WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Рогатых Станислав Валентинович

ОЦЕНКАСТРУКТУРЫ СООБЩЕСТВ ХЕМОЛИТОТРОФНЫХ

МИКРООРГАНИЗМОВ МЕСТОРОЖДЕНИЯ ШАНУЧ (КАМЧАТКА) С

ПРИМЕНЕНИЕМ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск – 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Научноисследовательском геотехнологическом центре Дальневосточного отделения Российской академии наук Научные руководители:

доктор биологических наук Кофиади Илья Андреевич кандидат биологических наук, доцент Мурадов Сергей Васильевич

Официальные оппоненты:

Вайнштейн Михаил Борисович – доктор биологических наук, профессор, Пущинский государственный естественно-научный институт, г. Пущино Московской обл., ректор Логинов Олег Николаевич – доктор биологических наук, профессор, Институт биологии Уфимского научного центра Российской академии наук, заведующий лабораторией биологически активных веществ

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского Российской академии наук

Защита диссертации состоится «28» февраля 2014 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации по адресу: 142279, Московская область, Серпуховской район, п. Оболенск.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

(ФБУН ГНЦ ПМБ) Роспотребнадзора

Автореферат разослан «» 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Фурсова Надежда Константиновна





ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. В настоящее время применение микроорганизмов в целях извлечения металлов из руд широко используется в мировом масштабе (Кондратьева и др., 2012). В России использование биотехнологий при добыче полезных ископаемых также придается большое значение, что получило отражение в технических направлениях различных фондов содействия развитию предприятий, занимающихся решением данной проблемы (Черняк, 2002). Горнорудная промышленность относится к главным отраслям экономики Камчатского края.

Согласно планам экономического развития Камчатки, в ближайшее время будут разрабатываться различные месторождения цветных металлов. Это приведет к увеличению негативной антропогенной нагрузки на окружающую природную среду, водные и рыбные ресурсы Камчатского края (Левенец и др., 2007). Поэтому необходимо разработать практические меры, направленные на охрану живой природы как на видовом, так и на экосистемном уровне, которые могут быть использованы при разработке месторождений цветных металлов.

Известно, что экологическая безопасность предприятий по переработке руд цветных металлов может быть повышена за счет внедрения современных биотехнологий, например, биовыщелачивания (Минеев, 1989; Заулочный, 2011). В данной работе получены достоверные данные о структуре сообщества хемолитотрофных микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч. Использование этих результатов на практике будет способствовать внедрению современных биотехнологий в горнорудную отрасль народного хозяйства России.

Современное внедрение технологии биовыщелачивания невозможно без четких данных о структуре микробных сообществ или ассоциаций, вносимых в нарабатываемую культуру выщелачивающего раствора. Причем данные о качественном (видовом) составе микробной культуры и количественном соотношении микроорганизмов в ней необходимо узнавать перед внесением ее в выщелачивающий раствор (Rawlings, 2005). Это позволит интенсифицировать процессы биовыщелачивания не только путем проведения модельных экспериментов с различными микробными ассоциациями, но и оперативно контролировать и отслеживать процесс выщелачивания, вносить коррективы и управлять микробной популяцией при мониторинге процесса.

Мониторинг хемолитотрофных микроорганизмов в отработанных отвалах и хвостохранилищах также позволит избежать загрязнения водных объектов и почвенного покрова возле рудников и объектов горнорудной промышленности.

Одним из наиболее перспективных подходов к изучению видового разнообразия микроорганизмов является анализ последовательностей их ДНК.В настоящем исследовании реализована модификация метода полимеразной цепной реакции (основы большинства методов генодиагностики микроорганизмов), основанная на использовании флуоресцентной детекции продуктов реакции – ПЦР в реальном времени.

Актуальность настоящей работы заключается в необходимости определения качественного и количественного состава сообществ биовыщелачивающих ацидофильных микроорганизмов, их генетического скрининга и мониторинга в культуральной среде, в создании технологии универсальной системы пробоподготовки, позволяющей с одинаковой эффективностью очищать ДНК различных микроорганизмов.





Степень разработанности темы. Технология биометаллургии для извлечения металлов из руд в последнее время активно используется и развивается (Халезов, 2008; Norris et al., 2000). Исследователи многих стран изучают микробное разнообразие биовыщелачивающих растворов, используя в том числе и современные методы (Кондратьева и др., 2012). Однако в большинстве работ по интенсификации процесса биовыщелачивания не определяется структура микробной ассоциации, вносимой в выщелачивающий раствор, в ее качественной и количественной характеристике. В основном используют аборигенную микрофлору, находящуюся в исходной пульпе, подразумевая, что она адаптируется к условиям выщелачивающего раствора (Левенец, 2012). Настоящая работа дополняет и уточняет вопрос мониторинга микробных ассоциаций в ходе процесса биовыщелачивания, рекомендуя для определения видового и количественного состава ассоциаций использовать разработанную схему исследования.

Цель исследования – оценить структуру сообществ хемолитотрофных микроорганизмов, принимающих участие в технологии биовыщелачивания, в ее качественной и количественной характеристике.

В соответствии с поставленной целью определены основные задачи:

1) провести молекулярно-биологическое исследование смешанного сообщества биовыщелачивающих микроорганизмов, включающее анализ его структуры и технические средства диагностики;

2) провести оценку эффективности методик очистки, выбор и адаптацию метода выделения бактериальной ДНК из образцов накопительных культур хемолитотрофных микроорганизмов;

3) оценить видовой состав сообществ микроорганизмов сульфидных руд месторождения Шануч с помощью построения библиотеки клонов;

4) разработать комплекс ПЦР-тест-систем для выявления фрагментов генома основных представителей исследуемого сообщества;

5) определить количественный состав сообщества и целесообразность применения проведенного молекулярно-биологического исследования структуры сообщества в прикладных биотехнологических и микробиологических исследованиях.

Научная новизна. Впервые с помощью молекулярно-биологических методов охарактеризован видовой и количественный состав аборигенного сообщества биовыщелачивающих микроорганизмов месторождения Шануч. Таким образом, получены новые данные, вносящие вклад в развитие представлений об экологии характерной для данного региона микробной ассоциации, и получены новые данные о структуре сообщества, обладающей повышенной выщелачивающейся способностью.

Впервые в России сформирована методологическая и теоретическая база для осуществления мониторинга микробиологических параметров с помощью молекулярно-биологических подходов. В том числе проведена оценка эффективности методов очистки бактериальной ДНК из субстратов соответствующих естественной среде обитания ацидофильных микроорганизмов, разработаны и адаптированы к использованию с отечественным детектирующим оборудованием тест-системы для анализа микробиологических сообществ, применен оригинальный подход к оценке количества представленных микроорганизмов.

Примененное в работе молекулярно-биологическое исследование смешанных бактериальных сообществ легко адаптируется к решению аналогичных задач, поставленным в настоящем исследовании. Реализованный подход позволил повысить точность результатов анализа и расширить область применения полученных научных результатов.

Впервые использование разработанных методов в рутинной биотехнологической практике позволило повысить эффективность мероприятий по мониторингу изменений биогенного состава культур, используемых в биореакторах, и, кроме того, откроет новые возможности к их позитивной трансформации и установлению ассоциаций, характеризующихся наибольшим биовыщелачивающим потенциалом.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенное исследование с применением молекулярно-биологических методов может служить основой комплексного подхода к определению качественного и количественного составов смешанных сообществ микроорганизмов. Универсальность проведенного исследования определяет перспективность его использования в технологии промышленного биовыщелачивания для быстрого и точного анализа проб с руды, выщелачивающего раствора и инокулята.

Разработаны и внедрены в лабораториях НИГТЦ ДВО РАН в исследовательское испытание ПЦР-тест-системы для выявления микроорганизмов Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphilum, а также модификации и повышения эффективности промышленной технологии биовыщелачивания (учрежденческий уровень внедрения).

Результаты работы будут использованы при исследовании штаммового полиморфизма A. ferrooxidans, идентификации микроорганизмов без выделения чистых культур, определения адаптации штаммов микроорганизмов к условиям биовыщелачивания, подбору сообщества, обладающего наибольшей продуктивностью в получении целевого продукта – ценных металлов.

Полученные результаты используются при разработке технологического процесса переработки низкообогащенных остатков и отвалов сульфидной руды рудника Шануч компанией, его разрабатывающего, – ЗАО «НПК Геотехнология» (региональный уровень внедрения).

Результаты исследования включены в образовательные программы для студентов биологических специальностей учреждений высшего профессионального образования (региональный уровень внедрения). Материалы диссертации используются в лекциях для аспирантов НИГТЦ ДВО РАН.

Методология и методы исследования. В работе использованы экспериментальные методы исследования: микробиологические (культивирование микроорганизмов на жидких и твердых питательных средах), молекулярнобиологические (выделение и очистка нуклеиновых кислот хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов, очистка плазмидной ДНК, построение библиотеки клонированных фрагментов гена 16S рРНК, определение нуклеотидной последовательности выделенной ДНК, агарозный гель-электрофорез, полимеразная цепная реакция, в том числе ПЦР в реальном времени).

Положения, выносимые на защиту:

1. Модифицированная методика очистки ДНК характеризуется высокой эффективностью в отношении исследованных микроорганизмов, позволяет очистить образцы накопительных культур от ингибиторов ПЦР, обладает повышенной экспрессностью и рекомендуется для выделения ДНК из аналогичного материала.

2. Оценка качественной и количественной структуры сообществ, основанная на ПЦР в реальном времени, эффективна при анализе смешанных сообществ микроорганизмов (в том числе биовыщелачивающих), обладает универсальностью и низкой себестоимостью.

Степень достоверности результатов. Результаты исследования получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных. Достоверность результатов исследований обосновывается корректной постановкой задач исследований, обоснованным использованием методов работы, значительным объемом качественно обработанных экспериментальных данных и учетом предшествующих работ. Достоверность результатов исследования также обеспечивается использованием современных, стандартных методов измерений, связанных с тематикой диссертации.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: IV международной конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности» (Санкт-Петербург, 2007), III и VI международных молодежных школах-конференциях «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2007, 2010), V международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010), XI международной научной конференции «Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей» (Петропавловск-Камчатский, 2010), международном молодежном научном форуме «Ломоносов-2011» (Москва, 2011), III всероссийской научно-практической конференции «Природные ресурсы, их современное состояние, охрана, промысловое и техническое использование» (ПетропавловскКамчатский, 2012), научной конференции «Никеленосные провинции Дальнего Востока» (Петропавловск-Камчатский, 2012), I всероссийской научнопрактической конференции «Экология Камчатки и устойчивое развитие региона» (Петропавловск-Камчатский, 2012); межлабораторных семинарах и Ученых советах НИГТЦ ДВО РАН в 2009–2013 гг.

Работа выполнена в лаборатории биогеохимии и экологии НИГТЦ ДВО РАН по теме НИР «Бактериально-химические и бактериально-автоклавные процессы и геотехнологии переработки сульфидных медно-никелевых руд», № госрегистрации 01200963715 (научный руководитель – д.г.-м.н. Ю.П. Трухин).

Часть работы поддержана проектом РФФИ № 13-05-00585 (руководитель – д.б.н. Л.В. Захарихина), проектом ДВО РАН № 13-III-В-06-093 (руководитель – С.В. Рогатых).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 – в изданиях, входящих в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий» Высшей аттестационной комиссии Минобрнауки России.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, заключения и выводов, списка литературы, приложения, изложена на 132 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами, 19 рисунками. Список использованной литературы включает 118 источников, из них 44 отечественных и 74 зарубежных.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

В последних российских работах по исследованию процессов биовыщелачивания (Минеев, 1989; Черняк, 2002; Кузякина и др., 2008; Заулочный, 2011;

Вайнштейн и др., 2011; Левенец, 2012; Хайнасова, 2012 и др.) показано, что в России и мире широко используются бактериально-химические технологии переработки Ni, Co, Cu, Zn, Au и других металлов. Изучению процессов биовыщелачивания и роли в них хемолитотрофных микроорганизмов много внимания уделяют отечественные и зарубежные ученые (Konishi et al., 1998; Rawlings, 1998; Norris et al., 2000; Каравайко и др., 2006 и др.).

До недавнего времени видовое определение микроорганизмов в процессе выщелачивания проводили с помощью культуральных, микроскопических, биохимических методов. В настоящее время определение видового состава сообществ ведется, как правило, с использованием молекулярно-биологических методов, основанных на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов ДНК или гибридизационного ДНК-анализа in situ. Однако эти методы не позволяют проводить количественное определение состава сообществ, время пробоподготовки занимает большое количество времени, они сложны и ресурсоемки.

В настоящей работе реализована модификация методики ПЦР, основанная на использовании флуоресцентной детекции продуктов реакции, которая подходит как для качественного, так и для количественного анализа. Данный метод превосходит классические культуральные и молекулярные методы. Он прост в применении и обладает рядом преимуществ, определяющих его максимальную приспособленность для нужд микробиологического мониторинга в культуральной среде бактериальных сообществ ацидофильных хемолитотрофов: это возможность выявления даже нескольких копий генома бактерий в образце и, как следствие, максимальная диагностическая мощность; чувствительность и специфичность, достигающие 100 %; высокая воспроизводимость; сжатые сроки исследования; умеренная и постоянно снижающаяся себестоимость. Аналоги данной методики реализованы при идентификации ацидофильных хемолитотрофов в процессах биовыщелачивания за рубежом, в частности в КНР (Bowei et al., 2009).

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использованы чистые культуры Acidithiobacillus thiooxidans, Acidithiobacillus ferrooxidans, Sulfobacillus thermosulfidooxidans и Ferroplasma acidiphilum, предоставленные лабораторией хемолитотрофных микроорганизмов Института микробиологии им. С. Н. Виноградского РАН, а также образцы смешанных культур автохтонных сообществ хемолитотрофных микроорганизмов, выделенных из окисленной и неокисленной руды кобальт-медноникелевого месторождения Шануч (Камчатка), предоставленные лабораторией геохимии и геотехнологии НИГТЦ ДВО РАН.

Выделение микроорганизмов осуществляли классическими методами, выращивали на среде Сильвермана – Люндгрена 9K без железа и, в случае с железоокисляющими бактериями, на той же среде с железом (Каравайко и др., 1989) в лабораторных реакторах. В сравнении принимали участие два типа проб: содержащие микроорганизмы, прикрепленные к частицам руды, и содержащие преимущественно свободные клетки. В общей сложности проанализировано около 170 проб. Общая схема исследования представлена на рис. 1.

Разработка видоспецифичных и универсальных праймеров Амплификация фрагмента гена Выделение ДНК из смешанных ществ с помощью универсальных Секвенирование полученных сообществ из реакторных проб клонированных фрагментов Создание библиотеки клонов Количественный и качественный Клонирование проводилось в ООО «Евроген» (Москва) с использованием вектора pGemTeasy. В качестве клонируемого фрагмента использован ПЦРпродукт, полученный при амплификации специфического участка гена 16S рРНК с помощью универсальных праймеров upr2-d и upr3-r. Для анализа библиотеки клонов было отобрано 100 колоний, содержащих вставку ПЦРпродукта, полученного с помощью данных праймеров.

Выделение ДНК осуществляли несколькими комбинированными протоколами очистки ДНК, основанными на различных типах (механическом, ферментативном, комбинированном и химическом) воздействия на клетки. Во всех случаях брали 500 мкл образца. Перед этапом лизиса пробы промывали фосфатным буфером.

Для мечения продуктов использовали один из комплементарных праймеров и набор меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов (BigDye Terminator Kit, Applied Biosystems, США). Реакцию проводили в амплификаторе «Терцик»

(ЗАО «НПФ ДНК-Технология», Россия) по следующей программе: 94С – 10 с, 56С – 20 с, 72С – 20 с в течение 40 циклов. Дальнейшая подготовка продукта для проведения реакции секвенирования включала химическую денатурацию матрицы с помощью денатурирующего буфера TSR (Template Suppression Reagent, Applied Biosystems, США) в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем.

Оптимальную температуру отжига праймеров определяли постановкой ПЦР с температурой отжига праймеров в диапазоне 60–72С с последующей оценкой количества ПЦР-продукта методом агарозного гель-электрофореза.

Результатом первого этапа работы стала разработка универсальных праймеров, позволяющих амплифицировать фрагмент генома всех бактерий и архей, входящих в состав микробного сообщества. Этот фрагмент содержит участки, которые используются в качестве маркеров при идентификации видов. При этом эффективность амплификации выбранного фрагмента в данном случае определяет аналитическую чувствительность метода ПЦР, поскольку предпочтительная амплификация основного типа последовательностей может привести к потере информации о слабо представленных микроорганизмах и искажению результатов анализа.

В сравнении принимали участие пары праймеров в восьми различных комбинациях: 1) upr1-d + upr2-r, 2) upr1-d + upr3-r, 3) bac2-d + upr2-r, 4) bac2-d + upr4-r, 5) bac2-d + 1427-r, 6) upr2-d + upr3-r, 7) upr2-d + upr4-r, 8) upr2-d + 1427-r (табл. 1). Универсальность праймеров была проверена более чем на 5000 последовательностях бактерий и архей. Для оценки наличия продуктов неспецифической амплификации и димеров праймеров, а также выбора праймеров, позволяющих получить более короткие продукты амплификации, проведен электрофорез, результаты которого показаны на рис. 2. В качестве анализируемых образцов использовали ДНК, выделенную из реакторных проб, культивируемых в лаборатории геохимии и геотехнологии НИГТЦ ДВО РАН. Как видно из рис. 2 и по результатам обработки баз данных, наилучший результат дала пара праймеров upr2-d и upr3-r.

Таблица 1 – Последовательности универсальных праймеров, использованных в сравнительном исследовании (Рогатых и др., 2011)

2. TGCATGGCYGTCGTCAGCTCGT

4. TGACGGGCGGTGTGTRCAAGG

Для проверки выбранных праймеров upr2-d и upr3-r была проведена ПЦР в реальном времени на ДНК, выделенной из чистых линий культур A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans и F. acidiphilum, результаты которой приведены на рис. 3. Как видно из этого рисунка, выбранные праймеры показали свою специфичность в отношении каждого представителя микроорганизмов.

Приблизительно одинаковое значение Сt (15–17) для всех чистых культур (при равном количестве стартовой ДНК) свидетельствует о том, что выбранные нами универсальные праймеры обеспечивают сходную эффективность амплификации фрагмента гена 16S рРНК всех основных предполагаемых представителей хемолитотрофных микроорганизмов сообщества месторождения Шануч.

Рисунок 2 – Электрофореграмма ПЦР-продуктов, полученных при амплификации фрагмента гена 16S рРНК, с использованием попарных комбинаций разработанных праймеров:

1 – upr1-d + upr2-r (562 п.н.), 2 – upr1-d + upr3-r (898 п.н.), 3 – bac2-d + upr2-r (293 п.н.), 4 – bac2-d + upr4-r (630 п.н.), 5 – bac2-d + 1427-r (724 п.н.), 6 – upr2-d + upr3-r (358 п.н.), 7 – upr2-d + upr4-r (363 п.н.), 8 – маркер, 9 – upr2-d + 1427-r (457 п.н.) Рисунок 3 – Протоколы результатов ПЦР в реальном времени, полученные при амплификации ДНК, выделенной из чистых культур (а – A. thiooxidans, б – A. ferrooxidans, в – S. thermosulfidooxidans, г – F. acidiphilum) с использованием универсальных праймеров upr2-d, upr3-r Эффективность полимеразной цепной реакции была проверена методом построения стандартной кривой. Для этого использованы серии десятикратных разведений препаратов ДНК, полученных из чистых культур A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans и F. acidiphilum в качестве образцов. Четыре разведения каждого из образцов были протестированы в трех повторностях. Десятичные логарифмы относительных значений концентрации были нанесены на график против значений Ct (точка пересечения кривой накопления продукта ПЦР с произвольно установленным пороговым уровнем, превышающим уровень шумов). В данном случае эффективность ПЦР зависит только от угла наклона кривой, поэтому абсолютные значения концентрации ДНК не требуются (Ребриков и др., 2009). Расчеты эффективности ПЦР с использованием программного обеспечения ДТ-96 показали, что эффективность составила 93 %.

3.2. Выделение бактериальной ДНК из реакторной установки Достоверность молекулярно-биологических методов, используемых при анализе структуры сообществ микроорганизмов, зависит от качества препарата ДНК и репрезентативности смеси нуклеиновых кислот, полученных в результате очистки. Некоторые методы выделения ДНК могут вносить искажение в результат количественного анализа за счт неэффективного лизиса клеток, сорбции ДНК на частичках грунта, наличия в препарате ферментативных и других ингибиторов, а также потери ДНК или нарушения ее структуры. Кроме того, качество препарата оказывает влияние на достоверность анализа, основанного на методах прямого определения нуклеотидной последовательности (секвенирования) и клонирования, широко применяемых при изучении структуры сообществ.

В связи с этим целью данного этапа работы стала апробация нескольких способов выделения ДНК и выбор метода, наиболее подходящего для анализа накопительных культур сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов. Получаемая смесь нуклеиновых кислот должна быть репрезентативной и, по возможности, сохранять количественное соотношение копий геномов каждого вида, входящего в состав пробы. Выполнение последнего условия необходимо для проведения точного количественного анализа сообществ.

Проведено сравнение несколько комбинированных протоколов выделения ДНК, основанных на различных типах воздействия на клетки эубактерий и архей (табл. 2). Были проанализированы методики, основанные на физическом (перетирание клеток с частицами SiO2), ферментативном (обработка протеиназой К и лизоцимом) и химическом (обработка GuSCN и CTAB) воздействии на клетки. Кроме того, нами была разработана комбинированная методика, основанная на щелочном лизисе (KOH) в присутствии низкомолекулярного полимера полиэтиленгликоля (PEG–200).

Таблица 2 – Типы воздействия на клетки микроорганизмов, используемые в комбинированных методах выделения ДНК Вариант На сегодняшний день не существует общепринятой методологии очистки нуклеиновых кислот из смешанных культур микроорганизмов. Однако для решения задач, связанных с количественным анализом микробных сообществ, вопрос качества препарата нуклеиновых кислот является принципиальным.

Так, например, недостаточная очистка от ингибиторов (гуминовых кислот или ионов железа, содержащихся в средах для выращивания железоокисляющих бактерий) оказывает влияние на эффективность работы Taq-полимеразы и приводит к искажению результатов количественной ПЦР. Кроме того, смешанные сообщества могут содержать микроорганизмы из различных таксономических групп, обладающих различной устойчивостью к механическому, химическому или ферментативному воздействию. Так, например, из-за особенностей строения клеточной стенки грамотрицательные клетки разрушаются легче, чем грамположительные, что приводит к изменению исходного соотношения различных типов нуклеиновых кислот и, как следствие, к некорректным результатам количественного анализа.

Выбранные нами методы продемонстрировали значительные отличия в эффективности выделения нуклеиновых кислот из предоставленных накопительных культур. Это может объясняться и различной эффективностью очистки от ингибиторов, и комплексным составом исследованных образцов.

Наилучший результат получен для методики, основанной на лизирующей активности GuSCN (рис. 4, а). Сходный по эффективности результат был получен для ферментативной методики, однако в данном случае на результат количественной ПЦР оказали влияние остатки бактериальных нуклеиновых кислот, содержащиеся в реагентах, использованных при выделении ДНК (рис.4, б). На рис. 4, б видно, что использование ферментов при выделении ДНК приводит к значительному сдвигу кривой контроля выделения (1).

Рисунок 4 – Сравнение эффективности методик очистки ДНК по результатам ПЦР в реальном времени: a – сравнение всех методик (1 – лизис GuSCN, 2 – ферментативный лизис, 3 – лизис KOH в присутствии PEG-200, 4 – лизис CTAB, 5 – перетирание с частицами SiO2, 6 – отрицательный контроль ПЦР), б – сравнение результатов ПЦР в реальном времени для контролей выделения Показана низкая эффективность методик, основанных на лизирующей активности бромида цетилтриметиламмония (CTAB) и на физическом воздействии на клетки с помощью частиц SiO2. Для методики, основанной на лизирующей активности KOH, в присутствии PEG-200, получен средний результат, однако ее принципиальным недостатком является низкая степень очистки препарата ДНК от ингибиторов, в частности ионов железа, содержащихся в некоторых культуральных средах. В то же время этот метод показал лучший результат для проб, содержащих микроорганизмы, не окисляющих железо. Значимых отличий в эффективности лизиса между пробами, содержащими свободные и прикрепленные клетки, обнаружено не было.

Полученные результаты позволяют рекомендовать для проведения молекулярного анализа структуры сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов методику, основанную на лизирующей активности GuSCN (лизиc при 65С) с последующей очисткой фенолом и хлороформом.

3.3. Создание, анализ библиотеки клонов и секвенирование фрагментов гена 16S рРНК хемолитотрофных микроорганизмов На данном этапе исследования были охарактеризованы структура и состав накопительных культур микроорганизмов, полученных из биореакторов НИГТЦ ДВО РАН. Для этого был использован подход с построением библиотеки бактериальных клонов, содержащих специфические вставки фрагмента гена 16S рРНК бактерий и архей. Анализ нуклеотидных последовательностей позволяет установить качественный состав смешанных сообществ микроорганизмов на уровне родов, однако, в силу ограничений метода, определение до вида, как правило, затруднено.

В составе библиотеки было получено и проанализировано 93 клона. Все последовательности генов 16S рРНК были сгруппированы в 5 риботипов, относящихся к 4 известным родам, а также 1 группу сходных последовательностей, классифицируемых до семейства. Группировку последовательностей проводили с помощью он-лайн алгоритма FastGroup II по принципу процентного соотношения идентичных последовательностей для двух анализируемых клонов. За пороговый уровень сходства последовательностей было принято значение 97 %.

Установлено, что подавляющее большинство нуклеотидных последовательностей (92 %) принадлежит представителям рода Acidithiobacillus. Уровень сходства последовательностей, формирующих данный риботип, был достаточно высок (более 98 % последовательности) и не позволил провести более точный анализ в пределах группы. Помимо бактерий рода Acidithiobacillus было обнаружено 3 последовательности альфапротеобактерий семейства Acetobacteriaceae. Для двух из них не удалось определить родовую принадлежность (некультивируемые ацетобактерии). Единственная последовательность, на основании которой удалось классифицировать микроорганизм до рода, принадлежала бактерии Acidiphilium sp.(класс Alphaproteobacteria, порядок Rhodospirillales, семейство Acetobacteriaceae). Кроме того, в составе сообщества было обнаружено 3 последовательности, принадлежащие археям типа Euryarchaeota: две из них были классифицированы как Thermococcus sp. (класс Thermococci, порядок Thermococcales, семейство Thermococcaceae) и одна как Ferroplasma sp. (класс Thermoplasmata, порядок Thermoplasmatales, семейство Ferroplasmaceae).

3.4. Анализ структуры и оценка видового разнообразия сообществ хемолитотрофных микроорганизмов по результатам ПЦР С помощью ранее разработанных нами видоспецифичных праймеров установлено относительное количество микроорганизмов, входящих в состав исследованных сообществ. Относительное количество специфической группы микроорганизмов может быть представлено в виде процента от общей бактериальной массы. Количественные показатели оценивали на основании номера «порогового» цикла (Ct), на котором прибор начинает регистрировать положительную реакцию. Количество ДНК искомого микроорганизма в образце выражали числом геном-эквивалентов (ГЭ), пропорциональным числу микроорганизмов с учетом числа копий гена 16S рРНК в геноме микроорганизма.

Для удобства сравнения числа копий целевого фрагмента значения Ct математическим путем переводят в значения log 10 копий геномов по формуле (50 – Ct) / 3,4, где 50 – это Ct, после которого регистрация целевого фрагмента невозможна (Ребриков и др., 2009). В результате этой операции число копий целевого фрагмента ДНК будет выражено в форме 10n (Липова и др., 2009).

Формула была адаптирована нами с учтом различий в числе копий гена 16S рРНК в опероне rrn представителей различных таксонов бактерий и архей.

Кроме того, в серии экспериментов по определению эффективности ПЦР нами было установлено, что для разработанных тест-систем максимальное значение Ct, после которого положительный сигнал не регистрируется, составляет циклов. Поэтому числа ГЭ, необходимые для оценки относительного количества микроорганизмов, получали по формуле:

где x – это число копий гена 16S рРНК в опероне rrn анализируемых бактерий и архей, N – число геном-эквивалентов.

В табл. 3 приведены значения оцениваемых показателей. В ней среднее число копий гена 16S рРНК общей бактериальной массы исследуемого сообщества показано для микроорганизмов, установленных при помощи анализа библиотеки клонов (рр. Acidithiobacillus (2), Thermococcus (1), сем. Acetobacteraceae (4), пор.Thermoplasmatales (1)) с учтом их представленности.

По результатам относительного количественного анализа установлено, что микроорганизмы видов A. ferrooxidans, A. thiooxidans, F. acidiphilum представлены в составе анализируемого сообщества в соотношении 62 % : 4 % : 0,14 % соответственно. Таким образом, данные микроорганизмы составляют немногим более 65 % сообщества. Полученные данные подтверждают и дополняют результаты более ранних микробиологических исследований. Соотнося полученные данные с результатами анализа библиотеки клонов, видно, что видовое разнообразие в пределах установленных таксонов значительно шире. Так, например, с учтом копийности гена 16S рРНК представители рода Acidithiobacillus представляют более 90 % сообщества. Следовательно, около трети разнообразия ацидитиобацилл приходится на другие виды рода. То же, по всей видимости, справедливо и для представителей рода Ferroplasma.

Таблица 3 – Количественная характеристика сообщества хемолитотрофных микроорганизмов месторождения Шануч Примечание – среднее число копий гена 16S рРНК:

* для порядка Clostridiales;

** для порядка Thermoplasmatales.

Следует отметить, что в составе смешанных культур присутствуют термофильные археи, которые при повышенных температурах обеспечивают более высокую скорость окисления сульфидов.

3.4.1. Разработка видоспецифичных тест-систем Данные морфологических и культуральных методов идентификации аборигенных для месторождения Шануч микроорганизмов не дают представления о количественном составе сообществ, а также не позволяют дифференцировать близкородственные и не различающиеся морфологически виды. Для решения задачи качественного и количественного анализа сообществ нами был разработан комплекс ПЦР-тест-систем с возможностью детекции результатов реакции в режиме реального времени.

Тест-системы были подобраны таким образом, чтобы достоверно выявлять четыре вида бактерий, принимающих участие в процессе биовыщелачивания:

A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans и F. acidiphilum. Последовательности генома были получены из открытых баз данных последовательностей ДНК и экспериментально. Ранее были синтезированы два универсальных праймера, располагающиеся в консервативных участках последовательностей (см. п. 3.1). Участки, амплифицируемые с помощью этих праймеров, составляли 420 пар нуклеотидов в длину и содержали несколько высоко вариабельных доменов. Эти вариабельные домены (рис. 5, отмечены стрелкой) были впоследствии использованы для подбора мест отжига видоспецифичных праймеров.

Рисунок 5 – Нуклеотидная последовательность ПЦР-продуктов, полученных с помощью универсальных праймеров С помощью интернет-баз данных, содержащих известные последовательности ДНК, было выявлено, что универсальные праймеры соответствуют последовательностям 16S рРНК многих бактерий и архей, в то время как специфические праймеры обладают высокой специфичностью на видовом уровне.

Системы праймеров в эксперименте показали высокую специфичность и точность (рис. 6). Как видно на рис. 6, сигнал присутствует только в пробирках с образцами культур A. thiooxidans и A. ferrooxidans соответственно. Таким образом, результаты воспроизводимы на культурах бактерий.

Разработанные тест-системы были апробированы для накопительных культур и реакторных пробах, предоставленных сотрудниками лаборатории геохимии и геотехнологии НИГТЦ ДВО РАН. Для этого была поставлена ПЦР в реальном времени для проб, отобранных из реакторных установок, и качественная ПЦР с электрофоретической детекцией для проб культур, выделенных из руды, по разработанным нами методическим рекомендациям, которые в настоящее время применяются в экспериментальных работах по выявлению наиболее эффективных в выщелачивании сообществ хемолитотрофных микроорганизмов.

Рисунок 6 – Результаты определения видоспецифичности разработанных праймеров a – ПЦР с праймерами, специфичными для вида A. thiooxidans;

б – ПЦР с праймерами, специфичными для вида A. ferrooxidans (по оси абсцисс – номер цикла, по оси ординат – количество регистраций флуоресценции) Разработанные тест-системы основаны на использовании интеркалирующего красителя SybrGreen I. Важным свойством интеркалирующих красителей является их способность к встраиванию в двухцепочечную молекулу ДНК.

Флуоресцентный сигнал, получаемый в ходе реакции, является неискаженным отображением динамики накопления продукта реакции, что наилучшим образом подходит для количественного анализа нуклеиновых кислот. Единственным недостатком методов, основанных на использовании интеркалирующих красителей, является возможность регистрации накопления продуктов неспецифической амплификации. Для верификации результатов ПЦР в реальном времени нами была проведена оценка возможности кросс-реакции разработанных видоспецифичных олигонуклеотидов. Для этого каждую пару праймеров тестировали на всех имеющихся образцах чистых культур в серии из 4 экспериментов. На образцах чистых культур A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans и F. acidiphilum протестированы пары праймеров AtF, AtR и AfF, AfR (рис. 7, а) и пары праймеров Fer-d, Fer-r1 и Sulf-d1, Sulf-r (рис. 7, б). Ни в одной из параллельных реакций неспецифическая амплификация не была отмечена.

Кроме того, нами была определена нуклеотидная последовательность продуктов ПЦР из 5 реакций для каждого эксперимента. Во всех случаях полученная последовательность совпадала с последовательностями целевых фрагментов гена 16S рРНК.

Таким образом, разработанные тест-системы могут быть использованы при оценке состава смешанных сообществ биовыщелачивающих микроорганизмов, а также для качественной и количественной диагностики микроорганизмов A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans и F. acidiphilum.

Рисунок 7 – Результат ПЦР в реальном времени в экспериментах по установлению возможности кросс-реакции разработанных видоспецифичных праймеров (по оси абсцисс – номер цикла, по оси ординат – количество регистраций флуоресценции) 3.5. Применение разработанных тест-систем при микробиологическом исследовании микробного сообщества Как видно из многих работ по изучению процессов биовыщелачивания (Foucher et al., 2003; Совмен и др., 2007; Harvey, Bath, 2007) подбору микробной ассоциации для биогеотехнологических задач уделяется большое внимание, так как эффективность биовыщелачивания руды во многом зависит от видового состава сообщества и выщелачивающей активности микроорганизмов.

В качестве одного из вариантов решения этого вопроса и для практического применения результатов проведенного молекулярно-биологического исследования был поставлен эксперимент по выделению потенциально важных для биовыщелачивания автохтонных ассоциаций хемолитотрофных микроорганизмов из различных проб окисленной руды месторождения Шануч (две пробы из склада окисленных руд, пробы из карьера, штольни, хвостохранилища – контрольная проба) с изучением их минерального состава (Трухин и др., 2012).

Как показала Т.С. Хайнасова (2012), из исследуемых образцов руды в мезофильных ацидофильных условиях в течение полутора месяцев выделились морфологически однородные ассоциации микроорганизмов с характерным присутствием палочковидных грамотрицательных и грамположительных бактерий.

Разработанными ПЦР-тест-системами проводился мониторинг этой автохтонной микрофлоры, который подтвердил, что бактерии родов Acidithiobacillus и Sulfobacillus принимают непосредственное участие в биогеохимических процессах на месторождении Шануч. Представители рода Ferroplasma в окисленной руде обнаружены не были.

По результатам мониторинга тест-системами видно, что зависимости видового разнообразия хемолитотрофных ацидофильных бактерий от минерального состава проб и содержания сульфидных минералов, отобранных для микробного выделения, не выявлено. Для показателя качественной микробной характеристики основное значение имеют, главным образом, не минеральные особенности субстрата, а условия залегания руды.

Также обнаружилось, что на месторождении и непосредственно в рудном теле по частоте выделения доминирующее участие обнаруживает бактерия A. ferrooxidans. Биоокислительные процессы в зонах дополнительного активного контакта с агентами выветривания (на поверхности рудника) происходят при участии ассоциаций микроорганизмов A. ferrooxidans и Sulfobacillus spp., предпочитающих использовать в своем метаболизме соединения железа. В лабораторных условиях проба руды из карьера, характеризующаяся наибольшим разнообразием первичных и вторичных минералов, оказалась эффективнее для получения биомассы железоокисляющих бактерий (Трухин и др., 2012; Хайнасова, 2012).

В результате работы из окисленной руды месторождения Шануч выделены перспективные для технологии биовыщелачивания ассоциации мезофильных и умеренно термофильных хемолитотрофных микроорганизмов родов Acidithiobacillus (A. ferrooxidans) и Sulfobacillus. Показано, что в качестве объекта для выделения биотехнологически перспективной автохтонной микрофлоры, в частности монокультуры бактерий A. ferrooxidans, рекомендуется использовать руду, отобранную непосредственно в рудном теле разрабатывающегося месторождения.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключении обобщены результаты проделанной работы и сформулированы следующие выводы.

1. Проведенным молекулярно-биологическим исследованием смешанных бактериальных сообществ, включающим оригинальные тест-системы, оценена их структура в видовой и количественной характеристике.

2. При проведении молекулярного анализа структуры сообществ ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов рекомендована модифицированная методика, основанная на лизирующей активности гуанидинизотиоцианата (лизиc при 65°С) с последующей очисткой фенолом и хлороформом.

3. Установлено, что подавляющее большинство нуклеотидных последовательностей в составе библиотеки клонов исследуемого сообщества принадлежит представителям альфапротеобактерий рода Acidithiobacillus. Также было обнаружено наличие последовательностей семейства Acetobacteriaceae, бактерии Acidiphilium sp., архей Thermococcus sp.и Ferroplasma sp.

4. Разработаны ПЦР-тест-системы для специфической детекции микроорганизмов A. thiooxidans, A. ferrooxidans, S. thermosulfidooxidans, F. acidiphilum, проведена качественная оценка и идентифицировано их присутствие в микробных сообществах, выделенных из реакторных установок и сульфидной руды месторождения Шануч.

5. Показано, что микроорганизмы видов A. ferrooxidans, A. thiooxidans, F. acidiphilum представлены в составе анализируемого сообщества в соотношении 62 % : 4 % : 0,14 % соответственно. Основным представителем микроорганизмов медно-никелевого месторождения Шануч на Камчатке является A. ferrooxidans – одна из наиболее эффективных железоокисляющих бактерий. В составе смешанных культур присутствуют термофильные археи, которые при повышенных температурах обеспечивают более высокую скорость окисления сульфидов.

Разработанное исследование оценки структуры сообщества хемолитотрофных ацидофильных микроорганизмов показало свою состоятельность и целесообразность применения при идентификации микроорганизмов сульфидных руд в прикладных биотехнологических и микробиологических исследованиях, направленных на снижение негативных последствий металлургического производства на окружающую природную среду (тема НИР НИГТЦ ДВО РАН «Бактериально-химические и бактериально-автоклавные процессы и геотехнологии переработки сульфидных медно-никелевых руд», № госрегистрации 01200963715).

Рекомендации и перспективы дальнейшей разработки темы Результаты данной работы рекомендуют использование микробной ассоциации из A. ferrooxidans, A. thiooxidans, F. acidiphilum на обогатительной фабрике, которая впоследствии будет построена на руднике Шануч. Однако возможно включение в скрининг биовыщелачивающих сообществ месторождения Шануч других бактерий, принимающих участие в выщелачивании и ранее обнаруженных на месторождении – A. caldus, A. ferrivorans, L. ferrooxidans, L. thermoferrooxidans, L. ferriphillum, Alicyclobacillus disulfidooxidans, S. acidophilus, F. cupricumulans (Кузякина и др., 2008). Примененная схема проведения молекулярно-биологического исследования структуры микробной ассоциации позволит изучать и получать другие ассоциации, обладающие более высокими окисляющими способностями. Такая схема позволит в дальнейшем достаточно легко решать такие задачи, как определение видового состава смешанной культуры микроорганизмов и количественного соотношения микроорганизмов в среде на разных стадиях процесса выщелачивания; исследование штаммового полиморфизма A. ferrooxidans и определения адаптации штаммов к условиям выщелачивания; идентификация микроорганизмов без выделения в чистые культуры (выделение исследуемых микроорганизмов в чистые культуры занимает времени от двух недель); подбор такой комбинации штаммов хемолитотрофов, которая будет обладать наибольшей продуктивностью в получении целевого продукта – выщелачивающего металла (кобальт, никель, медь).

В ходе работы разработан и внедрен в исследовательский процесс проект методических рекомендаций проведения качественного и количественного молекулярно-биологического исследования смешанных бактериальных сообществ, используемых в реакторах при биовыщелачивании. Методические рекомендации являются универсальными для сообществ микроорганизмов, выщелачивающих сульфидные руды, и применяются для экспресс-анализа видового разнообразия хемолитотрофных микроорганизмов, в модельных экспериментах по определению эффективности выщелачивающих микробных сообществ и на производстве для быстрого и точного анализа взятых проб из руды, выщелачивающего раствора и инокулята.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

а) публикации в научных журналах, рекомендованных ВАК 1. Трухин, Ю. П. Эколого-экономические аспекты применения технологии биовыщелачивания ценных компонентов из сульфидных кобальт-медноникелевых руд (Камчатка) / Ю. П. Трухин, Т. И. Кузякина, С. В. Мурадов, Т. С.

Хайнасова, О. О. Левенец, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Проблемы региональной экологии. – 2010. – № 6. – С. 117–122.

2. Рогатых, С. В. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов / С. В. Рогатых, А. А. Докшукина, Т. С. Хайнасова, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади // Прикладная биохимия и микробиология. – 2011. – Том 47. – № 2. – С. 226–230.

3. Рогатых, С. В. Оценка качественного и количественного состава сообществ культивируемых ацидофильных микроорганизмов методами ПЦР-РВ и анализа библиотеки клонов / С. В. Рогатых, А. А. Докшукина, О. О. Левенец, С.

В. Мурадов, И. А. Кофиади // Микробиология. – 2013. – Том 82. – № 2. – С.

212–217.

4. Хайнасова, Т. С. Окисленная руда как источник выделения ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов для биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд / Т. С. Хайнасова, С. В. Рогатых, Т. И. Кузякина, Т. И.

Корнилова // Горный информационно-аналитический бюллетень. – 2013. – № 10. – С. 127–134.

б) публикации в других изданиях и материалах конференций 5. Хайнасова, Т. С. Использование термоацидофильных микроорганизмов в процессах биовыщелачивания сульфидных руд Дальнего Востока / Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, С. В. Рогатых // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования, образование. Т. 11 : сборник трудов Четвертой международной научно-практической конференции «Исследование, разработка и применение высоких технологий в промышленности». – СПб. : Изд-во Политехн. ун-та, 2007. – С. 420–421.

6. Хайнасова, Т. С. Перспективы использования термоацидофильных микроорганизмов в процессах биовыщелачивания сульфидных руд Дальнего Востока / Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, С. В. Рогатых // Актуальные аспекты современной микробиологии : материалы III международной молодежной школыконференции. – М. : Макс Пресс, 2007. – С. 124–125.

7. Кузякина, Т. И. Развитие технологии биовыщелачивания в Камчатском крае / Т. И. Кузякина, С. В. Мурадов, Т. С. Хайнасова, О. О. Левенец, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Биотехнология: состояние и перспективы развития :

материалы V Московского международного конгресса. – М. : ЗАО «Экспобиохим-технологии», 2009. – С. 339–340.

8. Левенец, О. О. Повышение окислительной активности мезофильных ассоциаций хемолитотрофных микроорганизмов / О. О. Левенец, Т. С. Хайнасова, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Биотехнология: экология крупных городов :

материалы Московской международной научно-практической конференции. – М. : ЗАО «Экспо-биохим-технологии», 2010. – С. 138–139.

9. Рогатых, С. В. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур хемолитотрофных микроорганизмов / С. В. Рогатых, И. А. Кофиади // Актуальные аспекты современной микробиологии : материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием. – М. : Макс Пресс, 2010. – С. 114–116.

10. Кофиади, И. А. Разработка генодиагностических тест-систем для определения структуры аборигенного микробного сообщества месторождения Шануч (Западная Камчатка) / И. А. Кофиади, С. В. Рогатых, С. В. Мурадов // Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей : материалы XI международной научной конференции. – Петропавловск-Камчатский : Камчатпресс, 2010. – С. 96–99.

11. Дронин, А. В. Эффективность методов выделения ДНК из культур ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов, выделенных из сульфидной руды медно-никелевого месторождения Шануч (Западная Камчатка) / А. В.

Дронин, С. В. Рогатых // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» [Электронный ресурс]. – М. : Макс Пресс, 2011.

– Секция Биология. С. 177. – 1 электрон. опт. диск (DVD-ROM).

12. Трухин, Ю. П. Выделение хемолитотрофных микроорганизмов из окисленной руды медно-никелевого месторождения Шануч (Камчатка) для биовыщелачивания сульфидных руд / Ю. П. Трухин, Т. С. Хайнасова, С. В. Рогатых // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. – 2012. – № 1 (2).

– С. 83–87.

13. Рогатых, С. В. Разработка тест-систем и анализ структуры сообщества ацидофильных микроорганизмов, используемых в биовыщелачивании сульфидных руд месторождения Шануч (Камчатка) / С. В. Рогатых, О. О. Левенец, Т. С. Хайнасова, И. А. Кофиади // Природные ресурсы, их современное состояние, охрана, промысловое и техническое использование : материалы III Всероссийской научно-практической конференции. – Петропавловск-Камчатский :

КамчатГТУ, 2012. – С. 139–142.

14. Рогатых, С. В. Применение молекулярно-генетических методов в технологии биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд месторождения Шануч (Камчатка) / С. В. Рогатых, С. В. Мурадов, И. А. Кофиади, А. А. Балыков, О. О. Левенец, Т. С. Хайнасова // Никеленосные провинции Дальнего Востока : материалы конференции с международным участием. – ПетропавловскКамчатский : НИГТЦ ДВО РАН, 2012. – С. 139–145.

15. Мурадов, С. В. Технология биовыщелачивания медно-никелевой руды месторождения Шануч (Западная Камчатка): молекулярно-генетические и биотехнологические подходы / С. В. Мурадов, А. А. Балыков, С. В. Рогатых // Экология Камчатки и устойчивое развитие региона : материалы I Всероссийской научно-практической конференции. – Петропавловск-Камчатский : КамГУ им. Витуса Беринга, 2013. – С. 223–229.

Выражаю сердечную благодарность своим научным руководителям к.б.н.

С.В. Мурадову и д.б.н. И.А. Кофиади за всестороннюю поддержку и помощь в проведении данного исследования.

Особо признателен сотрудникам НИГТЦ ДВО РАН д.б.н., проф. Т.И. Кузякиной, к.т.н. О.О. Левенец, к.б.н. Т.С. Хайнасовой, А.А. Балыкову, А.И. Хоменко, Л.А. Мудрановой за предоставление материалов для исследований, помощь в работе и ценные советы и консультации; д.б.н. Т.Ф. Кондратьевой (ИНМИ РАН) за предоставление материала для исследований, к.б.н. О.Ю. Бусаровой (ДВФУ) за рекомендации и методическую помощь при подготовке диссертационной работы.

Благодарю А.А. Докшукину и Д.С. Шведову за помощь при проведении экспериментов на разных этапах работы.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессора И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете при ФБУН ГНЦ ПМБ, ученого секретаря диссертационного совета к.б.н. Н.К. Фурсову за организацию ее проведения, к.м.н. И.В. Абаева (ФБУН ГНЦ ПМБ) за рецензирование и корректировку диссертационной работы.

Глубоко признателен ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.



 
Похожие работы:

«Закария Давидович Гинтури Псиллиды (Hemiptera, Psylloidea) междуречья рек Малого Лиахви и Меджуды: фауна, биология, результаты использования инсектицидов - энтомология 03.00.09 АВТОРЕФЕРАТ диссертации представленной на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук _ 2006 Тбилиси Диссертационная работа выполнена на кафедре зоологии Тбилисского Государственного Университета им. Ив. Джавахишвили. Научный...»

«Фардеева Марина Борисовна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ПРОСТРАНСТВЕННО-ОНТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПОПУЛЯЦИЙ РАСТЕНИЙ, ДИНАМИКА И МОНИТОРИНГ 03.02.01 – ботаника 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань – 2014 Работа выполнена на кафедре общей экологии Института экологии и географии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный консультант : доктор биологических наук,...»

«ШЕСТАК Анна Александровна АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИХ ИСТОЧНИКИ В ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ЦИАНОБАКТЕРИИ АNABAENA VARIABILIS 03.00.2503 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Научный руководитель : доктор...»

«Сперанская Анна Сергеевна ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕИНАЗ ТИПА КУНИТЦА ИЗ КАРТОФЕЛЯ: МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ Специальность 03.00.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук МОСКВА 2008 Работа выполнена в лаборатории биохимии протеолиза Института биохимии им А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор ВАЛУЕВА Татьяна Александровна Официальные оппоненты : доктор химических наук РОТАНОВА...»

«Омельченко Галина Валентиновна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТОПОЛЯ ДЕЛЬТОВИДНОГО И ПИЛЕЗИИ МНОГОЦВЕТКОВОЙ В БИОМОНИТОРИНГЕ УРБОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов - на - Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре генетики и в НИИ биологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор педагогических наук, кандидат Научный руководитель : биологических наук,...»

«НИКИФОРОВА Ирина Александровна ОЦЕНКА И ПРОГНОЗ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ АТМОСФЕРЫ С УПРАВЛЕНИЕМ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬЮ ТЕРРИТОРИАЛЬНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОГО КОМПЛЕКСА 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань 2007 2 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева и в Управлении природных ресурсов и охраны окружающей...»

«КОЗИНА Ирина Владимировна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И НОВЫЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ THERMOANAEROBACTER И CALDANAEROBACTER Специальность 03.00.07-микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловская Официальные оппоненты : доктор биологических наук профессор...»

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«ШАЙХУТДИНОВА АНАСТАСИЯ АНАТОЛЬЕВНА ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА И ПРОГНОЗ КАЧЕСТВА АТМОСФЕРНОГО ВОЗДУХА В УСЛОВИЯХ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПРОДУКТАМИ СЖИГАНИЯ ТВЕРДОГО ТОПЛИВА 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Казань 2010 Работа выполнена на кафедре Теоретические основы теплотехники Казанского государственного технического университета им. А.Н. Туполева. Научный руководитель : доктор технических наук, профессор Байгалиев Борис...»

«Космачевская Ольга Владимировна Влияние физиологических лигандов на функционирование легоглобина 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : Доктор биологических наук А.Ф. Топунов Официальные оппоненты : Доктор биологических наук, профессор А.С. Капрельянц, Доктор биологических...»

«Харитонцев Борис Степанович Флорогенез и фитоценогенез на юге Западной Сибири Специальность: 03.00.05 – БОТАНИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2009 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской академии наук Научный консультант – академик РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Горчаковский Павел Леонидович Официальные оппоненты : доктор...»

«Семина Алиса Владимировна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ЭВОЛЮЦИЯ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОТНОШЕНИЯ В ДВУХ ГРУППАХ РЫБ СЕМЕЙСТВ MUGILIDAE И CYPRINIDAE 03.00.15 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2008 2 Работа выполнена в лаборатории генетики Института биологии моря им. А.В. Жирмунского Дальневосточного отделения Российской Академии наук Научный руководитель доктор биологических наук, старший научный сотрудник Брыков Владимир...»

«БУЗАЕВА Мария Владимировна ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СТОЧНЫХ ВОД ОЧИСТКОЙ ОТ НЕФТЕПРОДУКТОВ И ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПРИРОДНЫХ СОРБЕНТОВ И КОМПЛЕКСОНОВ 03.02.08 - экология (химические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена на кафедре Химия Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Ульяновский государственный технический университет....»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«САВИНОВ Иван Алексеевич Система и эволюция порядка Celastrales на основе данных сравнительной морфологии 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург - 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН и в ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор,...»

«Иванищева Елизавета Александровна ЛАНДШАФТНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КАРКАСА СЕВЕРО-ЗАПАДА ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08. – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2013 Работа выполнена в лаборатории моделирования экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук Научный руководитель...»

«Цыганов Андрей Николаевич Морфологическая изменчивость, видовой состав и структура сообществ сфагнобионтных раковинных амёб Специальность 03.00.18 – Гидробиология 03.00.08 – Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на кафедре гидробиологии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Научные руководители:...»

«МИХАЙЛОВА Валерия Вадимовна Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние на нее актин-связывающего белка кофилина 03.00.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Д. И.Левицкий Официальные оппоненты : доктор биологических наук С.Ю....»

«НАЙДАРОВА ДУЛМА ЛОДОЕВНА СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ СЕРЫХ ЛЕСНЫХ И ЛУГОВО-КАШТАНОВЫХ ПОЧВ ТЕРРИТОРИИ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА АЛХАНАЙ (ЮГО-ВОСТОЧНОЕ ЗАБАЙКАЛЬЕ) 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2009 Работа выполнена на кафедре почвоведения Бурятского государственного университета. Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты :...»

«КОЛЕСОВА Наталья Сергеевна ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И СТРУКТУРА НАСЕЛЕНИЯ ШМЕЛЕЙ (HYMENOPTERA, APIDAE: BOMBUS, PSITHYRUS) ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТАЕЖНЫХ ЭКОСИСТЕМ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2010 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Вологодского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор БОЛОТОВА...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.