WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЕРМОЛЕНКО Дмитрий Николаевич

ИЗУЧЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТИ И СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКОВ

НА ПРИМЕРЕ УБИКВИТИНА И ПЕРОКСИДАЗЫ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2003

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре биохимии и молекулярной биологии колледжа медицины Пенсильванского государственного университета.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук А.В. Жердев

Научный консультант:

кандидат физико-математических наук Г.И. Махатадзе

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий, доктор биологических наук, профессор В.В. Месянжинов

Ведущая организация:

химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится 28 октября 2003 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д.

33, корп. 2, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан сентября 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Механизм сворачивания полипептидной цепочки является одной из важнейших проблем, находящихся на стыке молекулярной биологии, физической химии и химии полимеров. Со времени классических работ Анфинсена известно, что аминокислотная цепочка белка сворачивается в одну уникальную пространственную структуру; иными словами, последовательность аминокислот однозначно определяет третичную структуру белка. Однако принцип соответствия между последовательностью аминокислот и пространственной структурой белка (“вторая половина генетического кода”) остается неизвестным.





Несмотря на то, что в понимании термодинамики сворачивания был достигнут сравнительно большой прогресс, факторы, стабилизирующие белковую молекулу, нуждаются в более детальном исследовании.

Аминокислотные остатки, спрятанные в гидрофобном ядре, традиционно считаются ключевыми в фолдинге белка. Предполагалось, что поверхностные остатки практически не влияют на стабильность и фолдинг белка. Однако в самое последнее время появились сообщения о том, что в ряде случаев эти аминокислотные остатки вносят существенный вклад в термодинамическую стабильность белка и участвуют в сворачивании. В связи с этим роль поверхности белка в его стабилизации и сворачивании, ранее в значительной степени недооцененная, требует дальнейшего изучения.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в характеристике влияния поверхностных остатков на стабильность и фолдинг белка, а также в выявлении факторов, определяющих вклад поверхностных аминокислот в стабильность белка. Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

• систематизировать литературные данные о роли поверхностных остатков в стабилизации и сворачивании белка;

• экспериментально охарактеризовать вклад взаимодействий поверхностных остатков в стабильность белка на примере дрожжевого убиквитина;

• изучить роль белковой поверхности в сворачивании на примере влияния антител на ренатурацию пероксидазы хрена из гуанидин-гидрохлорида.

Научная новизна. На основании анализа литературных данных сделан вывод о том, что вклад поверхностных остатков в стабильность белка определяют такие факторы, как разная способность аминокислот к образованию -спиралей, -структур и петель в белках, взаимодействие заряженных остатков, образование стабилизирующих гидрофобных контактов, обратный гидрофобный эффект, разная конформационная подвижность аминокислот в поворотах и петлях основной цепочки. В экспериментальной части работы на основании сравнения термодинамических параметров сворачивания мутантных форм дрожжевого убиквитина продемонстрировано, что поверхностные аминокислотные остатки вносят существенный вклад в стабильность белка. Показано, что шкалы энергии образования -спирали в расчете на один остаток для незаряженных аминокислот в середине и на С-конце -спирали не отличаются. Установлено, что неполярные аминокислоты, частично экспонированные на белковой поверхности, существенно стабилизируют белок за счет гидрофобных взаимодействий. На примере пероксидазы хрена продемонстрировано, что взаимодействие белковой поверхности с моноклональными антителами может способствовать сворачиванию белка, увеличивая выход активного фермента при ренатурации.

Практическая значимость работы. Описанный в работе стабилизирующий эффект гидрофобных взаимодействий на частично экспонированных позициях позволяет рекомендовать введение с помощью генной инженерии гидрофобных аминокислот на поверхность белковой глобулы как средство повышения стабильности белков, применяемых в биотехнологии. Обнаруженное увеличение выхода ренатурации пероксидазы хрена в присутствии моноклональных антител может быть использовано при рефолдинге рекомбинантного фермента из тел включения.





представлены на конференции “Biocatalysis–2002: Fundamentals & Applications” (Москва, Россия, 2002), 16-м симпозиуме “Symposium of the Protein Society” (СанДиего, США, 2002), 16-й ежегодной конференции “Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics” (Корбандейл, США, 2002), 5-м симпозиуме “European Symposium of the Protein Society” (Флоренция, Италия, 2003) и 7-й конференции “Hopkins Folding Meeting” (Беркли Спрингс, США, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения (2 главы), выводов и списка литературы, включающего 258 ссылок. Работа изложена на 124 страницах, содержит 5 таблиц и 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Мутагенез и экспрессия мутантных вариантов убиквитина. Ген дрожжевого убиквитина был клонирован в плазмиду – производную вектора pVЕX.

В полученной конструкции ген убиквитина с присоединенным к С-концу гексагистидиновым тагом находился под контролем изопропил--D-тиогалактозид индуцируемого Т7 промотора. Аминокислотные замены были произведены с помощью Quick-Change Site-Directed Mutagenesis kit (Stratagene, США). Наличие каждой мутации подтверждали секвенированием. Экспрессию мутантных вариантов убиквитина проводили в штамме BL21 (DE3) Escherichia coli.

Рекомбинантные белки изолировали с помощью аффинной хроматографии на NiNTA агарозе (Novogene, США) и гель-фильтрации на сефадексе G-50.

Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина с помощью микрокалориметрии. Эксперименты проводили в 30 мМ глициновом буфере, рН 2,0-3,5, сканируя образцы с помощью калориметра VP-DSC (MicroCal, США) со скоростью 1,5 оС в минуту. Каждую калориметрическую кривую аппроксимировали с помощью модели двух состояний с энтальпией разворачивания (Hcal), изменением теплоемкости разворачивания (Cp) и температурой плавления (Tm) как независимыми параметрами.

Термодинамические параметры сворачивания вычисляли в соответствии со следующими уравнениями:

где S(T) и G(T) – функции энтропии и свободной энергии Гиббса.

Все приведенные ниже термодинамические параметры вычислены для рН 3,0, 65 оС.

Измерение спектров кругового дихроизма (КД). Спектры измеряли с помощью спектрофотометра Jasco-715 (Jasco Corporation, Япония). Значение эллиптичности,, конвертировали в эллиптичность на один аминокислотный остаток, [], в соответствии с формулой:

где l – длина оптического пути в см, c – концентрация белка в мг/мл, MWR – средняя масса аминокислоты в белке.

Очистка моноклональных антител против пероксидазы. Антитела очищали с помощью преципитации в 40% сульфате аммония и аффиной хроматографии на цианбромид-сефарозе, модифицированной нативной пероксидазой хрена.

Денатурация и ренатурация пероксидазы. Пероксидазу хрена (изофермент С, RZ=A403/A280=3,0, Biozyme, Великобритания) денатурировали в 6–6,5 М гуанидин-гидрохлориде 12–16 часов. Ренатурацию инициировали 40 или 100кратным разведением препарата в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 100 мМ хлорида натрия, или в 125 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, в присутствии антител или без них.

Измерение каталитической активности пероксидазы. Образцы ренатурированной или нативной пероксидазы в 8–12 разведениях инкубировали с о-дианизидином или диаммониевой солью 2,2'-азино-бис3-этилбензтиазолин-6сульфоновой кислоты (АБТС) в присутствии пероксида водорода в течение минут при комнатой температуре в 96-луночном планшете. Оптическую плотность продукта реакции окисления измеряли при 450 нм (о-дианизидин) или 405 нм (АБТС) на вертикальном фотометре Multiscan EX (Labsystems, Финляндия).

Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ. Стандартный препарат пероксидазы иммобилизовали в лунках полистироловых планшетов (Costar, США). После отмывки не связавшихся молекул в планшеты вносили пробы, содержащие нативную или ренатурированную пероксидазу, и инкубировали в присутствии моноклональных антител против пероксидазы в течение часа при 37 оС. Затем планшет снова отмывали и инкубировали с антителами против иммуноглобулинов мыши, меченными щелочной фосфатазой (ICN Biomedicals, США). Ферментативную активность иммобилизованной фосфатазы определяли в реакции с р-нитрофенил фосфатом. Оптическую плотность продукта реакции измеряли при 405 нм на вертикальном фотометре Multiscan EX.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков в стабильность убиквитина. Для исследования влияния поверхностных остатков на стабильность белка были выбраны три аминокислоты с разной степенью экспонированности, оцененной с помощью программы NACCESS на основании известной кристаллической структуры убиквитина:

аспарагиновая кислота в позиции 32, лизин в позиции 33 и глутаминовая кислота в позиции 34. Аспарагиновая кислота 32 находится на экспонированной в воду стороне С-конца единственной -спирали убиквитина, боковая цепочка остатка на позиции 32 полностью доступна для растворителя. Лизин 33 является последним остатком -спирали убиквитина. Этот остаток расположен на поверхности убиквитина, однако только 50% поверхности его боковой цепочки доступно для растворителя. Наконец, глутаминовая кислота 34 является первым промежуточным остатком между -спиралью и следующим за ней поворотом основной цепочки. Для растворителя доступно только 30% поверхности ее боковой цепочки. Таким образом, выбранные позиции охватывают широкий спектр экспонированности, что позволяет выяснить, как изменение данного параметра влияет на стабильность белка.

На каждой из выбранных позиций с помощью сайт-направленного мутагенеза был сделан ряд аминокислотных замен: на позиции 32 – 11 замен (A, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V)*;* на позиции 33 – 12 замен (A, Е, F, G, I, L, M, N, Q, S, T, V); на позиции 34 – 19 замен (все природные аминокислоты). Данный набор охватывает * В работе использованы следующие обозначения аминокислот: A – аланин, С – цистеин, D – аспарагиновая кислота, E – глутаминовая кислота, F – фенилаланин, G – глицин, H – гистидин, I – изолейцин, K – лизин, L – лейцин, M – метионин, N – аспарагин, P – пролин, Q – глутамин, R – аргинин, S – серин, T – треонин, V – валин, W – триптофан, Y – тирозин.

практически весь спектр различий между остатками в химической природе, геометрии и размере боковой цепи, а также способности образовывать -спираль.

Рекомбинантные белки были экспрессированы в клетках E. coli;

термодинамическую стабильность различных вариантов убиквитина измеряли методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Вклад аминокислотных остатков в стабильность белка на каждой позиции оценивали по величинам изменения энергии Гиббса разворачивания (G) и температуры плавления (Tm) в результате мутаций. Чтобы выявить, какие факторы и какие типы взаимодействий влияют на термодинамическую стабильность белка на каждой из позиций, была изучена корреляция между наблюдаемыми изменениями в стабильности и свойствами аминокислот.

Вклад разной способности аминокислот образовывать -спираль в стабильность убиквитина. Для полученных вариантов убиквитина с заменами на позиции 32 были определены термодинамические параметры разворачивания (табл. 1), характеризующие стабильность белка.

Таблица 1. Влияние аминокислотных замен на позиции Аминокислотный остаток Tm – температура плавления убиквитина при рН 3,0, G – изменение свободной энергии разворачивания относительно аланина, усредненное по измерениям при пяти значениях рН.

Как видно из таблицы, аминокислотные замены на поверхности убиквитина на позиции 32 ведут к существенным изменениям в стабильности белка. Самым стабильным вариантом является аланин, наименее стабилен из выбранных аминокислот глицин, наихудший остаток для формирования -спирали после пролина. Разница между этими вариантами весьма значительна – больше семи градусов в температуре плавления и около 4,5 кДж/моль в терминах свободной энергии сворачивания.

Экспериментально определенные изменения стабильности в результате аминокислотных замен на предпоследней позиции в -спирали убиквитина (позиции 32) очень хорошо коррелируют со шкалой энергии образования спирали (рис. 1). Это позволяет сделать вывод о том, что изменения стабильности в результате аминокислотных замен на позиции 32 определяет разная тенденция аминокислот образовывать -спираль.

Рис. 1. Корреляция между экспериментально измеренными изменениями стабильности убиквитина (по оси ординат), вызванными аминокислотными заменами на конце -спирали на позиции 32, G(X32), и унифицированной шкалой энергии образования спирали на один остаток относительно аланина (по оси абсцисс), основанной на экспериментальных данных об эффекте замен в центре спирали белков и пептидов, G(P&S) (по Pace and Scholtz). Коэффициент корреляции и угол наклона прямой составляют 0,93 и 1,05 соответственно.

Ранее на основании экспериментов с модельными пептидами в работах группы Луиса Серрано (Luis Serrano) был сделан вывод о том, что для остатков в середине и на конце -спирали шкала энергии спиралеобразования существенно отличается. Однако наши данные не подтверждают это предположение для незаряженных аминокислот (см. рис. 1). Существенное различие между нашими данными и результатами исследования пептидов, по-видимому, объясняется последние остатки в аминокислотной последовательности пептида на самом деле не принадлежат -спирали.

Гидрофобные взаимодействия на частично экспонированных позициях на поверхности убиквитина. Последний остаток -спирали на позиции заменялся набором аминокислот, использованных на позиции 32, а также глутаминовой кислотой. Представленные в таблице 2 данные свидетельствуют о весьма значительном влиянии на стабильность белка аминокислотных замен на позиции 33. Разница между наиболее (изолейцин) и наименее (глицин) стабильными вариантами составляет около 12 кДж/моль в энергии Гиббса и 20 оС в температуре плавления.

Таблица 2. Влияние аминокислотных замен на позиции Аминокислотный остаток Tm – температура плавления при рН 3,0, G – разница в свободной энергии разворачивания относительно аланина, усредненная по измерениям при пяти значениях рН.

Как и на позиции 32, наиболее дестабилизирующими оказываются остатки с худшими после пролина способностями образовывать -спираль – глицин и аспарагин. Однако, в отличие от позиции 32, где самым стабильным был лучший для -спирали остаток, аланин, на позиции 33 максимальный стабилизирующий эффект наблюдается для гидрофобных аминокислот изолейцина, лейцина, валина и метионина. Таким образом, разная способность аминокислот образовывать -спираль частично определяет изменения в стабильности на позиции 33. Другим фактором, влияющим на стабильность на позиции 33, повидимому, является гидрофобность аминокислот. Это неожиданно с учетом того, что гидрофобный эффект и Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия обычно связывают с остатками, спрятанными в неполярном ядре белковой молекулы.

Стабилизирующий эффект присутствия неполярных аминокислот на белковой поверхности, обнаруженный на позиции 33, оказался еще более значительным на позиции 34. Наблюдаемые изменения стабильности вариантов убиквитина, отличающихся по одной поверхностной аминокислоте, очень велики (рис. 2 и таблица 3). Температура плавления варьируется в диапазоне 45 оС, свободная энергия разворачивания – в диапазоне более чем 20 кДж/моль.

Теплоемкость, кДж/моль*К Рис. 2. Калориметрические кривые для нескольких рекомбинантных вариантов убиквитина с мутациями на позиции 34, измеренные при рН 3,0. Замены обозначены однобуквенным кодом для аминокислот над максимумом каждой из кривых.

Таблица 3. Термодинамические параметры разворачивания вариантов убиквитина, имеющих аминокислотную замену на позиции 34.

Остаток Tm (°C) Изменения в стабильности G(65 оС) приведены относительно аланина.

Экспериментальная ошибка определения температуры плавления Tm равна ±0. С, H(Tm) и H(65 оС) – ±7%.

Рис. 3. Корреляция между экспериментально измеренными изменениями в стабильности убиквитина в результате аминокислотных замен на позиции Gэксперимент и гидрофобностью боковой цепочки, измеренной по энергии переноса модельных соединений из октанола Gоктанол и циклогексана Gциклогексан в воду. Коэффициенты корреляции равны 0,81 и 0, соответственно.

Как следует из рис. 3, корреляция между изменениями стабильности убиквитина в результате аминокислотных замен и гидрофобностью остатков весьма существенна. Таким образом, основным фактором, определяющим вклад остатка на позиции 34 в стабильность белка, является его гидрофобность.

Гидрофобные аминокислоты являются выгодными с термодинамической точки зрения на двух поверхностных позициях убиквитина – 33 и 34. Чтобы оценить возможность дополнительной стабилизации белка за счет двойной гидрофобной замены на поверхности, был создан убиквитин с изолейцином 33 и лейцином 34 (самые стабильные варианты для соответствующих позиций). В результате двойной мутации температура плавления белка повысилась на 20 оС, а стабильность увеличилась на 11,3 кДж/моль по сравнению с аланиновым вариантом. Мутации оказались практически аддитивными – увеличение стабильности белка лишь на 1,1 кДж/моль меньше суммы эффектов единичных аминокислотных замен (4,8 кДж/моль для замены A33I и 7,5 кДж/моль для замены A34L).

кДж/моль Рис. 4. Термодинамические параметры разворачивания мутантных вариантов убиквитина (названия приведены по оси абсцисс). Для каждого мутантного варианта показаны слева направо изменения относительно варианта с аланином в энергии Гиббса (G), в энтальпии (H) и в энтропии, умноженной на температуру (–TS).

Термодинамические параметры разворачивания для вариантов убиквитина с гидрофобными аминокислотами на позициях 33 и 34 представлены на рис. 4. Как видим, увеличение энергии Гиббса разворачивания для данных белков (особенно для двойного мутанта с лейцином на позиции 34 и изолейцином на позиции 33) сопровождается значительным ростом энтальпии разворачивания.

Сравнение вкладов энтальпии и энтропии позволяет заключить, что стабилизация убиквитина является преимущественно энтальпийной. Можно предположить, что стабилизация убиквитина обусловлена энтальпией гидрофобных взаимодействий боковых цепей изолейцина и лейцина. Как видно из рис. 4, эффекты замен аланина на неполярные остатки с более объемной боковой цепью, валин и лейцин, на позициях 33 и 34 сходны с изменениями энтальпии и свободной энергии на полностью спрятанных позициях 5, 17 и 67, однако амплитуда этих эффектов существенно выше на полностью спрятанных позициях.

Вклад взаимодействия гидрофобных остатков на поверхности в стабильность белка, по-видимому, зависит от экспонированности боковой цепи: например, лейцин в меньшей степени стабилизирует белок на позиции 33, экспонированной на 50%, чем на позиции 34, экспонированной только на 30%.

Таким образом, поверхностные гидрофобные остатки убиквитина по крайней мере на двух позициях 33 и 34 стабилизируют белок; эта стабилизация является энтальпийной и обусловлена гидрофобными взаимодействиями. Полученные результаты находятся в согласии со статистическими данными о распределении неполярных аминокислот на поверхности термостабильных белков, свидетельствующими о возможности стабилизации белков кластерами гидрофобных остатков. Следовательно, стабилизирующий эффект гидрофобных взаимодействий частично экспонированных неполярных остатков, наблюдаемый в убиквитине на позициях 33 и 34, можно считать достаточно общим для различных белков.

Сворачивание пероксидазы хрена в присутствии моноклональных антител. Недавно было показано, что сворачивание полипептидной цепочки может быть сопряжено со связыванием макромолекулярного лиганда. Одним из вариантов сворачивания, сопряженного со связыванием, является сворачивание под воздействием специфических антител. На примерах бычьего сывороточного альбумина, фрагмента панкреатической РНКазы А и карбоксипептидазы А была продемонстрирована возможность увеличения выхода ренатурации в присутствии специфических антител. Однако влияние антител на фолдинг белков остается еще мало исследованным. Нами было изучено влияние специфических моноклональных антител на ренатурацию пероксидазы хрена после ее разворачивания. Пероксидаза является удобным объектом для изучения сворачивания, так как за ее ренатурацией легко следить по восстановлению каталитической активности, которая детектируется при очень низких концентрациях фермента. Кроме того, фолдинг пероксидазы был сравнительно хорошо охарактеризован ранее.

Денатурацию пероксидазы осуществляли в 6–6,5 М гуанидин-гидрохлориде. В таких условиях белок полностью теряет и пространственную, и вторичную структуру. Ренатурацию инициировали стократным разбавлением раствора белка.

Выход ренатурации оценивали по восстановлению каталитической активности.

Было протестировано влияние на выход рефолдинга пяти моноклональных антител против пероксидазы, а также моноклонального антитела против тиреоглобулина. Результаты экспериментов суммированы в таблице 4.

Установлено, что в присутствии одного из изученных антител, продукта клона С7, выход каталитически активного белка увеличивался. Следует отметить, что именно этот клон в 2–2,5 раза повышал каталитическую активность нативного фермента.

Таблица 4. Выход ренатурации пероксидазы (50 нМ), проинкубированной в течение часа с различными антителами (0,2 µМ). Относительное стандартное отклонение измеряемой величины пероксидазной активности не превышало 5%.

Ренатурация с антителом против Относительная каталитическая активность, % Рис. 5. Кинетика ренатурации пероксидазы. Пероксидазу (5 µM) денатурировали в 6,5 M гуанидин-гидрохлориде. Ренатурацию инициировали 100-кратным разбавлением в 125 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5. Белок ренатурировали в течение 2,5–60 мин, после чего измеряли каталитическую активность.

Приведены кинетические зависимости для ренатурации пероксидазы (50 нМ) без антител (o), с 0,2 µM антител C7 (), с 0,2 µM антител 7G1G (), с 0,2 µM антител против тиреоглобулина 1F12 (),а также для связывания нативной пероксидазой антител C7 (). Активность нативной пероксидазы принята за 100%.

Кинетики сворачивания пероксидазы в присутствии и в отсутствие антител существенно отличаются (рис. 5). Стационарный уровень активности при сворачивании в присутствии антител С7 достигается за 60 мин, тогда как при ренатурации в отсутствие антител для достижения максимума пероксидазной активности достаточно 2,5 мин. Восстановление активности при сворачивании в отсутствие антител и образование иммунного комплекса между нативным белком и антителом С7 происходили в интервале времени менее 2,5 мин.

Рис. 6. Конкурентный ИФА с антителом С7 для нативной (-o-) и ренатурированной из гуанидин-гидрохлорида в течение 5 мин (-•-) пероксидазы. По оси абсцисс – концентрация пероксидазы, по оси ординат – оптическая плотность продукта реакции щелочной фосфатазы, метки антивидовых антител. Пунктирные линии соответствуют максимальному и 50%-ному связыванию меченых антител.

Аффинности антитела С7 к нативной и ренатурированной пероксидазе были сравнены в схеме конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА). Как можно судить по концентрации антигена, при которой наблюдается 50%-ое связывание, иммунологическая активность ренатурированной пероксидазы в 5–7 раз ниже активности нативного фермента (рис. 6). Эти данные находятся в хорошемсоответствии с выходами ренатурации, наблюдаемыми при рефолдинге пероксидазы без антител (8–9%). Таким образом, антитело С7 обладает существенно большей аффиностью к нативному ферменту, чем к неактивной форме пероксидазы, преобладающей после ренатурации. Основываясь на этом факте, можно сделать два вывода: антитело С7 является конформационночувствительным; неактивная форма пероксидазы находится в конформации, отличной от нативной.

Выход ренатурации пероксидазы изучался при разном мольном отношении антитело/фермент. В то время как активность нативной пероксидазы достигала максимума при эквимолярном отношении и с дальнейшим ростом концентрации антител не изменялась, выход ренатурации увеличивался линейно с ростом избытка антител С7 (рис. 7).

Относительная каталитическая активность, % Рис. 7. Зависимость каталитической активности пероксидазы от мольного отношения антитело С7/пероксидаза при постоянной концентрации фермента ( нМ). Нативная пероксидаза после инкубации с антителами в течение 60 мин (-o-);

восстановление активности фермента после 60 мин ренатурации в присутствии антител (-•-). Активность нативной пероксидазы в отсутствие антител принята за 100%.

Наблюдаемое увеличение активности пероксидазы при ренатурации в присутствии антител, по-видимому, складывается из индуцированного антителами сворачивания и возрастания активности ренатурированного нативного белка при связывании с антителами. Различия между этими двумя составляющими проявляются как в кинетике, так и в зависимости от концентрации антител.

Причины неполного восстановления каталитической активности пероксидазы при ренатурации. Чтобы получить более полное представление о механизме сворачивания пероксидазы в присутствии антитела С7, были изучены причины низкого выхода при ренатурации в отсутствие антител (меньше 10% в наших экспериментах).

Молярная эллиптичность, [], град*см2 *дмоль- Рис. 8. КД-спектры пероксидазы. Спектр нативной пероксидазы в фосфатном буфере, рН 7,4, показан тонкой сплошной линией; спектр нативной пероксидазы в фосфатном буфере в присутствии 150 мМ гуанидин-гидрохлорида – жирной сплошной линией; спектр развернутой в 6 М гуанидин-гидрохлориде пероксидазы – прерывистой линией; ренатурированной пероксидазы – точечной пунктирной линией. Эксперименты проводились при концентрации пероксидазы 1 µM.

В 6 М гуанидин-гидрохлориде вторичная структура пероксидазы полностью развернута, что следует из ее КД-спектра в дальнем ультрафиолете (рис. 8). В тех же условиях спектр поглощения пероксидазы характеризуется широким пиком с максимумом 385 нм, очень сходным со спектром свободного гема в водном растворе, тогда как гем в составе нативного белка имеет острый пик при 403 нм.

Таким образом, в 6 М гуанидин-гидрохлориде белковая часть пероксидазы перестает связывать гем. После ренатурации в фосфатном буфере КД-спектр пероксидазы почти идентичен спектру нативного белка, т.е. происходит практически 100%-ное восстановление вторичной структуры. Незначительное понижение амплитуды сигнала при 222 нм в КД-спектре ренатурированной пероксидазы может быть объяснено небольшим вкладом агрегации. Нужно отметить, что присутствие 150 мМ гуанидин-гидрохлорида (конечная концентрация денатуранта на стадии ренатурации) не оказывает существенного влияния ни на вторичную структуру, ни на активность пероксидазы (см. рис. 8, 9).

В то время как при ренатурации 1 µM фермента происходит полное сворачивание вторичной структуры (см. рис. 8), каталитическая активность пероксидазы восстанавливается только на 60% (рис. 9). Кроме того, поглощение гема в составе пероксидазы при 403 нм увеличивается при ренатурации, но достигает только чуть больше половины поглощения нативного фермента при нм. Таким образом, при ренатурации гем встраивается лишь примерно в 60% молекул пероксидазы.

Относительная каталитическая Рис. 9. Каталитические активности (белые столбцы) нативной пероксидазы в присутствии 150 мМ гуанидин-гидрохлорида (а), ренатурированной (б) и развернутой в 6 М гуанидин-гидрохлориде пероксидазы (в), нормализованные относительно активности нативной пероксидазы. Эксперименты проводились при концентрации пероксидазы 1 µM. Серым показано поглощение тех же образцов при 403 нм.

Как видно из рис. 9, при ренатурации 1 µM фермента происходит восстановление 60% активности, что существенно отличается от наблюдаемых нами 8% при ренатурации 50–100 нМ пероксидазы. Логично предположить поэтому, что выход ренатурации пероксидазы может зависеть от концентрации фермента. Это предположение нашло свое подтверждение. При понижении концентрации белка от 1 до 0,1 µM выход ренатурации снижается от 60 до 10% (рис. 10).

Основываясь на полученных данных, можно сделать вывод о том, что при ренатурации пероксидазы из гуанидин-гидрохлорида происходит практически стопроцентное восстановление вторичной структуры, однако гем встраивается не полностью. Инкорпорация гема особенно неэффективна при низкой концентрации фермента.

Относительная каталитическая Рис. 10. Зависимость выхода ренатурации пероксидазы, измеренной по восстановлению каталитической активности, нормализованной на активность нативного белка, от концентрации белка при рефолдинге. Ошибка эксперимента составляла ±5%.

Возможный механизм увеличения выхода ренатурации пероксидазы в присутствии антител. Можно предположить, что антитело С7 стабилизирует нативную конформацию пероксидазы, связываясь с ее неактивной формой в районе гем-связывающего кармана (это соответствует данным об увеличении активности нативного фермента в присутствии антитела С7). Так как неактивная форма имеет структуру, отличную от нативной, аффинность антитела С7 к этой форме низка (равновесие между нативной и ненативной конформацией эпитопа сильно смещено в пользу последней), что подтверждается данными конкурентного иммуноферментного анализа (рис. 6), проявляется в медленной кинетике восстановления активности в присутствии антитела С7 (рис. 5) и в росте выхода рефолдинга при большем избытке антител (рис. 7). Стабилизация нативного эпитопа, расположенного в районе активного центра, может повышать аффинность пероксидазы к гему, облегчая тем самым встраивание последнего.

Таким образом, антитело С7, по всей видимости, влияет на последний этап сворачивания пероксидазы – реконструкцию, встраивание гема в фермент с полностью сформированной вторичной структурой, но с неактивной конформацией.

ВЫВОДЫ

1. На основании сравнения термодинамических параметров сворачивания мутантных форм дрожжевого убиквитина установлено, что поверхностные аминокислотные остатки вносят существенный вклад в стабильность белка.

Так, разница в энергии Гиббса и температуре плавления между наименее и наиболее стабильными вариантами на позициях 32–34 убиквитина варьировалась от 4 до 22 кДж/моль и от 8 до 45 оС.

2. Сравнение эффектов аминокислотных замен на стабильность белка на конце -спирали убиквитина с данными, полученными для замен в середине спирали белков и пептидов, показало отсутствие достоверных различий между шкалами энергии образования -спирали в расчете на один остаток для незаряженных аминокислот в середине и на С-конце -спирали.

3. На примере остатков 33 и 34 в молекуле убиквитина установлено, что неполярные аминокислоты, частично экспонированные на белковой поверхности, существенно стабилизируют белок за счет гидрофобных взаимодействий. Показана возможность аддитивного действия множественных гидрофобных замен на поверхности.

4. На примере пероксидазы хрена продемонстрировано, что взаимодействие белковой поверхности с моноклональными антителами может способствовать сворачиванию белка, увеличивая выход активного фермента при ренатурации.

5. Показано, что неполное восстановление каталитической активности пероксидазы при ренатурации обусловлено степенью встраивания гема в фермент. Моноклональные антитела, увеличивающие выход активного фермента при ренатурации, по-видимому, облегчают встраивание гема в неактивную форму фермента, структурно отличную от нативной конформации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Popov V.O. Antiperoxidase antibodies enhance refolding of horseradish peroxidase. // Biochemical & Biophysical Research Communications. 2002. V. 291. N 4. P. 959–965.

2. Bezsudnova K.Yu., Ermolenko D.N., Zherdev A.B., Popov V.O., Dzantiev B.B.

Renaturation of horseradish peroxidase in the presence of specific antibodies. // Abstracts of the International Conference “Biocatalysis–2002: Fundamentals & Applications”. Moscow, Russia. June 10–15, 2002. P. 73.

3. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Popov V.O., Dzantiev B.B. Anti-peroxidase antibodies enhance refolding of horseradish peroxidase. // Abstracts of the 16th Symposium of the Protein Society, San Diego, CA, USA. August 17–21, 2002. P. 92.

4. Ermolenko D.N. Zherdev A.V., Popov V.O., Dzantiev B.B. Antibody-assisted refolding of horseradish peroxidase. // Abstracts of the 16th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics. Carbondale, Illinois, USA. September 28 – October 1, 2002. P.

5. Richardson J.M., Ermolenko D.N., Loladze V.V., Makhatadze G.I. Contribution of helical propensity to the thermodynamic stability of proteins. // Abstracts of the 16th Annual Gibbs Conference on Biothermodynamics. Carbondale, Illinois, USA.

September 28 – October 1, 2002. P. 107.

6. Ermolenko D.N., Thomas S.T., Aurora R., Gronenborn A.M., Makhatadze G.I.

Hydrophobic interactions at the Ccap position of the C-capping motif of alpha-helices.

// Journal of Molecular Biology. 2002. V. 322. N 1. P. 123–135.

7. Ermolenko D.N., Loladze V.V., Thomas S.T., Makhatadze G.I. Stabilizing packing interactions on the protein surface. // Abstracts of the 7th Hopkins Folding Meeting.

Berkeley Springs, West Virginia, USA. March 22–25, 2003. P. 10.

8. Ermolenko D.N., Zherdev A.V., Popov V.O., Dzantiev B.B. Monoclonal antibodies assist refolding of horseradish peroxidase. // Abstracts of the 5th European Symposium of the Protein Society. Florence, Italy. March 29 – April 2, 2003. P. 187– 9. Ermolenko D.N., Richardson J.M., Makhatadze G.I. Noncharged amino acid residues at the solvent-exposed positions in the middle and at the C terminus of the alphahelix have the same helical propensity. // Protein Science. 2003. V. 12. N 6. P. 1169– 10. Безсуднова Е.Ю., Жердев А.В., Ермоленко Д.Н., Яковлева И.В., Свиридов В.В., Попов В.О., Дзантиев Б.Б. Изучение рефолдинга пероксидазы хрена в присутствии специфических антител. // Прикладная биохимия и микробиология.

2003. Т. 39. N 5. C. 509–517.



 
Похожие работы:

«ЛИТТИ Юрий Владимирович Анаэробное окисление аммония и метаногенез в системах аэробной очистки сточных вод с иммобилизацией микроорганизмов 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2012 1 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт микробиологии им. С. Н. Виноградского Российской академии наук Научный...»

«БАЗАНОВА Любовь Петровна ВЗАИМООТНОШЕНИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА (YERSINIA PESTIS) И БЛОХ (SIPHONAPTERA) (на примере сибирских природных очагов чумы) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Иркутск – 2008 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Антропогенная трансформация ландшафтов, вовлечение территорий природной очаговости чумы в хозяйственную деятельность человека, существующая угроза террористических актов с...»

«Моисеев Павел Александрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ДРЕВЕСНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ВЕРХНЕМ ПРЕДЕЛЕ ЕЕ ПРОИЗРАСТАНИЯ НА УРАЛЕ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант доктор биологических наук, профессор Шиятов Степан Григорьевич Официальные оппоненты : доктор...»

«ГАЛУШКО МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ТРОМБИНУ ПО КОАГУЛОАКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ И УРОВНЮ МАРКЕРОВ НЕПРЕРЫВНОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и...»

«БАХАРЕВА ИРИНА ЮРЬЕВНА ИЗМЕНЕНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА ГАРЯХ В ЛЕНТОЧНЫХ БОРАХ АЛТАЙСКОГО КРАЯ В ЗОНАХ СУХОЙ И УМЕРЕННО-ЗАСУШЛИВОЙ КОЛОЧНОЙ СТЕПИ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул – 2009 2 Работа выполнена на кафедре экологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Трофимов Иван Тимофеевич Официальные оппоненты : доктор...»

«ПОЛЯКОВ АРТЕМ ИГОРЕВИЧ ВЛИЯНИЕ ВЫРУБКИ ЛЕСА НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ГОРНЫХ ПОЧВ ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2011 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Южного федерального университета Научный руководитель : доктор географических наук, профессор Казеев Камиль Шагидуллович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Безина Ольга Вячеславовна Экологические особенности распределения наземных моллюсков в разнотипных биоценозах лесостепи Правобережного Поволжья 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов - 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского на кафедре зоологии и экологии Научный...»

«Цыремпилов Энхэ Галсанович ПОЧВЫ БАРГУЗИНСКОЙ КОТЛОВИНЫ: РАЗНООБРАЗИЕ, ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ И РАЦИОНАЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2013 Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экспериментальной агрохимии ФГБУН Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН и ФГБОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р....»

«Синежук Екатерина Борисовна ДЕМОНСТРАТИВНАЯ ПЕСНЯ ОБЫКНОВЕННОЙ ЧЕЧЕВИЦЫ CARPODACUS ERYTHRINUS (PALLAS, 1770): СТРУКТУРА, ИНДИВИДУАЛЬНАЯ И ГЕОГРАФИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ 03.02.04 - Зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 Работа выполнена на кафедре Зоологии позвоночных федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального...»

«БУХАРОВА Надежда Владимировна АФИЛЛОФОРОВЫЕ ГРИБЫ ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО ЗАПОВЕДНИКА БАСТАК 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2013 Работа выполнена в лаборатории низших растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биолого-почвенного института ДВО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Булах Евгения Мироновна Научный консультант : кандидат биологических...»

«САИДОВ АБДУСАТТОР САМАДОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРЫЗУНОВ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 03.02.04 - зоология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Душанбе – 2011 Работа выполнена в Отделе экологии наземных позвоночных животных Института зоологии и паразитологии им. Е.Н.Павловского Академии наук Республики Таджикистан Научный консультант : академик АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук,...»

«Ганеева Лилия Ахатовна ОЦЕНКА УРОВНЯ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫХ ФЕРМЕНТОВ И ЖЕЛЕЗА, МЕДИ, МАРГАНЦА В КЛЕТКАХ КАРТОФЕЛЯ, ИНФИЦИРОВАННЫХ PHYTOPHTHORA INFESTANS. 03.00.07 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2009 2 Работа выполнена в ТТГПУ, г. Казань и в Институте проблем экологии и недропользования академии наук РТ, г.Казань. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Морозов Николай Васильевич...»

«МОКРЯКОВА Мария Владимировна УЧАСТИЕ ПЕПТИДИЛ-ПРОЛИЛ ЦИС/ТРАНС ИЗОМЕРАЗ ARABIDOPSIS THALIANA ВО ВЗАИМОДЕЙСТВИИ РАСТЕНИЯ-ХОЗЯИНА С ПАТОГЕНОМ (специальность 03.02.07 – генетика) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в лаборатории функциональной геномики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва. Научный...»

«Альфрайхат Махмуд Хасан УСТОЙЧИВОСТЬ ПОЧВ ВЫСОКОГО ПЛАТО ИОРДАНИИ И ЕГО ОБРАМЛЕНИЯ Специальность: 03.00.27-почвоведение Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва-2009 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения и земледелия Российского университета дружбы народов Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ларешин Вячеслав Григорьевич. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ганжара Николай...»

«АРЛЯПОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА И АНАЛИЗА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СМЕСЕЙ 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2009 Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. кандидат химических наук, доцент Научный руководитель : Алферов Валерий Анатольевич доктор...»

«Салеем Кайд Мохаммед Абдулла ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.00.16 –экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук 2 МОСКВА 2003 г. Работа выполнена в Российском государственеом университете нефти и газа им. И. М. Губкина на кафедре промышленной экологии. Научный...»

«Рыжакова Ольга Сергеевна ИНТЕРСТИЦИАЛЬНАЯ КОЛЛАГЕНАЗА (ММП-1) И ЕЁ ЭНДОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ГЕНОМ Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ТИПА (HPV16) 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук Научный руководитель : доктор...»

«Рогатых Станислав Валентинович ОЦЕНКАСТРУКТУРЫ СООБЩЕСТВ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕСТОРОЖДЕНИЯ ШАНУЧ (КАМЧАТКА) С ПРИМЕНЕНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оболенск – 2014 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Научноисследовательском геотехнологическом центре...»

«ЕЛИЗАРЬЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИКА ЮЖНОГО УРАЛА OXYTROPIS GMELINII FISCH. EX BORISS. (FABACEAE) В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 2 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности в Учреждении РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.