WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ТИЩЕНКО Елена Викторовна

Разработка технологии глубинного культивирования

гриба Trichophyton verrucosum

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва - 2010 2

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Мирзаев Микаиль Нурбагандович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Тихонов Игорь Владимирович доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный ветеринарный врач РФ Заерко Виктор Иванович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности»

Защита состоится «_» 2010 г. в ч. на заседании диссертационного совета Д.220.042.01 при ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина». по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23.

Тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина».

Автореферат разослан «»_ 2010 года и размещен на сайте http://mgavm.ru

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Несмотря на интенсивное развитие ветеринарной медицины и, в частности ветеринарной дерматологии, трихофития по-прежнему имеет значительный и стабильный удельный вес среди кожных болезней животных в большинстве стран мира.

Эта болезнь распространена повсеместно и наносит ощутимый экономический ущерб за счет снижения прироста живой массы и качества кожевенного сырья, увеличения затрат на проведение лечебнооздоровительных мероприятий (Борисова Л.И., 1986; Поляков И.Д., Иванова Л.Г., 1994; Кухар Е.В., 2006).





Существующие технологии получения вакцин против микозов (Саркисов А.Х., Петрович С.В., Никифоров Л.B. и др., 1972; Летягин К.П., Саркисов К.А., Панин А.Н., Маноян М.Г., 1997; Соловьев Н.П., 2004;

Лазовский В.А., 2007) основаны на культивировании грибов только поверхностным способом. Однако, как известно, такой способ культивирования промышленных штаммов микроорганизмов по современным требованиям биотехнологии нельзя считать технологичным.

При развитии на твердых средах и, особенно, при снятии с поверхности агаризованных сред споры возбудителей микозов могут загрязнять производственные помещения, а процесс культивирования целевых штаммов длительный (более 20 суток) и трудоемкий.

Анализ опубликованной информации показывает, что ранее проводились исследования по разработке технологии глубинного культивирования несовершенных грибов, к которым относится и Trichophyton verrucosum (Мирзаев М.Н., Кононова С.Ю., 1985; Баласова А.И., Бабаян Е.Ю., Булатова А.А. и др.,1985). Полученные авторами данные позволили заменить промышленную технологию культивирования гриба Beauveria bassiana поверхностным методом на глубинное при получении энтомопатогенного препарата боверин.

Известные работы по культивированию гриба Trichophyton verrucosum (= синоним Trichophyton faviforme) глубинным способом посвящены оценке динамики накопления массы (Кухар Е.В., 1999 г.; Кухар Е.В., 2002 г.; Кухар Е.В., 2006 г.) и показывают, что наибольший рост достигнут за 21 сутки.

Таким образом, из изложенного видно, что актуальной задачей современной биотехнологии является усовершенствование производства препаратов против трихофитии животных на основе интенсификации процесса глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum.

Цель и задачи исследований. Целью исследований является разработка технологии культивирования гриба Trichophyton verrucosum в глубинных условиях на основе создания новой питательной среды и оптимизации условий развития.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать сбалансированный компонентный состав питательной среды для глубинного способа выращивания гриба Trichophyton verrucosum;

- определить основные технологические параметры культивирования Trichophyton verrucosum в жидкой питательной среде: аэрация, температура, инокулят;

- исследовать влияние условий культивирования на динамику спорообразования гриба;

- получить экспериментальные образцы глубинной биомассы гриба Trichophyton verrucosum и изучить их антигенные свойства на лабораторных животных;

- обосновать экономическую целесообразность внедрения в производство глубинного культивирования гриба Trichophyton verrucosum для получения соответствующей вакцины.

Научная новизна. Впервые разработана технологическая схема культивирования Trichophyton verrucosum в глубинных условиях на новой питательной среде, содержащей картофельный отвар и минеральные компоненты, оптимизированы основные параметры культивирования гриба (аэрация, температура, инокулят). Впервые с помощью электронной и световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей микроорганизма, выращенного на агаризованной и жидкой средах.





Практическая значимость работы. Разработаны питательная среда, а также параметры и режимы для глубинного культивирования Trichophyton verrucosum с целью получения биомассы гриба, являющейся основой иммунобиологического препарата. Практическая значимость разработанной технологической цепочки глубинного культивирования Trichophyton verrucosum подтверждена в условиях ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» в аппарате-ферментере КНТ-10, результаты производственных испытаний оформлены утвержденным актом испытаний.

Результаты диссертации используются в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научно-исследовательской работе.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на научной конференции молодых ученых МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, (2008) Основные положения, выносимые на защиту:

- состав питательной среды для культивирования Trichophyton verrucosum;

- технологические режимы культивирования гриба;

- морфология мицелия гриба при развитии в глубинных и поверхностных условиях - антигенные свойства биомассы гриба, полученной глубинным методом культивирования.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 работы, в том числе 2- в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста и включает следующие разделы:

введение, литературный обзор, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы, включающий 156 источников, в т.ч. 56 иностранных, и приложение. Материалы диссертации иллюстрированы 19 рисунками и таблицами.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа выполнена в научно-исследовательской лаборатории инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» в период с 2006 по 2009 год.

Объект исследований – штамм гриба Trichophyton verrucosum.

Исследования проводили на жидких и агаризованных питательных средах, приготовленных и разработанных нами в ходе исследований.

Оптимизацию компонентного состава питательной среды и режимов культивирования (температура, аэрация, инокулят, рН и др.) проводили традиционными микробиологическими и биохимическими методами, основанными на законах, описывающих протекание фундаментальных процессов микробиосинтеза - накопление биомассы, изменение содержания компонентов питательной среды, прохождение физиологических фаз в периодической культуре.

Процесс спорообразования Trichophyton verrucosum контролировали методом подсчета клеток в камере Горяева.

Биомассу гриба в динамике развития определяли методом доведения до постоянного веса при 105С.

Утилизацию углеводов в динамике развития гриба контролировали с помощью антронового метода, регистрируя оптическую плотность при 620нм на спектрофотометре PD-303UV.

Глубинное культивирование гриба на жидкой среде проводили в стандартных качалочных колбах на круговой микробиологической качалке Heidolph Unimax 2010 при вращении 220-240 об/мин и температуре 28С и в биопрепаратов». Коэффициент заполнения аппарата – 0,7, т.е. в аппарат вносили 7л среды, число оборотов мешалки 290-320 об/мин.

микроорганизма исследовали методом световой и электронной микроскопии.

Препарат просматривали в световом микроскопе Biolar и в электронном микроскопе Hitachi 800 со сканирующей приставкой.

суспензию клеток гриба в асептических условиях разливали по флаконам, затем лиофильно высушивали по общепринятой методике.

Оценку антигенных свойств биомассы гриба проводили с помощью реакции агглютинации (РА) по методике, описанной в работе (Саркисов А.Х., Никифоров Л.И и др., 1972).

В качестве подопытных животных использованы кролики породы шиншилла массой 2,5-3,0 кг, биомассу вводили внутримышечно в дозе 3мл.

Гематологические и биохимические показатели подопытных кроликов исследовали с помощью гемометра Сали и биохимических анализаторов Elan-160, Stat fax. Полученный цифровой материал обрабатывали статистически (Плохинский Н.А., 1987).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Оптимизация состава питательной среды и параметров В связи с тем, что до настоящего времени практически отсутствуют данные о глубинном культивировании гриба Trichophyton verrucosum, наши исследования были начаты с конструирования питательной среды, подбора режимов и параметров культивирования в жидкой питательной среде. При этом в качестве источников углерода и энергии были апробированы глюкоза, сахароза, крахмал, картофельный отвар. Варианты питательных сред перечисленных углеводов, а их эффективность оценивали по интенсивности развития гриба на них. В качестве минеральных компонентов среды апробированы разные соотношения NaNO3, MgSO4, CaCL2, KH2PO4. На основе этих предварительных экспериментов была подобрана питательная среда, содержащая следующие ингредиенты, г/л: NaNO3 – 9,0; MgSO4 – 0,6;

CaCL2 – 8,0; KH2PO4 – 1,6; глюкоза – 20,0 и 200 мл картофельного отвара.

Как видно из представленного состава среды, она содержит повышенное количество кальция. Это связано с тем, что в свое время для культивирования несовершенных грибов и получения их споровой (конидиальной) биомассы, была предложена и апробирована аналогичная питательная среда для глубинного выращивания Beauveria bassiana (М.Н.Мирзаев, С.Ю.Кононова, 1985; Малькова А.И, Бабаян Е.Ю. и др.,1985). Среда позволяла получать в глубинных условиях повышенное количество конидиоспор и это объяснялось тем, что на богатой углеводной среде на начальных этапах культивирования микроорганизм интенсивно накапливает мицелиальную массу, а затем переходит на спорообразование. А кальций, как известно, необходим для синтеза альфа-дипиколиновой кислоты, являющейся основным компонентом спор микроорганизмов. В дальнейшем все исследования были проведены с использованием этой среды с небольшими изменениями.

При отработке технологических параметров культивирования гриба температуры, рН, аэрации и массообмена. Как известно, наиболее простым и доступным способом оценки влияния аэрации на развитие микроорганизмов является внесение в колбы разных объемов среды, регуляция подачи воздуха и вращения мешалки в ферментерах (или платформы качалок). В опытах по отработке режима аэрации, разные объемы (50-100 мл) среды вносили в регулировали от 120 до 290 об/мин, следили за ходом развития гриба.

Температурный режим подбирали также экспериментальным путем, культивировали микроорганизм при 15С, 28С и 35С.

Рис. 1 Культивирование в качалочных колбах на круговой микробиологической качалке Heidolph Unimax Как наиболее оптимальный выбран режим культивирования в качалочных колбах: pH 6,8-7,2; температура 27,5-28,5С; скорость вращения качалки 240 об/мин (рис. 1); объем посевного материала 5-10 %.

Влияние углеводов на развитие культуры Trichophyton verrucosum Углеводы, как известно, выполняют роль как источников энергии, так и строительного материала для клеток. При конструировании питательных сред для микроорганизмов исходят из имеющейся информации об их систематическом положении, наличии у них той или иной энзиматической системы. В биотехнологии обычно в качестве источника углеводов в питательные среды вносят отходы других производств (меласса, гидрол, патока, жом свекловичный и др.) и индивидуальные сахара (глюкоза, сахароза, лактоза и др.). В своих исследованиях мы изучали влияние наиболее доступных и относительно недорогих углеводов (глюкоза, сахароза и крахмал) на развитие культуры гриба. При этом в динамике контролировали общее количество углеводов спектрофотометрически с помощью заранее построенной калибровочной кривой. Из полученных данных следует, что максимальный выход биомассы наблюдается на среде с глюкозой – 6,67- 10,0 г/л. Интенсивность развития гриба зависит также от температуры культивирования и степени аэрации – при температуре 15С выход сухой биомассы составляет 2,5±0,2г/л, а при 28С и 35С выход биомассы практически одинаковый и составляет 6,67±0,5г/л и 6,13±0,4 г/л, соответственно (рис.2).

Рис.2 Влияние температуры и аэрации на развития гриба в жидкой В качалочных колбах, содержащих 100мл среды, оптимальным является режим аэрации 220-240 оборотов в минуту, что подтверждается тем, что при 110-120 об/мин выход биомассы составляет 4,2±0,6г/л, а повышение числа вращений до 280-290об/мин не дает существенного эффекта.

Одним из важнейших параметров биотехнологических процессов, основанных на культивировании микроорганизмов (особенно грибов и стрептомицетов), является инокулят, т.е. посевной материал. Оптимальный посевной материал обеспечивает сокращение лаг-фазы, увеличение выхода целевого продукта и сокращение времени ферментации. Поэтому представлялось необходимым провести работу по установлению характера влияния инокулята на развитие возбудителя трихофитии на жидкой питательной среде. Для получения относительно стандартного посевного материала суспензию спор гриба, выращенного на глюкозо-картофельном агаре, вносили в качалочные колбы с жидкой питательной средой. Колбы инкубировали в течение 36-40 часов, при 28С и 240 об/мин и получали вегетативный посевной материал (ВПМ), который использовали в дальнейших исследованиях. Данные, представленные на рис.3, свидетельствуют о наличии корреляции между количеством ВПМ и характером развития гриба.

Рис. 3 Влияние посевного материала на кинетику развития гриба При внесении ВПМ в количестве около 10% от объема среды лаг-фаза в данных условиях культивирования находится в пределах 20 часов. А количество ВПМ 5% удлиняет лаг-фазу на 10 часов. Из анализа стационарную фазу развития гриба при 10% ВПМ наступает гораздо раньше, чем при 5% ВПМ.

Рис.4 Скорость роста (a) и утилизации углеводов (b) Trichophyton культивирования происходит до 60 часов роста, с 60 до 84 часов культура практически не растет (рис 4a). Это связано с утилизацией источников углеводов, накоплением собственных метаболитов, что является типичной картиной, характерной для замкнутых периодических культур микроорганизмов.

Все сказанное о накоплении биомассы в периодической культуре, подтверждается данными по контролю скорости развития микроорганизма.

Как видно из данных рис. 4a, максимальная скорость роста приходится на 36часов, а на 80 час скорость развития гриба практически прекращается.

Параллельно с накоплением биомассы идет утилизация углеводов, что видно из рис. 4b. Уже к 40 часам роста утилизировано приблизительно половина имеющегося сахара в питательной среде.

Как известно, любой биотехнологический процесс, основанный на культивировании микроорганизмов, в определенной мере может быть качественно оценен по экономическим коэффициентам, входящих в состав среды ингредиентов (Перт Дж, 1978.). Эти показатели дают информацию об эффективности использования компонентов среды. На основе изложенных выше данных рассчитан экономический коэффициент по углеводам:

Y1= X1/S1=8,9/15,635=0,579, где X1 – количество накопленной биомассы;

S1 – количество утилизированного углевода.

Это свидетельствует о том, что на единицу утилизированного углевода образуется 0,579 г биомассы.

Следующим этапом наших исследований была апробация полученных на качалочных колбах данных в ферментере, т.е проверка развития гриба на той же питательной среде и в тех же условиях только в ферментере.

Культивирование Trichophyton verrucosum в ферментере проводили на Покровском заводе биопрепаратов. Схема проведения опыта заключалось в следующем: ВПМ, выращенный в колбах, вносили в ферментер КТН-10 со стерильной средой. В ферментер, содержащий 7л стерильной питательной среды, для аэрации автоматически через ротаметр подавался воздух в объеме 7 литров в минуту.

Полученные данные свидетельствуют о том, что гриб развивается в ферментере достаточно интенсивно. Максимальный выход сухой биомассы к 74 часам достигает 9 г/л. К этому времени основная масса углеводов из среды утилизирована. Спорообразование начинается примерно с 48 часов, когда накоплено достаточное количество мицелиальной массы, продолжается в течение всего периода культивирования (84 ч) и к концу ферментации количество спор составляет 80-100 млн/мл культуральной жидкости.

Рис.6 Динамика накопления общей биомассы и количества спор в процессе развития гриба Trichophyton verrucosum в ферментере a. - утилизация углеводов, г/л; - накопление биомассы, г/л.

Из данных рис.6 видно, что фаза спорообразования совпадает с фазой замедления накопления общей биомассы гриба. Максимальная скорость выхода спор наблюдается к 60-70 часам роста, к этому времени культура находится на стационарной фазе развития. Экономический коэффициент по углеводам в ферментере составляет: Y2=X2/S2=9,42/14,85=0,63.

Таким образом, экономический коэффициент при культивировании в качалочных колбах и в аппарате ферментере имеет примерно одинаковое значение. Некоторое снижение этой величины в колбах, видимо, связано с тем, что количество аэрации и массообмена в колбах хуже, поэтому выход биомассы на единицу утилизированных углеводов ниже. На основе полученных результатов, предложена технологическая схема глубинного культивирования Trichophyton verrucosum и получения экспериментальных образцов лиофильно высушенной биомассы (рис.7).

Рис. 7 Технологическая схема получения лиофильно высушенной биомассы гриба Trichophyton verrucosum, выращенной глубинно 1 – исходная культура Trichophyton verrucosum, 2 - ВПМ (вегетативно посевной материал), 3 - рабочий аппарат-ферментер, 4 - розлив по флаконам, 5 - лиофильная сушка.

Культуру гриба, выращенную на скошенном агаре, добавляют в жидкую питательную среду, содержащую глюкозу, картофельный отвар и минеральные компоненты и выращивают в качалочных колбах для приготовления ВПМ. Далее ВПМ в стерильных условиях переносят в аппарат-ферментер и культивируют в течение 80-86 часов. разливают по флаконам и лиофильно высушивают.

Световая и сканирующая электронная микроскопия Trichophyton verrucosum при глубинном и поверхностном культивировании Для сравнительного анализа морфологических особенностей гриба при развитии в глубинных и поверхностных условиях культивирования использовали метод традиционной световой и электронной микроскопии.

Конкретным материалом исследований служили колонии Trichophyton мицелиальные шарики и отдельные гифы гриба, выросшего в глубинных условиях. Из полученных результатов следует, что микроорганизм сохраняет видовую идентичность при культивировании в глубинных условиях. Однако мицелий на жидкой питательной среде, более тонкий, длинный (рис. 8). В течение первых 40-48 часов отмечено начало образования спор (3-5 x 1- мкм), которые по мере дальнейшего развития гриба обнаруживаются в культуральной жидкости (рис. 8).

Рис.8 Формирование спор при развитии гриба на жидкой (слева) и При поверхностном культивировании гриба мицелий объемистый, ветвящийся, с большим количеством конидий, размером 4-7 x 2-3 мкм (рис.

8). Формирование конидиоспор наблюдается на 7-8 сутки, что существенно отличается от развития гриба в глубинных условиях Рис. 9 «Мицелиальные шарики» гриба Trichophyton verrucosum:

визуальный вид в качалочных колбах (а), световая (b, ув.x60) и В отдельных случаях при культивировании гриба в жидкой питательной среде (28-30С, 220 об/мин) биомасса приобретает шаровидную форму и образуются так называемые «мицелиальные шарики», представляющие собой переплетение гифов на различных стадиях развития (рис. 9).

Выявлены гифы, как с развивающимися конидиями, так и пустые чехлы.

Следует отметить, что при исследовании гриба методом сканирующей электронной микроскопии нами подобраны оптимальные условия для глютарового альдегида, препарат обезвоживали пропиленоксидом, а фосфатном буфере и обезвоживали этиловым спиртом разной концентрации (50-100%).Таким образом, видовая специфичность гриба и присущие ему свойства, такие как образование конидиоспор, сохраняются на жидкой среде.

Изучение антигенных свойств глубинной биомассы Trichophyton Перспективной целью проводимых исследований является возможное использование глубинной биомассы возбудителя трихофитии для получения иммунобиологического препарата. Поэтому представлялось необходимым получить первичную информацию об антигенных свойствах биомассы гриба, полученной на жидкой среде. В качестве базовой методики использовали схему иммунизации, предложенную разработчиками препарата ЛТФ-130. Было сформировано 3 группы кроликов живой массой 2,5-3,0 кг породы шиншилла по 4 головы в каждой. Животным 1 группы вводили препарат ЛТФ-130 двукратно внутримышечно в дозе 3 мл с интервалом дней, животным 2 группы – лиофильно высушенную биомассу гриба, полученную глубинно, 3 группа – контрольная, им вводился только изотонический раствор (0,85%) NaCl. Из серологических методов исследований, отклонений от физиологических норм клинического состояния животных (температура, пульс, дыхание) не наблюдалось.

Животные хорошо переносили «вакцинацию», охотно поедали корм.

Установлено, что при введении живых антигенов гриба Trichophyton биохимические показатели существенно не отличались друг от друга (Р0,05) и не превышали границ физиологической нормы во все сроки исследования.

Действие антигенов Trichophyton verrucosum на биохимические Общий белок, г/л Мочевина, мМ/л Общий билирубин, мкМ/л Кальций сыворотке, мМ/л Фосфор неорганический, мМ/л *- p=0,95 при n=6; ** - p=0,99 при n=6;

норма: общий белок – 60-82г/л, мочевина – 4,4-6,6 ммоль/л, общий билирубин – 0,17-3,42 мкмоль/л, кальций общий – 2,12-2,62 ммоль/л, фосфор неогрганический – 0,81-1,13 ммоль/л Как видно из данных таблицы 1, при введении препарата наблюдается достоверное повышение общего белка в крови кроликов. В первой и второй группах кроликов, на 14 день опыта увеличение белка составляет 20% и 9% соответственно, что, видимо, связано с возрастанием иммуноглобулиновых фракций сыворотки крови в ответ на введение антигена Trichophyton достоверно. Данные таблицы 2 показывают также достоверное увеличение количества лейкоцитов к 14 дню опыта. Из лейкоцитарной формулы видно увеличение содержания палочкоядерных нейтрофилов и лимфоцитов.

Количество эозинофилов остается без существенных изменений, т.е. антиген экспериментальными образцами высушенной биомассы кроликов на 14 день опыта в крови выявлены специфические агглютинины к антигенам Trichophyton verrucosum в титрах 1:40-1:60, на 30-й день опыта их количество увеличивается до 1:80-1:120.

Лейкоциты, Эритроциты, Эозинофилы, Лейкоцитарная формула * - p=0,95 при n=15; ** - p=0,99 при n=15; *** - p=0,999 при n=15;

норма: лейкоциты – 6,5-9,5 тыс/мкл; 109/л, эритроциты – 4,5-7,5 млн/мкл; 1012/л, эозинофилы – 1-3 %, нейтрофилы палочкоядерные – 5-9%, нейтрофилы сегментоядерные – 33-39%, лимфоциты – 43-62%, моноциты – 1-3% неиммунизированных животных специфические антитела к антигенам Trichophyton verrucosum не выявлены.

глубинным способом культивирования, обладает антигенными свойствами и это свидетельствует о перспективности исследований в плане дальнейшего совершенствования технологии получения биомассы на жидкой среде.

Экономические показатели технологии получения биомассы Trichophyton verrucosum в глубинных условиях При глубинном культивировании выход спор составляет 100 млн/мл., т.е. в 1 мл содержится 20 доз. Для получения 300 тыс. доз (такая доза является средней для технологического цикла при производстве ЛТФ-130) необходимо – 15 л среды. Ферментация в небольшом 100 л аппарате, при коэффициенте заполнения ферментера 0,7, позволяет получать 1,4 млн. доз.

Получение аналогичного количества доз поверхностным способом культивирования возможно при засеве 467 матрасов.

Стоимость 600 мл сусло-агара, вносимого в 1 матрас, составляет примерно 40 рублей, а стоимость среды для глубинного культивирования при получении тех же 3000 доз составляет 10 рублей.

Таким образом, эффективность технологии получения биомассы возбудителя трихофитии в глубинных условиях связана с тем, что стоимость только одной среды при поверхностном культивировании гриба для получения 300 тыс. доз составляет 4000 рублей, а стоимость жидкой среды рублей. Следует учесть и то, что время культивирования гриба на агаре 21 сутки, а на жидкой среде- 4 суток.

ВЫВОДЫ

1. Разработан сбалансированный компонентный состав питательной среды на основе картофельного отвара и минеральных солей для культивирования Trichophyton verrucosum в глубинных условиях.

2. При культивировании Trichophyton verrucosum в глубинных условиях в качестве инокулята предложено использовать вегетативный посевной материал, получаемый путем проращивания споровой массы гриба в течение 36-40 часов и вносимый в количестве 5-10% от объема среды 3. Установлено, что Trichophyton verrucosum развивается на жидкой питательной среде, подчиняясь общеизвестным закономерностям развития микроорганизмов в периодической культуре: лаг-фаза длится до 30 часов, экспоненциальная фаза до 48-54 часов и далее гриб переходит в стационарную фазу. Максимальный выход спор наблюдается к 60-70 часам и составляет 100 млн/мл культуральной жидкости. Экономический коэффициент по углеводам находится в пределах 0,46-0,63.

4. Впервые с помощью электронной и световой микроскопии проведен сравнительный анализ морфологических особенностей Trichophyton verrucosum, выращенного на твердой и жидкой средах.

Показано, что гифы мицелия в глубинных условиях более тонкие и длинные, выявлены гифы, как с развивающимися конидиями, так и пустые чехлы.

животным (кролики, порода шиншилла) лиофильно высушенная биомасса гриба Trichophyton verrucosum, не оказывает токсического или аллергенного действия. После иммунизации антигеном, кролики охотно поедали корм, отклонений клинических показателей (температура, пульс, дыхание) от физиологических норм не наблюдалась.

глубинной биомассой Trichophyton verrucosum установлено, что при культивировании в жидкой среде гриб Trichophyton verrucosum сохраняет антигенные свойства, в реакции агглютинации титр составляет 1:80-1:

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ

РЕЗУЛЬТАТОВ

1. По результатам исследований составлен и утвержден в установленном порядке отчет «Создание иммунобиологических средств субъединичных компонентов микроорганизмов возбудителей бактериальных и грибковых (Trichophyton) заболеваний» за 2007, 2008 г по хоз-договору №14-06.

2. В производственных условиях на ФГУП «Покровский завод биопрепаратов» использованы данные диссертации по отработке и оптимизации технологии глубинного культивирования Trichophyton verrucosum, показано интенсивное развитие и накопление биомассы гриба, что подтверждено актом испытаний, утвержденным соответствующим образом. Методы получения глубинной биомассы используются в НИЛ инфекционной патологии и биотехнологии ФГОУ ВПО МГАВМиБ в научноисследовательской работе.

3. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГОУ ВПО МГАВМиБ для студентов факультета ветеринарной медицины.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

качестве нового методического подхода при проведении исследований по получению иммунобиологических препаратов на основе глубинной биомассы возбудителя трихофитии.

2. Результаты исследований по глубинному культивированию Trichophyton verrucosum рекомендуются использовать в учебном процессе по курсу «Биотехнология» в сельскохозяйственных вузах.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Тищенко Е.В., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Особенности развития гриба Trichophyton faviforme / Объединенный научный журнал. – 2008. - №6 (212). – С. 63.

2. Тищенко Е.В., Мирзаев М.Н., Девришов Д.А. Технологические параметры Trichophyton faviforme при культивировании в биореакторах // Ветеринарная медицина. – 2009. - №1-2. – С. 20.

микроскопия гриба Trichophyton faviforme при глубинном и поверхностном культивировании // Ветеринарная медицина. – 2009. - №4. – С. 21.



 
Похожие работы:

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»

«Омельченко Галина Валентиновна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТОПОЛЯ ДЕЛЬТОВИДНОГО И ПИЛЕЗИИ МНОГОЦВЕТКОВОЙ В БИОМОНИТОРИНГЕ УРБОСИСТЕМ (НА ПРИМЕРЕ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов - на - Дону - 2013 2 Работа выполнена на кафедре генетики и в НИИ биологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор педагогических наук, кандидат Научный руководитель : биологических наук,...»

«ЛУБЯНОВ Александр Александрович МЕХАНИЗМЫ ДЕЙСТВИЯ РЕГУЛЯТОРА РОСТА РАСТЕНИЙ СТИФУНА И ЕГО ПРОТЕКТОРНЫЕ СВОЙСТВА В УСЛОВИЯХ КАДМИЕВОГО СТРЕССА Специальность 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Институт биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Яхин Олег Ильдусович Научный консультант :...»

«ЕФИМОВА Мария Александровна БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ VACCINIUM MYRTILLUS L. И VACCINIUM VITIS-IDAEA L. В ЕСТЕСТВЕННЫХ И АНТРОПОГЕННО НАРУШЕННЫХ ЛЕСНЫХ СООБЩЕСТВАХ КОЛЬСКОГО ПОЛУОСТРОВА 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2007 Работа выполнена в Лаборатории экологии растительных сообществ Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук,...»

«Легонькова Ольга Александровна БИОТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ ПУТЕМ СОЗДАНИЯ ГИБРИДНЫХ КОМПОЗИТОВ 03.00.23 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Москва 2009 Работа выполнена в проблемной лаборатории полимеров Московского Государственного университета прикладной биотехнологии и на кафедре микробиологии Российского Государственного Аграрного Университета МСХА им. К.А.Тимирязева. Научный консультант - академик...»

«ХОДАК Юлия Александровна РНК-ПОЛИМЕРАЗА E.coli: ЭКСПРЕСС-МЕТОД ВЫДЕЛЕНИЯ ВЫСОКОЧИСТЫХ ПРЕПАРАТОВ; НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 03.01.03 молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в отделе химии нуклеиновых кислот НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные кандидат химических...»

«СМЕКАЛОВ Михаил Андреевич ВЛИЯНИЕ БИОВЕРМИКУЛИТА НА ВЫВЕДЕНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ИЗ ОРГАНИЗМА И НОРМАЛИЗАЦИЮ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ У КОРОВ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОЙ ЗОНЫ 03.01.04 — Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Дубровицы, 2011г. Работа выполнена в отделе биохимических и химико-аналитических исследований Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии...»

«Моисеев Павел Александрович СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ДРЕВЕСНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ НА ВЕРХНЕМ ПРЕДЕЛЕ ЕЕ ПРОИЗРАСТАНИЯ НА УРАЛЕ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант доктор биологических наук, профессор Шиятов Степан Григорьевич Официальные оппоненты : доктор...»

«РЫЛЬНИКОВ Валентин Андреевич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И ПОДХОДЫ К УПРАВЛЕНИЮ ЧИСЛЕННОСТЬЮ СИНАНТРОПНЫХ ВИДОВ ГРЫЗУНОВ (на примере серой крысы Rattus norvegicus Berk.) 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2007 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Научно-исследовательский институт дезинфектологии Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и...»

«ПРОКОФЬЕВА Мария Юрьевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ СЕМЯН В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КОРНЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в группе специализированного метаболизма корней Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва....»

«СМИРНОВ Дмитрий Григорьевич ОРГАНИЗАЦИЯ СООБЩЕСТВ И ПОПУЛЯЦИЙ РУКОКРЫЛЫХ (MAMMALIA: CHIROPTERA) В УСЛОВИЯХ УМЕРЕННО-КОНТИНЕНТАЛЬНОГО  КЛИМАТА  РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пенза – 2013 1 Работа  выполнена  в  федеральном  государственном  бюджетном  образовательном учреждении высшего профессионального образования “Пензенский государственный...»

«Потапенко Наталья Христофоровна АДАПТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШЕЛКОВИЦЫ В УСЛОВИЯХ КЛИМАТИЧЕСКОГО СТРЕССА (НА ПРИМЕРЕ НИЖЕГОРОДСКОГО ПОВОЛЖЬЯ) Специальность: 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена на базе Ботанического сада Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Научный...»

«Бутина Наталья Александровна ИЛЬМОВНИКИ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ ФЛОРИСТИЧЕСКОГО И ФИТОЦЕНОТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ, БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА ULMUS. L. 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ-2009 3 Работа выполнена в Забайкальском государственном гуманитарнопедагогическом университете им. Н.Г. Чернышевского доктор биологических наук Научный руководитель : Ольга Александровна Попова...»

«ГЫНИНОВА АЮР БАЗАРОВНА ПОЧВЫ ДЕЛЬТЫ р. СЕЛЕНГИ (ГЕНЕЗИС, ГЕОГРАФИЯ, ГЕОХИМИЯ) 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории географии и экологии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный консультант : Член-корреспондент РАН, профессор Шоба С.А. Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Г.Д. доктор биологических...»

«Ашихмин Александр Александрович Каротиноиды светособирающих комплексов пурпурной серной бактерии Ectothiorhodospira haloalkaliphila 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Пущино – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук (ИФПБ РАН) Научный руководитель : доктор биологических наук Москаленко Андрей Анатольевич...»

«Гусев Евгений Сергеевич ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ФИТОПЛАНКТОНА СТРАТИФИЦИРОВАННЫХ ОЗЕР КАРСТОВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ ЦЕНТРАЛЬНОЙ РОССИИ (ВЛАДИМИРСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.18 –гидробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Борок – 2007 Работа выполнена в Институте биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Корнева Людмила Генриховна Официальные...»

«Горовцов Андрей Владимирович ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Внуков Валерий Валентинович Официальные оппоненты : Киреева Валерия Васильевна,...»

«ТРУШКОВА Марина Александровна СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЛАНДШАФТАХ РАЗЛИЧНОГО РАНГА (на примере Нижегородского Поволжья) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 2 Работа выполнена на кафедре зоологии и общей биологии естественно-географического факультета ГОУ ВПО Нижегородский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических...»

«Иметхенова Оксана Васильевна SPIRAEA AQUILEGIFOLIA PALL. В РАСТИТЕЛЬНОСТИ СЕЛЕНГИНСКОГО СРЕДНЕГОРЬЯ (ЗАПАДНОЕ ЗАБАЙКАЛЬЕ) 03.00.05 Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2008 Работа выполнена в Бурятском государственном университете Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Намзалов Бимба-Цырен Батомункуевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Дулепова Бэлла Ивановна...»

«Головатских Инна Васильевна ПОКАЗАТЕЛИ МЕТАБОЛИЧЕСКОЙ ОБЕСПЕЧЕННОСТИ НЕКОТОРЫМИ БИОЭЛЕМЕНТАМИ И ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОФИЛАКТИКИ ДЕФИЦИТА КАЛЬЦИЯ И ЙОДА У ДЕТЕЙ ПРЕПУБЕРТАТНОГО ВОЗРАСТА ЮЖНОГО РЕГИОНА БАШКИРИИ (НА ПРИМЕРЕ Г.МЕЛЕУЗА И МЕЛЕУЗОВСКОГО РАЙОНА) 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск — 2014 2 Работа выполнена на кафедре биологической химии государственного бюджетного образовательного учреждения высшего...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.