WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Шлеева Маргарита Олеговна

ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ БАКТЕРИЙ РОДА MYCOBACTERIUM:

ПОЛУЧЕНИЕ, БИОХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РЕАКТИВАЦИИ.

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2004 1

Работа выполнена в лаборатории «биохимии стрессов микроорганизмов» Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Капрельянц Арсений Сумбатович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Озерецковская Ольга Леонидовна доктор биологических наук, профессор Эль-Регистан Галина Ивановна

Ведущая организация: Московский гГосударственный Университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет

Защита состоится «21» декабря 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » 2004г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы В научной среде давно существует предположение о том, что латентная форма туберкулеза связана с особым состоянием клеток возбудителя M. tuberculosis в организме, при котором они могут сохраняться много лет в хозяине с возможным последующим переходом в активное состояние, и, как следствие, активизацией болезни. Однако существование покоящегося состояния для микобактерий in vitro или in vivo не было экспериментально установлено. Эта проблема является общей для микробиологии, т.к.

ранее покоящееся состояние микроорганизмов связывали только со специализированными формами (спорами и цистами), образуемыми ограниченным числом бактерий. Однако сейчас становится ясно, что многие неспорулирующие бактерии, в том числе и патогенные микроорганизмы, в определенных условиях могут переходить в покоящееся состояние, оставаясь при этом жизнеспособными.

Ранее было показано, что культура М. luteus способна образовывать покоящиеся формы в длительной постстационарной фазе. Характерной особенностью таких форм является их «некультивирумость», т.е. неспособность образовывать колонии на твердых средах или размножаться в жидкой среде. Было также обнаружено, что реактивирующей покоящиеся клетки способностью обладает секретируемый в культуральную среду белок M. luteus, названный Rpf (от английского resuscitation protein factor). Согласно базам данных гомологичные гены rpf имеются в микроорганизмах рода Mycobacterium. Об этом также свидетельствуют результаты гибридизации и ПЦР со специфическими для rpf праймерами. Логично предположить, что продукты rpf-подобных генов в этих бактериях выполняют аналогичные ему функции у микрококка. В частности у M. tuberculosis имеется 5 генов и, возможно, они контролируют вход\выход клеток из покоящегося состояния.

Несмотря на значимость изучения латентности туберкулеза, экспериментальная модель получения покоящихся клеток M. tuberculosis не описана, тем более не установлена роль белков Rpf в этом процессе.

Цель и задачи исследования.

Целью работы явилось создание экспериментальной модели образования покоящихся клеток микобактерий, в том числе Mycobacterium tuberculosis и их реактивация.

В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработка метода получения покоящихся форм микроорганизмов рода Mycobacterium, в том числе Mycobacterium tuberculosis.

2. Исследование механизмов образования «некультивируемых» клеток бактерий.

3. Разработка метода реактивации покоящихся форм.

4. Исследование роли белков Rpf в процессе реактивации покоящихся клеток бактерий.

Научная новизна.

1. Впервые найдены условия, при которых культуры Mycobacterium tuberculosis, Rhodococcus rhodochrous и Mycobacterium smegmatis переходят в длительной постстационарной фазе в «некультивируемое» состояние, которое по своим параметрам соответствует покоящемуся.

2. Впервые установлено, что появление покоящихся форм сопровождается накоплением в культуральной жидкости смеси жирных кислот, основной частью которых является олеиновая кислота, в концентрациях, подавляющих размножение активных клеток.

3. Впервые установлена зависимость перехода в активное состояние покоящихся клеток M. tuberculosis от функционирования белков семейства Rpf.

Научно-практическое значение.

Созданные экспериментальные модели получения покоящихся форм микобактерий, в частности M. tuberculosis, могут быть использованы для изучения механизмов латентности туберкулеза и перехода этих бактерий к активному состоянию in vivo. Белки семейства Rpf могут быть в дальнейшем использованы в качестве новых мишеней для создания противотуберкулезных средств и разработки новых методов профилактики заболевания.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы докладывались на итоговых научных конференциях: International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology" (Пущино, 2000), школе-конференции "Горизонты физико-химической биологии" (Пущино, 2000), Society for General Microbiology-149th Ordinary Meeting. (University of East Anglia, Norwich, 2001), 10 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology ‘The World of Microbes’( Paris, 2002), 153rd meeting Society for General Microbiology (Anglia, 2003) Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 11 печатных работ, в числе которых 5 статей в российских и международных научных журналах.

Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на страницах. Список цитируемой литературы включает

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы. Обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, изложены научная новизна и практическая ценность полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы, посвященный характеристикам различных физиологических состояний бактерий, поведению микробных популяций в стационарной фазе. Отдельное внимание уделено стрессу бактерий и реакции на него, факторам, определяющим поведение бактериальной популяции в условиях недостатка питательных веществ, биохимическим изменениям бактериальной клетки в условиях голодания, выходу бактерий из покоящегося состояния, социальному поведению бактерий. Кратко описано экспериментальное изучение туберкулеза и латентности инфекции. Изложены современные представления о генетической регуляции переживания бактериальными клетками неблагоприятных условий.

Во второй главе представлены методы и материалы исследования.

Выращивание бактериальных культур Mycobacterium tuberculosis штамм «Академия» выращивали при 37оС в стеклянных пробирках, содержащих 2 мл среды Сатона, к которой был добавлен БСА (бычий сывороточный альбумин, 5 фракция), глюкоза и NaCl. Культуры выдерживали в постстационарной фазе при 37оС в течение 8-ми месяцев.

Rhodococcus rhodochrous, штамм NCIMB 13805, выращивали аэробно при 37 °C в колбах при перемешивании (125 мл среды в колбах объемом 750 мл, скорость перемешивания rpm) в богатой питательной среде broth E (Lab M) или модифицированной среде Сатона.

Mycobacterium smegmatis (штамм mc2155) выращивали первоначально в течение 30 ч при 37 °C на орбитальной качалке (250 rpm) в 150 мл богатой среды Broth E (LabM), к которой был добавлен 0.05% (v/v) твин-80. Затем бактерии были пересеяны в модифицированную среду Hartman’s-de Bont (mHdeB).

Оценка жизнеспособности клеток. Суспензию бактериальных клеток последовательно разводили в свежей среде и затем 100 мкл из каждого разведения высевали на агаризованную среду Сатона. Предел обнаружения колониеобразующих единиц (КОЕ) составлял 5.100 мл-1.

Общее число клеток в миллилитре культуры оценивали при помощи камеры Helber по формуле n/5. 108, где n - среднее количество клеток в одном малом квадрате.

Сканирующая электронная микроскопия.

Клетки были зафиксированы в 3% глутаровом альдегиде с последующей обработкой 0. М Na-какодилатном буфере (pH 7.2). Пробы были высушены на воздухе, после чего производили напыление Au частицами размером 20 нм. Микроскопия осуществлялась при использовании сканирующего электронного микроскопа GSM-840A (Япония).

Иммуноферментный анализ.

Бактериальный супернатант (0.2 мл) был помещен в пластиковые планшеты (Costar).

Затем лунки промывали PBS-T (фосфатный буфер, содержащий 0.05% твина-80).

Первичные анти-Rpf антитела кролика были добавлены в разведении 1:10.000. После промывки PBS-T были добавлены вторичные антитела (анти-кроличий алкалинфосфатазный коньюгат (Sigma, 1:5.000). Затем, после очередного цикла промывки PBS-T был добавлен субстрат щелочной фосфатазы ( таблетка п-нитрофенилфосфата - Sigma).

Интенсивность окраски определяли сканированием планшетов при 405 нм (Labsystem optical reader). Для калибровки метода использовали различные концентрации рекомбинантного белка Rpf в соответствующей культуральной среде.

Гель – фильтрация супернатанта с ингибирующей активностью.

Гель-фильтрацию проводили при низком давлении на носителе Bio-Gel P-2 (Bio-Rad) с областью фракционирования 0.1 – 1.8 кДа. Общий объем колонки составил 175 мл, нулевой объем – 65 мл. Скорость эллюции = 25 мл\ч. Объем пробы (лиофильно сконцентрированный в 8 раз СН с ингибирующей активностью) = 3.5 мл. Объем каждой фракции составил 5 мл. Для калибровки колонки использовали миоглобин, НАДФ, ФМН, триптофан.

Гидрофобная хроматография.

модифицированной агарозе «Octyl-Sepharose CL-4B» (Pharmacia). Перед использованием колонку (объемом 5 мл) промывали последовательно водой (один объем колонки), таким же объемом этанола, двумя объемами бутанола, затем в обратном порядке этанолом и водой. После этого колонку уравновешивали 0.025 М Na-фосфат-цитратным буфером.

Скорость промывки составила 25 мл\см2.ч. Ступенчатую элюцию вели с помощью воды, этанола и ацетонитрила. Колонку предварительно уравновешивали водой. Затем начали подавать этанол (один объем колонки), затем колонку снова уравновешивали водой, после чего элюцию вели ацетонитрилом (один объем).

Тонкослойная хроматография (ТСХ).

ТСХ фракции с ингибирующей активностью, полученной после гидрофобной хроматографии, проводили на силикагеле 60 F254 (Merk, Германия) в системе: хлороформметанол-конц.аммиак (65:35:5) в течение часа при температуре 20-25°C..

Двумерная хроматография ингибирующей фракции после очистки на октил-сефарозе супернатанта M. smegmatis в системах - хлороформ:метанол:аммиак = 65:35:5 и хлороформ:метанол:ацетон:уксусная кислота:вода = 5:1:2:1:0,5.

Хроматограммы проявляли опрыскиванием водой. В результате получали индивидуальное пятно, которое экстрагировали из силикагеля ацетонитрилом.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР).

Спектры ЯМР в препаратах ИВ, предварительно очищенного при ТСХ и затем растворенного в дейтерированном метаноле, регистрировали на спектрометре Varian HAD (рабочая частота спектрометра 100 мгГц). Для повышения отношения сигнал\шум использовали накопитель спектров С-1024. Все спектры ЯМР снимали при температуре образцов 34°C. Стабилизация резонансных условий осуществляли по сигналу Н2О, присутствующей в небольшом количестве в дейтерированном метаноле. Для калибровки амплитудных интенсивностей пиков в спектрах ЯМР различных образцов использовали один и тот же внешний эталонный образец раствора гексаметилдисилоксана (ГМДС) в четыреххлористом углероде в отношении 1:50. Химические сдвиги в спектрах ЯМР измеряли от линии Н2О и пересчитывали на ГМДС.

В третьей главе представлены собственные результаты.

Получение «некультивируемых» форм микроорганизмов семейства Nocardiaceae.

Был проведен скрининг сред и условий культивирования для получения покоящихся форм микобактерий. В результате нами были подобраны условия, при которых культуры Mycobacterium tuberculosis (рис.1), Rhodococcus rhodochrous (рис.2) и Mycobacterium smegmatis (рис.3) могли переходить в покоящееся состояние.

В качестве критерия образования покоящихся клеток была выбрана способность культивирования бактерий на твердых средах. Ранее на M. luteus было обнаружено, что появление покоящихся форм коррелирует с резким снижением способности образовывать колонии на твердых средах при снижении уровня метаболизма, сохранении общего числа клеток (ОЧК) и целостности мембраны.

В результате срининга различных условий было найдено, что образование «некультивируемых» форм исследуемых бактерий наблюдается в стационарной фазе, если до этого клетки росли длительное время при неблагоприятных условиях выращивания в логарифмической фазе. К таким условиям относятся: неоптимальный состав среды роста, сниженный кислородный режим.

Переход клеток в «некультивируемое» состояние зависит от совокупности факторов, таких как возраст инокулята, постоянства рН, различные типы голодания, состав среды роста, кислородный режим. Даже небольшие изменения в условиях культивирования приводят к очень значительным изменениям в поведении культуры в стационарной фазе.

Например, для образования «некультивируемых» клеток M.smegmatis возраст инокулята, как оказалось, должен быть около 30 ч, инокуляты в возрасте 24, 72 ч практически использовании полной среды значительного снижения КОЕ не наблюдалось (рис.5).

Для перехода клеток непатогенного штамма M. tuberculosis (штамм «Академия») в покоящееся состояние культуру продолжали инкубировали в стационарной фазе при 37°С в течение 8 месяцев без доступа кислорода. При этих условиях после 3,5 – 4 месяцев культивирования наблюдалось появление покоящихся форм, некультивируемых на плотных средах (рис.1). Было установлено, что "некультивируемые" клетки представлены небольшими овоидными и коккоидными формами (0,6-0,8 мкм)( рис.6) с неповрежденной клеточной стенкой и с дыхательной активностью близкой к нулю.

Рис.1.Образование «некультивируемых» клеток Рис. 2.Изменение числа колониеобразующих единиц Число бактерий\мл

КОЕ КОЕ

Рис.3. Образование покоящихся форм Mycobacterium Рис.6. Сканирующая микроскопия покоящихся КОЕ кл\мл КОЕ кл\мл КОЕ кл\мл Образование «некультивируемых» форм у мутантных клеток М.smegmatis.

Из выше приведенных данных можно предположить, что при субоптимальных условиях роста клетки переходят в некое определенное состояние, в котором они как бы синхронизируются с кажущейся потерей культивируемости. Если это предположение верно, то и другие комбинации неблагоприятных для развития популяции условий могут привести к образованию покоящихся форм. Мы исследовали некоторые мутантные штаммы Mycobacterium smegmatis, в которых методом транспозонного мутагенеза были заблокированы гены пуринового метаболизма (purF) или двухкомпонентной регуляторной системы (devR), что приводило к уменьшению выхода биомассы. Эти мутанты показали значительное временное снижение КОЕ в процессе роста на немодифицированной HdeB среде в анаэробных условиях. Общее количество клеток не менялось в культурах мутантов, что позволяет отнести эти бактерии со сниженным количеством КОЕ к «некультивируемым». Через некоторое время КОЕ восстанавливалось до исходного уровня. В присутствии кислорода подобного поведения мутантных клеток не наблюдали (рис.7 А, Б). При этом дикий тип, растущий в анаэробных и аэробных условиях? не проявил подобного фенотипа, т.е. уменьшения КОЕ не наблюдалось (рис.7 В). В данном случае для получения «некультивируемых» форм необходимо сочетание анаэробиоза и повреждение функционирования некоторых генов.

микроорганизмов семейства Nocardiaceae в стационарной фазе общим является необходимость культивирования клеток при сочетании неоптимальных условий роста, переход в «некультивируемое» состояние чувствителен ко многим факторам, таким как возраст инокулята, постоянство рН, различные типы голодания, состав среды роста, кислородный режим, некоторые мутации.

Рис.7. Поведение мутантов M. smegmatis (DevR и purF) в стационарной фазе КОЕ кл\мл Изучение ингибирующего вещества, накапливающемся в культуральной жидкости бактерий при переходе в «некультивируемое» состояние.

При изучении процесса образования покоящихся форм M. smegmatis и R. rhodochrous было обнаружено низкомолекулярное вещество (ИВ), обладающее ингибиторным действием на рост активных бактериальных клеток. Накопление этого вещества в среде выращивания сопутствует снижению способности клеток образовывать колонии. В активных культурах оно практически не обнаруживается. Можно было предположить, что это вещество каким-то образом участвует в образовании «некультивируемых»

клеток. При тестировании активности выяснилось, что как у родококка, так и у M.

неактивному состоянию, а затем его распад после наступления фазы с минимальным КОЕ. Методом ультрафильтрации было установлено, что масса ИВ находится в районе 500 – 1000 Да. Гель-фильтрация на Bio-Gel P-2 показала, что масса этого вещества Рис.8. Гель фильтрация (BioGel P-2) концентрированного супернатанта Rhodococcus rhodochrous с ингибирующей активностью Хранение супернатантов, содержащих ингибирующее вещество, при +4С показало, что активность сохраняется долгое время (примерно 1 месяц).

Данное вещество обладает гидрофобными свойствами. При тестировании его активности необходимо рассчитывать его концентрацию не на единицу объема, а на единицу клеток.

Первый этап очистки – пропускание супернатанта через октил-сефарозу (снимаем этанолом), затем используем метод тонкослойной хроматографии в системе хлороформметанол-конц.аммиак (65:35:5). Хроматограммы проявлялись опрыскиванием водой. В результате мы получаем индивидуальное пятно (рис.9), которое экстрагируем из силикагеля ацетонитрилом.

Рис.9.Тонкослойная хроматография фракции с ингибирующей активностью на силикагеле Небольшая масса исследуемого вещества и наличие гидрофобных свойств позволило предположить, что оно может относиться к классу липидов. Для проверки этого предположения была проделана серия анализов по выявлению структуры этого вещества.

Анализ ЯМР и ИК спектров показало, что алифатические соединения неизопреноидной природы, обладающие карбониловой группой и 1-2 ненасыщенными связями, являются основными веществами препарата.

Анализ двумерных Н-Н (рис.10А) и Н-С (рис.10Б) спектров ЯМР показал наличие в препарате определенных последовательностей, характерных для мононенасыщенных жирных кислот:

--С==С130--С28 —С33— и С179—С36,4—С26—[С30]n—СН Цифрами обозначены химические сдвиги Рис.10. Двумерные спектры ЯМР ингибитора, выделенного из супернатанта M.

smegmatis По результатам масс-спектрометрии было получено, что изучаемый препарат является смесью жирных кислот, при этом доминирующей ЖК у M. smegmatis является олеиновая (рис.11).

Рис.11. Масс-спектроскопия ингибитора, выделенного из супернатанта M.

smegmatis При сравнительном анализе спектров ЯМР ИВ из M. smegmatis и олеиновой кислоты (оба вещества были предварительно пропущены через колонку с октил-сефарозой, а затем очищены при помощи ТСХ на силикагеле-60) было обнаружено, что оба соединения имеют похожие спектры (рис.12).

Рис.12.Спектры ЯМР олеиновой кислоты и ингибитора из M. smegmatis Олеиновая кислота ингибитор По результатам биологического тестирования ингибирующей активности этих веществ было получено, что оба соединения замедляют рост клеток при одних и тех же концентрациях (действующая концентрация на 105 клеток = 5 мкг\мл).

При добавлении в супернатант БСА, который как известно, эффективно связывает ЖК, ингибирующая активность исчезала. Таким образом, ИВ, появляющееся в супернатантах культур при переходе клеток в «некультивируемое» состояние, относится к жирным кислотам.

Восстановление покоящихся форм.

Для доказательства способности клеток образовывать покоящиеся формы абсолютно необходимым является демонстрация способности таких клеток к восстановлению метаболизма и способности к делению. Ранее нами было установлено, что реактивация покоящихся клеток M.luteus было успешной, если ее проводить в жидкой среде. Для этого мы использовали метод конечных разведений (МКР), который позволяет одновременно проводить реактивацию в жидкой среде и оценивать количество жизнеспособных бактерий в исходной культуре. Это помогало при определении численного значения реактивированных клеток и в решении проблемы остаточной выживаемости при проведении реактивации. Было выяснено, что, как и в случае с M.luteus, восстановление жизнеспособности исследуемых в данной работе клеток происходит, если в качестве жидкой среды для реактивации использовали супернатанты, полученные при фильтровании культур Rhodococcus rhodochrous, М.tuberculosis и M.smegmatis в логарифмической фазе. Супернатанты применяли в качестве среды для определения жизнеспособности методом конечных разведений. В этом случае число жизнеспособных бактерий увеличивалось на 4-7 порядков, приближаясь к общему числу клеток, подсчитанному микроскопически (рис.13).

Рис.13. Количественная оценка оживления некультивируемых форм методом МКР Анализируя супернатант активно растущих клеток было обнаружено, что пропускание его через аффинную колонку, содержащую антитела, выработанные против Rpf, его оживляющая активность заметно снижалась, что указывает на природу активного вещества, имеющую сходство с Rpf. Другие свойства активного начала в супернатанте также свидетельствовали в пользу белковой природы стимулятора (табл1).

Таблица 1. Влияние различных обработок на оживляющую активность полученного из логарифмической культуры R. rhodochrous аффинную колонку Для доказательства того, что определяющим в восстановлении клеток у микобактерий являются Rpf-подобные факторы, были исследованы специфические трансформанты M.

smegmatis. Эти трансформанты (pAGR и pAGMo) содержали плазмиду с включенным геном Rpf M. luteus под контролем собственного промотора (pAGR) или ацетамидного промотора (pAGMo). В обычных аэробных условиях при росте на полной среде Сатона поведение трансформированных культур не отличалось от дикого типа.

В аэробных условиях на модифицированной среде эти трансформанты, так же как и дикий тип, показали значительное снижение КОЕ. Однако при оживлении наблюдались отличия от дикого типа. Для pAGR и pAGMo было характерно самооживление на 4-6 день (увеличение ОD), в то время как pAGH (трансформант с контрольной плазмидой) и дикий тип никакого увеличения OD не показали.

«некультивируемых» клеток M. smegmatis, супернатантов M. smegmatis и культивированного совместно с M. luteus OD, 600 нм супернатантах культур различных штаммов, показал, что имеется максимум накопления этих белков в логарифмической фазе (рис.15). В то время как концентрации Rpf-подобных белков для штаммов, содержащих плазмиды pAGMo и pAGH (контрольный вектор), были равны, в супернатанте штамма, содержащего плазмиду pAGR, образовывалось больше этих белков, что, вероятно, отражается на процессе активации покоящихся форм.

Для «некультивируемых» форм M. tuberculosis, в отличие от дикого штамма быстрорастущих микобактерий, было характерно наличие самооживления в жидкой среде, т.е. активация клеток проходила в жидкой среде без каких-либо добавок (рис.16).

исследованы мутанты M. tuberculosis, у которых были заблокированы путем аллельного обмена по три Rpf-подобных гена. Эти мутанты, так же как и дикий тип образовали «некультивируемые» формы. Однако, они оказались не способны к самовосстановлению, в отличие от дикого типа (рис.16), что подтверждает роль белков Rpf в реактивации покоящихся клеток M. tuberculosis.

Рис.16. Поведение мутантов M. tuberculosis по генам Rpf при оживлении из «некультивируемого» состояния.

Rv0867+ Rv Rv0867+ Rv Таким образом, нам впервые удалось установить зависимость перехода в активное состояние покоящихся клеток M. tuberculosis от функционирования белков семейства Rpf.

ОБСУЖДЕНИЕ

Несмотря на довольно большое количество экспериментально зарегистрированных продемонстрирована обратимость этого процесса, т. е. способность «некультивируемых»

форм к переходу в активное, делящееся состояние. Однако, если такая обратимость не доказана, подобные клетки должны рассматриваться как нежизнеспособные. При отсутствии оживления ставится под сомнение микробиологическое и медицинское значение таких форм.

В нашей работе мы разработали методы для получения и оживления «некультивируемых»

клеток M. tuberculosis, R. rhodochrous и M. smegmatis, относящихся к Г-Ц - богатым бактериям. Однако имеется существенное различие между «некультивируемыми»

клетками R. rhodochrous, M. smegmatis и M.tuberculosis в их способности к реактивации.

Для первых двух культур необходимым условием реактивации «некультивируемых»

клеток являлось добавление в среду восстановления супернатанта, полученного из активно растущих клеток, или белка Rpf. В то время как в случае с M. tuberculosis происходило существенное увеличение числа жизнеспособных клеток (до 5 порядков) при культивировании клеток на свежей среде Сатона без специальных добавок (рис.13).

Возможно, это свойство возбудителя туберкулеза как-то связано с его способностью к длительной персистенции в организме хозяина и реактивации туберкулеза.

Очевидно, действующим началом, способствующим реактивации микобактерий, является белок, сходный с ранее обнаруженным в супернатанте M.luteus, белком Rpf. Об этом свидетельствуют результаты экспериментов с клетками M. tuberculosis с нокаутированными генами Rpf. Этот вывод представляется существенным для понимания механизмов персистенции возбудителя туберкулеза и патогенеза латентных форм туберкулеза.

1) Впервые обнаружено, что при культивировании в длительной стационарной фазе «некультивируемые» формы, которые по своим характеристикам могут быть отнесены к покоящимся. Необходимым фактором перехода клеток в неактивное неблагоприятных факторов (различные типы голодания, недостаток кислорода).

2) При образовании «некультивируемых» форм в среде выращивания обнаружено появление смеси свободных жирных кислот, среди которых преобладает олеиновая кислота. Возможно, что накопление жирных кислот является одним из факторов образования покоящихся клеток при адаптации микобактерий к субоптимальным условиям роста.

3) «Некультивируемые» клетки M. smegmatis и R. rhodochrous могут быть реактивированы в жидкой среде в присутствии белка Rpf или веществ(а) содержащихся в супернатанте активно растущих клеток, близких к Rpf.

4) «Некультивируемые клетки» трансформанта M. smegmatis, продуцирующего секретируемую форму Rpf, способны к самовосстановлению.

5) «Некультивируемые» клетки M. tuberculosis дикого типа способны к самовосстановлению в жидкой среде. Клетки, содержащие по три одновременно инактивированных гена Rpf (Rv0867+Rv1884+Rv1009 и Rv0867+Rv1884+Rv2389) теряют споcобность к самовосстановлению, что подтверждает роль белков Rpf в оживлении покоящихся клеток M. tuberculosis.

Cписок статей 1. M. O. Shleeva, K. Bagramyan, M. V. Telkov, G. V. Mukamolova, M. Young, D. B. Kell and A. S. Kaprelyants. Formation and resuscitation of “non-culturable” cells of Rhodococcus rhodochrous and Mycobacterium tuberculosis in prolonged stationary phase. (2002). Microbiology UK, 148, 1581-1591.

2. M.O. Шлеева, Г.В. Мукамолова, М.В. Телков, T.Л. Березинская, A.В. Сыроешкин, С.Ф. Бикетов, A.С. Капрельянц. Образование «некультивируемых» клеток Mycobacterium tuberculosis и их оживление.(2003).Микробиология,Т.72, стр. 76-83.

3. Матвеева И.С., Плетенева Т.В., Березинская Т.Л., Аветисян А., Шлеева М. О., Капрельянц А.С., Лебедев И.М., Колесников М.Н., Бикетов С.Ф., Фролов В.А., характеристика вида и физиологического состояния. Микроэлементы в медицине.

4. Kuznetsov BA, Davydova ME, Shleeva MO, Shleev SV, Kaprelyants AS, Yaropolov AI.(2004) Electrochemical investigation of the dynamics of Mycobacterium smegmatis cells' transformation to dormant, nonculturable form. Bioelectrochemistry.

Sep;64(2):125-31.

5. Shleeva M, Mukamolova GV, Young M, Williams HD, Kaprelyants AS. Formation of 'non-culturable' cells of Mycobacterium smegmatis in stationary phase in response to growth under suboptimal conditions and their Rpf-mediated resuscitation. Microbiology.

Jun;150(Pt 6):1687-97.

Тезисы конференций 1. A.Kaprelyants, G.Mukamolova, M.Shleeva, D.Kell, M.Young."Non-culturable" bacteria.

The role of bacterial cytokines in resuscitation( 2000) Abstracts of International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Puschino, p.53.

2. M.Telkov, M.Shleeva, K.Bagramyan et al. In vitro model of "nonculturable" Mycobacteria and their resuscitation with bacterial cytokines of Rpf family.

(2000)Abstracts of International symposium "Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology". Puschino, p.126.

некультивируемых (покоящихся) форм микроорганизмов рода Микобактерии.

биологии". Пущино, стр.215.

4. M.O. Shleeva, G.V. Mukamolova, K. Bagramyan, M.V. Telkov, D.B. Kell, M.Young, A.S. Kaprelyants. Formation and resuscitation of "non-culturable" mycobacteria in stationary phase.(2001). Abstracts of Society for General Microbiology-149th Ordinary Meeting. University of East Anglia, Norwich, p.44.

5. M. Shleeva. Cultivation of Mycobacteria under non-optimum conditions in logarithmic phase results in formation of ‘non-culturable’(dormant) cells in stationary phase.(2002).Abstracts of 10 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology ‘The World of Microbes’, Paris, p. 233.

6. Obolbek A. Turapov, Margarita O. Shleeva, Galina V. Mukamolova, Danielle I. Young, Arseny S. Kaprelyants, Michael Young, PBMG 27 Rpf-mediated resuscitation of stressed mycobacteria. Abstracts of 153rd meeting Society for General Microbiology. (2003).p.



 


Похожие работы:

«ЕФИМОВА Мария Александровна БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ VACCINIUM MYRTILLUS L. И VACCINIUM VITIS-IDAEA L. В ЕСТЕСТВЕННЫХ И АНТРОПОГЕННО НАРУШЕННЫХ ЛЕСНЫХ СООБЩЕСТВАХ КОЛЬСКОГО ПОЛУОСТРОВА 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 Работа выполнена в Лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук,...»

«БЕРНИКОВ Кирилл Александрович Фауна и экология рукокрылых (Chiroptera) равнинной тайги Западной Сибири (на примере Ханты-Мансийского автономного округа) Специальность 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии ГОУ ВПО Сургутский государственный университет ХМАО – Югры. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Стариков Владимир Павлович...»

«Брагина Евгения Васильевна Вокальная коммуникация стерха Grus leucogeranus и даурского журавля G.vipio: разнообразие репертуара, половые и индивидуальные особенности 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Диссертация выполнена на кафедре зоологии позвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Сумина Ольга Ивановна ФОРМИРОВАНИЕ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ТЕХНОГЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ КРАЙНЕГО СЕВЕРА РОССИИ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена на кафедре геоботаники и экологии растений Санкт-Петербургского государственного университета Официальные оппоненты : доктор биологических наук Матвеева Надежда Васильевна доктор биологических наук Капелькина Людмила Павловна доктор...»

«Чимитдоржиева Эржена Очировна ЗАПАСЫ УГЛЕРОДА В ЧЕРНОЗЕМАХ И КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ И ЭМИССИЯ СО2 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2011 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«СУДНИК Светлана Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРАТЕГИЙ КРЕВЕТОК 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград - 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Буруковский Рудольф Николаевич Официальные...»

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«Назарова Орзугуль Домулоджановна ЭКОЛОГИЯ СЕРОЙ КРЫСЫ (RATTUS NORVEGICUS BERKENHOUT, 1769) В ГИССАРСКОЙ ДОЛИНЕ ЦЕНТРАЛЬНОГО ТАДЖИКИСТАНА специальность 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 1 Работа выполнена в лаборатории природных очагов болезней Научно-производственного предприятия Биологические препараты Таджикской Академии сельскохозяйственных наук Научный руководитель : доктор биологических...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«Феоктистов Александр Сергеевич Распределение лектинов в талломе листоватых лишайников в связи с особенностями их морфоструктурной организации Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Диссертационная работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова...»

«Целоусова Ольга Сергеевна РОЛЬ ГЕНОВ СИСТЕМ ПРОТЕОЛИЗА И МЕДИАТОРОВ ВОСПАЛЕНИЯ В ФОРМИРОВАНИИ ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТИ К ХРОНИЧЕСКИМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ ОРГАНОВ ДЫХАНИЯ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук УФА - 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН доктор медицинских наук, профессор Научный руководитель : Викторова Татьяна Викторовна доктор...»

«СИМОНОВ Евгений Петрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ПЕРИФЕРИЙНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ОБЫКНОВЕННОГО ЩИТОМОРДНИКА (GLOYDIUS HALYS (PALLAS, 1776)) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Горюнова Юлия Дмитриевна ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СОДЕРЖАНИЕ В РАСТЕНИЯХ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТОВ Специальность 03.00.16 – Экология 03.00.12 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград – 2009 Работа выполнена в Российском государственном университете имени Иммануила Канта. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Чупахина Галина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«Каюкова Светлана Николаевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА OROSTACHYS FISCH. В ВОСТОЧНОМ ЗАБАЙКАЛЬЕ 03.00.05 - ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 Работа выполнена в Забайкальском государственном гуманитарнопедагогическом университете им. Н.Г. Чернышевского доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Бэлла Иванова Дулепова Официальные оппоненты : Татьяна Петровна Анцупова, доктор...»

«Жмылёва Александра Павловна Влияние экологических факторов на время зацветания лесных растений средней полосы России 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 2 Диссертационная работа выполнена на кафедре системной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Карпухина Е.А. Официальные оппоненты : доктор...»

«ПОЛЕНОГОВА Ольга Викторовна ВИРУСОНОСИТЕЛЬСТВО И ПРОЯВЛЕНИЕ ПОЛИЭДРОЗА У НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (Lymantria dispar L.) 03.02.05. - энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный доктор биологических наук руководитель: Ильиных Александр Васильевич...»

«Меркулова Ольга Сергеевна ЛИШАЙНИКИ СТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮЖНОГО УРАЛА И ПРИЛЕГАЮЩИХ ТЕРРИТОРИЙ 03.00.24 — Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2006 Работа выполнена в Лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи УрО РАН. Научный руководитель : кандидат географических наук Урбанавичюс Геннадий Пранасович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Голубкова Нина Сергеевна...»

«САИДОВ АБДУСАТТОР САМАДОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРЫЗУНОВ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 03.02.04 - зоология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Душанбе – 2011 Работа выполнена в Отделе экологии наземных позвоночных животных Института зоологии и паразитологии им. Е.Н.Павловского Академии наук Республики Таджикистан Научный консультант : академик АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук,...»

«МАРТЫНОВА Кристина Владимировна СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОРОТКИХ ГЛИЦИН- И ПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ПЕПТИДОВ 03.00.23 – биотехнология 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии Московской государственной академии тонкой химической технологии им. М.В. Ломоносова и в Отделе химии физиологически активных веществ Учреждения Российской академии наук Института...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.