WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЯЗЫНИНА Елена Валентиновна

РАЗРАБОТКА ИММУНОХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕРБИЦИДОВ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва - 2003

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев, кандидат биологических наук А.В. Жердев.

Официальные оппоненты:

доктор химических наук Б.А. Кузнецов, кандидат химических наук, доцент А.П. Осипов.

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН.

Защита состоится 14 января 2003 г. в 15 час на заседании диссертационного совета (К 002.247.01) по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им.

А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2, конференц-зал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан 9 декабря 2002 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Устойчивый рост применения средств химической защиты растений стал одной из причин необходимости создания систем контроля уровня загрязнения ими природных объектов и сельскохозяйственной продукции. Опасность гербицидов обусловлена их высокой токсичностью, стабильностью, способностью аккумулироваться в окружающей среде. В сельском хозяйстве многих стран широко используются гербициды, относящиеся к классам триазинов (атразин, симазин и др.) и сульфонилмочевин (хлорсульфурон и его структурные аналоги). В связи с этим актуальной является задача разработки высокоспецифичных, чувствительных и быстрых методов определения данных соединений.





В настоящее время для определения гербицидов применяют как традиционные физико-химические, так и иммунохимические методы (ИХМ) анализа. К достоинствам ИХМ, основанных на связывании анализируемых соединений с антителами, относятся высокая чувствительность и специфичность, возможность автоматизации и проведения измерений как в лабораторных, так и в полевых условиях.

Аналитические характеристики любого ИХМ определяются физико-химическими характеристиками иммунореагентов и количественными параметрами реакций между ними.

Поэтому изучение взаимодействия антител с гербицидами в различных аналитических системах является неотъемлемой основой разработки ИХМ, представляющих значительный интерес для современной практики экологического мониторинга.

Возможности и диапазон применения этих методов расширяются при сокращении продолжительности анализа, поэтому в рамках данной работы основное внимание уделялось созданию экспрессных иммунохимических систем определения гербицидов.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение количественных закономерностей взаимодействия антител с гербицидами разной природы и свойств в водных и водно-органических средах для создания и апробации новых экспрессных иммунохимических методов детекции этих соединений. Достижение поставленной цели связано с решением следующих задач:

- синтез и характеристика реагентов для различных форматов иммуноанализа;

СОКРАЩЕНИЯ: АБТС – диаммониевая соль 2,2'-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты); АБТС•+ – катион-радикал АБТС; БСА – бычий сывороточный альбумин; ГО – глюкозооксидаза; ГЦ – гемоцианин; ИФА – иммуноферментный анализ; ИХМ – иммунохимический метод; Ка – равновесная константа ассоциации; КПА – карбоксильное производное атразина; КПС – карбоксильное производное симазина; КПХ – карбоксильное производное хлорсульфурона; ПМА – полиметакриловая кислота; ПТ – иммуносенсор на основе pH-чувствительного полевого транзистора; ПФИА – поляризационный флуоресцентный иммуноанализ; ПО – пероксидаза; ПЭ – иммуносенсор на основе золотого планарного электрода; ПЭВП – поли-(N-этил-4-винилпиридиний);

СБА – стафилококковый белок А; СИТ – соевый ингибитор трипсина; СПЭ – иммуносенсор на основе скрин-принт электрода; ЭДФ – этилендиаминфлуоресцеинтиокарбамат; ЯА – яичный альбумин.

- получение и характеристика антител против гербицидов атразина, симазина и хлорсульфурона;

- изучение кинетических закономерностей и влияния состава водно-органических сред на взаимодействие антиген-антитело в различных схемах иммуноферментного анализа (ИФА) гербицидов;

- разработка новых иммуноаналитических систем на основе водорастворимых полиэлектролитов и исследование кинетики иммунных взаимодействий c их участием;

- сравнение характеристик систем иммуносенсорного анализа.

Научная новизна. Получены иммунореагенты (антитела и конъюгаты гербицидов с белками и ферментами), определены их физико-химические и иммунохимические свойства.





Изучено влияние состава гомогенных водно-органических смесей на каталитическую активность пероксидазы (ПО) из корней хрена и глюкозооксидазы (ГО) из Aspergillus niger.

Исследованы процессы взаимодействия гербицидов с антителами в присутствии органических растворителей, а также растворимых и иммобилизованных синтетических полиэлектролитов. Предложен новый принцип проведения твердофазного и мембранного ИФА гербицидов, основанный на применении водорастворимых полиэлектролитов.

Практическая значимость работы. На основе полученных реагентов и проведенных исследований разработаны новые иммуноферментные тест-системы для экспрессного определения гербицидов (симазина, атразина, хлорсульфурона) в воде и продуктах питания (молоко, фруктовый сок), показана эффективность определения гербицидов с помощью трех типов электрохимических иммуносенсоров.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на следующих конференциях: V Международный конгресс “Biosensors–98” (Берлин, Германия, 1998), IX Международный конгресс “Pesticide Chemistry: The Food–Environment Challenge” (Лондон, Великобритания, 1998), VII Симпозиум “Chemistry & Fate of Modern Pesticides” (Лоуренс, США, 1999), IV Рабочее совещание “Biosensors & Biological Techniques in Environmental Analysis” (Мао, Испания, 1999), Школа-конференция “Горизонты физикохимической биологии” (Пущино, Россия, 2000), VIII Симпозиум “Chemistry & Fate of Modern Pesticides” (Копенгаген, Дания, 2001), VIII Европейская конференция “Organised Thin Films” (Отранто, Италия, 2001).

Решением Ученого Совета Института биохимии в 1999 году автор удостоен стипендии имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, изложения результатов исследований и их обсуждения (3 главы), выводов, списка литературы, включающего 236 ссылок. Работа изложена на 165 страницах, содержит 18 таблиц и 41 рисунок.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы и объекты исследования. В работе использовали стандартные образцы гербицидов классов триазинов, сульфонил- и арилмочевин (ВНИИ химических средств защиты растений, Москва), карбоксилированные производные симазина, атразина, хлорсульфурона (синтезированы на Химическом факультете МГУ им. М.В. Ломоносова), полиметакриловую кислоту (ПМА) (Mw=260 кДа) и поли-(N-этил-4-винилпиридиний) (ПЭВП) (Mw=1740, 2900, 3900, 9800 кДа) (синтезированы на кафедре высокомолекулярных соединений МГУ), гемоцианин (ГЦ) из гепатопанкреаса краба Paralithodes camtschatica (предоставлен д.х.н., проф. И.Ю. Сахаровым, МГУ).

Синтез реагентов. Конъюгаты карбоксилированных производных симазина, атразина, хлорсульфурона с белками и этилендиаминфлуоресцеинтиокарбаматом (ЭДФ), а также модифицированным сукцинимидным методом. Конъюгат ПЭВП с соевым ингибитором трипсина (ПЭВП–СИТ) синтезировали с использованием s-цианурхлорида. Мольный состав конъюгатов определяли титрованием свободных аминогрупп на поверхности белка.

Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ (ПФИА). В пробирки вносили пробы, содержащие определяемый гербицид, конъюгат гербицид-ЭДФ и антисыворотку.

Поляризацию флуоресценции измеряли на поляризационном флуориметре “Beacon-2000” (“Panvera”, США).

иммобилизовали в лунках полистироловых планшетов с использованием адсорбированного СБА. После отмывки в планшет вносили пробы, содержащие определяемый гербицид, и конъюгат гербицид-фермент; инкубировали и отмывали. Для определения активности ГО добавляли субстратный раствор, содержащий D(+)-глюкозу, ПО и 3,3',5,5'-тетраметилбензидин. Оптическую плотность продуктов реакции измеряли при 450 нм на вертикальном фотометре Multiskan EX (“Labsystems”, Финляндия). Для определения активности ПО добавляли субстратный раствор, содержащий диаммониевую соль 2,2'-азино-бис(3этилбензтиазолин-6-сульфоновой кислоты) (АБТС) и H2O2. Оптическую плотность продуктов реакции измеряли при 405 нм.

Твердофазный ИФА с использованием меченых антител. Конъюгат гербицидбелок адсорбировали в лунках планшета, затем вносили пробы, содержащие определяемый гербицид, и антисыворотку. После инкубации добавляли конъюгат антивидовых антител с ПО. Активность ПО определяли как описано выше.

ИФА с использованием полиэлектролитов. Раствор ПЭВП адсорбировали в лунках планшета. В отдельный планшет последовательно вносили пробы, содержащие определяемый гербицид, конъюгат гербицид-ПО, антисыворотку и конъюгат СБА-ПМА. Смесь инкубировали 5 мин, переносили в планшет с предварительно адсорбированным ПЭВП и инкубировали 8 мин. Планшет отмывали и определяли активность ПО как описано выше.

Мембранный иммунофильтрационный анализ. Между пластинами специального держателя помещали мембрану и впитывающий материал. В отверстия верхней пластины вносили раствор ПЭВП, а после его просачивания – К-фосфатный буфер. В лунках планшета смешивали анализируемую пробу, конъюгат гербицид-ПО, антисыворотку и конъюгат CБА-ПМА. Смесь инкубировали 5 мин, переносили на мембрану, которую затем промывали и помещали в субстратный раствор, содержащий тетрагидрохлорид 3,3'диаминобензидина, CoCl2 и H2O2. Интенсивность окрашенных пятен детектировали с помощью сканера “ScanJet 5p” (“Hewlett Packard”, Тайвань).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Получение и характеристика иммунореагентов. Возможности иммунохимических тест-систем определяются преимущественно свойствами иммунореагентов. Поэтому важный этап разработки систем определения гербицидов (симазина, атразина, хлорсульфурона) состоял в получении иммунореагентов и изучении их свойств. Выбранные гербициды не содержат реакционных групп, поэтому для конъюгации с носителями были синтезированы модифицированные производные антигенов – гаптены (табл. 1). В основе дизайна гаптенов лежали два подхода: сходство структуры гаптена и анализируемого вещества (симазин, атразин) или использование одного из фрагментов молекулы (хлорсульфурон). На основании этих принципов были выбраны следующие соединения:

карбоксильное производное симазина (КПС) N-(4-хлор-6-(N-этиламино)-1,3,5-триазин-2-ил)аланин, карбоксильное производное атразина (КПА) N-(6-(N-изопропиламино)-2-хлортриазин-4-ил)-6-аминокапроновая кислота и карбоксильное производное хлорсульфурона (КПХ) 1-((2-хлор)-фенилсульфонил)-моноамидоянтарная кислота.

При синтезе иммуногенов в качестве белков-носителей использовали ГЦ, бычий сывороточный альбумин (БСА) и СИТ. В результате иммунизации было получено препаратов поликлональных антител, которые характеризовали по величине титров, аффинности и специфичности к соответствующему гербициду методами твердофазного ИФА и ПФИА с использованием гомологичных пар реагентов (см. табл. 1). Для дальнейших Таблица 1. Структурные формулы гербицидов и модифицированных антигенов, состав конъюгатов.

Таблица 2. Специфичность антисывороток Сим-15, Атр-25 (твердофазный ИФА с меченым антигеном).

Гербицид *N3 соответствует R1-NH-.

Таблица 3. Специфичность ПФИА хлорсульфурона по отношению к гербицидам класса сульфонилмочевин.

* – замещенный диазиновый фрагмент; ** – замещенное тиофеновое кольцо;

*** – отсутствует ароматический фрагмент.

исследований были выбраны препараты антител Сим-15, Атр-25, Хло-1 (иммуногены КПСГЦ, КПА-БСА, КПХ-СИТ), обладавшие наилучшими иммунохимическими характеристиками.

Изучение специфичности антисывороток Сим-15, Атр-25 методом твердофазного ИФА выявило перекрестное реагирование с хлорсодержащими триазинами (табл. 2), что соответствует литературным данным и позволяет рекомендовать эти препараты антител для группоспецифического анализа. Для антисыворотки Хло-1 методами ПФИА и ИФА было показано, что перекрестное реагирование со структурно близкими сульфонил- (табл.

3) и арилмочевинами (диурон, изопротурон, линурон, хлорбромурон, хлортолурон), а также триазинами (атразин, пропазин, семерон) не превышает 1%. Высокая специфичность антител против хлорсульфурона при использовании фрагмента молекулы в качестве гаптена для иммунизации свидетельствует о существенном вкладе в процесс иммунного распознавания радикала хлора в бензольном кольце.

Количественную характеристику аффинности поликлональных антител проводили методом ИФА с иммобилизованными антителами и меченым антигеном. Распределение взаимодействий по константам связывания определяли при помощи программы “Affinogen”, разработанной в лаборатории иммунобиохимии. Проведенные расчеты показали, что препараты поликлональных антител содержат в существенных количествах субпопуляции с достаточно высокими константами связывания: Ка(Сим-15)=1,8·109 М-1; Ка(Атр-25)=2,2· М-1; Ка(Хло-1)=8,0·109 М-1, что важно для разработки высокочувствительных методов ИФА.

Количественные закономерности гомогенного иммуноанализа атразина и хлорсульфурона. Для синтеза флуоресцентных конъюгатов (КПА-ЭДФ и КПХ-ЭДФ) и анализа атразина и хлорсульфурона использовали гаптены, приведенные в табл. 1. Титры антител составили 1:8000 (для антисыворотки Атр-25) и 1:50000 (для антисыворотки Хло-1).

Оптимальные разведения антител, найденные из кривых титрования, составили 1:800 и 1:2000 для антисывороток Атр-25 и Хло-1. По градуировочным графикам, полученным при изучении конкурентного связывания, были определены аналитические характеристики ПФИА данных гербицидов (табл. 4). Разработанные методики ПФИА атразина и хлорсульфурона позволяют проводить определение концентраций данных соединений в нанограммовом диапазоне. Коэффициенты корреляции ПФИА атразина с ИФА и ГХ-МС составляют соответственно 0,999 и 0,998. Время анализа 10 образцов не превышает 10 мин.

Таблица 4. Аналитические характеристики ПФИА атразина и хлорсульфурона.

концентраций, нг/мл Твердофазный ИФА гербицидов: кинетические закономерности и аналитические характеристики. В рамках исследования ставилась задача разработать экспрессные иммуноферментные методы определения гербицидов. Методы ИФА основаны на реакции антиген-антитело, поэтому неотъемлемой частью разработки экспрессных методов иммуноанализа является изучение кинетики данного взаимодействия. В связи с этим на примере иммунохимической системы детекции хлорсульфурона были изучены кинетические закономерности иммунных реакций:

• меченного ферментом антигена с адсорбированными антителами;

• антител с коньюгатом КПХ – яичный альбумин (КПХ-ЯА) в присутствии хлорсульфурона.

Изучение кинетических зависимостей реакции конъюгата КПХ-ГО с антителами показало, что насыщение центров связывания происходит за 30-40 мин (рис. 1) независимо от присутствия хлорсульфурона в пробе.

иммобилизованным КПХ-ЯА в отсутствии и в присутствии хлорсульфурона. Установлено, что для насыщения антигенных групп конъюгата необходимо от 10 до 60 мин в зависимости 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, Рис. 2. Кинетика взаимодействия антител с иммобилизованным конъюгатом КПХ–ЯА в отсутствии (а) и в присутствии хлорсульфурона (б). Кривые 1-5 (рис. 2а) соответствуют разведениям антисыворотки 1:73000, 1:24300, 1:8100, 1:2700 и 1:900, кривые 1-3 (рис. 2б) – концентрациям хлорсульфурона 220, 74 и 24 нг/мл. По оси ординат на рис. 2-7 – оптическая плотность продуктов окисления АБТС при 405 нм.

от концентрации антител (рис. 2а). Следует отметить, что присутствие хлорсульфурона в пробе увеличивало время, необходимое для достижения равновесия, от 20 до 80 мин (рис.

2б). Таким образом, переход к кинетическому режиму в рамках традиционных форматов ИФА сопряжен со значительным снижением амплитуды детектируемого сигнала (в 2-4 раза определяемых концентраций.

Для обеспечения максимальной чувствительности и воспроизводимости определения гербицидов была проведена оптимизация условий анализа, включавшая подбор длительности стадий и концентраций реагентов. Оптимальные режимы и аналитические характеристики твердофазного ИФА гербицидов представлены в таблице 5. Все разработанные методы обладают высокой чувствительностью (0,06–1,2 нг/мл) и точностью (10,8%), что удовлетворяет требованиям экологического мониторинга.

Использование пероксидазной и глюкозооксидазной меток, способных генерировать электроактивные соединения, дает возможность применять полученные иммунореагенты в электрохимических иммуносенсорах (см. стр. 17-18).

Таблица 5. Оптимальные режимы проведения и аналитические характеристики твердофазного ИФА симазина, атразина и хлорсульфурона.

Продолжительность инкубации антисыворотки с белком А, мин Разведение конъюгата антивидовых антител с пероксидазой Продолжительность ферментативной реакции, мин Воспроизводимость измерений (n=4), % 1,1–8,9 1,4–10,8 2,0–6,5 2,3–4, Изучение влияния органических растворителей на иммунореагенты. Существует необходимость выявлять гербициды в сложных по составу объектах (почва, растения, продукты питания). Гидрофобные гербициды экстрагируют, как правило, органическими растворителями, которые при проведении иммунохимического анализа могут оказывать воздействие как на антигенсвязывающую способность антител, так и на активность ферментов-маркеров. Поэтому в работе была изучена возможность использования водноорганических смесей при проведении ИФА гербицидов. В качестве первого этапа рассматривалось влияние состава гомогенных водно-органических смесей на окисление субстратов в системах, содержащих:

АБТС, H2O2 и ПО (с образованием катион-радикала АБТС•+);

-D-глюкозу, ГО, АБТС и ПО (с образованием глюконолактона, H2O2 и АБТС•+).

Исследование процесса окисления АБТС показало, что максимум активности наблюдается в интервале 5–60 об.% растворителя (табл. 6). Уменьшение величины оптической плотности катион-радикала АБТС при дальнейшем увеличении концентрации растворителя, по-видимому, связано с денатурацией ПО. Аналогичный эффект наблюдался также для реакции окисления -D-глюкозы ГО или КПХ-ГО в присутствии этанола и ацетонитрила. Вероятная причина роста коэффициента экстинции АБТС•+ в водно-спиртовых смесях заключается в нуклеофильной сольватации АБТС•+ за счет свободных электронных пар спиртов, что приводит к стабилизации катиона. Полученные данные свидетельствуют, что стабильный катион-радикал АБТС•+ может генерироваться и в водно-органической среде.

Для сопряженной реакции окисления -D-глюкозы и пероксидазного окисления АБТС наблюдалось возрастание оптической плотности продуктов в присутствии до 80 об.% метанола и изопропанола (см. табл. 6). При дальнейшем увеличении концентрации растворителя происходила полная инативация ГО. Данный эффект обусловлен влиянием полярных протонных растворителей на реакцию окисления -D-глюкозы до -Dглюконолактона. Вероятно, метанол и изопропанол значительно повышают эффективность катализа, что приводит к увеличению концентрации H2O2 и, как следствие, увеличению количества АБТС•+. Обнаруженный эффект активации может быть использован в гомогенных иммуноаналитических системах со спектрофотометрической детекцией.

На следующем этапе было изучено влияние состава водно-органических смесей на формирование комплексов антител с КПА-ПО (табл. 7) и КПХ-ГО. Увеличение содержания органических растворителей приводило к уменьшению относительного уровня связывания с антителами. В случае этанола и ацетонитрила наблюдалось небольшое возрастание связывания меченого антигена в присутствии от 2 до 6 об.% растворителя. Таким образом, Таблица 6. Влияние концентрации органических растворителей на каталитическую активность ПО, ГО и их конъюгатов с гербицидами.

конъюгат КПА-ПО КПХ-ГО Таблица 7. Влияние органических растворителей на эффективность взаимодействия конъюгата КПА-ПО с иммобилизованными антителами.

для проведения иммунохимической реакции необходимо ограничиться достаточно узким диапазоном концентраций органического растворителя (3–20%).

При проведении твердофазного ИФА хлорсульфурона (маркер – ГО) в системе, содержащей от 3 до 20 об.% органического растворителя (метанола, этанола, изопропанола, ацетонитрила), было обнаружено значительное снижение детектируемого сигнала, что препятствовало осуществлению измерений. Данный эффект свидетельствует в пользу гипотезы о влиянии полярных протонных растворителей на реакцию окисления D-глюкозы. Напротив, для ИФА атразина (маркер – ПО) уменьшение детектируемого сигнала в присутствии метанола, этанола и изопропанола менее значительно (до двухкратного при 15 об.% растворителя). Пределы обнаружения атразина находятся в диапазоне 0,2–5 нг/мл, что удовлетворяет практическим требованиям.

Твердофазный ИФА на основе полиэлектролитов. Существенной проблемой является повышение экспрессности иммунохимических систем детекции гербицидов. Для ускорения анализа был разработан подход, основанный на комбинации иммунохимических взаимодействий и применения водорастворимых полиэлектролитов (полианиона ПМА и поликатиона ПЭВП – рис. 3), которые обеспечивают быстрое и эффективное разделение прореагировавших и непрореагировавших иммунореагентов благодаря высокой кооперативности интерполиэлектролитной реакции. В рамках данной работы взаимодействие полиэлектролитов было использовано для создания двух новых систем иммуноанализа – микропланшетного ИФА и мембранного иммунофильтрационного анализа.

ПМА ПЭВП

Для унификации данного подхода при анализе различных антигенов применяли универсальный иммунореагент, конъюгат СБА–ПМА, что снимает необходимость в синтезе конъюгатов специфических антител с ПМА для каждой разрабатываемой тест-системы.

Состав и стабильность интерполимерных комплексов в значительной степени определяются молекулярными массами полимеров и соотношением полианион/поликатион. Оптимальные условия формирования интерполимерных комплексов в растворах, содержащих различные концентрации полиэлектролитов, были установлены на основании турбидиметрических показателей, определенных в равновесных условиях (рис. 4).

Целью проведенных исследований являлось повышение экспрессности твердофазного ИФА за счет снижения диффузионных ограничений на стадии разделения иммунных комплексов. Для этого иммунохимическую реакцию проводили в растворе, а разделение осуществляли с помощью взаимодействия полиэлектролитов.

Предлагаемый метод иммуноанализа (рис. 5) основан на сочетании механизмов образования интерполиэлектролитных комплексов с принципами твердофазного ИФА и включает последовательное проведение следующих стадий:

• адсорбции поликатиона на твердой фазе;

• конкуренции между нативным и меченным ферментом гаптеном за связывание со специфическими антителами; взаимодействия антител с конъюгатом СБА-ПМА;

• формирования интерполимерных комплексов на твердой фазе;

• детекции связавшегося с твердой фазой иммунохимического комплекса.

различавшиеся по средней молекулярной массе. Препарат ПЭВП (Mw=3900 кДа) обеспечил достижение наилучшей чувствительности ИФА симазина и был выбран для дальнейших исследований.

Чтобы охарактеризовать возможность сокращения длительности ИФА, была изучена кинетика взаимодействия полианиона с иммобилизованным на поверхности полистирола поликатионом (рис. 6). Насыщение 90% сайтов связывания адсорбированного поликатиона достигается за 8 минут, тогда как двух минут инкубации достаточно для связывания более чем 50% сайтов. Максимальное количество иммобилизованных комплексов достигается при инкубации иммунореагентов с иммобилизованным поликатионом в течение 5 мин (рис.

7). Высокая скорость может объясняться двумя факторами: высокой поверхностной плотностью заряда взаимодействующих групп и кооперативностью в формировании дополнительных электростатических связей между звеньями полимерных молекул.

Перевод иммунохимических реакций в гомогенную фазу также позволяет ускорить анализ.

Оптимизированные режимы и аналитические характеристики методов ИФА атразина и симазина с использованием полиэлектролитов представлены в таблице 8. Разработанная схема не уступает по чувствительности и воспроизводимости традиционному ИФА и при этом существенно превосходит его по экспрессности.

ИФА на основе полиэлектролитов был применен для обнаружения известных количеств симазина, внесенных в питьевую воду, фруктовый сок и молоко. Процент открытия составил от 95% до 135% (табл. 9), что свидетельствует о возможности применения предложенных методов для детекции гербицидов в мультикомпонентных пробах.

Рис. 5. Принципиальная схема микропланшетного ИФА на основе полиэлектролитов.

2, 1, 0, Рис. 6. Кинетика взаимодействия конъюгата Рис. 7. Гомогенная кинетика образования СБА-ПМА с ПЭВП (Mw=3900 кДа), иммо- иммунных комплексов (взаимодействие билизованным на поверхности лунок микро- конъюгатов КПС-ПО, СБА-ПМА и антисыпланшета. Кривые 1-4 соответствуют 0,1, воротки Сим-15) в ходе полиэлеки 0,8 мкг/мл конъюгата СБА-ПМА. тролитного ИФА. Кривые 1, 2 соответствуют Таблица 8. Оптимальные режимы проведения и аналитические характеристики ИФА симазина и атразина на основе полиэлектролитов.

Параметры анализа Продолжительность инкубации антисыворотки с анализируемой пробой, конъюгатами гербицид-ПО и CБА-ПМА, мин Таблица 9. Полнота выявления симазина в продуктах питания методом ИФА на основе полиэлектролитов.

концентрация Мембранный иммунофильтрационный анализ. Для безинструментального анализа был разработан метод иммунофильтрации с применением полиэлектролитов. На первой стадии анализа в растворе взаимодействуют четыре реагента – определяемый и меченный пероксидазой гербицид, антитела и белок А, конъюгированный с полианионом. Затем реакционная смесь переносится на мембрану с адсорбированным поликатионом, помещенную в специальный держатель. Благодаря свойствам полиэлектролитов полианион и связавшиеся с ним компоненты быстро образуют на мембране комплекс с поликатионом. После добавления субстрата пероксидазы, дающего нерастворимый окрашенный продукт, на мембране образуются пятна, интенсивность окраски которых определяется начальной концентрацией гербицида в анализируемой пробе.

В результате проведенного скрининга мембранных носителей и подбора оптимальных реагентов были разработаны системы иммунофильтрационного определения симазина и атразина на мембране Hybond N, позволяющие в течение 15 мин выявлять данные гербициды в нанограммовом диапазоне (табл. 10). Эти системы могут быть использованы во внелабораторных условиях и позволяют проводить качественное определение наличия гербицидов в тестируемых образцах. При денситометрической детекции (рис. 8) возможно количественное определение гербицидов с высокой точностью.

Таблица 10. Аналитические характеристики мембранного иммунофильтрационного определения симазина и атразина.

Параметры анализа анализируемой пробой, конъюгатами гербицид-ПО и СБАПМА, мин Воспроизводимость измерений на одной мембране (n=4), % 3,2–5,1 4,1–5, Электрохимические иммуносенсоры для определения гербицидов. Полученные иммунореагенты (антитела, пероксидазные и глюкозооксидазные конъюгаты) были применены при создании методов определения гербицидов в сенсорных устройствах с электрохимической детекцией совместно с Институтом биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (г. Пущино) и Самаркандским медицинским институтом (Узбекистан).

Иммунореагенты использовали в трех типах иммуносенсоров:

потенциометрическом иммуносенсоре на основе pH-чувствительного полевого транзистора (ПТ);

амперометрическом иммуносенсоре на основе скрин-принт электрода (СПЭ);

потенциометрическом иммуносенсоре на основе золотого планарного электрода (ПЭ).

В потенциометрических сенсорах измеряли изменение потенциала электрода (U, мВ), который определялся pH реакционной среды в ходе окисления субстрата ПО.

Параметром, детектируемым в амперометрическом сенсоре, было изменение электрического тока (I, нА).

Иммобилизацию иммунореагентов в иммуносенсорах на основе ПТ и СПЭ осуществляли на сменных мембранных носителях (Hybond N и Pall Biodyne A соответственно), что позволяет проводить измерения без регенерации антител. Иммунные комплексы на мембране Hybond N иммобилизовали методом иммунофильтрации с использованием полиэлектролитов; иммобилизацию антител на мембране Pall Biodyne A осуществляли путем нековалентной сорбции. В иммуносенсоре на основе ПЭ антитела иммобилизовали непосредственно на поверхности электрода методом электроосаждения.

Разработанные иммуносенсорные системы при определении симазина, атразина и хлорсульфурона показали высокую чувствительность (0,01-2,0 нг/мл), удовлетворяющую практическим требованиям. Применение электрохимических сенсоров позволило обеспечить также высокую экспрессность и точность измерений (табл. 11).

Таблица 11. Характеристики иммуносенсоров, разработанных для определения гербицидов.

Характеристики

ПТ СПЭ ПЭ

иммуносенсоров Предел обнаружения, нг/мл Диапазон концентраций, нг/мл Коэффициент вариации, % В целом, разработанные в рамках проведенных исследований иммунохимические системы обеспечивают как высокую чувствительность анализа, соответствующую сельскохозяйственной продукции, так и высокую экспрессность, что обуславливает перспективность их практического применения. Предложенные подходы могут быть использованы для разработки методов иммунохимической детекции других гербицидов, а также соединений различной природы.

ВЫВОДЫ

1. Получены и охарактеризованы реагенты – антитела, конъюгаты гаптенов с белками, ферментами и флуорохромами – для проведения иммунохимического определения гербицидов атразина, симазина и хлорсульфурона.

2. На основе изучения взаимодействия исследованных гербицидов со специфическими антителами в равновесном и кинетическом режимах определены оптимальные условия применения полученных реагентов в различных схемах иммуноанализа.

3. Изучено влияние состава водно-органических смесей на реагенты, используемые для иммунодетекции гербицидов (антитела, ферменты и их конъюгаты с гербицидами).

Предложены оптимальные условия определения атразина в водно-органических средах иммуноферментным методом.

4. Исследованы кинетические зависимости взаимодействия гербицид-антитело в присутствии водорастворимых полиэлектролитов. Предложены пути применения иммобилизованных полиэлектролитов в аналитических целях, обеспечивающие значительное сокращение продолжительности анализа при сохранении высокой чувствительности.

5. Разработаны новые методы иммуноанализа гербицидов, позволяющие проводить их определение в воде и продуктах питания. Пределы обнаружения гербицидов данными методами находятся в интервале 0,05–10 нг/мл.

6. Показана эффективность определения гербицидов в трех типах электрохимических иммуносенсоров. Полученные иммунореагенты позволяют определять до 10 пг/мл гербицида в течение 15 мин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Dzantiev B.B., Reshetilov A.N., Shuvalova Yu.V., Izumrudov V.A., Yazynina E.V., Zherdev A.V. Development of immunosensor for pesticide simazine based on polyelectrolytes interaction. // Refereed Abstracts. The Vth World Congress on Biosensors. Berlin, Germany.

June 3-5, 1998. P. 387.

2. Dzantiev B.B., Zherdev A.V., Yazynina E.V., Izumrudov V.A. Enzyme immunoassays of herbicide simazine using water-soluble polyelectrolytes. // Abstracts. The IXth International Congress “Pesticide Chemistry: The Food-Environment Challenge”. Westminster, London, UK. August 2-7, 1998. P. 7A-O.

3. Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Izumrudov V.A., Gee S.J., Hammock B.D.

Immunoassay techniques for detection of the herbicide simazine based on use of oppositely charged water-soluble polyelectrolytes. // Analytical Chemistry. 1999. V. 71. N 16. P. 3538Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Izumrudov V.A., Gee S.J., Hammock B.D.

Microplate immunoassay technique with use of polyelectrolyte carriers: kinetic studying and application for detection of herbicide atrazine. // Analytica Chimica Acta. 1999. V. 399. N 1-2.

P. 151-160.

5. Dzantiev B.B., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Shuvalova Ju.V., Reshetilov A.N. Express immunotechniques for triazine herbicides detection. // Abstracts. The VIIth Symposium on The Chemistry and Fate of Modern Pesticides. Kansas, USA. September 14-16, 1999. P. 93.

6. Dzantiev B.B., Reshetilov A.N., Zherdev A.V., Shuvalova J.V., Yazynina E.V. Pesticides detection using immunosensor based on FET and changeable carriers. // Abstracts and Conference Program. IVth Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis. Mao, Spain. December 1-3, 1999. P. O8.

7. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Язынина Е.В., Решетилов А.Н., Шувалова Ю.В., Коржук иммунодетекции антигенов: Методические рекомендации. М.: Институт биохимии им.

А.Н. Баха РАН. 2000. 20 сс.

8. Язынина Е.В., Бызова Н.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Новые методы экспрессного иммуноанализа, основанные на полиэлектролитном разделении реагентов. // Тезисы стендовых сообщений Школы-конференции “Горизонты физико-химической биологии”.

Пущино, Россия. 28 мая – 2 июня 2000. C. 186.

9. Yulaev M.F., Sitdikov R.A., Dmitrieva N.M., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B.

Development of a potentiometric immunosensor for herbicide simazine and its application for food testing. // Sensors & Actuators B: Chemical. 2001. V. 75. N 1-2. P. 129-135.

10. Dzantiev B.B., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Eremin S.A., Popova V.A. Development of ELISA techniques for detection of herbicide chlorsulfuron. // Abstracts. VIIIth Symposium on the Chemistry and Fate of Modern Pesticides. Copenhagen, Denmark. August 21-24, 2001.

11. Shuvalova Yu.V., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B., Reshetilov A.N. Separationfree immunoassay of chlorsulfuron. // Abstracts. VIIIth European Conference on Organised Thin Films. Otranto, Italy. September 3-7, 2001. P. 12.05.

12. Язынина Е.В., Жердев А.В., Еремин С.А, Попова В.А., Дзантиев Б.Б. Разработка иммуноферментных методов определения гербицида хлорсульфурона. // Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38. N 1. С. 14-19.

13. Dzantiev B.B., Zherdev A.V., Yazynina E.V. Application of water soluble polymers and their complexes for immunoanalytical purposes. // In: “Smart Polymers for Bioseparation and Bioprocessing” (Igor Yu. Galaev & Bo Mattiasson, eds.), Taylor & Francis Books Ltd, London – New York. 2002. P. 207-229.

14. Eremin S.A., Ryabova I.A., Yakovleva J.N., Yazynina E.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B.

Development of a rapid, specific fluorescence polarization immunoassay for the herbicide chlorsulfuron. // Analytica Chimica Acta. 2002. V. 468. N 2. P. 231-238.



 
Похожие работы:

«Легонькова Ольга Александровна БИОТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ ПУТЕМ СОЗДАНИЯ ГИБРИДНЫХ КОМПОЗИТОВ 03.00.23 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Москва 2009 Работа выполнена в проблемной лаборатории полимеров Московского Государственного университета прикладной биотехнологии и на кафедре микробиологии Российского Государственного Аграрного Университета МСХА им. К.А.Тимирязева. Научный консультант - академик...»

«Курбанова Патимат Магомедкадиевна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ПО ЭФФЕКТИВНОЙ ВОЗРАСТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ Специальность: 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунитета отдела генетики Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова в 2005 – 2009 гг. Научный руководитель :...»

«МЕЙСУРОВА Александра Федоровна БИОМОНИТОРИНГ АТМОСФЕРНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИК СПЕКТРАЛЬНОГО АНАЛИЗА ИНДИКАТОРНЫХ ВИДОВ ЛИШАЙНИКОВ (НА ПРИМЕРЕ ТВЕРСКОЙ ОБЛАСТИ) Специальность 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Тверь-2014 1 Работа выполнена на кафедрах ботаники, физической химии и лаборатории спектроскопии ЦКП ФГБОУ ВПО Тверской государственный университет Научный консультант : доктор химических наук,...»

«Китаев Константин Альбертович ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОАДАПТАЦИИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА (LEPTINOTARSA DECEMLINEATA SAY) И ЕГО ЭНТОМОФАГОВ 03.02.07 – генетика 03.02.08– экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2013 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) является инвазивным видом, появившимся в агроэкосистемах вслед за картофелем, и наиболее массовым фитофагом...»

«ЧЕПИНОГА Виктор Владимирович ФЛОРА БАССЕЙНОВ РЕК ИЯ И ОКА (В ПРЕДЕЛАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.00.05. - ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Иркутск, 2000 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики Иркутского государственного университета. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент А. М. Зарубин Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор, Л.И. Малышев кандидат биологических наук, М.Г....»

«ШАДРИНА МАРИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 03.01.07 – Молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН доктор биологических наук, профессор Научный консультант : Петр Андреевич Сломинский Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной...»

«АБАТУРОВА АННА МИХАЙЛОВНА Изучение механизмов взаимодействия компонентов фотосинтетической цепи транспорта электрона методами компьютерного моделирования Специальность: 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : Доктор физико-математических наук, профессор...»

«КУШНИР Константин Яковлевич ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ ВТОРИЧНЫХ ОТХОДОВ ПРИ ПОЛИГОННОМ ЗАХОРОНЕНИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ Специальность: 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва-2010 Диссертационная работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре Техника и технология переработки отходов. Научный руководитель : доктор технических...»

«ЕВРЕИНОВА АЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА ИЗМЕНЕНИЕ ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЧЕРНОЗЕМА ОБЫКНОВЕННОГО ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ ВТОРОГО КЛАССА ОПАСНОСТИ (Mo, Co, Cr, Ni) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2006 2 Работа выполнена на кафедре экологии и природопользования Ростовского государственного университета Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, доцент Колесников Сергей...»

«Благодатский Сергей Александрович МИКРОБНАЯ БИОМАССА И МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦИКЛА АЗОТА В ПОЧВЕ Специальность 03.02.03 – микробиология 03.02.13 – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино – 2011 Работа выполнена в лаборатории почвенных циклов азота и углерода Учреждения Российской академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино, Московская обл. Научный консультант : д.б.н.,...»

«БУЗАЕВА Мария Владимировна ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД ОЧИСТКОЙ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРИРОДНЫХ СОРБЕНТОВ И КОМПЛЕКСОНОВ 03.02.08 - экология (химические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена на кафедре Химия Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный технический университет....»

«КАНЦЕРОВА Надежда Павловна Са2+-ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ НЕКОТОРЫХ ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И РЫБ Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН Научный руководитель : член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор НЕМОВА Нина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«ЗЕЛЕНКИНА Татьяна Савельевна Разнообразие и функциональная активность метилотрофного сообщества гидротерм восточного побережья озера Байкал 03.00.16 – экология 03.00.07– микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 2 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Дагурова Ольга Павловна Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ульяновск- 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования национальный исследовательский...»

«Пиотровский Михаил Сергеевич Участие НАДФН-оксидазы плазмалеммы в генерации супероксид-анион радикала в апопласте 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 1 Работа выполнена в лаборатории мембран растительных клеток Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва Научный руководитель :...»

«Рубцова Анна Викторовна БРИОФЛОРА УДМУРТСКОЙ РЕСПУБЛИКИ Специальности 03.02.01 – ботаника 03.02.08 - экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии растений ФГБОУ ВПО Удмуртский государственный университет. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Баранова Ольга Германовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Баишева Эльвира Закирьяновна...»

«Абрамов Сергей Маркович Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации 03.02.03 - Микробиология 03.01.06 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского...»

«ЛЕОНОВА Тамила Шамильевна ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННЫЕ СВЯЗИ PASSER DOMESTICUS L, 1758 И PASSER MONTANUS L, 1758 В УСЛОВИЯХ СОВМЕСТНОГО ОБИТАНИЯ НА УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЯХ РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2013 Работа выполнена на кафедре биоэкологии ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) Федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«КАШЕВАРОВ Глеб Сергеевич СТРУКТУРА И ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ДРИФТА БЕСПОЗВОНОЧНЫХ РЕК МЁША, КАЗАНКА И НОКСА (РЕСПУБЛИКА ТАТАРСТАН) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена на кафедре биоресурсов и аквакультуры (ранее кафедра зоологии позвоночных) Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный...»

«Моисеев Павел Александрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ДРЕВЕСНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ВЕРХНЕМ ПРЕДЕЛЕ ЕЕ ПРОИЗРАСТАНИЯ НА УРАЛЕ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант доктор биологических наук, профессор Шиятов Степан Григорьевич Официальные оппоненты : доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.