WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ПЕГАСОВА ТАТЬЯНА ВЛАДИМИРОВНА

СТРУКТУРА ЛАККАЗЫ ИЗ CORIOLUS HIRSUTUS И

СТРОЕНИЕ ЕЕ АКТИВНОГО ЦЕНТРА

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2004

Работа выполнена в ВНК “Ферментативные основы биодеградации” Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, О.В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Р.А. Звягильская кандидат физико-математических наук, И.Н. Цыганник

Ведущая организация:

Химический факультет Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится «8»_ июня 2004 г. в «_ 11 _»

часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп.1.

Автореферат разослан «_4_»мая_ 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

Общая характеристика работы

.

Актуальность проблемы. В настоящее время ферментные препараты находят широкое примение в различных отраслях промышленности и сельского хозяйства, медицине и ряде других областей. Практический интерес к изучению ферментов продиктован прежде всего их каталитическими характеристиками:

активностью и специфичностью действия. Лакказа (КФ 1.14.18.1) является одной из наиболее просто структурно организованной медьсодержашей оксидазой, активный центр которой представлен ансамблем из четырех ионов меди. Лакказа обладает способностью катализировать окисление различных соединений, включая o,п-дифенолы, аминофенолы, полифенолы, полиамины, некоторые неорганические ионы и арилдиамины с сопутствующим восстановлением молекулярного кислорода до воды. Уникально широкая субстратная специфичность, которую можно увеличить использованием редокс-медиаторов, биоэлектрокаталитические свойства, высокая стабильность, использование кислорода в качестве второго субстрата, обуславливают перспективность использования лакказы в прикладных биотехнологиях.





Следует отметить, что их крупномасштабное практическое использование ограничено, несмотря на наличие ряда рекомбинантных лакказ. Очевидно, отсутствие установленого механизма действия фермента и взаимосвязи его структурных и каталитических особенностей ограничивает эффективное использование лакказы в биотехнологии.

Лакказы, впервые открытые более столетия назад, остаются предметом как фундаментальных, так и прикладных исследований. В настоящее время получено четыре пространственные структуры нативных гликозилированных лакказ. Однако, полученные данные оказались недостаточны для решения ключевых вопросов, связанных с механизмом катализа. Остался неясным механизм генерации окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) Т центра на структурном уровне, определяющий эффективность катализа. На основании структурных данных не выяснена роль и структура отдельных интермедиатов в процессе катализа и условия их взаимных переходов, и как следствие, не предложен механизм восстановления кислорода в трехъядерном медном кластере и роль отдельных медных центров (Т2 и Т3) в этом процессе.

Таким образом, для установления взаимосвязи структуры лакказ и их высокоредокспотенциальных лакказ и их основных каталитических особенностей.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение структуры высоко редокспотенциальной лакказы из Coriolus hirsutus и строения ее активного центра.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определение аминокислотной последовательности данного фермента.

2. Исследование структуры фермента и его активного центра при температурнофазовых переходах.

3. Определение по дифракционным данным кристаллической структуры белка.

Научная новизна.

Разработан протокол очистки лакказы из Coriolus hirsutus методом последовательность лакказы из Coriolus hirsutus 072 по нуклеотидной последовательности кДНК. Показано, что лакказа существует в растворе в виде мономеров и димеров (соотношение 85% – 15%). Установлено, что при размораживании препарата фермента происходит процесс конформационной каталитической активности. Найдены условия роста монокристаллов лакказы из Coriolus hirsutus 072. Собран набор дифракционных данных с разрешением 1.85. Структура лакказы решена методом молекулярного замещения и уточнена до R-фактора 18.15%. Впервые получена структура нативного интермедиата, содержащего в центре трехъядерного кластера дополнительный спектроскопических данных предложен механизм восстановления молекулярного кислорода в процессе ферментативного катализа.





Практическая ценность работы. Полученная впервые структура “нативного интермедиата” лакказы может быть использована для уточнения каталитического механизма действия фермента и для установления взаимосвязи структура-функция. Установленная взаимосвязь структуры фермента и его функций даст возможность не только повысить эффективность его практического использования, но и откроет возможности для получения рекомбинантных ферментов с заданными свойствами путем использования направленного точечного мутагенеза.

Объем работы. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав собственных исследований и обсуждения полученных результатов, выводов, содержит 14 таблиц, 36 рисунков. Список использованной литературы включает 125 наименований.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 3-м Биохимическом Съезде (Россия, С.-Петербург, 2002 г.), конкурсе на стипендию имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича (Россия, Москва, ИНБИ РАН, 2003 г.), 10й Молодежной научной конференции “Актуальные проблемы биологии и экологии”, (Россия, Сыктывкар, 2003 г.), II-м Московском международном Конгрессе “Биотехнология: состояние и перспективы развития”, (Россия, Москва, 2003 г.), 5-й Международной конференции по молекулярной и структурной биологии, (Австрия, Вена, 2003 г.).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 6 тезисов.

Ранее было показано, что C. hirsutus 072 синтезирует две изоформы (С1, С2) лакказы при росте на пептонно-глюкозной среде в условиях глубинного культивирования. Следует отметить, что данные изоформы практически всегда присутствовали в препаратах фермента на различных стадиях очистки в соотношении по белку С1:С2 – 83:17 и имели близкие изоэлектрические точки, лежащие в кислой области рН. Однако, в отличие от большинства изоферментов, синтезируемых базидиальными грибами, возбудителями “белой гнили”, более каталитически активная изоформа С1 синтезировалась и в большем количестве. Это позволило нам использовать ее для изучения трехмерной структуры фермента и для исследования механизма его действия.

Согласно мнению ряда авторов трудности получения фермента в кристаллическом состоянии вызваны рядом причин, одной из которых является кристаллизации лакказы, Piontek K. с соавторами (2002) считают использование метода изоэлектрофокусирования для очистки фермента.

Для проверки данного предположения для очистки и выделения в ионообменную хроматографию (заключительная стадия – высокоэффективная жидкостная хроматография), изоэлектрофокусирование и препаративный электрофорез. Очистка по протоколу, включающему последовательные стадии ионообменной хроматографии, позволила достичь разделения изоферментов только на заключительной стадии – ВЭЖХ. Контроль чистоты объединенных гомогенность данной изоформы после очистки данным методом (так как практически идентичны, на рис. 1 приведена лишь одна электрофореграмма).

Очистка ферментного препарата методом изоэлектрофокусирования в широком и узком градиенте рН имела свои особенности. Использование ультрафильтрации через мембраны с отсечением 10 кДа позволило удалить Изоэлектрофокусирование в широком градиенте рН показало присутствие белков, не обладающих ферментативной активностью, с изоэлектрическими точками в нейтральном диапазоне рН. Для получения гомогенного изофермента лакказы, проводили ре-изоэлектрофокусирование фракций, обладающих лакказной активностью. После повторного изоэлектрофокусирования в узком градиенте рН был получен лишь один изофермент С1, гомогенность которого подтверждалась электрофорезом в ПААГе в денатурирующих условиях.

изоферментов был использован впервые (рис.2). Предполагалось, что в условиях проведения препаративного электрофореза (рН 8.6) лакказа может практически полностью потерять ферментативную активность. Действительно, при определении ферментативной активности отдельных фракций после очистки этим методом, абсолютные величины ферментативной активности (усл. ед./мл) были значительно ниже таковых во фракциях после очистки согласно двум другим протоколам. Однако, последующий диализ против 0.05 М К-фосфатного буфера рН 6.5 позволил практически полностью восстановить активность фермента. Для сравнения приведем значения удельной активности лакказы после очистки методами: ВЭЖХ – 110-120, ИЭФ – 100-110, и препаративного электрофореза 24-26 (до диализа) и 98-105 усл.ед./мг белка (после диализа).

Таким образом, очистка согласно всем трем использованным протоколам позволила получить препараты гомогенного изофермента С1 с высокой удельной активностью.

Рис. 1. Электрофорез в ПААГ в Рис. 2. Разделение изоформ лакказы денатурирующих условиях гомогенного методом препаративного препарата изоформы С1 после электрофореза (10% ПААГ, трис-HCl заключительной стадии очистки методом буфер рН 8.6).

изоэлектрофокусирования.

Изучение влияния температурно-фазовых переходов на ферментативную активность и структуру лакказы из Coriolus hirsutus.

Основная трудность при использовании лакказы для экспериментальной работы состоит в отсутствии стандартных лиофилизированных препаратов используют замороженный препарат фермента (хранение при –18С). Как известно, в процессе заморозки и последующей разморозки могут происходить как обратимые, так и необратимые изменения структуры фермента и его состояния в растворе. Поэтому было предпринято исследование состояния фермента в растворе после замораживания и последующего оттаивания.

Исследование состояния фермента в растворе непосредственно до заморозки, сразу после перехода из твердой фазы в жидкую, через 4 ч и 24 ч Экспериментальные кривые практически совпадали. На рис. 3 представлена обьединенная кривая после сглаживания и введения коллимационной поправки, построенная в координатах Гинье (логарифм интенсивности log I от S2).

Прямая, проведенная по начальному участку дает радиус инерции частиц Rg=23.3. Радиус сферической частицы с таким радиусом инерции равен 1. Log (I/I 0) Рис. 3. Объединенная кривая Рис. 4. Функция распределения по интенсивности малоуглового рассеяния расстояниям p(r), рассчитанная по лакказы в координатах Гинье после кривой малоуглового рассеяния.

сглаживания и введения коллимационной поправки.

Для уточнения размера частиц лакказы был построен график (рис. 4) характеристической функции p(r) (функции распределения по расстояниям).

Значения функции распределения частиц по размерам рассчитывали с помощью программы косвенного Фурье-преобразования GNOM. Как видно из графика, положение максимумов кривых совпадает и соответствует радиусу сферы, равному 29. Полученное значение радиуса примерно соответствует молекуле с молекулярной массой 50 – 60 кДа, что совпадает с данными о молекулярной массе фермента, определенной ранее. Однако, “плечо” в области, соответствующей частицам с размерами 60 – 130, указывает на присутствие в растворе частиц, диаметр которых достигает 130. Рассчитанное соотношение мономерных и агрегировавших частиц составило 85% и 15%, соответственно.

Таким образом, соотношение мономерных и агрегировавших частиц лакказы при исследованном температурно-фазовом переходе не изменялось.

Однако, по данным ряда авторов в растворе происходят взаимные переходы промежуточных форм лакказы, сопровождающиеся изменением каталитической активности фермента. Поэтому изучение температурнофазовых переходов лакказы включало исследование динамики ферментативной активности и изменения структуры активного центра. Изменения активности лакказы в концентрированных и разбавленных растворах фермента оценивали в течение трех часов после ее оттаивания. Следует подчеркнуть, что при измерении активности концентрация фермента в кювете была одинаковой – 210-8 М. Cогласно представленным данным (рис. 5) динамика зависимости активности от времени практически одинакова для концентрированного и разбавленного препаратов фермента: достаточно заметная активация в течении первых 40 мин. с незначительным падением каталитической активности между 40 – 60 мин., последующим ее возрастанием и выходом на плато (после мин. инкубации). Таким образом, можно предположить изменение соотношения переходных форм фермента в растворе с последующим достижением равновесия через 3 часа. Так как изменения соотношения мономерных и агрегировавших частиц фермента в растворе не было зарегистрировано методом малоуглового рассеяния, полученные данные свидетельствуют о перестройках активного центра лакказы.

Для выяснения влияния температурно-фазового перехода на структуру активного центра фермента проводили спектрофотометрические исследования состояния Т1 центра (610 нм) и Т3 центра (340 нм) в диапазоне температур 12–30 °С (рис.6). Следует отметить, что оптическая плотность фермента на нм (характеристическая длина волны для ионов меди антиферромагнитной пары Т3) практически не менялась, что свидетельствует о значительной стабильности данного центра (кривая 1, рис. 6). Значительное падение оптической плотности наблюдалось при 610 нм (кривая 2, рис. 6), следовательно значительные изменения происходят в Т1 центре, которые могут быть оценены с помощью ЭПР-спектроскопии.

активность, усл.ед.

Рис. 5. Динамика ферментативной Рис. 6. Влияние температуры на активности препаратов лакказы после спектральные характеристики оттаивания и инкубации при комнатной медных центров лакказы. Изменение температуре. 1 - концентрированный (5 оптической плотности: 1 – при мг/мл) и 2 - разведенный сразу после нм, 2 – при 610 нм.

оттаивания (0.25 мг/мл) препараты ЭПР-спектры лакказы, полученные непосредственно после оттаивания и в процессе инкубации при комнатной температуре, показаны на рис. 7. Вклад иона меди Т1 центра в результирующий спектр уменьшается в процессе инкубации. Кроме того в процессе инкубации происходит уширение и расщепление спектральной линии соответствующей вкладу иона меди первого типа. Очевидно, что уширение сигнала является следствием двух процессов – суперпозиции сигналов ионов меди 1 и 2 типа при комнатной температуре и появлением вклада Т3 пары в результирующий спектр из-за усиления антиферромагнитного взаимодействия между ионами меди Т3. Поэтому моделирование спектров и определение параметров сверхтонкого расщепления становиться невозможным. Тем не менее, полученные данные однозначно свидетельствуют о структурных перестройках активного центра фермента в процессе температурно-фазового перехода, причем наибольшие изменения Определение аминокислотной последовательности лакказы С.

Для расшифровки полной пространственной структуры белка была установлена первичная структура его аминокислотной последовательности с помощью определения нуклеотидной последовательности кДНК лакказы Coriolus hirsutus 072. Полученная аминокислотная последовательность представленна на рис. 8. Определенная ранее N-концевая последовательность изофермента С1 была идентична аминокислотным остаткам с 22 по 32, а последовательность сигнального пептида – 1-21 остаткам. Таким образом, представленная последовательность имела сигнальный пептид, типичный для эукариотов, в котором основная область была гидрофобна, а С-конец содержал трипептид AHA (рис. 8). Для исследуемой лакказы наблюдается полная идентичность аминокислотных остатков С-конца сигнального пептида и Nконца аминокислотной последовательности с другими грибными лакказами:

Pycnoporus cinnabarinus, Trametes villosa, Coriolus hirsutus IFO 4917.

Сигнальный пептид

MSRFQSLLTFITISLVAVAHA AVGPVADLTITDAAVSPDGFSRQAVVVNGVTPGPLVAGNIGDRF

QLNVIDNLTNHTMLKSTSIHWHGFFQHGTNWADGPAFINQCPISPGHSFLYDF

QVPDQAGTFWYHSHLSTQYCDGLRGPFVVYDPNDPHASRYDVDNDDTVITL

ADWYHTAAKLGPKFPGAADAVNINGKGRAPVTLPASCSVIKVTKGKRYRFR

LVSLSCNPNHTFSIDGHNLTIIEVDSVNSQPLEVDSIQIFAAERYSFVLDANQA

VDNYWIRANPNFGNVGFDGGINSAILRYDGAPAAEPTTNQTTSVKPLNEVDL

HPLVSTPVPGASDKAIDMAFDFNGSDFFINGASFVPPTVPVLLQILSGAQTAQ

DLLPSGSVYVLPSNASIEISFPATAAAPGAPHPFHLHGHTFAVVRSAGSTVYN

FDNPPLVSTPVPGASDKAIDMAFDFNGSDFFINGASFVPPTVPVLLQILSGAQT

AQDLLPSGSVYVLPSNASIEISFPATAAAPGAPHPFHLHGHTFAVVRSAGSTV

YNFDNPIFRDVVSTGTPAAGDNVTIRFDTNNPGPWFLHCHIDFHLEGGFAVV

MAEDTPDVQAVNPVPQAWSDLCPTYDALDPNDQ

Рис. 8. Аминокислотная последовательность лакказы из C. hirsutus 072.

Аминокислотная последовательность состоит из 495 аминокислотных остатков, что соответствует молекулярной массе 53 кДа. Различие между рассчитанной молекулярной массой и определенной методом электрофореза в денатурирующих условиях и ВЭЖХ связано с наличием углеводной части, составляющей по независимым экспериментам 12%.

Степень сходства полученной аминокислотной последовательности исследуемой лакказы с последовательностями известных лакказ и мономерной субъединицы аскорбатоксидазы оценивали программой CLUSTALW.

Полученные результаты представлены в Табл. 1.

Анализируя сходство представленных последовательностей, следует отметить, что наиболее консервативной частью аминокислотных последовательностей лакказ является непосредственное окружение ионов меди, состоящее из 10 гистидиновых и одного цистеинового остатков. Некоторыми авторами предполагалось ранее, что на значение потенциала иона меди Т центра влияет природа его аксиального лиганда, хотя данный лиганд и не координирует ион меди Т1. На основании этой гипотезы была предложена следующая классификация лакказ: высокоредокспотенциальные, Табл. 1. Сравнение степени сходства аминокислотных последовательностей, величины окислительновосстановительного потенциала и природы аксиальной аминокислоты в Т1 центре для некоторых лакказ и Coprinus cinereus Rhizoctonia solani Neurospora crassa Rhus vernicifera * Не определялось.

имеющие аксиальный фенилаланин; среднередокспотенциальные, имеющие аксиальный лейцин, и низкоредокспотенциальные, имеющие аксиальный метионин. Однако, сравнительный анализ трех параметров: величина ОВП иона меди Т1, природа аксиального лиганда и степень сходства полной аминокислотной последовательности показал, что природа аксиального лиганда является не единственным фактором, влияющим на величину потенциала иона меди Т1 центра (Табл. 1). Лакказы из R. solani и N. crassa имели такое высокое значение ОВП, что могли бы быть отнесены к высокоредокспотенциальным лакказам, однако содержали в качестве аксиального аминокислотного остатка лейцин. Однако, для этих лакказ неизвестно, соответствует ли приведенная в банке данных аминокислотная последовательность той изоформе, для которой определяли ОВП иона меди первого типа. Поэтому анализ корреляции величины ОВП от природы аксиального аминокислотного остатка и степени сходства аминокислотных последовательностей корректнее проводить на лакказах C. hirsutus, T.versicolor, P. cinnabarinus, T. villosa, C. cinereus, Rhus vernisifera и Ascorbate oxidase для которых данное соответствие установлено.

Проведенный анализ данных показал, что высокоредокспотенциальные лакказы имеют большую степень сходства (Табл. 1). Если учесть 100% сходство первой координационной сферы активного центра лакказ, то можно предположить, что на потенциал иона меди Т1 центра могут влиять аминокислотные остатки второй координационной сферы.

Подбор и оптимизация условий кристаллизации лакказы Coriolus Кристаллизацию фермента проводили методом диффузии паров в “висячей” капле. Широкий поиск условий кристаллизации проводили с использованием коммерческих наборов Crystal Screen Kit I, Crystal Screen Kit II, Crystal Screen Kit Cryo при двух температурах (4С, 20С). Капля состояла из равных объемов раствора белка в 0.05 М К-фосфатном буфере (КФБ) рН 7.0 (с концентрацией белка ~30 мг/мл) и соответствующего раствора из используемых коммерческих наборов. Кристаллы в форме друз выросли в условиях: №7 Crystal Screen Kit II (10 % в/о ПЭГ 1000, 10 % в/о ПЭГ 8000).

Рис. 9. Фото концентрациях белка ~5 мг/мл были получены кристаллов лакказы из C. hirsutus.

(рис. 9). С уменьшением концентрации фермента в каплях наблюдалась тенденция к формированию монокристаллов, однако время их роста заметно увеличивалось. Так, при комнатной температуре и концентрации белка ~25 – мг/мл кристаллы формировались в течение 4 – 7 суток, в то время как при той же температуре, но концентрации фермента ~5 мг/мл – в течении 30 суток. При снижении температуры до 4С время роста кристаллов увеличивалось до 45 и 150 сут при концентрации фермента ~25 – 30 мг/мл и ~5 мг/мл, соответственно.

Согласно мнению ряда авторов, решающее значение для успешной кристаллизации лакказы имеет метод ее очистки, поэтому в подобранных оптимальных условиях роста кристаллов были проведены эксперименты по кристаллизации трех гомогенных препаратов лакказы Coriolus hirsutus, изоэлектрофокусирования и препаративного электрофореза. Рост кристаллов наблюдался для всех использованных препаратов фермента, а время их роста практически не отличалось.

Сбор кристаллографических данных и их обработка были выполнены в Европейской Лаборатории Молекулярной Биологии, Гамбург (Германия).

Набор был собран с одного кристалла при 100К на рабочей станции BW7A при длине волны =1.38, соответствующей краю поглощения атома меди, с использованием 165 мм MAR CCD детектора. В качестве криопротектанта использовали парафиновое масло. Обработка полученных данных была выполнена с помощью программ DENZO, SCALEPACK. Полученные кристаллы принадлежали орторомбической пространственной группе симметрии P212121 с параметрами ячейки a=50.65, b=74.01, c=124.83.

Плотность упаковки характеризовалась параметром Мэтьюза, равным 2. 3/Да (40% содержание растворителя). В независимой части элементарной ячейки находилась одна молекула белка.

Решение пространственной структуры лакказы методом молекулярного В качестве исходной модели для решения структуры лакказы из C.hirsutus методом молекулярного замещения были использованы координаты атомов лакказы T. versicolor (PDB код 1GYC). Молекулы воды и остатки углеводов не включались в модель, координаты оставшихся атомов были использованы в программе Molrep для расчета функций вращения и трансляции с разрешением 4. Верное решение соответствало первому пику функции вращения и первому пику функции трансляции, которые были значительно больше следующих пиков. Начальный Rf=35. Корреляция соответствовала 64.5%.

Кристаллическая структура. Уточнение и корректировка модели Позиции атомов и их температурные факторы для нативной лакказы кристаллографического уточнения чередовались с ручной корректировкой модели фермента для учета отличий в первичной последовательности лакказ из C. hirsutus и T. versicolor, построения модели углеводной части структуры и локализации молекул растворителя.

Визуальная корректировка основывалась на анализе разностных синтезов Фурье с коэффициентами (2F0 – Fc, c) и (F0 – Fc, c), где F0, Fc – экспериментальные и рассчитанные модули структурных факторов, а c – рассчитанные фазы структурных факторов. Для построения и корректировки модели молекулы фермента использовали комплекс графических программ О.

В результате такого уточнения была получена структура, содержащая неводородных атомов со значениями кристаллографических факторов Rf=18.15%, Rfree=23.98%, при этом среднее отклонение длин связей и валентных углов от стандартных значений составляло 0.020 и 1.79 соответственно.

Было установлено, что четыре боковых цепи аминокислотных остатков полипептидной цепи имеют двойные положения: Ile63, Val201, Cys205, Thr343.

В модель были включены тринадцать углеводных остатков. Восемь из них были остатками N-ацетилглюкозамина, четыре из которых связывались с молекулами аспарагина (Asn54, Asn217, Asn329, Asn432) посредством Nгликозидной связи, а оставшиеся остатки N-ацетилглюкозамина и пять молекул -D-маннозы соединялись между собой.

В ходе уточнения структуры были обнаружены большие расхождения в первичных последовательностях, определенных по данным рентгеноструктурного анализа и секвенированием кДНК. На основании этих данных аминокислотная последовательность, определенная секвенированием кДНК была существенно исправлена. Тем не менее, в модели осталось шесть аминокислотных остатков, не совпадающих с с остатками, определенными по нуклеотидной последовательности кДНК: Glu 242, Asp 419, Thr 423, Gly 429, Asn 431, Asp 440 (остатки Pro, Gly, Pro, Arg, неидентифицированный и Gln по кДНК последовательности, соответственно). Все остатки за исключением Gly 429, для которого нет электронной плотности для боковой цепи, надежно локализованы по картам электронной плотности.

Рис. 10. Схематическое изображение лакказы из C.hirsutus. пятью, и как в домене 1 – три 3 -спирали в пептидах связывают отдельные -повороты и домены 1 и 3, соответственно.

310-спираль между доменами 2 и 3 образует петлю длиной в 40 аминокислотных остатков. Третий домен (Val309 – Gln495) помимо -структуры, образованной двумя -слоями с пятью поворотами, имеет -складчатый лист с двумя поворотами, который вместе с -спиралью образуют полость, где расположен Т1 центр. В третьем домене спираль длиной в 13 аминокислот С-конца молекулы стабилизирована дисульфидным мостиком между Cys484 и Cys домена 1. Существует также второй дисульфидный мостик между доменами 1 и 2 (Cys117 и Cys205), имеющий два положения.

Активный центр лакказы из C.hirsutus состоит из моноядерного медного центра Т1 и трехъядерного кластера Т2/Т3. Субстрат связывающий карман, в котором находится Т1 ион меди, располагается между 2 и 3 доменом, а Т2/Т кластер - в полости между 1 и 3 доменами (1-128, 129-308, 309-495).

Ион меди Т1 координируется двумя гистидиновыми остатками и одним цистеиновым, причем и ион меди и координирующее его атомы азота и серы Рис. 11. Пространственное строение Т1 же расстоянии 3.60 находится центра лакказы из C. hirsutus.

Кислород-восстанавлива-ющий центр Т2/Т3 находится на расстоянии около 12 от поверхности молекулы фермента и локализован между 1 и 3 доменами (рис.12). В координации ионов меди этого кластера участвуют аминокислотные остатки, принадлежащие N-концу 6 (His64, His66), С-концу 7 (His109, His111), N-концу 26, С-концу 28, 5. Т2/Т3 кластер удален от Т1 иона меди высококонсервативным для лакказ трипептидом His447 – Cys448 – His449, расположенным на С-конце -цепи (28), Cys448 координирует ион меди Т1, аминокислотный остаток His447 – T32, а His449 – T31.

Три медных иона в кластере Т2/Т3 образуют почти равнобедренный треугольник с расстояниями: Т2 – Т31 = 3.78, Т2 – Т32 = 4.03, Т31 – Т32 = 3.85. На карте электронной плотности локализован в центре кластера кислородный лиганд О3 (рис. 12). Между двумя ионами меди в Т3 центре находится кислородный мостиковый лиганд О1. Следует отметить, что этот кислородный лиганд присутствует во всех структурах лакказ.

Рис. 12. Пространственное строение Т2/Т3 кластера лакказы из C. hirsutus.

Расстояние между кислородными лигандами О1 – О3 составляет 2.47, что соответствует длине водородной связи. Длины связей: Т31 – О1 =2.48, Т32 – О1 =1.91, с углом 125.25; Т31 – О3 =2.15, Т32 – О3 =2.52, с углом 109.78.

Ионы меди Т3 пары координируются шестью аминокислотными остатками гистидинов. Пять из гистидиновых остатков координируются N атомами, а шестой – N1. Т31 координируется атомами N1 (His66), N2 (His109), N2 (His449) и О3. Т32 координируется атомами N2 (His111), N2 (His395), N (His447) и О1. Координация каждого из этих ионов может быть описана как искаженный тетраэдр (рис. 12).

Окружение иона меди Т2, состоящее из атомов N2 His64, N2 His393 и двух кислородных лигандов О2 и О3, образует плоский квадрат. Гистидиновые аминокислотные остатки, координирующие ион меди Т2, имеют водородные связи с атомами основной цепи остатков Asp77 и Asp419. Точный характер кислородных лигандов О1, О2 и О3 в кластере Т2/Т3 не может быть определен из кристаллографических данных. Расстояния от иона меди до кислородных лигандов О2 и О3 равны: Т2 – О2 =1.88, Т2 – О3 =2.09. Расстояние между кислородными лигандами О2 – О3 составляет 2.09, что меньше длины водородной связи, поэтому можно предполагать, что данная связь ковалентная.

Ранее кислородный лиганд О3 был найден только в трехъядерном кластере структуры лакказы из Melanocarpus albomyces, однако там Т2 центр вместо О имел ион Cl-, а расстояния до кислородного лиганда О3 равны ~2.5, что соответствует водородной связи. Таким образом, впервые определена кристаллическая структура промежуточной формы лакказы – нативного интермедиата, содержащего три кислородных лиганда в Т2/Т3 кластере.

Предполагаемый механизм действия фермента.

Лакказа катализирует четырехэлектронное восстановление молекулярного кислорода до воды. Первичным акцептором электронов является Т1 центр. Теоретический расчет показал, что перенос электронов от иона меди первого типа может осуществляться двумя путями: через связи аминокислотных остатков или туннельным переносом (пространственно).

Трипептид His–Cys–His играет роль “мостика” между ионом меди первого типа и трехъядерным медным кластером, обеспечивая наиболее благоприятный путь переноса электронов. Одной из связей, участвующих в туннельном переносе Нативный Рис. 13. Предполагаемый механизм восстановления молекулярного кислорода в Т2/Т3 кластере.

Табл. 2. Корреляция длины водородной связи между атомом O Cys448 и атомом 1N His447 и величиной ОВП иона меди Т электрона, является водородная связь между атомом O Cys и атомом 1N His. Структурный анализ лакказ, полученных в кристаллическом состоянии, показал, что у высокоредокспотенциальных лакказ длина данной водородной связи в трипептиде His-Cys-His короче, чем у низкоредокспотенциальных лакказ (табл. 2). Таким образом, высокая эффективность катализа высокоредокспотенциальными лакказами обеспечивается более высоким значением электрондвижущей силы, определяемой разницей окислительновосстановительных потенциалов ионов меди Т1 и Т3, и более коротким путем переноса электронов. Перенос электрона на Т3 кластер завершает первую стадию катализа, за которой следует стадия восстановления кислорода с образованием двух молекул воды. Известно, что в каталитическом цикле лакказы участвуют несколько взаимопереходящих форм фермента, а именно пероксо-форма, полностью восстановленная форма, окисленная “покоящаяся” форма и нативный интермедиат. Взаимные переходы промежуточных форм лакказы и время их жизни в растворе в значительной степени зависят от рН и температуры. Согласно общепринятой классификации промежуточных форм фермента, нативным интермедиатом является такая форма, у которой все ионы меди трехъядерного медного кластера находятся в окисленном состоянии и каждый из них имеет кислородный лиганд – О1, О2 и О3 (“трехмостиковая” модель). Окисленная “покоящаяся” форма отличается от нативного интермедиата отсутствием кислородного лиганда О3. В структуре трехъядерного медного кластера лакказы C. hirsutus установлено наличие трех кислородных лигандов, два из которых являются “мостиками” между Т31 и Т (О1) и между Т31 и Т2 (О3), а третий – кислородным лигандом только Т2 (О2).

Таким образом, в отличие от других известных структур лакказ, имеющих два кислородных лиганда (окисленная “покоящаяся” форма), для лакказы C.

hirsutus получена структура в форме нативного интермедиата. Обобщая результаты структурных исследований, предложена гипотетическая схема механизма восстановления кислорода в трехъядерном кластере (рис. 13).

Восстановление кислорода может происходить двумя путями. Первый путь предполагает участие в катализе нативного интермедиата, который, получая электрон от Т1 центра, переходит в окисленную “покоящуюся” форму с сопутствующим отщеплением одной молекулы воды. Следует отметить, что после отщепления воды кислородный лиганд О1 остается мостиковым между ионами меди антиферромагнитной пары, а кислородный лиганд О3 переходит в положение, занимаемое О2 лигандом. Второй путь восстановления молекулярного кислорода предполагает перестройку Т2/Т3 кластера окисленной “покоящейся формы после переноса электрона с Т1 центра с образованием “мостика” между Т31 и Т2 ионами меди. Такая конформация Т центра способна связывать кислород с образованием «мостика» между Т31 и Т32. При этом остальные кислородные лиганды (О1 и О2) находятся в тех же положениях. Таким образом, образуется нативный интермедиат, который после протонирования и отщепления молекулы воды может переходить в окисленную “покоящуюся” форму. Кислородным лигандом Т2 у данной формы становится О1, а кислородный мостиковый лиганд между Т31 и Т2 отщепляется в составе молекулы воды.

1. Разработан протокол очистки лакказы из Coriolus hirsutus методом препаративного электрофореза.

2. Определена аминокислотная последовательность лакказы из Coriolus hirsutus 072 по нуклеотидной последовательности кДНК. Установлено, что высокоредокспотенциальные грибные лакказы имеют более 70% степени сходства аминокислотных последовательностей.

3. Показано, что лакказа существует в растворе в виде мономеров и димеров (соотношение 85% – 15%). Методами ЭПР и оптической спектроскопии установлено, что при размораживании препарата фермента происходит процесс конформационной перестройки активного центра, сопровождающийся изменением каталитической активности.

4. Найдены условия роста монокристаллов лакказы из Coriolus hirsutus 072. На синхротронном источнике рентгеновского излучения собран набор дифракционных данных с разрешением 1.85. Структура решена методом молекулярного замещения. Проведено кристаллографическое уточнение структуры до R-фактора 18.15%.

5. Впервые получена структура нативного интермедиата, содержащего в центре трехъядерного кластера дополнительный кислородный лиганд. Установлена коррреляция между длиной водородной связи между атомом Cys 448 O и атомом His 447 1N и величиной окислительно-восстановительного потенциала иона меди Т1.

6. На основании полученных структурных и спектроскопических данных предложен механизм восстановления молекулярного кислорода в процессе ферментативного катализа.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Koroleva O. V., Pegasova T. V., Stepanova E. V., Rebrikov D. V., Zwart P., Lamzin V. S. Crystallisation and preliminary X-ray analysis of the laccase from Coriolus hirsutus.// Jahresbericht 2002, Annual Report, Part II, pp. 117 – 118.

2. Степанова Е. В., Гаврилова В. П., Ландесман Е. О., Пегасова Т. В., Королева О. В. Сравнительное изучение лакказ Cerrena unicolor 095, Cerrena unicolor 0784 и Pleurotus ostreatus. Прикл.Биохим. и Микробиология, 39 (4) 2003, 375- 3. Pegasova T.V., Zwart P., Koroleva O.V., Stepanova E.V., Rebrikov D.V., Lamzin V.S. Crystallisation and preliminary X-ray analysis of a four-copper laccase from Coriolus hirsutus. Acta crystallographica, 2003, 59, 1459- 4. O. V. Koroleva, T. V. Pegasova, E. V. Stepanova, O. A. Harichkova, K. M.

Polyakov, K. Schirwitz, V. S. Lamzin Preliminary X-ray analysis of the laccase from Coriolus zonatus.// Jahresbericht 2003, Annual Report, Part II.

5. Koroleva O.V., Rebrikov D.V., Stephanova E.V., Pegasova T.V., Landesman E.O., Gavrilova V.P. Molecular Analysis of a Laccase Gene from the White Rot Fungus Coriolus hirsutus. PDB code AY081775.1, 2002.

6. Королева О. В., Пегасова Т. В., Степанова Е. В., Ландесман Е. О.

Исследование структуры С. hirsutus лакказы и ее активного центра, 3-й Биохим.

Съезд, С. Петербург, 2002, с.495.

7. Пегасова Т. В., Степанова Е. В., Явметдинов И. С., Ткачев Я. В., Королева О.

В., Структура и функция медьсодержащей оксидазы – лакказы и ее роль в обеспечении биологической устойчивости базидиальных грибов. Молодежная научная конференция. “Актуальные проблемы биологии и экологии”, Сыктывкар, Апрель 2003, с.166-167.

8. Пегасова Т.В., Королева О.В., Степанова Е.В., Рябов А.Д., Фермент – медиаторные системы нового поколения. Москва, II Московский международный Конгресс. Биотехнология: состояние и перспективы развития.

Ноябрь, 2003, Часть 2, 225-226.

9. Королева О.В., Степанова Е.В., Пегасова Т.В., Ткачев Я.В., Тимофеев В.П., Исследование конформационных изменений лакказы при различных температурах. Москва, II Московский международный Конгресс.

Биотехнология: состояние и перспективы развития. Ноябрь, 2003, Часть 2, 236Koroleva O.V., Pegasova T.V., Stepanova E.V., Zwart P., Lamzin V.S., Ryabov A.D. Structural study of native and modified with ruthenium complex laccase from Coriolus hirsutus, 5th International Conference on Molecular Structural Biology, Vienna, September 3-7, 2003, 126/P78.



 
Похожие работы:

«Устименко Елена Александровна БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ У ТИХООКЕАНСКИХ ЛОСОСЕЙ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ВОСПРОИЗВОДСТВЕ НА КАМЧАТКЕ 03.02.06 — ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Камчатский государственный технический университет и Камчатском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО) Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»

«КАШТАНОВА Наталья Николаевна ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Мордовский государственный университет...»

«ДУХОВЛИНОВА Елена Николаевна ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНА env ШТАММОВ ВИЧ-1, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ГРУППАХ РИСКА В САНКТПЕТЕРБУРГЕ 03.01.04 – Биохимия 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 Работа выполнена в лаборатории негосударственного научноисследовательского учреждения Биомедицинский центр, Санкт-Петербург. Научный руководитель - доктор...»

«АНДРЕЯНОВ Олег Николаевич ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЦИРКУЛЯЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ТРИХИНЕЛЛЕЗА В ЦЕНТРАЛЬНОМ РЕГИОНЕ РОССИИ И ОПТИМИЗАЦИЯ МЕР БОРЬБЫ Специальность: 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук Москва – 2014 2 Работа выполнена в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина Россельхозакадемии Научный консультант : - член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор...»

«Меркулова Ольга Сергеевна ЛИШАЙНИКИ СТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮЖНОГО УРАЛА И ПРИЛЕГАЮЩИХ ТЕРРИТОРИЙ 03.00.24 — Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2006 Работа выполнена в Лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи УрО РАН. Научный руководитель : кандидат географических наук Урбанавичюс Геннадий Пранасович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Голубкова Нина Сергеевна...»

«МУРАЛЕВ Сергей Григорьевич АГРОПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРАНУЛОМЕТРИЧЕСКОГО СОСТАВА ПОЧВ И ЕГО ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В ОЦЕНКЕ КАЧЕСТВА СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЗЕМЕЛЬ Специальность: 03.02.13 - почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата сельскохозяйственных наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре почвоведения и природообустройства Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии кандидат сельскохозяйственных наук, Научный руководитель :...»

«ЖИГАДЛОВА Галина Геннадьевна МОРСКИЕ ВОДОРОСЛИ - МАКРОФИТЫ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ КАМЧАТКИ (биоразнообразие, систематика, биология, рациональное использование) 03.00.18 - гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2007 2 Работа выполнена в Лаборатории гидробиологии Камчатского филиала Тихоокеанского института географии ДВО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«РАХИМОВ Ильгизар Ильясович АВИФАУНА СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ В УСЛОВИЯХ АНТРОПОГЕННОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ ПРИРОДНЫХ ЛАНДШАФТОВ Специальность 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2002 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета Научный консультант : доктор биологических наук, профессор КонстантиновВ.М....»

«Брежнева Ирина Николаевна МЕТОДИКА ОЦЕНКИ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФИТОСТРОМУ ПРИ СТРОИТЕЛЬСТВЕ СКВАЖИН (на примере Оренбургского Предуралья) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2010 2 Работа выполнена в Волго-Уральском научно-исследовательском и проектном институте нефти и газа, г. Оренбург доктор биологических наук, профессор, Научный Рябинина Зинаида Николаевна руководитель доктор...»

«Кирий Оксана Аркадьевна ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ БАКТЕРИЙ ПРИ БИОРЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ ПОЧВ И ВОД НА ЮГЕ РОССИИ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Колесников...»

«ПОСКРЯКОВА НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА РАЗРАБОТКА ОСНОВЫ БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ДЕСТРУКЦИИ ЖИРОВ 03.00.23 - биотехнология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2007 Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра РАН в рамках темы и метаболиты почвенных и ризосферных Ферменты микроорганизмов (номер государственной регистрации ГР № 01200210612) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Логинов Олег...»

«ГАВРИЛО Мария Владиславовна БЕЛАЯ ЧАЙКА PAGOPHILA EBURNEA (PHIPPS, 1774) В РОССИЙСКОЙ АРКТИКЕ: особенности гнездования вида в современном оптимуме ареала 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации Арктическом и Антарктическом научно-исследовательском институте Росгидромета (ГНЦ...»

«СИБИРНЫЙ ВЛАДИМИР АНДРЕЕВИЧ Разработка новых методов анализа спиртов и альдегидов и конструирование продуцентов этанола с использованием нетрадиционных дрожжей Hansenula polymorpha и Pichia stipitis 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва, 2013 1 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и микробиологии биолого-почвенного факультета Жешовского...»

«Вагун Илья Владимирович Продукционный процесс и фиторемедиационный потенциал сортов рапса на загрязненных тяжелыми металлами почвах Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре физиологии растений Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Кошкин...»

«ЗЕНИНА Мария Александровна ОСТРАКОДЫ КАК ИНДИКАТОРЫ СОСТОЯНИЯ И ДИНАМИКИ ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМ (на примере северной части Амурского залива и акватории порта Владивосток) 03.00.18 – гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток - 2009 2 Работа выполнена в Лаборатории экологии бентоса Института биологии моря им. А.В. Жирмунского ДВО РАН Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Шорников...»

«ШУМЕЕВ Александр Николаевич ПРЕСНОВОДНЫЕ И НАЗЕМНЫЕ ПЛАНАРИИ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА Специальность: 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в Лаборатории эволюционной морфологии Зоологического института Российской Академии наук. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ю.В. Мамкаев Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор А.И. Гранович...»

«ТЮТЮНОВ Юрий Викторович ПОСТРОЕНИЕ, ИССЛЕДОВАНИЕ И ПРИЛОЖЕНИЯ МАТЕМАТИЧЕСКИХ МОДЕЛЕЙ ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ДИНАМИКИ ПОПУЛЯЦИОННЫХ СИСТЕМ (03.00.02 – Биофизика) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Красноярск – 2009 2 Работа выполнена в отделе математических методов в экономике и экологии Научно-исследовательского института механики и прикладной математики им. Воровича И.И. Южного федерального университета Научный...»

«БАКАЕВА Светлана Сергеевна СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ КРАПЧАТОГО СУСЛИКА (Spermophilus suslicus Gld.) В ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ АРЕАЛА: МЕТАПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА, БИОТОПИЧЕСКАЯ ПРИУРОЧЕННОСТЬ, ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«Фатыхова Юлия Наильевна РОЛЬ СТРУКТУРЫ СООБЩЕСТВ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗРУШЕНИИ СТРОИТЕЛЬНЫХ СИЛИКАТНЫХ МАТЕРИАЛОВ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2006 2 Работа выполнена в Томском государственном архитектурно – строительном университете на кафедре Охрана труда и окружающей среды Научный руководитель доктор геолого-минералогических наук, профессор Мананков Анатолий Васильевич...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.