WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

МАМАЕВ Дмитрий Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ

ДИКАРБОКСИЛАТНОГО ТРАНСПОРТЕРА МИТОХОНДРИЙ

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

МОСКВА • 2003 1

Работа выполнена в Лаборатории биологического окисления Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: кандидат биологических наук К.Ф. Шольц

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Л.С. Ягужинский доктор биологических наук, профессор А.С. Капрельянц

Ведущая организация: Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «08» июля 2003 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета (К 002.247.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН по адресу: 119071. Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » мая 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. C4-дикарбоксилаты (прежде всего L-малат и сукцинат) играют важную роль в метаболизме. Они являются интермедиатами цитратного цикла, локализованного в митохондриях. Окисление дикарбоксилатов необходимо для окислительного фосфорилирования, основного поставщика АТФ в клетке.

Наряду с участием в обмене веществ особую роль играет специфический транспорт этих метаболитов через биологические мембраны. Так, например, транспорт L-малата через митохондриальную мембрану связан с так называемым транспортом восстановительных эквивалентов, необходимым для обеспечения взаимодействия между двумя изолированными пулами НАДН - митохондриальным и цитозольным. Транспорт сукцината через митохондриальную мембрану обеспечивает взаимосвязь между обменом в пероксисомах и митохондриях. Особую роль играет транспорт L-малата через плазматическую мембрану клетки, поскольку этот дикарбоксилат, благодаря его особой роли в основном обмене может служить источником углерода, необходимого для роста в аэробных условиях клеток эукариотов.

Изучению структуры и особенностей функционирования дикарбоксилатных переносчиков уделяется значительное внимание. В частности, для некоторых из них определена первичная структура. Во внутренней мембране митохондрий выявлены транспортеры дикарбоксилатов, функционирующие только по электронейтральному обменному механизму. H+/дикарбоксилатные транспортеры плазматической мембраны дрожжей являются симпортерами. По сравнению с другими транспортерами митохондрий дикарбоксилатный мало изучен, а дрожжевые транспортеры слабо изучены по сравнению с другими транспортерами плазматических мембран. Особенно мало известно о молекулярном механизме функционирования этих транспортеров. В частности, не установлены принципиальные для функции переносчиков особенности структуры их активного центра, включающего точки связывания дикарбоксилатов и каналы, по которым поступают субстраты к этим точкам связывания. Из обзора видно, что для увязывания значительного количества структурных данных с актом транспорта даже для наиболее изученных митохондриальных транспортеров, необходима новая структурнофункциональная модель и разработка методов проверки ее адекватности.

Цель и задачи исследования. С целью исследования механизма функционирования дикарбоксилатного транспортера в работе решались следующие задачи:

1. Зондирование активного центра функционирующего дикарбоксилатного транспортера митохондрий печени крыс с высоким разрешением с помощью производные двух его субстратов – малата и малоната – с алкильным заместителем различной длины.

2. Сравнительное исследование активного центра двух типов дикарбоксилатных транспортеров и фермента (сукцинатдегидрогеназы), субстратом которого является дикарбоксилат.

3. Разработка методики определения действующей концентрации амфифильных ингибиторов мембранных ферментов и метода определения доли доступной для этих соединений мембранной фазы клетки.

Научная новизна. Изучение топографии активного центра функционирующего транспортера с помощью набора алкил-производных субстратов позволило получить новые данные в пользу одноцентровой модели транспортера.

Практическая значимость работы. Разработан метод оценки проницаемости клеток дрожжей для амфифильных кислот и методика определения действующей концентрации этого типа ингибиторов на процессы в интактной мембране митохондрий.

Апробация работы. Основные результаты исследования были представлены на следующих конференциях: Всесоюзная конференция "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена" (11-13 июня 1986 г., Пущино); Международная конференция "Chemical Physics of Enzyme Catalysis" (Tallinn, Sept., 21-22, 1987); Meeting of the FEBS (30.06.-5.07.2001, Lisbon, Portugal); III съезд биохимического общества (26.06. Санкт-Петербург).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем работы. Диссертация, изложенная на с., включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов, список литературы (139 работ) и содержит рисунков и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. Работу проводили на митохондриях печени крыс, субмитохондриальных частицах печени крыс, клетках S. сerevisiae штамма Y-503, выращенных на глюкозе и подвергнутых истощению эндогенных субстратов с помощью холодного анаэробиоза и митохондриях, выделенных из этих дрожжей.

Метод определение доли доступной для амфифильных анионов мембранной фазы клеток. Определяют исходную (C0) и равновесную (Cw) концентрацию амфифильных анионов в водной фазе в присутствии интактных (C0' и Cw') и пермеабилизованных с ДМСО (40%) клеток (C0" и Cw"). Концентрацию амфифильных анионов определяют после экстракции их комплекса с метиленовым синим. Долю доступной липофильной фазы (a/0) рассчитывали по уранению: a/0 = (C0'/Cw' C0"/Cw" - 1).

Измерение скорости дыхания митохондрий и клеток. Скорость восстановления кислорода определяли в полярографической ячейке с закрытыми электродами с рабочим объемом 1 мл амперометрическим методом на полярографе ОН-105 (Венгрия) или LP- (Чехословакия).

Измерение сукцинатдегидрогеназной активности. Измерялась активность сукцинат:феррицианид-редуктазы субмитохондриальных частиц печени крыс фотометрически при 420 нм на спектрофотометре Hitachi-557 (Япония) в среде С1 с добавлением антимицина A (1 мкМ), цианида (1 мМ) и феррицианида калия (1 мМ).

Определение коэффициентов распределения амфифильных кислот в системе октанол/вода. Аликвоту раствора ингибитора, например одной из Oациляблочных кислот, в диметилсульфоксиде вводят в 10мМ калий-фосфатный буфер с pH 5,5 или 7,2, перемешивают и добавляют октанол. Объем водной фазы (vw) и октанола (vo) подбирают таким образом, чтобы после установления равновесия концентрация амфифильной кислоты в водной фазе снизилась на 20 – 50%. После добавления октанола проводят осторожное (исключающее значительное пенообразование) перемешивание жидкостей (30 - 120 мин) до установления равновесия, когда концентрация ингибитора в водной фазе перестает изменяться. Исходную (C0) и равновесную (Cw) концентрацию ингибитора в водной фазе определяли с метиленовым синим (см. выше). Коэффициент распределения соответствующей амфифильной кислоты (R) рассчитывают по формуле:

R = (C0 – Cw)vw/Cwvo Этим методом были получены зависимости коэффициентов распределения O-ацил-L-малатов в системе октанол/вода от количества атомов углерода (n) в алифатической цепи этих соединений при pH 5,5 (pH среды инкубации клеток S.

cerevisiae) и 7,2 (pH среды инкубации митохондрий).

Как следует из данных, представленных на рис. 1 эти зависимости описываются уравнениями: lgR = 0,416n – 3,46 (для pH 5,5) и lgR = 0,406n – 5,42 (для pH 7,2).

Инкременты lgR в данном случае несколько ниже соответствующего инкремента, полученного для жирных кислот в системе гептан/вода [Tanford, 1973] Производные малата и малоната. Производные субстратов дикарбоксилатных транспортеров L-малата, D-малата и малоната (2-алкилмалонаты, 2,2-диалкилмалонаты, Рис. 1. Зависимость коэффициента распределения (R) в системе октанол/вода от количества атомов C (n) в алифатической цепи O-ацил-L-малатов и pH водной фазы.

Условия опыта: 10мМ калий-фосфатный буфер с pH 5,5 и 7,2.

O-ацил-L- и O-ацил-D-малаты,,-алкилдималонаты) синтезированы в нашей лаборатории Д.И. Бондаренко. Очистку соединений проводили многократной перекристаллизацией из различных систем органических растворителей. Чистоту препаратов определяли методами газожидкостной (в виде метиловых эфиров на приборе «Цвет-102»), тонкослойной хроматографией (пластины «Silufol», ЧССР) и элементным анализом.

Определение размеров молекул. Для расчета внутримолекулярных расстояний использовали программу Desktop Molecular Modelling.

Определение кинетических параметров. Наблюдаемые константы ингибирования (Ki) рассчитывали по формулам: Ki = IKM/(KM’ - KM) или Ki = I50KM/(KM + S), где KM и KM’ – константы Михаэлиса для субстрата, найденные в координатах Лайнуивера–Берка, в отсутствие и в присутствии ингибитора, I – концентрация ингибитора, I50 - найденная в координатах Диксона концентрация ингибитора, вызывающая 50% эффект, S – концентрация субстрата.

При определении истинной константы ингибирования (Ki) амфифильных ингибиторов исходили из зависимости наблюдаемой Ki (Ki°) от концентрации доступной ингибитору липидной фазы в системе в соответствии с уравнением: Ki° = Ki + (KiRa)B, где B концентрация митохондрий или клеток. Поскольку выражение в скобках, включающее коэффициент распределения вещества между липофильной и водной фазами системы (R), удельный объем доступной ингибитору липидной фазы (a) и истинную константу ингибирования данного ингибитора (Ki), является постоянной величиной,. истинная Ki находится в точке пересечения прямой с осью Ki в зависимости Ki°от B.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Чтобы исключить возможные артефакты, связанные с выделением переносчиков и их реконструкцией в искусственных мембранах, в настоящей работе активности дикарбоксилатных транспортеров измерялись в интактных мембранах с помощью эндогенных сопряженных систем окисления сукцината.

Использованный в данной работе набор ингибиторов дикарбоксилатных транспортеров представляет собой субстраты, химически модифицированные липофильными алкильными или ацильными заместителями с различной длиной алифатической цепи. Эти соединения не влияют на убихиноноксидазный участок дыхательной цепи, поскольку они не ингибируют 2-оксибутиратоксидазную систему митохондрий (данные не приведены).

Рис. 2. Зависимость скорости дыхания митохондрий печени крыс (0,2 мг белка в 1 мл) с сукцинатом (3 мМ) и концентрации O-лауроил-L-малата в присутствии в отсутствие грамицидина S.

В среде: протонофор 3,5-ди-трет-бутил-4-оксибензилиденмалононитрил (20 мкМ) и цитохром c (4 мкМ).

Поскольку пермеабилизация митохондрий грамицидином S (рис. 2) значительно снижает степень ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий O-лауроил-L-малатом, дикарбоксилатный транспортер этих органелл лимитирует сукцинатоксидазу этих органелл. Несмотря на то, что некоторые ингибиторы сукцинатоксидаз (алкилмалонаты) являются также ингибиторами сукцинатдегидрогеназы, (см. ниже), их ингибирующий эффект на сукцинатоксидазах отражает их действие на дикарбоксилатный транспортер.

Это обусловлено тем, что сродство этих соединений к сукцинатдегидрогеназе значительно ниже, чем к переносчику, а также тем, что они не проникают в матрикс митохондрий. Это следует, в частности из того, что на зависимостях Диксона не выявляется вторая составляющая: кривые Диксона для всех изученных соединений были линейны.

Таблица 1. Определение доли доступной для ингибитора O-пальмитоил-L-малата ( мкМ) и протонофора SF6847 (10 мкМ) липофильной фазы клеток S. cerevisiae в 10мМ калий-фосфатном буфере с pH 5,5.

Из данных табл. 1 следует, что примерно 2/3 липофильной фазы интактной клетки дрожжей недоступны для одного из наиболее липофильных производных малата, O-пальмитоил-L-малата (a/0 = 0,364). В то время как для слабой кислоты протонофора SF 6847 эта фаза полностью доступна (a/0 = 1,09). Из этого следует, что в условиях эксперимента O-ацил-L-малаты не проникают и через плазматическую мембрану дрожжевых клеток и, следовательно, они могут взаимодействовать только транспортером этой мембране.

В работе показано, что дикарбоксилатный переносчик является лимитирующим звеном эндогенных сопряженных систем митохондрий печени крыс и клеток дрожжей, используемых для измерения скорости транспорта сукцината.

Клетки дрожжей окисляют сукцинат с максимальной скоростью, составляющей меньше 25% от скорости окисления пирувата (рис. 3), в то время как митохондрии дрожжей окисляют оба эти субстрата с близкими активностями. У клеток дрожжей KM по сукцинату на порядок больше, чем у дрожжевых митохондрий: 7,3 ± 1,1 мМ (3) и 0,635 ± 0,173 мМ (3), соответственно. Подавление скорости окисления сукцината в клетками дрожжей сукцината (но не ацетата) ингибитором сукцинатдегидрогеназы теноилтрифторацетоном имеет сигмоидный характер и, соответсвенно, система, начинающаяся с этого звена активнее, чем транспорт сукцината. Таким образом, несколькими способами показана пригодность эндогенных полиферментных систем для измерения активности транспортеров.

Таким образом, в подобранных условиях сукцинатоксидазную реакцию митохондрий лимитирует транспорт и эта эндогенная сопряженная система позволяет измерять ингибирование дикарбоксилатного транспортера митохондрий печени крысы алкилмалонатами и O-ацил-L-малатами. Для O-ацил-L-малатов (рис. 4Б) и остальных используемых ингибиторов (данные не приведены) зависимость скорости сукцинатоксидазной реакции митохондрий от концентрации этих соединений линейна в координатах Диксона. Линейность в координатах Диксона продемонстрирована и для сукцинатоксидазной реакции клеток (рис. 5Б). Эти данные также свидетельствует, что транспортер – лимитирующее звено используемых сопряженных систем O-Ацил-L-малаты ингибируют дыхание клеток с сукцинатом линейно в координатах Диксона, что можно видеть на примере O-стеароил-L-малата (рис. 5Б). Эти данные также logv, нмол/мин/мг сухого веса Рис. 3. Изменение скорости дыхания клеток S. cerevisiae при 30 с сукцинатом ( мМ), пируватом (23 мМ), ацетатом (20 мМ), и в отсутствие экзогенных субстратов в ходе аэробной инкубации при 0.

свидетельствуют о том, что дыхание клеток лимитируется дикарбоксилатным транспортером плазматической мембраны.

Все использованные в работе соединения являются конкурентными ингибиторами соответствующих сукцинат-зависимых процессов. Так, например, O-ацил-L-малаты Рис. 4. Зависимость скорости сукцинатоксидазной реакции митохондрий печени крыс (0, мг белка в 1 мл) от концентрации сукцината в присутствии O-ацил-L-малатов в координатах Лайнуивера-Берка (А) и от концентрации O-бутироил-L-малата в присутствии сукцината (3 мМ) в координатах Диксона.

повышают KM по сукцинату, не влияя на максимальную скорость сукцинатоксидазы митохондрий печени (рис. 4А) и клеток дрожжей (рис. 5А). Это означает, что в данном случае эти соединения обратимо взаимодействуют с точкой связывания субстрата в дикарбоксилатных транспортерах.

Сукцинатдегидрогеназа. Активный центр сукцинатдегидрогеназы доступен с матриксной стороне внутренней мембраны, поэтому для измерения ее активности использовали сукцинат:феррицианид-редуктазную реакцию инвертированных субмитохондриальных частиц.

Малонат является одним из наиболее эффективных ингибиторов сукцинатдегидрогеназы. По нашим данным его Ki равна 8,2 ± 0,16 мкМ (3) (см. табл. 2).

Как видно из данных на рис. 6, метилмалонат, а особенно 2,2-диметилмалонат, связываются с ферментом существенно слабее малоната. В то же время, связывание с Рис. 5. Зависимость скорости дыхания клеток S. cerevisiae (5 мг сырого веса в 1 мл) от концентрации сукцината в присутствии O-стеароил-L-малата в координатах Лайнуивера-Берка (А) и от концентрации ингибитора в присутствии сукцината (24 Мм) в координатах Диксона (Б) Таблица 2. Зависимость ингибирования сукцинат:феррицианид-редуктазной реакции субмитохондриальных частиц печени крысы от количества атомов углерода в алкильном заместителе производного малоната.

ферментом 2,2-дигексилмалоната и 2-гексилмалоната происходит с близкими константами (см. табл. 2). Это означает, что, по-видимому, вблизи точки связывания дикарбоксилатов существуют стерические препятствия для связывания производных малоната.

Необходимо отметить, что низшие моно- и диалкилмалонаты с одинаковой длиной заместителя имеют близкое сродство к дикарбоксилатному транспортеру митохондрий (табл. 3). Это означает, существование просторной зоны вблизи точки связывания субстрата в транспортере, в отличие от фермента.

Таблица 3. Константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крыс для низших 2-алкилмалонатов и 2,2-диалкилмалонатов с одинаковыми заместителями.

заместитель в атомов C в 2-алкилмалоната 2,2-диалкилмалоната Как следует из рис. 6, по мере увеличения длины алифатической цепи 2-алкилмалонатов Ki увеличивается, достигая максимального значения для бутилмалоната. Однако, начиная с бутилмалоната и по крайней мере до додецилмалоната, Ki начинает снижаться в соответствии с уравнением: lgKi = -0,211n - 0,958.

По-видимому, такое изменение характера ингибирования сукцинатдегидрогеназы свидетельствует о выходе концевых участков алифатической цепи высших алкилмалонатов из зоны стерических ограничений. Кроме того, поскольку по мере увеличения n наблюдается увеличение эффективности алкилмалонатов, эти концевые участки вступают в липофильные взаимодействия с липофильными остатками аминокислот в активном центре фермента.

Рис. 6. Зависимость константы ингибирования сукцинат:феррицианид-редуктазы субмитохондриальных частиц печени крыс для 2-алкилмалонатов и 2,2-диалкилмалонатов от количества атомов C (n) в алифатических остатках этих ингибиторов Коэффициент распределения O-ацил-L-малонатов в системе октанол/вода увеличивается с увеличением n с инкрементом lgR около 0,40 (рис. 1). В то же время инкремент lgKi для сукцинатдегидрогеназы существенно ниже (0,211). Это означает, что в активном центре сукцинатдегидрогеназы присутствуют как липофильные, так и гидрофильные остатки аминокислот и их соотношение таково, что липофильные взаимодействия с ингибитором не достигают максимально возможных значений, которые реализуются в системе октанол/вода.

Дикарбоксилатный транспортер митохондрий печени крыс. Зависимость lgKi от n для 2-алкилмалонатов имеет сложный характер (см. рис. 7). Так, n от 1 до 3 lgKi снижается («малый липофильный участок»). Затем наблюдается область с практически одинаковыми значениями Ki, в которую входят малонаты с n от 3 до 7 (полярный участок вблизи точки связывания субстратов). Затем имеет место крутое линейное снижение lgKi на участке с n 7 до 13 («большой липофильный участок»), с которого начинается замедленное снижение lgKi вплоть до 2-гептадецилмалоната («липофильно-гидрофильная область»).

Рис. 7. Зависимость константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крыс 2-алкилмалонатами и O-ацил-L-малатами от количества атомов C (n) в алифатической цепи ингибиторов Зависимость lgKi от n для O-ацил-L-малатов имеет значительное сходство с соответствующей зависимостью для 2-алкилмалонатов. Так, для низших ацилмалатов с n от 3 до 7 имеет место площадка. Затем наблюдается линейное снижение lgKi до n, равного 13, и в области высших производных наблюдается замедление этого снижения по крайней мере до n, равного 17. Надо отметить, что ацилмалаты не позволяют провести зондирование «малого липофильного участка» вблизи с точкой связывания субстратов в транспортере, т.к. размеры полярной головки у этих соединений больше, чем у малатов Таблица 4. Константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крысы для O-ацил-L-малатов и O-ацил-D-малатов с одинаковым заместителем.

Особенностью действия O-ацил-L-малатов является то, что их Ki примерно на порядок выше Ki 2-алкилмалонатов (см. рис. 7), хотя константы ингибирования транспорта сукцината через дикарбоксилатный транспортер для L-малата и малоната близки и составляют соответственно 0,5 мМ и 0,35 мМ. Такое снижение сродства, по-видимому, связано с блокированием OH-группы в молекуле малата, присоединением по ней остатка жирной кислоты. Эта группа может принимать участие в связывании L-малата в активном центре транспортера и блокирование ее может снизить сродство O-ацил-L-малатов к точке связывания субстратов. Роль гидроксильной группы в связывании L-малата подтверждается, меньшим сродством D-малата (Ki в 2,5 раза выше), и близким сродством к транспортеру O-ацил-L-малатов и O-ацил-D-малатов (табл. 4).

Зависимость Ki от n для высших 2-алкилмалонатов с n от 7 до 13 подчиняется уравнению: lgKi = - 0,39n + 0,49, а для O- ацилмалатов в этой же зоне, уравнению:

lgKi = -0,38n + 1,41. Из этих данных следует, что инкремент lgKi для обеих зависимостей существенно превышает соответствующий инкремент для сукцинатдегидрогеназной зависимости (0,211), но совпадает с инкрементом для lgR в зависимости коэффициента распределения O-ацил-L-малатов в системе октанол/вода при pH 7,2 (0,41). Это свидетельствует о преимущественно липофильном взаимодействии алифатической цепи ингибитора в соответствующей зоне активного центра транспортера. Вместе с тем инкремент lgKi на участке активного центра транспортера, соответствующем n от 13 до 17, (см. рис. 7) близок к инкременту lgKi для сукцинатдегидрогеназы, что, по-видимому, можно рассматривать как признак выхода концевого участка молекул ингибитора из канала переносчика, в котором присутствуют как полярные, так и липофильные аминокислотные остатки.

Зависимость lgKi от n для,-Алкилендималонатов сходна с соответствующей зависимостью для 2-алкилмалонатов (см. рис. 8). На ней имеет место плато на начальном участке зависимости до n, равного 6, и снижение lgKi на участке с n от 6 до 11.

По-видимому, равноудаленные от точки связывания субстрата метиленовые звенья ингибиторов всех трех гомологических рядов (O ацил-L-малаты, 2-алкилмалонаты и,алкилендималонаты) взаимодействуют с одинаковыми зонами в транспортере.

Разница в связывании производных с алифатической цепью одинаковой длины для 2-алкилмалонатов и,-алкилендималонатов обусловлена дополнительной малонатной группировкой. По-видимому, наличие второй полярной группы в ингибиторе препятствует липофильному взаимодействию,-алкилендималоната с «малым липофильным участком» активного центра транспортера.

Рис. 8. Зависимость константы ингибирования сукцинатоксидазы митохондрий печени крыс,-алкилендималонатами от количества атомов C (n) в алифатической цепи ингибитора.

Дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны дрожжей.

На рис. 9 видно, что lgKi O-ацил-L-малатов линейно зависит от n в диапазоне n от 14 до (т.е. на протяжении ~0,6 нм), в соответствии с уравнением: lgKi = - 0,51n + 2,99.

Из этого уравнения следует, что зависимость характеризуется высоким инкрементом lgKi, который близок или даже несколько превышает соответствующий инкремент для коэффициента распределения (R) производных L-малата в системе октанол/вода (). Эта зависимость имеет место при таких n (см. рис. 9), при которых в случае дикарбоксилатного транспортера митохондрий наблюдается переход в «липофильногидрофильную область» активного центра. По-видимому, такая особенность транспортера плазматической мембраны S. cerevisiae связана с тем, что активный центр у плазматического транспортера в области выхода из канала имеет более липофильное окружение, чем у митохондриального транспортера.

Рис. 9. Зависимость константы ингибирования дыхания клеток S. cerevisiae с сукцинатом O-ацил-L-малатами от количества атомов C (n) в алифатической цепи ингибиторов Другой особенностью дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны дрожжей является то, что в данном случае Ki O-ацил-L-малатов (рис. 9) примерно на порядок выше, чем Ki этих соединений для митохондриального транспортера (рис. 7). Повидимому, основная причина этого связана с тем, что в данном случае измерения проводятся в среде с pH 5,5 (на митохондриях печени– pH 7,2). Кроме того надо отметить, что сродство сукцината к митохондриальныму и дрожжевыму транспортерам отличается почти на порядок (1,03 и 7,3 мМ, соответственно).

Необходимо заметить, что дикарбоксилатный транспортер плазматической мембраны клеток S. cerevisiae относится к другому типу переносчиков, чем соответствующий транспортер митохондрий. В отличие от дикарбоксилатного транспортера митохондрий, который является антипортером, транспортер плазматической мембраны переносит субстраты в симпорте с протонами.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В работе используется набор производных субстратов дикарбоксилатного транспортера, представляющих собой субстрат с липофильным алифатическим заместителем различной длины (рис. 11). Поскольку эти соединения, являясь конкурентными ингибиторами, взаимодействуют с точкой связывания субстратов, они является своеобразным калибровочным устройством, позволяющим зондировать окружение вблизи точки связывания субстрата с шагом, равным длине метиленового звена. При этом уменьшение сродства после удлинения ингибитора на одно метильное звено интерпретируется как наличие стерических препятствий в области этого звена.

Увеличение же сродства рассматривается как признак попадания этого звена в липофильное окружение на данном расстоянии от точки связывания субстрата.

Зондирование активного центра сукцинатдегидрогеназы (рис. 6 и табл. 3) с помощью моно- и диалкилмалонатов показало, что на расстоянии 0,38 – 0,62 нм от точки связывания субстрата в активном центре фермента есть стерическое препятствие.

На расстоянии от 0,62 до 1,2 нм от точки связывания субстрата в ферменте присутствует область, в которой, по-видимому, присутствуют равномерно распределенные липофильные и гидрофильные остатки аминокислот, так как инкремент lgKi в этой области в два раза ниже характерного для липофильного окружения (рис. 1).

Рис. 10. Модель функционирования транспортера дикарбоксилатов.

При освобождении субстрата (S2-) канал остается открытым, чему способствует положительно заряженные группы в канале, локализованные на подвижных -спиралях.

После нейтрализации зарядов, что происходит при связывании субстрата, переносчик флуктуирует между двумя альтернативными состояниями в результате теплового движения подвижных мембранных сегментов (обозначены серым). При наличии двух субстратов (S1 и S2) может происходить их обмен в точке связывания.

В дикарбоксилатном транспортере митохондрий печени крыс область вблизи точки связывания субстратов просторна. Ее диаметр составляет не менее 0,72 нм (диаметр молекулы дилкилмалоната при параллельном расположении алифатических заместителей) (см. рис. 11). В то же время гидрофильная зона на расстоянии 0,45 – 0,72 нм от точки связывания субстрата, сменяется липофильной, на расстоянии до 1,7 нм, и снова липофильно-гидрофильной с инкрементом, близким к характерному для просторной зоны сукцинатдегидрогеназы.

Возможно, в отличие от транспортеров в сукцинатдегидрогеназе вблизи аминокислотных остатков, связывающих дианион субстрата, существуют дополнительные остатки, обеспечивающие за счет многоточечного взаимодействия, высокое сродство фермента к малонату. Они то и создают стерические препятствия.

Результаты зондирования активного центра дикарбоксилатного транспортера митохондрий крыс с помощью трех рядов ингибиторов (рис. 7 и 8) показали, что. малый липофильный домен вблизи точки связывания субстрата (расстояние 0,4 – 0,72 нм) и большой липофильный домен (расстояние 1,2 – 1,9 нм) разделены гидрофильной областью (расстояние 0,72 – 1,2 нм), в котором отсутсвуют положительно заряженные аминокислотные остатки. Если увеличение гидрофильности в зоне 1,9 – 2,3 нм свидетельствует о достижении относительно полярного выхода из канала, то точка связывания субстрата погружена вглубь транспортера и находится примерно в 2 нм от поверхности мембраны. Эти результаты позволяют поместить точку связывания дикарбоксилата на модели в центр транспортера. В просторную область, диаметром не менее 0,72 нм. Возможно, консервативный Arg-69, локализованный в центре сегмента II, может входить в ее состав. Гидрофильная область канала способствует проникновению к точке связывания гидрофильного субстрата, а большой липофильный домен является элементом воротного механизма.

Рис. 11. Основные субстраты дикарбоксилатного транспортера и его конкурентные ингибиторы, использованные в данной работе для зондирования активного центра переносчика Сравнительное зондирование двух транспортеров (рис. 7 и 9), принадлежащих эволюционно далеким организмам и отличающихся по механизму действия показало, что достаточно протяженная липофильная зона (0,6 нм), занимающая по крайней мере четверть длины канала, удаленная от точки связывания дикарбоксилатов на 1,2 нм присутствует и в дикарбоксилатном транспортере плазматической мембраны S. сerevisiae (рис. 9). Таким образом, канал с поверхностью, выстланной гидрофобными аминокислотными остатками между точкой связывания субстрата с одной стороны и выходом из канала является общей особенностью плазмолеммного и митохондриального транспортеров, для симпортера и антипортера.

В построении модели функционирования дикарбоксилатного транспортера митохондрий (рис. 10 и 11) использованы литературные и изложенные выше экспериметальные данные. Канал образован двумя одинаковыми субъединицами.

Трансмембранный -спиральный сегмент II, содержащий в центре инвариантный остаток аргинина – подвижный. Дикарбоксилат нейтрализует положительные заряды точки связывания и способствует открыванию транспортера на противоположную сторону мембраны в ходе тепловой флуктуации. Если там присутствует субстрат, то происходит обмен. Флуктуации канала транспортера без субстрата невозможно. Наши данные позволяют количественно описать переменную липофильность стенок канала по мере удаления от точки связывания субстрата и объяснить функциональный смысл этого (см.

выше). Существование раздвигающихся сегменьов согласуется с движением относительно друг друга гидрофильных петель, связанных с этими сегментами в ходе акта транспорта.

Последнее продемонстрированоКлингенбергом и соавторами для аденилатного переносчика дрожжей.

ВЫВОДЫ

1. Проведено зондирование активного центра функционирующих дикарбоксилатных транспортеров митохондрий печени крыс и плазматической мембране клеток S.

cerevisiae с помощью набора алкил- и ацил-производных малата и малоната.

2. Показано, что в активном центре транспортера митохондрий присутствуют большой и малый липофильные домены, разделенные полярным участком. В канале транспортера присутствует только одна точка связывания субстратов, в области которой отсутствуют стерические препятствия для связывания субстратов. Показано, что гидроксильная группа L-малата участвует в связывании этого субстрата в транспортере.

3. Показано, что в функционирующей сукцинатдегидрогеназе печени крыс область связывания субстрата имеет размеры, создающие стерические препятствия для связывания аналогов субстрата. Однако вблизи этой области находится просторный липофильно-гидрофильный участок.

4. Обнаружено, что в активном центре дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны дрожжей также присутствует большой липофильный домен, который, повидимому, является обязательным элементом активного центра транспортеров.

5. Разработан метод оценки проницаемости клеток S. cerevisiae для амфифильных кислот.

Показано, что O-ацил-L-малаты не проникают в клетки и поэтому взаимодействуют только с дикарбоксилатным транспортером плазматической мембраны.

6. Установленные функционально важные особенности структуры активного центра дикарбоксилатного транспортера использованы для конкретизации модели функционирования дикарбоксилатного транспортера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Шольц К.Ф., Мамаев Д.В. Взаимодействие цитохрома с с белками митохондрий и цибакрон-декстраном. // Биохимия 1985 Т. 50. №11. С. 1877 - 1883.

2. Мамаев Д.В., Шольц К.Ф. Взаимодействие цитохрома с с сукцинатоксидазой и ротеноннечуствительной НАДН-оксидазой в межмембранном пространстве. "Молекулярные механизмы и регуляция энергетического обмена", Всесоюз. конференция 11-13 июня 1986 г., Пущино. Тезисы докладов.

3. Шольц К.Ф., Мамаев Д.В., Гладких А.Г. Взаимодействие 2-алкилмалонатов с дикарбоксилатным переносчиком в интактных митохондриях. // Доклады АН СССР 1987. Т. 294. С. 1509 - 1514.

4. Sholtz K.F., Mamaev D.V. Mechanism of dicarboxylate carrier action: conformational or rotatory model". Abstracts of international conference "Chemical Physics of Enzyme Catalysis" (Tallinn, Sept., 21-22, 1987) Р. 143.

5. Шольц К.Ф., Мамаев Д.В., Бондаренко Д.И., Лагутина Л.С. Особенности взаимодействия 2-алкилмалонатов с центром связывания субстратов дикарбоксилатного переносчика митохондрий печени крыс. // Биохимия. 1990. Т. 55. № 10. С. 1832 - 1840.

6. Sholtz K.F., Bondarenko D.I., Mamaev D.V. Probing the active center of the mitochondrial dicarboxylate transporter. // FEBS Lett. 1993. V. 327. № 1. P. 54 - 56.

7. Бондаренко Д.И., Мамаев Д.В., Шольц К.Ф. Локализация точек связывания субстратов в дикарбоксилатном транспортере митохондрий. // Доклады АН. 1996. Т. 349. № 3. С.

408 - 410.

8. Aliverdieva D.A., Mamaev D.V., Bondarenko D.I., Sholtz K.F. Studies on cell respiration of Saccharomyces cerevisiae: physiological significance of dicarboxylate transporter of plasma membrane. Abstracts of the Meeting of the FEBS (30.06.-5.07.2001), Lisbon, Portugal.

(Poster PW8-005), P.223.

9. Аливердиева Д.А., Мамаев Д.В., Бондаренко Д.И., Шольц К.Ф. Роль дикарбоксилатного транспортера плазматической мембраны в дыхательной активности клеток Saccharomyces cerevisiae. Тезисы научных докладов на III съезде биохимического общества (26.06. - 01.07.2002, Санкт-Петербург), С.237-238.



 


Похожие работы:

«Александрова Елена Александровна Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1. Специальность – 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 Работа выполнена в группе геномного анализа сигнальных систем клетки Учреждения Российской...»

«Круглик Ольга Витальевна Реакция организма здоровых животных и животных с асцитной карциномой Эрлиха на воздействие сверхвысокочастотного электромагнитного излучения Специальность – 03.02.08 (экология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Красноярск, 2014 Работа выполнена в ФГАОУ ВПО Сибирский федеральный университет и ФГБУН Красноярский научный центр Сибирского отделения Российской академии наук доктор физико-математических наук,...»

«Пиотровский Михаил Сергеевич Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 1 Работа выполнена в лаборатории мембран растительных клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва Научный руководитель :...»

«Семенова Ольга Владимировна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА НАСЕЛЕНИЯ ЖУЖЕЛИЦ ПАРКОВОЙ ЗОНЫ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА НА ПРИМЕРЕ НИЖНЕГО ТАГИЛА 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург - 2008 2 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской Академии Наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Ольшванг Владимир Николаевич Официальные оппоненты : доктор...»

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«Тихомирова Людмила Ивановна ОСОБЕННОСТИ ИНДУЦИРОВАННОГО МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ У РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЭКСПЛАНТОВ IN VITRO КУЛЬТИВАРОВ ВИДОВ РОДА IRIS L. Специальность 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул, 2011 2 Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Научно-исследовательский институт садоводства Сибири имени М.А. Лисавенко Российской академии сельскохозяйственных наук (НИИСС)...»

«Федорова Наталья Петровна МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ЗАЩИТНО-ПРИСПОСОБИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ КОЖИ И ТИМУСА ПРИ ПОВРЕЖДАЮЩИХ И КОРРИГИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ 03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого...»

«Емельянов Алексей Валерьевич ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ МОНИТОРИНГА И УПРАВЛЕНИЯ РЕСУРСАМИ ОБЫКНОВЕННОГО БОБРА (CASTOR FIBER LINNAEUS, 1758) В БАССЕЙНАХ СРЕДНИХ РЕК 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов – 2013 1 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского на кафедре морфологии и экологии животных и в ФГБОУ ВПО Тамбовский государственный...»

«Пятакова Наталья Владимировна Регуляция активности растворимой гуанилатциклазы 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научноисследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича Российской академии медицинских наук (ФГБУ ИБМХ РАМН) доктор биологических наук, профессор, Научный руководитель : Северина Ирина Сергеевна...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«Дмитриев Павел Александрович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ПСАММОФИТНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ПЕСЧАНЫХ МАССИВАХ БАССЕЙНА ДОНА (В ГРАНИЦАХ РОСТОВСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре генетики и в Научно-исследовательском институте биологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, доцент...»

«ЗИНОВЬЕВ Андрей Валерьевич CРАВНИТЕЛЬНАЯ АНАТОМИЯ, СТРУКТУРНЫЕ ПРЕОБРАЗОВАНИЯ И АДАПТИВНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ АППАРАТА ДВУНОГОЙ ЛОКОМОЦИИ ПТИЦ 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на Биологическом факультете Московского государственного университета им. М. В. Ломоносова и Биологическом факультете Тверского государственного университета Научный консультант : доктор биологических наук, профессор...»

«ТУЖИКОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ФИТАСПАЗЫ NICOTIANA TABACUM 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов Научно-исследовательского Института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. доктор химических наук, профессор Научные руководители:...»

«ВАСИЛЬЧЕНКО Алексей Сергеевич ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ БАКТЕРИЙ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.02.03 – микробиология Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет на кафедре микробиологии и в Центре коллективного пользования приборным оборудованием Институт микро- и нанотехнологий доктор медицинских...»

«Сидоренко Марина Леонидовна ВЛИЯНИЕ АБИОТИЧЕСКИХ И БИОТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ ПОЧВЕННЫХ ЭКОСИСТЕМ НА РОСТ И РАЗМНОЖЕНИЕ ПАТОГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ 03.00.27 - Почвоведение 03.00.07 - Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток - 2003 2 Работа выполнена в лаборатории почвоведения и экологии почв Биологопочвенного института ДВО РАН и в лаборатории экологии патогенных бактерий НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН. Научные...»

«ПЕРЕВОЗОВ Александр Георгиевич ИЗМЕНЕНИЯ СООБЩЕСТВ ГНЕЗДЯЩИХСЯ ПТИЦ ВДОЛЬ ВЫСОТНОГО ГРАДИЕНТА НА ЗАПАДНОМ КАВКАЗЕ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2010 2 Работа выполнена на кафедре экологии и защиты окружающей среды ГОУ ВПО Майкопский государственный технологический университет доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Акатов Валерий Владимирович доктор...»

«САРАНЦЕВА Светлана Владимировна РОЛЬ ГЕНОВ ПРЕСЕНИЛИНА 1 И БЕЛКА ПРЕДШЕСТВЕННИКА АМИЛОИДА В ДИСФУНКЦИИ СИНАПСОВ ПРИ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2012 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова Научный консультант : доктор биологических наук Шварцман Александр Львович, Федеральное...»

«Каплан Игорь Борисович Сборка вирионов и распространение в растении разных групп фитовирусов 03.02.02 – Вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и на кафедре фитопатологии Корнельского университета (г. Итака, США) Научный консультант : доктор биологических наук, профессор, академик РАН...»

«БИЗИКОВ Вячеслав Александрович ЭВОЛЮЦИЯ ФОРМЫ И ФУНКЦИИ РАКОВИНЫ ГОЛОВОНОГИХ МОЛЛЮСКОВ ПОДКЛАССА COLEOIDEA 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва-2008 1 Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор; член-корреспондент РАН Малахов Владимир Васильевич, Московский государственный университет имени...»

«Брежнева Ирина Николаевна МЕТОДИКА ОЦЕНКИ АЭРОТЕХНОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ НА ФИТОСТРОМУ ПРИ СТРОИТЕЛЬСТВЕ СКВАЖИН (на примере Оренбургского Предуралья) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург – 2010 2 Работа выполнена в Волго-Уральском научно-исследовательском и проектном институте нефти и газа, г. Оренбург доктор биологических наук, профессор, Научный Рябинина Зинаида Николаевна руководитель доктор...»














 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.