WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

КОТОВА Яна Николаевна

Исследование механизмов формирования гетерогенности

тромбоцитов крови человека при их активации

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический научный центр РАМН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Атауллаханов Фазоил Иноятович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Васильев Сергей Александрович доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич Bедущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН

Защита диссертации состоится « » 2009 года в часов на заседании Диссертационного совета Д.001.042.02. при Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН по адресу:

125167, г. Москва, Новый Зыковский проезд д.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РАМН.

Автореферат разослан « » 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Е.Е. Зыбунова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из фундаментальных задач медицины, биофизики, биохимии, молекулярной биологии и медицинской химии является исследование закономерностей функционирования системы гемостаза человека и, как следствие, возможное предотвращение таких патологических состояний, как инсульты, инфаркт, спонтанный тромбоз и др. Гемостаз является защитной реакцией организма, выражающейся в остановке кровотечения при повреждении стенки сосуда. Он возникает в результате спазма кровеносных сосудов и появления закупоривающего сосуд кровяного сгустка. В гемостатической реакции человека принимают участие окружающая сосуд ткань, стенка сосуда, плазменные факторы свертывания крови и клетки крови, в первую очередь тромбоциты, которые представляют собой безъядерные клеточные структуры неправильной округлой формы диаметром 1-4 мкм.

Они образуются в костном мозге путем отщепления от мегакариоцитов. Главной функцией тромбоцитов является образование «белого тромба», закрывающего первичное повреждение стенки сосуда.





Активация тромбоцита может вызываться множеством стимулов, включая химические и механические. Основными физиологическими активаторами считаются коллаген (главный белок внеклеточного матрикса) и тромбин, которые относятся к сильным эффекторам, а также АДФ (аденозиндифосфат, появляющийся из разрушенных клеток сосуда или секретируемый самим тромбоцитами) и тромбоксан А (вторичный активатор, секретируемый тромбоцитами). Активаторы, взаимодействуя с соответствующими мембранными рецепторами тромбоцита, способствуют его переходу в активированное состояние, которое характеризуется изменением формы, адгезией, агрегацией, секрецией содержимого гранул, формированием прокоагулянтной поверхности.

В норме мембрана тромбоцита асимметрична, благодаря работе транслоказы, которая АТФ-зависимым образом осуществляет перенос фосфолипидов (фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина) во внутренний слой мембраны. При активации эта асимметричность нарушается, активируются ферменты, действие которых приводит к выравниванию концентраций фосфолипидов между внешней и внутренней поверхностями мембраны. Это ведет к появлению во внешнем слое мембраны отрицательно заряженного фосфатидилсерина, что способствует сборке прокоагулянтных комплексов, таких как теназный и протромбиназный. [Zwaal R.F.A. et al. 1997]. Было обнаружено, что по данному параметру (уровень фосфатидилсерина на поверхности клетки) тромбоциты разделяются на две группы. Кроме того, в ходе активации тромбоциты секретируют и содержание своих гранул (альфа и плотные гранулы), что играет важную роль в свертывании крови.

В настоящее время было показано, что сильная физиологическая активация тромбоцитов (например, тромбином в сочетании с коллагеном или конвульксином, агонистом коллагенового рецептора гликопротеина VI) может привести к развитию неоднородности в ответе тромбоцитов. В работе [Alberio L., et al. 2000] впервые было показано, что комбинированная активация тромбоцитов двумя физиологическими агонистами, тромбином и коллагеном, способствовала экспрессии высокого уровня гранулярного фактора V на поверхности части тромбоцитов. Они назвали данную фракцию клеток «укутанными» тромбоцитами. Было также доказано, что в данных клетках экспрессируется высокий уровень фосфатидилсерина на поверхности. В работе [Dale G.L., et al. 2002] было показано, что помимо -гранулярного фактора V на поверхности «укутанных» тромбоцитов экспрессируются и другие -гранулярные белки (фибриноген, фактор фон Виллебранта, тромбоспондин, фибронектин и 2антиплазмин). Таким образом, новая обнаруженная субпопуляция тромбоцитов, названная «укутанными» тромбоцитами, характеризуется высоким уровнем фосфатидилсерина и альфа-гранулярных белков на своей поверхности.

В ходе изучения свойств новой фракции тромбоцитов, было определено, что предшественника данной субпопуляции «укутанных» тромбоцитов не существует и доля этих клеток зависит только от условий активации. [Alberio L, et al. 2000; London F.S. et al. 2004; Panteleev M.A. et al. 2005]. Было показано возможное участие коллагеновой рецептор-связанной молекулы FcR, митохондриальной поры в формирование «укутанных» тромбоцитов. [Jobe S.M. et al. 2005; Remenyi G. et al. 2005] Важным и пока не разрешенным вопросом в исследовании свойств «укутанных»





тромбоцитов остаются механизмы, приводящие к их образованию.

Тромбин, а также тромбин с коллагеном или конвульксином, активируют тромбоцит, приводя к секреции гранул, с выделением тромбоксана А2 и АДФ. АДФ, как и тромбоксан А2, являются физиологическими активаторами тромбоцитов. Выброс последних важен для формирования и развития тромба при повреждении. Однако их возможная роль в формировании «укутанных» тромбоцитов не совсем понятна.

Предполагая, что АДФ через свои адренергические рецепторы, а тромбоксан А2 через собственный рецептор участвуют в активации тромбоцитов. Они активируют различные сигнальные пути, которые приводят к активации гликопротеина IIb/IIIa, агрегации, а также секреции.

В работе [Dale G.L. et al. 2002] было показано, что альфа-гранулярные белки являются субстратами для трансглутаминаз тромбоцитов (тканевая трансглутаминаза и фактор XIIIa), ферментов, катализирующих образование -(-глутамил)-лизиновых сшивок. Результаты экспериментов с антителами к тканевой трансглутаминазе и фактору XIIIa показали, что обе трансглутаминазы присутствуют на поверхности «укутанных» тромбоцитов, а использование ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования «укутанных» тромбоцитов. Это свидетельствует о возможной роли данных ферментов (фактор XIIIa и тканевая трансглутаминаза) в формировании «укутанных» тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002].

Существуют данные, предполагающие, что ведущую роль в формировании «укутанных» тромбоцитов может играть фактор XIIIa. [Cox A., D Devine. 1994; Dale G.L. et al. 2002; Kulkarni S., et al. 2004] Однако, в работе [Jobe S.M. et al. 2005] было продемонстрировано, что мыши дефицитные по фактору XIIIa не имели трудностей в образовании «укутанных» тромбоцитов. Эти данные свидетельствуют в пользу того, что фактор XIIIa не является необходимым для образования «укутанных» тромбоцитов, и предполагают, что другая клеточная трансглутаминаза, а именно тканевая трансглутаминаза, может компенсировать отсутствие фактора XIIIa. Вопрос о роли данных ферментов до сих пор открыт.

«Укутанные» тромбоциты являются очень интересным и важным подклассом тромбоцитов. Имея высоко прокоагулянтную поверхность, они способны поддерживать протромбиназную активность. Есть указания на то, что «укутанные»

тромбоциты могут быть критическим звеном, как в нормальном гемостазе, так и при тромбозе. Однако, их точное значение в физиологии и патофизиологии, а также механизмы формирования такой гетерогенности тромбоцитов при активации неизвестны. Поэтому изучение сигнальных механизмов, ведущих к формированию данной субпопуляции тромбоцитов очень важно.

Цель работы: Экспериментальное исследование механизмов формирования гетерогенности тромбоцитов при их активации in vitro.

Задачи исследования:

1. Определение роли секреции тромбоцитов в образовании «укутанных»

2. Исследование внутриклеточных путей сигнализации, регулирующих формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации 3. Определение роли тканевой трансглутаминазы и фактора XIIIa в формировании гетерогенности тромбоцитов Научная новизна. В работе показано, что на образование «укутанных»

тромбоцитов влияет АДФ, секретируемый из плотных гранул тромбоцитов, через адренергический рецептор P2Y12. Установлено, что в формировании гетерогенности тромбоцитов участвуют внутриклеточные пути сигнализации, идущие от рецептора P2Y12 и связанные с действием аденилатциклазы, фосфоинозитид-3-киназы и Srcтирозинкиназы. Установлено, что фактор XIIIa и, особенно, тканевая трансглутаминаза вносят существенный вклад в формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Научно-практическое значение. Данная работа является фундаментальным исследованием, позволяющим понять механизмы формирования гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации, а также предполагаемую роль «укутанных» тромбоцитов. Результаты данной работы могут быть полезны как для понимания происходящих процессов тромбообразования, так и для создания на основе имеющихся знаний новых методов антитромботической терапии.

Положения, выносимые на защиту:

1. АДФ из плотных гранул регулирует формирование гетерогенности тромбоцитов человека.

2. Сигнализация от АДФ, регулирующая образование «укутанных»

тромбоцитов, идет через пуринэргический рецептор P2Y12.

3. Пути внутриклеточной сигнализации, ведущие к формированию «укутанных»

тромбоцитов: аденилатциклаза, фосфоинозитид-3-киназа и Src-тирозинкиназа.

4. Показано, что тканевая трансглутаминаза и фактор XIIIa участвуют в формировании гетерогенности тромбоцитов крови человека при их активации.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 101 странице машинописного текста, состоит из введения, четырех глав (главы 1 — обзора литературы, главы 2 — описания материалов и методов, главы 3 — описание экспериментальных результатов, главы 4 — обсуждения результатов), выводов и библиографического указателя, включающего 99 источников. Работа выполнена на базе Учреждения Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН в лаборатории физической биохимии системы крови (зав. лабораторией проф., д.б.н. Атауллаханов Ф.И.).

Апробация работы состоялась 16 сентября 2009 года на заседании проблемной комиссии “Биохимия, биофизика и реология крови” в Учреждении Российской Академии Медицинских наук Гематологический Научный Центр РАМН.

Материалы диссертации докладывались на 11-й и 12-й Международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXIвека» (Пущино, октября – 2 ноября 2007 года, 10 – 14 ноября 2008 года); на 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference (Athens, 28 June – 3 July 2008); 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research (Vienna, February 04 - 07, 2009).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 7 публикациях. Статей в рецензируемых журналах: 3; публикациях в трудах конференций и съездов:

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реагенты: тромбин, фактор XIIIa человеческий (Haematologic Technologies, США);

конвульксин (Pentapharm, Швейцария); простагландин E1 (MP Biochemicals, США); Rфикоэритрин(PE)- и флуоресцеин(FITC)-конъюгированный аннексин V (Molecular Probes, США); U0126, SCH-23390, форсколин (Tocris Cookson, США); PP2, вортманнин, FITC- конъюгированное анти-мышиное иммуноглобулиновое антитело, мышиное антитело к тромбоспондину человека (Calbiochem, США); U46619 (Cayman Chemicals, США); ингибиторы цистеиновых протеиназ, любезно предоставленные Костановой Е.А. из института биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН [Костанова Е.А. и др. 2007]; ингибирующие пептиды T26 (HQSYVDPWMLDH) и F11KA (DQMMLPWPAVAL), синтезированные в лаборатории белковой инженерии института биологической и медицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН [Sugimura Y., et al. 2006]. Остальные реагенты были из Sigma (США) Используемые в работе буферные растворы: (1) Буфер для работы с тромбоцитами, pH 7.4 (Буфер А): 150 мM NaCl; 2.7 мM KCl; 1 мM MgCl2; 0.4 мM NaH2PO4; 20 мM HEPES; 5 мM глюкозы; 0.5% бычий сывороточный альбумин; (2) цитратный буфер, рН 5.5: 111 мМ цитрат натрия; (3) Фосфатный буфер, pH 7.4 фирмы Sigma.

Выделение тромбоцитов Тромбоциты изолировали из крови здоровых доноров, которую заготавливали на 3.8 % цитратном буфере (111 мМ цитрат натрия, рН 5.5), соотношение кровь : цитрат составляло 9 : 1, с добавлением простагландина Е1 (1 мкM) и апиразы (0.1 ед./мл) для предотвращения активации. Кровь центрифугировали при комнатной температуре при 100g в течение 8 минут. После центрифугирования крови отбирали слой богатой тромбоцитами плазмы и добавляли в нее 3.8 % раствор цитрата натрия (111 мМ цитрат натрия, рН 5.5) (в соотношении плазма : цитрат – 3:1) для предотвращения агрегации.

Тромбоциты осаждали при 400g в течение 5 минут при комнатной температуре, затем ресуспендировали в 300 мкл буфера А. Очищали от белков плазмы крови прохождением суспензии клеток через гель-хроматографическую колонку (длина x ширина = 6 x 1 см) с использованием в качестве носителя сефарозу CL-2B и применением в качестве элюента буфера А.

Анализ гетерогенности тромбоцитов на проточном цитометре Анализ субпопуляций тромбоцитов производился на проточном цитометре типа FACSCalibur (BD Biosciences, США) при помощи программы WinMDI 2.8 software (Joseph Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA, США).

Эксперименты на проточном цитометре проводили с использованием нескольких видов красителей и активаторов по следующей методике постановки.

Методика постановки эксперимента. Гель-фильтрованные тромбоциты в определенной концентрации активировали требуемым активатором (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином, SFLLRN и т.д.) в буфере А с добавлением 2.5 мМ CaCl и 0.5 % PE–конъюгированного аннексина V. Время активации составляло 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, затем образец разбавляли до 200мкл буфером А с 2.5 мМ CaCl2. Измерения пробы проводили на проточном цитометре в течение 20 секунд при высокой скорости подачи пробы в прибор.

Анализ секреции плотных гранул тромбоцитов Пробу объемом 300мкл, содержащую гель-фитрованные тромбоциты в концентрации 20тыс./мкл или 100тыс./мкл в конечном содержании пробы, инкубировали с 10 мкM мепакрина в конечном объеме. Весь образец инкубировали в течение 30 минут при 370С без доступа света. По истечении времени инкубации из образца отбирали по 10 или 5 мкл проинкубированных с мепакрином тромбоцитов в зависимости от исходной концентрации клеток в пробе (20тыс./мкл или 100тыс./мкл, соответственно). Затем проводили активацию путем добавления равного объема буфера А в присутствии 2.5 мМ CaCl2, 0.5 % PE–конъюгированного аннексина V и активатора (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином) в конечном содержании пробы.

Время активации составляло 15 минут при комнатной температуре без перемешивания.

По истечении времени активации каждую пробу разводили буфером А с 2.5 мМ CaCl до 200мкл и сразу же измеряли на проточном цитометре в течение 20 секунд при высокой скорости подачи пробы в прибор.

Окраска активированных тромбоцитов антителами на тромбоспондин, фибриноген, факторV, PAC-1, CD62P.

Окраска активированных тромбоцитов проводилась двумя различными способами. Выбор способа окрашивания зависел от вида антител. Если первичное антитело не было конъюгировано с флуоресцентной меткой и, следовательно, требовалось использование вторичного антитела конъюгированного с флуоресцентной меткой, то использовали первый способ окраски (измененная методика из работы G.L.

Dale et al. 2002). Если же антитела были сразу конъюгированы с флуоресцентной меткой, то использовали второй способ окраски, который является более простым и удобным.

Способ первый. Для выполнения данного вида эксперимента использовали измененную схему окраски антителами из статьи Дейла Дж. Л. с соавторами [Dale G.L.

et al. 2002].

Гель-фильтрованные тромбоциты в концентрации 50 тыс./мкл активировали активатором (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином, SFLLRN и т.д.) в буфере А в присутствии 2.5 мМ CaCl2 и 1 % PE-конъюгированного аннексина V. Объем каждой пробы составлял 20 мкл. Время активации 15 минут при комнатной температуре в стационарном состоянии, после этого каждую пробу метили неконъюгированным антителом (первичное) на тромбоспондин человека (0.2мкл).

Время инкубации с антителом 5 минут при комнатной температуре без перемешивания.

Далее пробу, меченную первичным антителом на тромбоспондин человека, окрашивали FITC–конъюгированным анти-мышиным антителом (вторичное) (1мкл).

Время инкубации с вторичным антителом составляло 5 минут при комнатной температуре. По истечении времени инкубации с антителами все реакции останавливали добавлением в пробу 40мкл 1,5% формалина в фосфатном буфере (pH 7.4), время остановки реакции составляло 20 минут. После этого весь образец разводили добавлением 800мкл фосфатного буфера (pH 7.4) с 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина и сразу же измеряли на проточном цитометре в течение минуты на высокой скорости подачи пробы.

Способ второй. Гель-фильтрованные тромбоциты в концентрации 100 тыс./мкл активировали в буфере А в присутствии 2.5 мМ CaCl2 и 1 % PE-конъюгированного аннексина V и требуемого активатора (тромбин, тромбин в сочетании с конвульксином и т.д.). Объем каждой пробы составлял 10 мкл. Время активации 15 минут при комнатной температуре без перемешивания, после каждую пробу метили одним из FITC-конъюгированных антител: на фактор V (0.1 мкл), фибриноген (0.2 мкл), PAC- (0.5 мкл), CD62P (0.5 мкл). Время инкубации с антителами составляло 5 минут при комнатной температуре. Затем пробы разводили до 0.2 мл буфером А с 2.5 мМ CaCl2 и анализировали в течение 20 секунд на проточном цитометре при высокой скорости подачи пробы.

Статистическая обработка данных Статистический анализ производили в программе OrginPro 7.5. Данные представляли как среднее ± стандартное отклонение среднего. Был проведен анализ статистической значимости полученных результатов с помощью критерия Стьюдента и дисперсионного анализа.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Выявление роли секреции и внутриклеточной сигнализации в формировании «укутанных» тромбоцитов В нашей работе все эксперименты выполнялись на тромбоцитах активированных как тромбином с конвульксином, так и только тромбином. Хорошо описано, что для двойной активации тромбоцитов тромбином и конвульксином (агонистом коллагенового рецептора GPVI) характерно появление субпопуляции «укутанных»

тромбоцитов, которая экспрессирует фосфатидилсерин и сохраняет -гранулярные белки на поверхности клетки [Dale G.L., et al. 2002; Dale G.L. 2005; Alberio L., et al.

2000]. Тромбоциты, активированные только одним тромбином, меньше охарактеризованы: было показано, что при этом виде активации образуется субпопуляция тромбоцитов с высокой экспрессией фосфатидилсерина и способностью связывать коагуляционные факторы [Panteleev M.A., et al. 2005; London F.S., et al. 2004;

London F.S., et al. 2006; Feng P., et al. 1998]. Не ясно, являются ли данные тромбоциты в действительности «укутанными» [Dale G.L. 2005; Alberio L., et al. 2000; Kempton C.L., et al. 2005], имеющие высокий уровень фосфатидилсерина и содержание гранулярных белков на поверхности клетки, хотя [Jobe S.M., et al. 2005] сообщали об образовании субпопуляции тромбоцитов положительной по связыванию фибриногена при активации тромбином. Для того чтобы лучше охарактеризовать тромбоциты в наших экспериментах, мы проводили двойное окрашивание клеток аннексином V и антителами на -гранулярные белки. На рисунке 1 представлены контурные плоты тромбоцитов окрашенных как на -гранулярные белки: тромбоспондин (рис. 1 А,Б) или фибриноген (рис. 1 В,Г), так и на фосфатидилсерин; как для активации только тромбином (рис. 1 А,В), так и двойной активации тромбином с конвульксином (рис. Б,Г). Оба вида стимуляции приводят к разделению тромбоцитов на две различные субпопуляции, одна из которых положительна как на фосфатидилсерин, так и на гранулярные белки.

Тогда как окрашивание на фибриноген фосфатидилсерин–экспрессирующих тромбоцитов могло быть объяснено образованием фибрина из секретируемого фибриногена и вплетением тромбоцитов в фибриновую сеть, подобные результаты для тромбоспондина (т.е. положительная окраска на антитело к тромбоспондину) делают такое объяснение маловероятным. Кроме того, эти эксперименты показывают, что фосфатидилсерин–положительные тромбоциты, наблюдаемые при стимуляции одним тромбином, действительно являются «укутанными» тромбоцитами.

Можно сказать, что, исследуя образование «укутанных» тромбоцитов при двух видах активации (тромбин плюс конвульксин и просто одним только тромбином), мы «моделируем» возможные варианты локализации тромбоцитов in vivo. Так, например, активация тромбоцитов тромбином с конвульксином (агонистом коллагенового рецептора GPVI) служит моделью тромбоцитов адгезировавшихся к коллагену в месте повреждения сосудистой стенки и стимулированных одновременно как коллагеном, так и тромбином, образованным выше места свертывания. Тогда как стимуляция одним только тромбином является моделью для активации тромбоцитов свободно циркулирующих в крови и рекрутирования последних к месту повреждения, и встраивания данных тромбоцитов в растущий тромб, так как только тромбин является доступным сильным активатором. Как видно, из наших кинетических экспериментов (рис. 2) по образованию «укутанных» тромбоцитов, которые определяли как популяцию клеток с высоким содержанием прокоагулянтного фосфатидилсерина на поверхности, получается, что данная субпопуляция появляется в первые полторы минуты от начала активации, что можно связать с фазой инициации свертывания [Бутенас С., Манн К.Г. 2002], которая характеризуется образованием с относительно низкой скоростью небольшого количества тромбина, а также факторов VIIa, IXa, Xa и XIa. Затем наступает фаза распространения тромбина, которая хорошо согласуется с достаточно высоким уровнем «укутанных» тромбоцитов, что может предполагать, их роль в тромбообразовании, тем, что они предоставляют свои прокоагулянтные поверхности для таких реакций свертывания, как протромбиназная.

Аннексин V-положительные тромбоциты (%) Данная фракция тромбоцитов важна для свертывания, что подтверждается многими работами, однако до сих пор открыт вопрос о механизмах возникновения такой «загадочной» субпопуляции. Работы [Alberio L, et al. 2000; London FS, et al. 2004;

Panteleev MA, et al. 2005], в которых говорилось о том, что данная фракция тромбоцитов не является предсуществующей и что количество клеток зависит только от силы и количества активатора при активации, натолкнули нас на гипотезу о том, что тромбоцитарная секреция может быть одним из контролирующих элементов в формировании «укутанных» тромбоцитов.

Так как мы предполагаем, что тромбоцитарная секреция может быть одним из контролирующих элементов образования «укутанных» тромбоцитов, то, чтобы подтвердить эту гипотезу были проведены эксперименты по активации тромбоцитов при различной их концентрации. Тромбоциты активировали в увеличивающейся концентрации либо тромбина, либо конвульксина в присутствии 10 нМ тромбина.

Обнаружили, что фракция «укутанных» тромбоцитов является возрастающей функцией, как от концентрации тромбоцитов, так и от активатора (рис. 3). Эти данные дают подтверждение, что одним из контролирующих механизмов в формировании «укутанных» тромбоцитов является тромбоцитарная секреция при активации.

Аннексин V-положительные тромбоциты (%) Рисунок 3. Увеличение образования «укутанных» тромбоцитов от концентрации тромбоцитов.

Тромбоциты активировали либо тромбином (А), либо тромбином с конвульксином (Б), и анализировали на проточном цитометре. Количество «укутанных» тромбоцитов представлено как функция от концентрации тромбоцитов. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров.

Хотя, ранее сообщали, что увеличение количества тромбоцитов приводит к повышению экспозиции фосфатидилсерина тромбоцитами, активированными тромбином, и этот феномен приписывали к эффекту тромбоцит-тробоцитарных взаимодействий [Dormann D., et al. 2000], наши эксперименты выполнялись без постоянного перемешивания или встряхивания в отличие от того, что было описано в работе [Dormann D., et al. 2000], что исключает возможность тромбоцит-тробоцитарных взаимодействий в наших опытах, и оставляет только объяснение наблюдаемого нами эффекта зависимостью от секреции.

Для ответа на вопрос, какие вещества секретируемые тромбоцитами при их активации могут участвовать в образовании «укутанных» тромбоцитов, мы в данной своей работе исследовали два физиологических тромбоцитарных активатора: АДФ и тромбоксан А2. Эти эксперименты выполняли при очень низкой концентрации тромбоцитов (4 тыс./мкл), которая является не насыщающейся, как видно из рисунка 3, для обоих видов активации, так что эффекты агонистов, так же как и антагонистов должны хорошо наблюдаться. Было обнаружено, что ни ингибитор тромбоксанового синтеза ацетилсалициловая кислота, ни добавление аналога тромбоксана А2 U46619 не имели никакого эффекта на образование «укутанных» тромбоцитов (рис. 4), что согласуется с данными, сообщенными в работе [Prodan C.I., et al. 2007], что только постоянное и непрерывное использование ацетилсалициловой кислоты имеет ингибиторный эффект на образование «укутанных» тромбоцитов, возможно, из-за ее эффекта на развитие мегакариоцитов.

Аннексин V-положительные тромбоциты (%)

КОНТРОЛЬ АЦЕТИЛСАЛИЦИЛОВАЯ КИСЛОТА U

Рисунок 4. Тромбоксан А2 не регулирует образование «укутанных» тромбоцитов. Суспензия тромбоцитов (4тыс./мкл) преинкубировали в течение 1часа в присутствии или отсутствии ацетилсалициловой кислоты (100мкМ), затем активировали 100нМ тромбина или 10нМ тромбина с 10нг/мл конвульксина в отсутствии или присутствии стабильного аналога тромбоксана A2 U (5мкМ). Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n= экспериментам с тромбоцитами от пятерых здоровых доноров. Данные статистически достоверно не различны между контролем, преинкубацией с ацетилсалициловой кислотой и добавлением U (р0.05).

Добавление апиразы, наоборот, дозо-зависимо снижает появление «укутанных»

тромбоцитов (рис. 5А), тогда как добавление АДФ в повышающейся концентрации увеличивает их долю (рис. 5Б). Контролируя кинетику высвобождения плотных гранул напрямую (флуоресценция мепакрина) (рис. 6), получили, что все тромбоциты в течение первых 30 секунд после стимуляции выбрасывают содержимое плотных гранул, а вот разделение на субпопуляции происходит несколько минут позднее. Это, тем самым, поддерживает ранее сообщенные данные, что у субпопуляции «укутанных»

тромбоцитов нет предшественников [Alberio L, et al. 2000; London FS, et al. 2004;

Panteleev MA, et al. 2005], а так же подтверждает наши данные, что АДФ играет контролирующую роль в развитии данной гетерогенности.

Аннексин V-положительные тромбоциты (%) Рисунок 5. АДФ регулирует образование «укутанных» тромбоцитов. А) Образование «укутанных»

тромбоцитов как функция от концентрации апиразы; Б) образование «укутанных» тромбоцитов как функция от концентрации АДФ. Тромбоциты (4тыс./мкл) активировали тромбином или тромбином с конвульксином в указанных на панелях концентрациях в присутствии либо апиразы, либо АДФ, анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров.

Как известно, АДФ действует на тромбоциты через свои адренергические рецепторы. Чтобы определить специфический рецептор, ответственный за эффект АДФ на формирование гетерогенности тромбоцитов, нами были выполнены эксперименты по активации тромбоцитов в присутствии специфических антагонистов АДФ рецепторов P2Y1 и P2Y12, MRS2179 и 2-MeS-5'-AMP, соответственно. MRS2179 не имел никакого эффекта, тогда как 2-MeS-5'-AMP ингибировал образование «укутанных» тромбоцитов в 2раза (рис. 7), а при сравнении с положительным контролем, где добавляли АДФ, различия были 3-х и 4-х кратными, предполагая преобладающую роль рецептора P2Y12 в АДФ эффекте.

Рисунок 7. Вклад подтипов АДФ рецепторов в формирование «укутанных» тромбоцитов.

Суспензию тромбоцитов (4тыс./мкл) активировали 100нМ тромбина или 10нМ тромбина с 10нг/мл конвульксина в отсутствии (контроль) или присутствии специфических антагонистов адренергических рецепторов MRS2179 (10мкМ) или 2-MeS-5'-AMP (100мкМ), или в присутствии насыщенной концентрации АДФ (10мкМ). Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров. Данные статистически достоверны (* P 0.05, and # P 0.01).

Эти наблюдения согласуются с предыдущими сообщениями, что рецептор P2Y играет важную роль в развитии прокоагулянтной активности тромбоцитов активированных тромбином. [Dorsam RT, et al. 2004; Behan MW, et al. 2005; Leon C, et al. 2003; Storey RF, et al. 2000; van der Meijden PE, et al. 2008] Подводя итог, наши результаты показывают, что количество «укутанных»

тромбоцитов, появляющихся при активации, регулируются комплексом механизмов вовлекающих положительную обратную связь тромбоцитарной секреции: активация первых тромбоцитов приводит к выбросу содержимого плотных гранул, а именно АДФ, который через свой адренергический рецептор P2Y12 усиливает сигнал при дальнейшей активации, приводя к повышению образования «укутанных» тромбоцитов.

Известно, что P2Y12 связан с Gi-белком, при активации которого происходит изменение содержания цАМФ и активация различных клеточных эффекторов, таких как фосфоинозитид-3-киназы, Akt/протеин киназы В, Src-тирозинкиназ, G-белок управляемых калиевых каналов и др. [Kahner B.N. et al. 2006].

Мы предположили, что возможные внутриклеточные механизмы, участвующие в развитии гетерогенности тромбоцитов, идут от адренергического рецептора P2Y (рис. 8). Было решено исследовать вклад данных путей в формировании «укутанных»

тромбоцитов.

Первым из таких сигнальных механизмов был путь, связанный с уровнем цАМФ, так как известно, что аденилациклаза и связанный с ней уровень цАМФ важны для активации тромбоцита. Была выдвинута гипотеза о том, что аденилатциклаза важна для регулирования формирования «укутанных» тромбоцитов. Чтобы это проверить использовали как агонист (форсколин), так и антагонист (SQ22536) для данного фермента. Для ингибирования действия аденилатциклазы тромбоциты преинкубировали в течение 30 минут с SQ22536 (30мкМ), а для активации аденилатциклазы преинкубировали с форсколином (20мкМ) в течение 30 минут, затем клетки активировали либо тромбином, либо тромбином с конвульксином. Было получено, что форсколин снижает образование «укутанных» тромбоцитов в семьдесять раз, тогда как ингибитор аденилатциклазы не оказывает никакого влияния на формирование гетерогенности (рис 9.А) как при активации только одним тромбином, так и при активации тромбином с конвульксином. Это говорит о том, что аденилатциклаза необходима для формирования гетерогенности тромбоцитов при их активации, но не является регулирующей в этом механизме развития.

Следующими внутриклеточными путями, которые мы исследовали, были фосфоинозитид-3-киназа и Src-тирозинкиназа, которые активируются при сигнализации через P2Y12.

Активация через P2Y12 приводит к стимуляции Gi белка, в результате чего происходит активация фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), поэтому для исследования данного сигнального пути проводили эксперименты по активации тромбоцитов тромбином или тромбином в сочетании с конвульксином, проинкубированных с антагонистом фосфоинозитид-3-киназы (500нМ вортманнина). Обнаружили, что при ингибировании фосфоинозитид-3-киназы при обоих видах активации доля «укутанных» тромбоцитов снижается в три раза по сравнению с контролем (рис. 9.Б). В работе [Hardy A.R., et al. 2004] показано, что Src-тирозинкиназа имеет ингибирующее влияние на фосфоинозитид-3-киназный путь, идущий от P2Y12. Поэтому было предположено, что, заингибировав Src-тирозинкиназу, доля «укутанных» тромбоцитов либо не изменится, либо увеличится. Однако, наблюдали совершенно иную картину – при использовании антагониста Src-тирозинкиназы РР2, доля «укутанных»

тромбоцитов снижалась в четыре раза по сравнению с контролем (рис. 9.Б). На основе полученных данных можно заключить, что Src-тирозинкиназа осуществляет свое влияние на формирование «укутанных» тромбоцитов не через фосфоинозитид-3киназу, а через какие-то еще сигнальные пути. Все эти данные говорят в пользу того, что данные пути задействованы в формировании гетерогенности тромбоцитов и могут играть ведущую роль в этом процессе.

В работе [Shankar H., et al. 2004] показано, что G-белок управляемые К+ каналы (далее по тексту просто К+ каналы) являются важными функциональными эффекторами рецептора P2Y12 тромбоцитов человека. Было решено проверить влияние К+ каналов на формирование гетерогенности тромбоцитов. Для исследования этого пути был использован антагонист К+ каналов SCH23390 в концентрации 200мкМ и не обнаружили достоверных различий по сравнению с контролем в изменении количества «укутанных» тромбоцитов (рис. 9.В). Следовательно, данный внутриклеточный путь не важен для образования «укутанных» тромбоцитов.

Киназа Erk2 (MAP киназа киназы) активируется рецепторами P2Y через механизм, вовлекающий Src-тирозинкиназу [Garcia A., et al. 2007]. Поскольку нами было показано выше, что Src-тирозинкиназа влияет на формирование «укутанных»

тромбоцитов, то можно предположить, что ее действие осуществляется через Erk2. Для исследования роли данной внутриклеточной сигнализации был использован селективный ингибитор Erk2 U0126. При ее ингибировании не обнаружили статистически значимых различий с контролем (рис. 9.В). Следовательно, Srcтирозинкиназа не опосредует свое действие через Erk2.

Суммируя изложенные выше результаты, можно сказать, что на формирование гетерогенности тромбоцитов влияют пути внутриклеточной сигнализации, связанные с действием аденилатциклазы, фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы; тогда как не оказывают никого эффекта на появление «укутанных» тромбоцитов К+ каналы и MAP киназа киназа (Erk2).

КОНТРОЛЬ DMSO PP2 ВОРТМАННИН

КОНТРОЛЬ DMSO PP2 ВОРТМАННИН

Рис 9. А) Аденилатциклаза влияет на формирование «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты преинкубировали в течение 30 минут с антогонистом (30мкМ SQ22536) и агонистом (20мкМ форсколина) аденилатциклазы, а затем активировали и анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n=3 экспериментам с тромбоцитами от трех здоровых доноров. *–достоверное различие при р0,05. Б) Фосфоинозитид-3-киназа и Src-тирозинкиназа регулируют формирование «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты инкубировали в течение 30 минут с или без специфических антагонистов фосфоинозитид-3-кинзы (500нМ вортманнина) и Src-тирозинкиназы (10мкМ PP2), затем активировали и анализировали на проточном цитометре. Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n=3 экспериментам с тромбоцитами от трех здоровых доноров. Данные статистически достоверны (* р0.05). В) MAP киназа киназы и К+ каналы не вовлекаются в формирование гетерогенности субпопуляций тромбоцитов крови при их активации.

Тромбоциты стимулировали в присутствии или отсутствии специфических антагонистов MAP киназы киназы (20мкМ U0126) и К+ каналов (200мкМ SCH23390) и анализировали на проточном цитометре.

Данные представлены в виде среднее ± стандартное отклонение среднего для n=4 экспериментам с тромбоцитами от четырех здоровых доноров. Данные статистически достоверно не различны по сравнению с контролем (р0.05).

гетерогенности тромбоцитов при их активации.

В ходе наших экспериментов было замечено, что при использовании активационной смеси, содержащей SFLLRN, на тромбоцитах положительных по аннексину V не обнаруживаются альфа-гранулярные белки, т.е. они не пришиваются к поверхности, тогда как в стандартной активации мы их наблюдаем (рис. 10).

Одним из ответов на данный вопрос, что может влиять на пришивку данных белков, была идея о воздействии тромбоцитарных трансглутаминаз на данный эффект.

Как известно, в работах [Dale G.L. et al. 2002; Dale G.L. 2005] показано, что гранулярные белки могут пришиваться к поверхности клетки через серотонин посредством трансглутаминазной реакции.

Выделяют два вида трансглутаминаз у тромбоцитов: фактор XIIIa и тканевую трансглутаминазу. Для исследования вклада каждой из трансглутаминаз использовали соответствующие ингибиторы.

Используя ингибиторы цистеиновых протеиназ (ИЦП), любезно предоставленных Костановой Е.А. из института биохимической физики им. Н.М.

Эммануэля РАН, которая с коллегами показала, что данные ИЦП способны подавлять ферментативную активность фактора XIIIa [Костанова Е.А. и др. 2007], мы обнаружили, что в присутствии различных концентраций препарата ИЦП при активации клеток разными агонистами доля «укутанных» тромбоцитов снижается дозозависимо (рис.11).

Для выявления участия тканевой трансглутаминазы в механизмах формирования «укутанных» тромбоцитов мы использовали ингибирующее антитело к данной трансглутаминазе в возрастающей концентрации. Добавление данного антитела к тромбоцитам до активации приводило к возникновению ингибирующего эффекта на тканевую трансглутаминазу, который наблюдался при некоторых видах активации, как снижение образования «укутанных» тромбоцитов (рис.12). Максимальный ингибирующий эффект в 4 и 3 раза по сравнению с контролем обнаружен при активации как одним конвульксином, так и при сочетании конвульксина с SFLLRN, соответственно. Тогда как активация тромбином или SFLLRN не имела никакого эффекта при использовании ингибирующего антитела в тех же самых концентрациях, что и для других типов активации Аннексин V-положительные тромбоциты (%) важны в ходе формирования «укутанных» тромбоцитов. Хотя при использовании ингибирующих пептидов (рис. 13) видно, что ингибирование тканевой трансглутаминазы приводит к большему снижению доли «укутанных» тромбоцитов (в 2-4 раза по сравнению с контролем), из чего можно предположить, что она играет более ведущую роль в процессе развития гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Аннексин V-положительные тромбоциты (%)

КОНТРОЛЬ

ИН ИН ИН LRN

ЬКС ЬКС

ВУЛ ВУЛ ИН

Рисунок 13. Ингибирование тканевой трансглутаминазы (tTG-2) и фактора XIIIa (F11KA) при образовании «укутанных» тромбоцитов. Тромбоциты преинкубировались в течение 30 минут с 1мМ T26 или F11KA, а затем активировались 5 типами активационных смесей: 1 – тромбином (10нМ) в присутствии конвульксина (1нг/мл); 2 – тромбином (100нМ); 3 – конвульксином (10нг/мл); 4 – конвульксином (1нг/мл) в сочетании с SFLLRN (150мкМ); 5 – SFLLRN (150мкМ). Представлены средние величины ± стандартные отклонения (n=2).

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что тромбоциты, стимулированные одним только тромбином, образуют две субпопуляции, одна из которых является «укутанными»

тромбоцитами, то есть имеет высокий уровень фосфатидилсерина и содержит на поверхности альфа-гранулярные белки.

2. Доказано, что АДФ, выделяемый из плотных гранул тромбоцитов при их активации, регулирует развитие гетерогенности тромбоцитов, тогда как тромбоксан А2 не оказывает никакого влияния на этот процесс.

3. Выявлено, что АДФ опосредует свое влияние на образование «укутанных»

тромбоцитов при их активации через адренергический рецептор P2Y12.

4. Показано, что внутриклеточные пути сигнализации, регулирующие формирование гетерогенности тромбоцитов при их активации, связаны с ингибированием аденилатциклазы, активированием фосфоинозитид-3-киназы и Src-тирозинкиназы.

5. Показано, что и фактор XIIIa и тканевая трансглутаминаза важны в ходе формирования «укутанных» тромбоцитов. Ингибирование обоих трансглутаминаз приводит к 3-7 кратному снижению количества «укутанных»

тромбоцитов при разных видах активации по сравнению с контролем. Выявлено при использовании ингибирующих пептидов, что ингибирование тканевой трансглутаминазы приводит к большему снижению доли «укутанных»

тромбоцитов по сравнению с ингибированием фактора XIIIa, из чего делается предположение, что она играет более ведущую роль в процессе развития гетерогенности тромбоцитов при их активации.

Cписок работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Котова Я.Н., Костанова Е.А., Розенфельд М.А., Синауридзе Е.И., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Влияние ингибиторов цистеиновых протеиназ на тромбоцитарное и плазменное звенья системы свертывания крови.

Биол.мембраны, 2009. т. 26 (5): 1-7.

2. Пантелеев М.А., Котова Я.Н., Токарев А.А., Атауллаханов Ф.И. Механизмы регуляции свертывания крови. Тер. архив, 2008. №7: 88-91.

3. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Coated platelets formation is regulated by the dense granule secretion of ADP acting via the P2Y12 receptor. J Thromb Haemost 2008; 6: 1603-1605.

4. Котова Я.Н., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Секреция АДФ регулирует формирование гетерогенных субпопуляций при активации тромбоцитов крови.

11-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 29 октября – 2 ноября 2007 года (Труды…,стр. 148) 5. Котова Я.Н., Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. Механизмы внутриклеточной сигнализации в формировании гетерогенных субпопуляций при активации тромбоцитов крови. 12-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 10 – 14 ноября года (Труды…,стр. 89).

6. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Role of P2Y12 receptor at formation of heterogeneous platelet subpopulations. 33rd FEBS Congress & 11th IUBMB Conference, Athens, 28 June – 3 July 2008 (Proceedings of..., p. 325).

7. Kotova Y.N., Ataullakhanov F.I., Panteleev M.A. Identification of signal transduction pathways controlling formation of heterogeneous subpopulations during platelet activation. 53rd Annual Meeting Society of Thrombosis and Haemostasis Research, Vienna, February 04 - 07, 2009 (Proceedings of..., p. A59).



 
Похожие работы:

«Волкова Елена Константиновна СИНТЕЗ И ОПТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛУПРОВОДНИКОВЫХ НАНОЧАСТИЦ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРИМЕНЕНИЙ 03.01.02 – Биофизика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Саратов 2013 2 Работа выполнена в ГОУ ВПО Саратовский государственный университет имени Н.Г.Чернышевского На кафедре Оптики и биофотоники Научный руководитель : доктор физико – математических наук, профессор Кочубей Вячеслав Иванович Официальные...»

«АБАТУРОВА АННА МИХАЙЛОВНА Изучение механизмов взаимодействия компонентов фотосинтетической цепи транспорта электрона методами компьютерного моделирования Специальность: 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва - 2008 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : Доктор физико-математических наук, профессор...»

«КОВПАК НАТАЛЬЯ ЕВГЕНЬЕВНА ВНУТРИВИДОВАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ КОРЮШКОВЫХ РЫБ РОССИИ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени Владивосток – 2010 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Скурихина Любовь Андреевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Фролов Сергей...»

«Головина Екатерина Олеговна Петрофитные степи западной части Ононской Даурии 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2009 Работа выполнена в Лаборатории географии и картографии растительности Учреждения Российской академии наук Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Сафронова Ирина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«ШОСТАЛЬ ОЛЬГА АНДРЕЕВНА ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ОСВЕЩЕНИЯ НА ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ DROSOPHILA MELANOGASTER Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук. Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент Москалев Алексей Александрович Официальные...»

«ШАГЖИНА АЙВИ ПЕТРОВНА ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В КРУГОВОРОТЕ АЗОТА В ЩЕЛОЧНЫХ ГИДРОТЕРМАХ ПРИБАЙКАЛЬЯ 03.00.16 – экология 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2007 1 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Баир Бадмабазарович Намсараев доктор биологических наук Научный...»

«Непряхина Ольга Константиновна Изучение динамики митохондриального ретикулума при окислительном стрессе 03.00.25-03 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и на факультете биоинженерии и биоинформатики Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : директор НИИ ФХБ им....»

«МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2008 год Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Государственного учреждения Медико-генетический научный центр РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович Официальные оппоненты :...»

«Абрамов Сергей Маркович Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации 03.02.03 - Микробиология 03.01.06 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского...»

«АШИБОКОВА ЛИАНА РАШИДОВНА ЭКОЛОГО-ЦЕНОТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДГОРНЫХ СТЕПЕЙ КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕСИИ И ИХ ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена в ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхозакадемии Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Дзыбов Джантемир Сосренович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Акатов...»

«МАЛХАНОВА Елена Владимировна ЭМИССИЯ ДИОКСИДА УГЛЕРОДА МЕРЗЛОТНЫМИ ПОЧВАМИ ЮГА ВИТИМСКОГО ПЛОСКОГОРЬЯ 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2007 Работа выполнена на кафедре почвоведения и экспериментальной биологии ФГОУ ВПО Бурятский государственный университет Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«СИМОНОВ Евгений Петрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ПЕРИФЕРИЙНОЙ ПОПУЛЯЦИИ ОБЫКНОВЕННОГО ЩИТОМОРДНИКА (GLOYDIUS HALYS (PALLAS, 1776)) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории экологии сообществ позвоночных животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Семёнов Михаил Александрович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЭКОСИСТЕМНОГО БИОРАЗНООБРАЗИЯ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ЛЕСОВОССТАНОВЛЕНИИ (НА ПРИМЕРЕ ЦНИНСКОГО ЛЕСНОГО МАССИВА) 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Воронеж – 2014 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Воронежская государственная лесотехническая академия Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Харченко Николай Николаевич Официальные оппоненты :...»

«Чимитдоржиева Эржена Очировна ЗАПАСЫ УГЛЕРОДА В ЧЕРНОЗЕМАХ И КАШТАНОВЫХ ПОЧВАХ ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ И ЭМИССИЯ СО2 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2011 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«БЕРНИКОВ Кирилл Александрович Фауна и экология рукокрылых (Chiroptera) равнинной тайги Западной Сибири (на примере Ханты-Мансийского автономного округа) Специальность 03.00.08 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии ГОУ ВПО Сургутский государственный университет ХМАО – Югры. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Стариков Владимир Павлович...»

«КОНЕВА Лада Анатольевна МОДЕЛИРОВАНИЕ РАСПРОСТРАНЕННОСТИ СПИНОЦЕРЕБЕЛЛЯРНОЙ АТАКСИИ I ТИПА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ОСОБЕННОСТЕЙ ГЕНЕТИКО-ДЕМОГРАФИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ЯКУТСКИХ ПОПУЛЯЦИЯХ 03.00.15 - генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2009 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте медицинской генетики Сибирского отделения РАМН и Учреждении Российской академии...»

«ЮРЦЕВА АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И АКВАКУЛЬТУРЕ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 1 Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«Фатыхова Юлия Наильевна РОЛЬ СТРУКТУРЫ СООБЩЕСТВ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В РАЗРУШЕНИИ СТРОИТЕЛЬНЫХ СИЛИКАТНЫХ МАТЕРИАЛОВ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2006 2 Работа выполнена в Томском государственном архитектурно – строительном университете на кафедре Охрана труда и окружающей среды Научный руководитель доктор геолого-минералогических наук, профессор Мананков Анатолий Васильевич...»

«АТЕФ АБДЕЛЬМОХСЕН АБДЕЛЬРАХМАН АХМЕД ВЛИЯНИЕ TRICHODERMA ПОЧВ ЕГИПТА И РЕСПУБЛИКИ ТАТАРСТАН НА ОТДЕЛЬНЫЕ ПАРАМЕТРЫ ЖИВЫХ СИСТЕМ 03.01.04. – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Алимова Фарида Кашифовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.