WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

БРИЛЛИАНТОВА

Анна Николаевна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГОСПИТАЛЬНЫХ ШТАММОВ

ВАНКОМИЦИН-УСТОЙЧИВЫХ Enterococcus faecium В ГЕМАТОЛОГИИ

14.01.21 гематология и переливание крови

03.01.03 молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН Научные руководители:

кандидат медицинских наук Г.А.Клясова доктор химических наук, профессор В.И.Тишков

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Е.Н.Паровичникова доктор биологических наук, профессор П.М.Рубцов Ведущее научное учреждение:

Федеральное Государственное Учреждение Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А.Герцена

Защита состоится «» 2010г. в час. на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 при Учреждении Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН по адресу: 125167, Москва, Новозыковский проезд, дом

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Автореферат разослан «_» _ 2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Е.Е.Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время энтерококки занимают одну из лидирующих позиций среди возбудителей госпитальных инфекций. Особую опасность для пациентов с иммуносупрессией представляют Enterococcus faecium устойчивые к ванкомицину (Сидоренко С.В., 2002). Частота инфекций, вызванных этими микроорганизмами, возрастает в последние годы. Описано шесть фенотипов устойчивости к ванкомицину (VanA, VanB, VanC, VanD, VanE и VanG). Наибольшее клиническое значение отводится фенотипу VanA, который определяется преимущественно у штаммов Enterococcus faecium (Coque T.




M. et al., 1995). Для этого фенотипа характерен высокий уровень резистентности к ванкомицину. Определено, что гены, кодирующие устойчивость у энтерококков с фенотипом VanA, входят в состав транспозона Tn1546. Этот транспозон может перемещаться из хромосомной ДНК бактерий в плазмиды, которые передаются от устойчивых к ванкомицину энтерококков к чувствительным штаммам (Weaver K.E. et al., 2002). Благодаря такому обмену происходит быстрое распространение в стационаре резистентных к ванкомицину штаммов энтерококков. Полагают, что мутации в составе транспозона Tn1546 влияют на уровень резистентности энтерококков к ванкомицину, а также на способность Tn1546 перемещаться из хромосомной ДНК в плазмидную (Park I.J.

et al., 2007). До сих пор значение структурных изменений в эволюции генов резистентности энтерококков к ванкомицину окончательно не выяснено.

При распространении энтерококков в стационаре немалое значение имеют и факторы вирулентности, которые могут индуцировать инфекционный процесс у человека.

Факторы вирулентности изучены недостаточно. В то же время известно, что некоторые гены, кодирующие факторы вирулентности, объединены в кластер - островок патогенности, который может передаваться от более вирулентных менее вирулентным штаммам энтерококков (Leavis H. et al., 2004).

В последние годы выявлено, что большинство изолятов Enterococcus faecium, вызывающих госпитальные вспышки инфекций, относятся к клональному комплексу штаммов Enterococcus faecium 17 (clonal complex 17 - СС17). Существование клонального комплекса СС17 было доказано при мультилокусном секвенировании (Multilocus Sequence Typing - MLST) фрагментов генов клеточного метаболизма и транспорта ванкомицинустойчивых энтерококков. Штаммы Enterococcus faecium, входящие в клональный комплекс CC17, характеризуются особой структурой этих генов и более высокой вирулентностью (Hendrickx A.A. et al., 2007). В связи с этим исследование молекулярной изменчивости транспозонов Tn1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, выявление генов вирулентности, а также определение принадлежности энтерококков к клональному комплексу госпитальных штаммов CC17 является актуальным и необходимым в изучении ванкомицин-устойчивых штаммов энтерококков, выделенных от больных в отделениях гематологии.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение молекулярных особенностей ванкомицин-устойчивых штаммов Enterococcus faecium, выделенных от гематологических больных. В этой связи в работе были поставлены следующие задачи:

1. Провести генотипирование госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, выделенных от больных опухолями системы крови, и определить клональный состав популяции этих микроорганизмов.

2. Исследовать молекулярную структуру транспозонов Tn1546, кодирующих резистентность энтерококков к ванкомицину, и их эволюцию в процессе циркуляции штаммов в стационаре.

3. Изучить гены вирулентности у ванкомицин-устойчивых штаммов Enterococcus faecium и провести сравнение с ванкомицин-чувствительными Enterococcus faecium.





4. Выявить принадлежность эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium к госпитальной популяции штаммов клональному комплексу CC17.

Научная новизна исследования. Впервые в России проведено исследование по изучению молекулярных особенностей госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium. При иccледовании энтерококков методом пульс-электрофореза выявлено преобладание в стационаре двух эпидемических клонов ванкомицинустойчивых Enterococcus faecium, содержащих 74% штаммов.

При изучении молекулярной структуры транспозонов Tn1546, кодирующих резистентность к ванкомицину, зарегистрировано преобладание транспозонов консервативной структуры (тип 1), содержащих полный набор генов резистентности к ванкомицину. Определены также транспозоны Tn1546, содержащие структурные изменения (тип 2, тип 3, тип 4), которые возникли при циркуляции штаммов в стационаре.

Выявлены такие мутации, как делеция фрагмента гена orf1, инсерция IS1216V в области orf1, а также инсерция IS1251 между генами vanS и vanH транспозона Tn1546.

Установлено, что транспозоны одного типа распространяются между генетически неродственными штаммами Enterococcus faecium.

Исследование генов вирулентности доказало, что у ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium по сравнению с чувствительными к ванкомицину штаммами достоверно чаще преобладают гены вирулентности esp (92% против 6%) и gelE (67% против 22%). Частота выявления гена hyl, напротив, значимо ниже для устойчивых штаммов по сравнению с чувствительными к ванкомицину изолятами (27% против 66%).

Показано, что наличие гена вирулентности esp является характерным для эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium и обеспечивает эволюционные преимущества микроорганизмам при распространении в стационаре.

Мультилокусное секвенирование эпидемических изолятов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium доказало, что в России циркулируют изоляты, которые относятся к популяции штаммов Enterococcus faecium, вызывающих госпитальные вспышки энтерококковых инфекций в разных странах мира - клональному комплексу CC17.

Впервые в международный банк данных по эпидемиологии и эволюции энтерококков (MLST enterococci) включены результаты исследований структуры генов резистентности к ванкомицину, генов вирулентности, а также данные мультилокусного секвенирования эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium из России.

Научно-практическая ценность работы. Определено, что эволюционное превосходство при распространении от пациента к пациенту имеют изоляты ванкомицинустойчивых Enterococcus faecium, относящиеся к популяции эпидемических штаммов клональному комплексу CC17, а также обладающие генами вирулентности esp. В этой связи необходимо изолировать больных, которые являются носителями ванкомицинустойчивых Enterococcus faecium. Принадлежность этих микроорганизмов к эпидемическим штаммам достоверно определяется на основании мультилокусного секвенирования; косвенной характеристикой является присутствие генов вирулентности esp, а также консервативной структуры транспозонов Tn1546.

Положения, выносимые на защиту.

1. Преобладает клональный механизм распространения госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium в гематологии.

2. Большинство госпитальных штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium имеет транспозоны Tn1546 консервативной структуры без каких-либо мутаций. В процессе циркуляции штаммов в стационаре выявлены структурные изменения транспозонов Tn1546.

3. Основным геном вирулентности у штаммов Enterococcus faecium устойчивых к ванкомицину является ген esp, чувствительных к ванкомицину – ген hyl.

4. Ванкомицин-устойчивые Enterococcus faecium, выделенные от больных опухолями системы крови, принадлежат к клональному комплексу штаммов CC17, вызывающих вспышки госпитальных инфекций в разных странах мира.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в отечественных и зарубежных изданиях, в том числе 3 статьи и 9 тезисов (2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК).

Апробация диссертации. Основные положения работы доложены на 16 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Ницца, 2006), 17 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Мюнхен, 2007), Международной гематологической школе “Лейкозы и лимфомы. Терапия и фундаментальные исследования” (Москва, 2008), 18 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Барселона, 2008), на Межнаучной конференции по антимикробным агентам и химиотерапии (Вашингтон, 2008), Всероссийском декаднике по гематологии (Москва, 2009), 19 Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель включает отечественных и 124 зарубежных литературных источника.

Диссертация выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук бактериологии, микологии и антибиотической терапии (заведующая лабораторией к.м.н.

Г.А.Клясова) при научном сотрудничестве с сотрудниками группы генетической инженерии и белкового дизайна Химического факультета МГУ (руководитель – д.х.н., профессор В.И.Тишков), лаборатории клинической микробиологии Государственного научного центра по антибиотикам (руководитель – д.м.н., профессор С.В.Сидоренко), лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (заведующий лабораторией к.б.н.

А.Б.Судариков), лаборатории молекулярной биологии Федерального научно-клинического центра детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава (ФНКЦ ДГОИ) (заведующая лабораторией к.м.н. В.О. Бобрынина).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы Материалы исследования ванкомицину. Эти штаммы были выделены от 125 больных опухолями системы крови, находящихся на лечении в ГНЦ РАМН и 4 пациентов ФНКЦ ДГОИ, в период с 2004 по 2007 гг. Штаммы ванкомицин-устойчивых E. faecium были выделены из следующих локусов: слизистой оболочки прямой кишки (n=107), мочи (n=9), ран (n=4), жидкости бронхоальвеолярного лаважа (n=4), крови (n=2), слизистой оболочки зева (n=2) и цервикального канала (n=1).

Методы исследования Выделение и идентификация энтерококков. В исследование были включены штаммы E. faecium устойчивые к ванкомицину. Значения минимальной подавляющей концентрации ванкомицина этих штаммов, согласно рекомендациям Института клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards – CLSI, 2006), составили 32 мг/л и выше. Для выделения ванкомицин-устойчивых энтерококков клинические образцы инкубировали в трипказо-соевом бульоне (bioMerieux, Франция) с добавлением 32 мг/л ванкомицина (Sigma Chemical Co., США) 24 ч. при 35С. При помутнении бульона высевали содержимое на желче-эскулиновый агар (bioMerieux, Франция), содержащий 32 мг/л ванкомицина. При получении результата проводили микроскопию по Граму, для идентификации энтерококков использовали тест-системы BBL Crystal GP (Becton Diсkinson, США).

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Исследование генотипа резистентности, генов вирулентности, а также изучение структуры транспозонов Tn1546 ванкомицин-устойчивых E. faecium проводили методом ПЦР. Для приготовления образцов ДНК штаммы культивировали на колумбийском агаре с добавлением 5% крови (bioMerieux, Франция) при 35°С в течение суток. Выделение ДНК осуществляли при помощи реагента ДНКэкспресс (Литех, Россия). Реакционная смесь объёмом 25 мкл содержала 1 ед. Taq ДНК полимеразы (Сибэнзим, Россия), 0,1 мМ каждого dNTP (Сибэнзим, Россия), 0,1 мМ каждого праймера (Синтол, Россия), 5 мкл образца ДНК. Реакции ПЦР-амплификации проводили на амплификаторе Терцик (ДНК-технология, Россия). ПЦР-продукты разделяли в 1% агарозном геле (Helicon, Россия) с добавлением этидия бромида (BioRad, США) при 200 В в 1xTBE буфере (Литех, Россия). Для подтверждения идентификации бактерий проводили амплификацию фрагментов генов, кодирующих фермент Ddl-лигазу (ddlE. faecium). Генотипы резистентности определяли амплификацией фрагментов генов устойчивости энтерококков к ванкомицину (vanA, vanB, vanC1 и vanC2/3). Реакции проводили согласно методике Dutka-Malen S. и соавт. (1995). Исследование структуры транспозонов Tn1546, кодирующих устойчивость энтерококков к ванкомицину, проводили полученными для контрольного штамма E. faecium BM4147 в соответствии с методиками Schouten M.A. и соавт. (2001) и Willems R.L. и соавт. (1999). Для выявления генов вирулентности проводили ПЦР-амплификацию фрагментов генов, кодирующих факторы вирулентности энтерококковый поверхностный протеин (esp), гиалуронидазу (hyl), желатиназу (gelE), субстанцию агрегации (agg), и цитолизин (cylA) (Billstrom H. et al., 2008;

Eaton T. J. et al, 2001).

Пульс-электрофорез (Pulsed Field Gel Electrophoresis - PFGE). Генотипирование Е.

faecium проводили с использованием наборов реагентов Genepath Reagent Kits group 1, (BioRad, США) в соответствии с инструкциями производителя. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК осуществляли в 1% агарозе и 1 х электрофорезном буфере (Electrophoresis Running Buffer) в аппарате GenePath (BioRad, США) при температуре буфера 14°С. Сравнение и учет электрофореграмм производился при помощи компьютерного анализа (GelCompar, BioNumerics Applied Maths, США). Был использован метод невзвешенного попарного среднего на основе коэффициента корреляции Пирсона.

Мультилокусное секвенирование (Multilocus Sequence Typing – MLST). Была проведена ПЦР-амплификация фрагментов следующих генов: adk (аденилаткиназа), atp (АТФ-синтаза), ddl (D-аланин-D-аланин лигаза), gyd (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа), gdh (глюкоза-6-фосфат дегидрогеназа), purK (фосфорибозил аминоимидазол карбоксилаза АТФазная субъединица), pstS (переносчик АТФсвязывающей кассеты). Секвенирование проводили в соответствии с методикой Homan W. L. и соавт. (2002). Для этого использовали амплификатор GeneAmp PCR System (Applied Biosystems, США) с 96-луночным планшетом MicroAmp 96-Well Reaction Plate (Applied Biosystems, США). Был использован генетический анализатор 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) и готовый набор реагентов для секвенирования ABI PRISM BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США). Обработка (http://www.mlst.net).

Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка результатов проводилась при использовании программы математической обработки Statistica, версия 5.5. Для оценки достоверности отличий использовали параметрический критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при вероятности ошибки р0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Молекулярное типирование штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium При молекулярном типировании 129 штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium методом PFGE было выявлено 23 различных типа, соответствующих рестрикционным профилям изолятов (A-W) (рис. 1).

Типы изолятов (PFGE) Рис. 1. Рестрикционные профили ванкомицин-устойчивых E. faecium. -ДНК маркер (конкатамеры ДНК фага ), справа указаны размеры ДНК фрагментов (кБ).

дендрограмме (рис. 2). Определены клоны бактерий, в состав которых входили два и более генетически идентичных штаммов. Эти клоны были представлены типами A-G.

Наибольшее число исследованных штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium было отнесено к клонам A и F, которые содержали 84 (65,1%) и 12 (9,3%) штаммов, соответственно. Клоны A и F определены эпидемическими. Клон A и клон F формировали два основных кластера изолятов (рис. 2). Более редкие клоны B, C, D, E и G содержали от двух до пяти штаммов E. faecium, суммарно они включали 17 (13,2%) изолятов.

Остальные 16 (12,4%) штаммов были спорадическими и относились к типам (H-W).

Рестрикционные профили изолятов, относящихся к одному клону, отличались в пределах трех полос. Учитывая эти различия, были выделены 30 субклонов A (A1-A30), восемь - F (F1-F8), пять - G (G1-G5); четыре - С (С1-С4) и E (E1-E4), а в клонах B и D по два субклона (B1 и B2; D1 и D2).

Рис. 2. Дендрограмма генетического родства 129 штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium.

Горизонтальная ось дендрограммы отражает степень сходства штаммов. Прерывистые линии отделяют кластеры штаммов, соответствующие различным типам. В скобках представлены выявленные субклоны E. faecium.

Нами было определено, что клональный состав популяции ванкомицин-устойчивых E. faecium изменялся в период с 2004 по 2007 гг. (табл. 1). Первый штамм E. faecium, устойчивый к ванкомицину, был выявлен в 2004 г. и относился к эпидемическому клону A.

В 2004 г., наряду с клоном А, был обнаружен штамм, который относился ко второму эпидемическому клону F, и один спорадический изолят J. В 2005 г. одновременно с циркуляцией эпидемических клонов A и F был зарегистрирован новый клон D, а число спорадических штаммов возросло до четырех (L, M, N, O). К 2006 г. выявляли уже пять различных клонов бактерий (A, D, E, F, G), количество спорадических штаммов при этом составило десять (H, K, P, Q, R, S, T, U, V, W). В 2007 г. число циркулирующих клонов сократилось до трех (A, B, C) и был выявлен лишь один спорадический штамм I.

Таблица 1. Распределение типов (PFGE) ванкомицин-устойчивых E. faecium с 2004 по 2007 гг.

Спорадические типы (H-W) Из полученных данных следует, что эпидемические клоны A и F не только включали наибольшее число штаммов, но и были наиболее стабильными. Период циркуляции клона А составил два с половиной года, а клона F - один год, в то время как малочисленные клоны (B, C, D, E, G) циркулировали в стационаре от восьми дней до восьми месяцев.

Таким образом, в результате молекулярного типирования была зарегистрирована клональность циркулирующих штаммов, определено два эпидемических клона (А и F), включающих 74% изолятов ванкомицин-устойчивых E. faecium. Наряду с циркуляцией эпидемических штаммов, были зарегистрированы спорадические изоляты, а также клоны, содержащие небольшое число молекулярно-родственняых штаммов (B, С, В, E, G).

Результаты проведенных исследований свидетельствует о наличии разных источников ванкомицин-устойчивых E. faecium в стационаре.

Структура транспозонов Tn1546, кодирующих резистентность E. faecium к ванкомицину Наряду с определением клонального родства 129 исследуемых штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium, нами был проведен анализ структур транспозонов Tn1546, кодирующих резистентность к ванкомицину. Все исследованные штаммы были отнесены к четырем различным типам в соответствии со структурными отличиями, выявленными при ПЦР-амплификации фрагментов 9 генов (orf1, orf2, vanR, vanS, vanH, vanA, vanX, vanY, vanZ), входящих в состав Tn1546. Результаты анализа сравнивали с данными, полученными для контрольного штамма E. faecium BM4147. Структуры транспозонов, даты и частота их выявления представлены на рис. 4.

области, амплифицируемые в данном исследовании, а также размер транспозона Tn1546 (пар оснований - п.о.). Делеции и инсерции (IS), выявленные при анализе, обозначены пунктирными линиями и треугольниками.

При исследовании был выявлен ряд структурных изменений в межгенной области vanS-vanH и в гене orf1 транспозона Tn1546. На основании выявленных изменений были определены типы транспозонов (тип 1 - тип 4). К типу 1 были отнесены штаммы, с транспозонами, которые были идентичны консервативным транспозонам Tn1546, обнаруженным у контрольного штамма E. faecium BM4147. К этому типу относились (91%) изолятов.

Для транспозонов тип 2 была выявлена инсерция в области между генами vanS и vanH (рис. 4). Инсерция IS1251 между генами vanS и vanH выявляли у штаммов из США, Норвегии и Ирландии, а также Греции и Бразилии (Willems R.J.L. et al., 1999; Camargo I.L.

et al., 2004). Транспозон тип 2 имел только один изолят (1%).

У транспозонов тип 3 была выявлена делеция нуклеотидов 42-1141 гена orf1 и определена инсерция в межгенной области vanSH. Дополнительный анализ структур транспозонов тип 3 с прямым праймером, специфичным к инсерции IS1216V, и обратным праймером, специфичным к гену orf1, выявил частичную замену гена orf1 инсерцией IS1216V (рис. 4). Замену фрагмента гена orf1 инсерцией IS1216V регистрировали в составе транспозонов Tn1546 Brown A. R. и соавт. (2001). К типу 3 относилось 9 (7%) исследуемых штаммов.

К типу 4 был отнесен один штамм (1%), у которого была обнаружена делеция в области нуклеотидов 42-3007 гена orf1. У этого штамма также определялась инсерция в области между генами vanS и vanH (рис. 4). Такие делеции в области левого конца Tn1546 (ген orf1) достаточно часто встречаются среди клинических штаммов E. faecium, выделенных в Европе (Schouten M. A., et al., 2001).

На рис. 5 представлена эволюция транспозонов Tn1546, при этом нумерация транспозонов соответствует очередности их выявления. Первым был выявлен тип 1, затем тип 2, тип 3 и тип 4. Порядковый номер отражает структурные изменения, возникающие в процессе циркуляции транспозонов. Согласно представленной схеме, изменения в структурах транспозонов происходили поэтапно. После инсерции IS1251 в область между генами vanS и vanH транспозона Tn1546 (тип 1) произошло образование транспозона тип 2. Затем, вероятнее всего, из транспозона тип 2 независимо образовались транспозоны тип 3 и тип 4 за счет делеций фрагмента гена orf1, а также исследованного штамма, то можно полагать, что его роль в эволюции кластера генов резистентности к ванкомицину была промежуточной.

Рис. 5. Схема эволюции транспозонов Tn1546.

Следует отметить, что транспозоны тип 1 и тип 3 были определены не только у штаммов одного клона, но и у генетически неродственных изолятов. Транспозон Tn консервативной структуры (тип 1) изначально выявляли у изолятов, относящихся к основному эпидемическому клону A. Затем этот транспозон был зарегистрирован у штаммов, принадлежащих к клонам D, F и G, а также у спорадических изолятов (S, T, U).

Транспозон тип 3 первично выявляли у спорадического штамма (V), а затем произошло его распространение среди других спорадических (I, W) и клональных изолятов (B).

Транспозон тип 2 был обнаружен лишь у одного штамма, относящегося к эпидемическому клону F. Аналогично транспозон тип 4 был выявлен у единичного спорадического штамма (H). Выявленные закономерности свидетельствуют о передаче транспозонов Tn между генетически неродственными изолятами E. faecium.

транспозонов Tn1546 консервативной структуры (тип 1) без каких-либо мутаций. Наряду с ними были определены транспозоны других типов (тип 2, тип 3, тип 4), которые возникли в процессе циркуляции ванкомицин-устойчивых E. faecium в гематологическом стационаре. У этих транспозонов были выявлены делеции и инсерции IS1216V в области гена orf1, а также инсерции IS1251 между генами vanS и VanH. Транспозоны тип 1 и тип были определены у генетически неродственных штаммов ванкомицин-устойчивых E.

faecium, что свидетельствует о передаче транспозонов Tn1546 между штаммами.

Результаты исследования генов вирулентности E. faecium Вирулентность ванкомицин-устойчивых штаммов E. faecium. Наряду с изучением структуры транспозонов Tn1546, кодирующих устойчивость к ванкомицину у энтерококков, были исследованы гены вирулентности у 129 ванкомицин-устойчивых штаммов E. faecium методом ПЦР. Ген вирулентности esp, который кодирует энтерококковый поверхностный протеин, способствующий адгезии микроорганизмов к различным поверхностям, был выявлен у 92% (n=119) штаммов. Частота обнаружения гена gelE, который кодирует желатиназу – белок, обладающий цитотоксическим действием, составила 67% (n=87). Ген вирулентности hyl, кодирующий гиалуронидазу – фактор, который повышает инвазивную способность микроорганизмов, был обнаружен у 27% (n=35) штаммов. Гены agg и cylA, кодирующие факторы агрегации и лизиса микроорганизмов (субстанцию агрегации и цитолизин), не были выявлены ни у одного ванкомицин-устойчивого штамма E. faecium.

Гены вирулентности esp, gelE и hyl присутствовали в различных комбинациях, только у 9% (n=12) изолятов был определен один ген esp. Обнаружение одновременно двух генов esp и gelE было у 56% (n=72) штаммов, генов esp и hyl - у 16% (n=20), трех генов вирулентности - esp, hyl и gelE - у 12% (n=15) исследуемых энтерококков.

Было выявлено, что ген вирулентности esp присутствовал у всех штаммов, входящих в эпидемические клоны A и F. Значимо реже он был зарегистрирован у других клонально-родственных штаммов (76% против 100, p0,001) и у спорадических изолятов (63% против 100%, p0,001) (табл. 2). Аналогичные результаты были получены другими исследователями. В работе Vankerckhoven V. и соавт. (2004) ген вирулентности esp был определен в качестве маркера эпидемических клонов E. faecium. В нашем исследовании ген вирулентности gelE также достоверно чаще определялся у эпидемических штаммов по сравнению с другими клонально-родственными изолятами (88% против 18%, p0,001).

Спорадические штаммы ванкомицин-устойчивых E. faecium не содержали этот ген.

Таблица 2. Частота обнаружения генов вирулентности у штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium, принадлежащих к различным клонам, и у спорадических изолятов.

Частота выявления генов вирулентности у ванкомицинустойчивых E. faecium n (%) Ген вирулентности hyl выявляли с одинаковой частотой у изолятов, входящих в эпидемические клоны A и F (24%), в другие клонально-родственные штаммы, (41%) и у спорадических штаммов E. faecium (31%). В исследовании Rice L. B. и соавт. (2003) ген hyl был определен как маркер эпидемических штаммов E. faecium. Нами, напротив, было показано, что наличие hyl не является характерным для эпидемических штаммов.

Таким образом, исследование генов вирулентности ванкомицин-устойчивых изолятов E. faecium показало, что эпидемические штаммы клонов A и F представляют собой более вирулентную группу микроорганизмов по сравнению со спорадическими штаммами и изолятами, входящими в другие клоны. Было выявлено, что ген обеспечивает эволюционные преимущества изолятов при распространении от пациента к пациенту. Значение генов вирулентности hyl и gelE в распространении ванкомицинустойчивых E. faecium не определено.

Характеристика вирулентности E. faecium, устойчивых и чувствительных к ванкомицину. Наличие генов вирулентности esp, gelE, hyl, agg и cylA было исследовано у 89 изолятов E. faecium, чувствительных к ванкомицину. Все штаммы были выделены из крови гематологических больных. Характеристика генов вирулентности у чувствительных и устойчивых к ванкомицину штаммов E. faecium представлена в табл. 3. Преобладание генов вирулентности esp (92% против 6%, p0,001) и gelE (67% против 22%, p0,001) у ванкомицин-устойчивых штаммов E. faecium, в сравнении со штаммами чувствительными к ванкомицину, доказывает важное значение факторов Esp и Gel в распространении ванкомицин-устойчивых штаммов E. faecium в стационаре.

Таблица 3. Характеристика вирулентности E. faecium, устойчивых и чувствительных к ванкомицину.

вирулентности чувствительных к ванкомицину штаммов E. faecium и составила 66% против 27% для устойчивых изолятов. Возможно, эти отличия были обусловлены тем, что все чувствительные к ванкомицину E. faecium были выделены из гемокультур, а среди устойчивых к ванкомицину штаммов преобладали изоляты из кишечника. Известно, что фактор Hyl обеспечивает инвазивные свойства энтерококков и таким образом участвует в развитии инфекционного процесса. Можно полагать, что высокая частота выявления гена hyl у штаммов, выделенных из крови, является закономерной. Тем не менее, необходимы дополнительные исследования по изучению генов вирулентности у штаммов энтерококков чувствительных и устойчивых к ванкомицину, которые выделены из гемокультур.

Мультилокусное секвенирование эпидемических штаммов E. faecium Для определения принадлежности эпидемических изолятов к клональному энтерококковых инфекций в странах Европы, Америки и Азии было проведено исследование методом MLST. Были проанализированы 16 изолятов ванкомицинустойчивых E. faecium, относящихся к наиболее широко распространившимся субклонам (A1, A3, A8, A10, A16, A26, F1, F3). Филогенетическое родство эпидемических штаммов определяли на основании структурного полиморфизма генов, кодирующих белки внутриклеточного метаболизма и клеточного транспорта. Были определены нуклеотидные последовательности фрагментов следующих генов: atpA, ddl, gdh, purK, gyd, pstS и adk. В табл. 4 представлены результаты исследования эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium методом MLST. Полученные результаты были обработаны на web-сайте http://www.mlst.net/, который содержит данные MLST международных исследований. Каждой выявленной нуклеотидной последовательности приписывался соответствующий аллельный номер. Номера аллелей, полученные для семи исследуемых генов каждого штамма, формируют аллельные профили. Согласно этими аллельными профилями была определена принадлежность штаммов к трем группам, так называемым сиквенс типам, ST202, ST18 и ST262 (табл. 4).

Таблица 4. Характеристика 16 эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium, исследованных методами PFGE и MLST.

Примечание. Номера аллелей отражают присутствие мутаций в генах atpA, ddl, gdh, purK, gyd, pstS и adk (1 – мутации в составе генов не обнаружены, 5,7 – выявлены мутации в различных положениях генов).

У 11 из 16 изолятов была выявлена только одна нуклеотидная замена гуанина на аденин в положении 452 гена pstS. Оставшиеся пять штаммов содержали мутации в генах atpA и gyd (табл. 5). В положениях 95 и 128 гена atpA тимин был заменен на цитозин. Замены цитозина и гуанина на тимин были выявлены в положениях 239 и гена atpA. В составе гена gyd тимин был заменен на цитозин в положениях 160 и 331.

Гены adk, ddl, gdh и purK оказались наиболее консервативными, мутации в этих генах не были выявлены.

Таблица 5. Замены в нуклеотидных последовательностях генов atpA, gyd, pstS, выявленные методом MLST, у эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium.

Все 16 эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium, выделенные нами, относились к сиквенс типам ST202, ST18 и ST262 и входили в состав клонального комплекса штаммов E. faecium СС17, вызывающих госпитальные вспышки инфекций в клинических отделениях разных стран.

Структура популяции E. faecium СС17 схематически представлена на рис. 6. Схема отражает результаты MLST типирования штаммов E.faecium, выделенных в Европе, Америке, Австралии, Африке и Азии. Первичным штаммом E. faecium в популяции СС является изолят, для которого характерна консервативная структура исследуемых генов atpA, ddl, gdh, purK, gyd, pstS и adk. Он относится к сиквенс типу ST17. Этот сиквенс тип занимает центральное положение на схеме (рис. 6) и обозначен большим черным кружком. Другие сиквенс типы, которые представлены на диаграмме серыми и черными кружками, происходят от сиквенс типа ST17 и отличаются от него мутациями в генах atpA, ddl, gdh, purK, gyd, pstS и adk. Размер каждого кружка отражает частоту встречаемости сиквенс типа в базе данных MLST. При этом сиквенс типы, отличающиеся мутациями лишь в одном гене, соединены между собой линиями. Числа на схеме представляют собой номера сиквенс типов. Выявленные в нашем исследовании сиквенс типы представлены на рис.6 в овалах.

Все сиквенс типы ванкомицин-устойчивых E.faecium (ST202, ST18, ST262), выделенных от больных в двух гематологических центрах в России были определены исследователями в других странах (табл. 6). Среди обнаруженных в нашем исследовании сиквенс типов наиболее распространенным в мире является ST18. Штаммы энтерококков, относящиеся к ST18, были обнаружены в 10 странах Европы, а также в Австралии, Китае и Африке. Эти изоляты были выделены от пациентов, находящихся на лечении в медицинских учреждениях, однако, наряду с клиническими изолятами, относящимися к типу ST18, в Бельгии аналогичный энтерококк был выявлен у животных (свиней). Таким ванкомицин-устойчивых E. faecium из внешнего источника, в частности, от животных. Все штаммы E. faecium, которые относились к сиквенс типу ST202, были выделены из клинических образцов, в Германии и Италии. Изоляты E. faecium, относящиеся к сиквенс типу ST262, отличались от изолятов, принадлежащих к типу ST18, лишь мутацией в гене pstS. Сиквенс тип ST262 ранее выявляли только среди госпитальных штаммов E. faecium в Нидерландах.

Рис. 6. Структура госпитальной популяции CC17, содержащей 1126 штаммов E. faecium, в основе которой результаты MLST анализа (http://www.mlst.net/).

Таблица 6. Распространение сиквенс типов ST18, ST202 и ST262 штаммов E. faecium в странах Европы, Африке и Австралии.

Сиквенс Примечание. Данные получены на сайте http://www.mlst.net/.

Можно полагать, что исследованные нами эпидемические штаммы ванкомицинустойчивых E. faecium, которые относились к сиквенс типам ST202 и ST18, произошли от первичного изолята E. faecium, принадлежащего к сиквенс типу ST17, вследствие генетических изменений. Эти изменения происходили по двум независимым направлениям. Вероятно, штаммы сиквенс типа ST202 произошли от изолятов, принадлежащих к сиквенс типу ST17, в результате мутации в гене pstS, а штаммы, относящиеся к типу ST18, вследствие мутаций в двух генах atpA и gyd. Изоляты сиквенс типа ST262, в свою очередь, происходили от штаммов, принадлежащих к типу ST18, в результате мутации в гене pstS. Эволюционные изменения эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium представлены на рис. 7.

(1-1-1-1-1-1-1) Рис. 7. Эволюционные изменения эпидемических штаммов ванкомицин-устойчивых E. faecium, выделенные от больных опухолями системы крови. Аллельные профили указаны в скобках. Их различия выделены подчеркиванием.

изолятов ванкомицин-устойчивых E. faecium, выделенных от больных в гематологических центрах, к клональному комплексу штаммов E. faecium СС17. Такие штаммы вызывают госпитальные вспышки энтерококковых инфекций в разных странах мира.

ВЫВОДЫ

1. Ванкомицин-устойчивые Enterococcus faecium в отделениях гематологии представлены в основном (96 из 129 штаммов) двумя клонами.

2. Кодирующие устойчивость к ванкомицину транспозоны Tn1546 с консервативной структурой генов (тип 1) преобладают у госпитальных штаммов ванкомицинустойчивых Enterococcus faecium; частота выявления составляет 91%.

3. В процессе циркуляции штаммов ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium изменяется структура транспозонов Tn1546, обнаружены делеции и инсерции IS1216V в области гена orf1, а также инсерции IS1251 между генами vanS и VanH.

4. Основной ген ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, кодирующий вирулентность, - ген esp, выявлен у 119 (92%) из 129 изолятов; определены также другие гены - gelE и hyl.

5. Основной ген ванкомицин-чувствительных Enterococcus faecium - ген hyl, выявлен у (66%) из 89 штаммов, обнаружены также гены - esp и gelE.

6. Эпидемические изоляты ванкомицин-устойчивых Enterococcus faecium, выделенные от больных опухолями системы крови, принадлежат к госпитальной популяции штаммов, входящих в состав клонального комплекса CC17.

Сокращения, используемые в тексте ПЦР – полимеразная цепная реакция п.о. – пар оснований Кб – тысяча оснований MLST – multilocus sequence typing, мультилокусное секвенирование PFGE – pulsed-field electrophoresis, пульс-электорофорез Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Клясова Г.А., Бриллиантова А.Н., Миронова А.В. Генотипирование грамотрицательных бактерий, выделенных из крови при сепсисе у больных с гематологическими заболеваниями. Терапевтический архив, 2007, т.79, N 7, c.74-80.

2. Клясова Г.А., Сперанская Л.Л., Миронова А.В., Масчан М.А., Байдильдина Д.Д., Верещагина С.А., Капорская Т.С., Юрицина Н.Ю., Поспелова Т.И., Крайнова Л.Е., Маркина О.А., Трушина Е.Е., Бриллиантова А.Н., Фролова И.Н. Возбудители сепсиса у антибиотикорезистентности (результаты многоцентрового исследования).

Гематология и трансфузиология, 2007, N1, c.11-19.

3. Brilliantova A. N., Kliasova G. A., Mironova A. V., Tishkov V. I., Novichkova G. A., Bobrynina V. O., Sidorenko S. V. Spread of vancomycin-resistant Enterococcus faecium in two haematological centers in Russia. International Journal of Antimicrobial Agents, 2010, Vol.

doi:10.1016/j.ijantimicag.2009.10.006.

4. Brilliantova A., Kliasova G., Mironova A., Novichkova G., Bobrynina V. Spread of epidemic vancomycin-resistant Enterococcus faecium clonal complex 17 in haematological patients in Russia. Clinical Microbiology and Infection, 2009, Vol.14, Supp.4, p.S631, abst. R2141.

5. Brilliantova A., Kliasova G., Mironova A., Sidorenko S., Tishkov V. Molecular Characteristic and Virulence Evaluation of Vancomycin-resistant Enterococcus faecium in Hematological Patients. 48th Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy (ICAAC) 2008, Washington DC, abstr. C-2 1999.

6. Brilliantova A., Mironova A., Kliasova G., Sidorenko S. Evaluation of virulence and resistance genes structure in vancomycin-resistant E. faecium. Clinical Microbiology and Infection, 2008, Vol.14, Supp.7, p.S624, abst. P2113.

7. Brilliantova A., Kliasova G., Mironova A., Sidorenko S. Clonal dissemination of Gramnegative bacteria causing bloodstream infections in patients with haematological malignancies. Clinical Microbiology and Infection, 2007, Vol.13, Supp.1, p.S176, abst. P722.

8. Kliasova G., Speranskaya L., Trushina E., Mironova A., Ptitcin S., Maschan M., Vereschagina S., Kaporskaya T., Yuritcina N., Pospelova T., Krainova L., Brilliantova A., Markina O. Bacteraemia and fungaemia in haematologic patients. Clinical Microbiology and Infection, 2007, Vol.13, Supp.1, p.S174, abst. P717.

9. Mironova A., Brilliantova A., Trushina E., Phrolova I., Speranskaya L. Prevalence of antimicrobial resistance of enterococcus species isolated from blood of patients with haematological malignancies in Russia. Clinical Microbiology and Infection, 2008, Vol.14, Supp.7, p.S143, abst. P598.

10. Mironova A., Brilliantova A. Prevalence and epidemiology of vancomycin-resistant enterococci in a Russian haematology center. Clinical Microbiology and Infection, 2008, Vol.14, Supp.7, p.S624, abst. P2114.

11. Mironova A., Kliasova G., Brilliantova A. Comparison of antibiotics susceptibility of different vancomycin-resistant Enterococcus faecium clones. Clinical Microbiology and Infection, 2007, Vol.13, Supp.1, p.S169, abst. P700.

12. Mironova A., Cherkashin E., Kliasova G., Tishkov V., Brilliantova A., Rezvan S., Sidorenko S. First detection of vancomycin-resistant enterococci in Russia: genetic background.

Clinical Microbiology and Infection, 2006, Vol.12, Supp.4, p.S131, abst. P1819.



 
Похожие работы:

«БОЛТОВИЧ ИРИНА МИХАЙЛОВНА КЛИНИКО-БИОРИТМОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ КОМБИНИРОВАННЫХ ОРАЛЬНЫХ КОНТРАЦЕПТИВОВ У ЗДОРОВЫХ ЖЕНЩИН 03.00.13 - Физиология 14.00.01 – Акушерство и гинекология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень – 2007 Работа выполнена в БУ ВПО Ханты-Мансийского автономного округа - Югры Ханты-Мансийский государственный медицинский институт Научный руководитель : доктор медицинских наук Соловьёв Сергей Владимирович...»

«Моисеев Павел Александрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ДРЕВЕСНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ВЕРХНЕМ ПРЕДЕЛЕ ЕЕ ПРОИЗРАСТАНИЯ НА УРАЛЕ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант доктор биологических наук, профессор Шиятов Степан Григорьевич Официальные оппоненты : доктор...»

«Зангелиди Вероника Владимировна ВЛИЯНИЕ ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА СОСТОЯНИЕ ПОЧВ Г. ВЛАДИКАВКАЗА 03.00.27 – Почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2009 Работа выполнена на кафедре геоэкологии и землеустройства ФГОУ ВПО Северо-Осетинский государственный университет им. К. Л. Хетагурова Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор Бясов Казбек Харитонович Официальные оппоненты : доктор...»

«ЕЛИЗАРЬЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ЭНДЕМИКА ЮЖНОГО УРАЛА OXYTROPIS GMELINII FISCH. EX BORISS. (FABACEAE) В УСЛОВИЯХ ИНТРОДУКЦИИ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 2 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности в Учреждении РАН Институт биологии Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный...»

«Дымшакова Ольга Сергеевна ЕСТЕСТВЕННАЯ И ИСКУССТВЕННАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ В КОМПЛЕКСЕ SAXIFRAGA CERNUA L. – S. SIBIRICA L. НА УРАЛЕ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Семериков Владимир Леонидович Официальные оппоненты : доктор...»

«Жмылёва Александра Павловна Влияние экологических факторов на время зацветания лесных растений средней полосы России 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2009 2 Диссертационная работа выполнена на кафедре системной экологии экологического факультета Российского университета дружбы народов Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Карпухина Е.А. Официальные оппоненты : доктор...»

«Тихомирова Людмила Ивановна ОСОБЕННОСТИ ИНДУЦИРОВАННОГО МОРФОГЕНЕЗА И РЕГЕНЕРАЦИИ У РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ ЭКСПЛАНТОВ IN VITRO КУЛЬТИВАРОВ ВИДОВ РОДА IRIS L. Специальность 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул, 2011 2 Диссертационная работа выполнена в Государственном научном учреждении Научно-исследовательский институт садоводства Сибири имени М.А. Лисавенко Российской академии сельскохозяйственных наук (НИИСС)...»

«Семина Алиса Владимировна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ В ДВУХ ГРУППАХ РЫБ СЕМЕЙСТВ MUGILIDAE И CYPRINIDAE 03.00.15 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2008 2 Работа выполнена в лаборатории генетики Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Брыков Владимир...»

«Алексеева Анна Юрьевна ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научный руководитель : Вейко Наталья Николаевна доктор биологических наук Официальные...»

«ЗНАК НАТАЛИЯ ЕВГЕНЬЕВНА ТЕОРИЯ РОСТА И ИСПАРЕНИЯ АЭРОЗОЛЬНЫХ КАПЕЛЬ ВО ВНЕШНЕЙ ГАЗОВОЙ СРЕДЕ Специальность 03.00.16 – Экология (физико-математические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва - 2008 2 Работа выполнена на кафедре теоретической физики Московского государственного областного университета заслуженный деятель науки РФ, Научный руководитель : доктор физико-математических наук, профессор Яламов Юрий...»

«Альфрайхат Махмуд Хасан УСТОЙЧИВОСТЬ ПОЧВ ВЫСОКОГО ПЛАТО ИОРДАНИИ И ЕГО ОБРАМЛЕНИЯ Специальность: 03.00.27-почвоведение Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва-2009 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения и земледелия Российского университета дружбы народов Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ларешин Вячеслав Григорьевич. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ганжара Николай...»

«Бутина Наталья Александровна ИЛЬМОВНИКИ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ ФЛОРИСТИЧЕСКОГО И ФИТОЦЕНОТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ, БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА ULMUS. L. 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ-2009 3 Работа выполнена в Забайкальском государственном гуманитарнопедагогическом университете им. Н.Г. Чернышевского доктор биологических наук Научный руководитель : Ольга Александровна Попова...»

«Головина Екатерина Олеговна Петрофитные степи западной части Ононской Даурии 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в Лаборатории географии и картографии растительности Учреждения Российской академии наук Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Сафронова Ирина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«ВЕРХУША Владислав Витальевич ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ТАЙМЕРЫ, ПОСТОЯННО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ И ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ БЕЛКИ 03.01.03 - молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН и в Медицинском колледже им. А. Эйнштейна в Нью-Йорке Научный консультант : доктор...»

«ТИТОВА СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА Влияние фитопатогенных микроорганизмов на энзиматическую активность растения-хозяина Glycine max (L.) Merr. и Glycine soja Sieb. et Zucc. 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Благовещенск – 2014 Работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории Соя ФГБОУ ВПО Дальневосточный государственный аграрный университет Научный руководитель кандидат биологических наук, доцент...»

«Яцко Яков Николаевич ПИГМЕНТНЫЙ АППАРАТ ВЕЧНОЗЕЛЁНЫХ РАСТЕНИЙ НА СЕВЕРЕ 03.01.05 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биологии Коми научного центра Уральского отделения РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Головко Тамара Константиновна Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Устименко Елена Александровна БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ У ТИХООКЕАНСКИХ ЛОСОСЕЙ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ВОСПРОИЗВОДСТВЕ НА КАМЧАТКЕ 03.02.06 — ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Камчатский государственный технический университет и Камчатском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО) Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ШУМЕЕВ Александр Николаевич ПРЕСНОВОДНЫЕ И НАЗЕМНЫЕ ПЛАНАРИИ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА Специальность: 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2008 Работа выполнена в Лаборатории эволюционной морфологии Зоологического института Российской Академии наук. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Ю.В. Мамкаев Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор А.И. Гранович...»

«НИМБУЕВА АЮНА ЗОРИКТОЕВНА ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ В ОРГАНИЧЕСКОМ ВЕЩЕСТВЕ ЛУГОВО-ЧЕРНОЗЕМНЫХ МЕРЗЛОТНЫХ И СЕРЫХ ЛЕСНЫХ ПОЧВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.00.27 – Почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук г. Улан- Удэ 2007 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор...»

«СЕРЕГИН Алексей Петрович РОД ALLIUM L. (ALLIACEAE) ВО ФЛОРЕ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2007 1 Работа выполнена на кафедре геоботаники Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ю.Е. Алексеев...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.