. микробиол., 2002, Т.38, №6, стр. 625-633.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, Т.А. Белозерская. Функциональная активность каротиноидов у бактерий и грибов при окислительном стрессе. Сборник докладов 6-й международной конференции “Биоантиоксидант”. Москва. 16- апреля 2002 г. стр. 540-541.

- А.В. Соколов, Н.Н. Гесслер, Т.А. Белозерская. Активность отдельных компонентов системы антиоксидантной защиты у грибов при окислительном стрессе. Сборник докладов 1-го съезда микологов России. Москва. 11- апреля. 2002 г. стр. 155.

Н.Н. Гесслер, А.В. Соколов, Т.А. Белозерская. Участие -каротина в антиоксидантной защите бактериальной клетки. // Прикл. биохим. микробиол., 2003, Т.39, №4, стр. 435-437.



 
Похожие работы:

«КАЗАКОВ Василий Иванович Ретропозоны Alu-семейства и их роль в геноме человека 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Официальные оппоненты : доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ Самойлов Владимир Олегович...»

«МУЗЫКАНТОВ Алексей Александрович АДАПТАЦИЯ МИКОПЛАЗМ (MYCOPLASMA GALLISEPTICUM S6) К НЕБЛАГОПРИЯТНЫМ УСЛОВИЯМ 03.00.04 - биохимия 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань-2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ патогенеза Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук Чернова Ольга Александровна...»

«Смирнов Иван Алексеевич Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов Специальность 03.00.24 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный...»

«ПРОВОРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты Специальность 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации, представленной в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт...»

«БАЗАНОВА Любовь Петровна ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА (YERSINIA PESTIS) И БЛОХ (SIPHONAPTERA) (на примере сибирских природных очагов чумы) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2008 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Антропогенная трансформация ландшафтов, вовлечение территорий природной очаговости чумы в хозяйственную деятельность человека, существующая угроза террористических актов с...»

«КУЛУЕВ БУЛАТ РАЗЯПОВИЧ НОВЫЕ ПРОМОТОРЫ КАУЛИМОВИРУСОВ И КОНСТРУИРОВАНИЕ ИХ ХИМЕРНЫХ ФОРМ 03.00.04 - биохимия 03.00.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2007 Работа выполнена в Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН и на кафедре биохимии и биотехнологии Башкирского государственного университета. Научные руководители Доктор биологических наук, профессор Р.И. Ибрагимов Доктор...»

«Димеева Лилия Аминовна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ ПУСТЫНЬ ПРИАРАЛЬЯ И ПРИКАСПИЯ 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 1 Работа выполнена в РГП Институт ботаники и фитоинтродукции КН МОН Республики Казахстан Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Курочкина Лидия Яковлевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна доктор географических наук,...»

«КАШТАНОВА Наталья Николаевна ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Мордовский государственный университет...»

«БЕЛЯЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА МИКРОБИОТА КИШЕЧНИКА КОРЕННОГО ЖИТЕЛЯ ЦЕНТРАЛЬНОГО ФЕДЕРАЛЬНОГО ОКРУГА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕГИОНАЛЬНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2014 Работа выполнена в Государственном Бюджетном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального Образования Тверская государственная медицинская академия Министерства...»

«ШЕСТАКОВ Игорь Евгеньевич ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ПОЧВЕННОГО ПОКРОВА г. ПЕРМИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Пермь – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пермский государственный национальный исследовательский университет. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ерёмченко Ольга Зиновьевна...»

«ДИДАНОВА ЕЛЕНА НАЖМУДИНОВНА ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И КАДАСТРОВАЯ ОЦЕНКА ПОЧВ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ КАБАРДИНО-БАЛКАРСКОЙ РЕСПУБЛИКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2008 2 Работа выполнена на кафедре почвоведения, агрохимии и физиологии растений Кабардино-Балкарской государственной сельскохозяйственной академии имени В.М. Кокова Научный руководитель : доктор...»

«Урусов Александр Евгеньевич РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ ЭКСПРЕССНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук Научные руководители: доктор химических наук, профессор...»

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И....»

«КИРСАНОВ ВЛАДИМИР ВАСИЛЬЕВИЧ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ СИСТЕМЫ МОНИТОРИНГА, УПРАВЛЕНИЯ ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТЬЮ И ПРОЦЕССАМИ БИООЧИСТКИ СТОЧНЫХ ВОД ПРЕДПРИЯТИЙ НЕФТЕХИМИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА 03.00.16 - Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Казань – 2008 1 Работа выполнена в Открытом акционерном обществе Казаньоргсинтез Официальные оппоненты : доктор технических наук, профессор Мелконян Рубен Гарегинович доктор...»

«Прутенская Екатерина Анатольевна Микробиологическая конверсия растительных отходов в гуминовые вещества 03.00.07 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и химии Тверского государственного технического университета. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Воробьева Галина Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор...»

«ФОКИНА Анна Ивановна ВЛИЯНИЕ СВИНЦА НА СТРУКТУРУ ФОТОТРОФНЫХ МИКРОБНЫХ КОМПЛЕКСОВ ПОЧВЫ 03.00.16. – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена в лаборатории биомониторинга Института биологии Коми НЦ УрО РАН и Вятского государственного гуманитарного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Домрачева Людмила Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Шиенок Александр Николаевич ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОРМОВЫХ РЕСУРСОВ ОСТРОВНОЙ ПОПУЛЯЦИЕЙ ПЕСЦА (Vulpes lagopus semenovi Ognev, 1931) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный руководитель : доктор биологических наук Крученкова Елена Павловна Официальные оппоненты :...»

«БУРЦЕВ Игорь Александрович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛНОЦИКЛОВОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ОСЕТРОВЫХ РЫБ И СОЗДАНИЯ НОВЫХ ПОРОД МЕТОДАМИ ГИБРИДИЗАЦИИ И СЕЛЕКЦИИ 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО), г. Москва Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Яржамбек Александр...»

«ФИЛИППОВ Дмитрий Андреевич СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЭКОСИСТЕМ ПОЙМЕННЫХ БОЛОТ БАССЕЙНА ОНЕЖСКОГО ОЗЕРА (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.16 – экология 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор БОЛОТОВА Наталья Львовна доктор биологических наук,...»

«ЕЛИЗАРЬЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИКА ЮЖНОГО УРАЛА OXYTROPIS GMELINII FISCH. EX BORISS. (FABACEAE) В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 2 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности в Учреждении РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.