WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«СОЗДАНИЕ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОЕ ПТИЦЕВОДСТВО СИСТЕМЫ КОМПЛЕКСНОГО СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

МУДРАК НАТАЛЬЯ СТАНИСЛАВОВНА

СОЗДАНИЕ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОЕ ПТИЦЕВОДСТВО

СИСТЕМЫ КОМПЛЕКСНОГО СЕРОЛОГИЧЕСКОГО

МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НА ОСНОВЕ

ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА

03.02.02 «Вирусология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Владимир - 2010 2

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный консультант: Дрыгин Владимир Викторович, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Смоленский Владимир Иванович, доктор биологических наук, профессор Цыбанов Содном Жамьянович, доктор биологических наук, профессор Мищенко Владимир Александрович доктор ветеринарных наук, профессор

Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ФГУ «ВНИиТИБП»)

Защита состоится « 2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного »

совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)

Автореферат разослан « 2010 г.

»

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Пономарев А.П.

1.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В связи с интенсивным развитием промышленного птицеводства, возникновением новых и изменением уже известных инфекционных болезней птиц, против которых проводится профилактическая вакцинация, требуется разработка чувствительных, высокоспецифичных и поддающихся автоматизации методов оценки иммунного статуса птиц. Своевременный мониторинг инфекционных болезней птиц является неотъемлемой частью комплекса мероприятий, направленных на профилактику этих заболеваний, что предусматривает внедрение в практику диагностических исследований, отвечающих современному уровню развития науки.





Несмотря на то, что традиционные иммунологические методы попрежнему широко используются в ветеринарной практике, метод иммуноферментного анализа (ИФА) занял ведущее место при проведении рутинных исследований. Преимущества ИФА как метода (скорость, чувствительность, специфичность, безопасность, возможность автоматизации процесса), широкое применение коммерческих наборов для ИФА в национальных программах борьбы с инфекционными болезнями птиц во многих странах Западной Европы и Америки определяют его одним из ведущих диагностических тестов.

Высокая эффективность мониторинга инфекционных заболеваний может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их практической работе.

В течение последнего десятилетия в промышленном птицеводстве были предприняты попытки модернизации серологической диагностики с применением иммуноферментного анализа. Для увеличения количества тестируемых проб и уменьшения расхода реактивов и трудозатрат была проведена оценка различных методик определения в ИФА титров антител при исследовании проб сывороток крови птиц в одном разведении. (Snyder D. B., 1984, 1985; Penzes Z., 1992).

Крупнейшие фирмы производители иммуноферментных наборов для диагностики болезней птиц (IDEXX (США), Synbiotics (КPL,США), Guildhay (Великобритания), Biochek (Голландия)) при постановке реакции в одном разведении для расчёта титра антител в сыворотке крови выбрали линейную зависимость логарифма титра (lg T) от величины логарифма S/P отношения (отношение оптической плотности испытуемой пробы к оптической плотности положительного контроля).

Применение измерительного оборудования, в частности, спектрофотометров для считывания значений оптической плотности в микропланшетном формате, позволило разработать методологию тестирования большого количества проб сывороток одновременно против нескольких антигенов. Это, в свою очередь, привело к созданию и внедрению в ветеринарную практику специализированных компьютерных программ не только для перевода оптической плотности в числовое значение точного титра, но и для автоматической обработки, хранения и создания баз данных (Snyder D.B, 1984).

Наиболее актуальным для промышленного птицеводства является мониторинг списочных (особо опасных) и экономически значимых болезней кур - ньюкаслской болезни (НБ), гриппа птиц (ГП), инфекционной бурсальной болезни (ИББ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), реовирусной инфекции птиц (РВП), инфекционного энцефаломиелита птиц (ИЭП), респираторного микоплазмоза и микоплазменного синовита, вызываемых Mycoplasma gallisepticum (МГ) и Mycoplasma synoviae (МС), которые определили перечень создаваемых отечественных диагностических тест-систем.





Гибель птиц при вспышках НБ и ГП, особенно молодой, может достигать 100%. По данным МЭБ, с июля 2008 по июль 2009 гг. официально зарегистрированы вспышки ньюкаслской болезни в 87 странах мира (OIE, www.oie.int), в том числе и в России. По данным Россельхознадзора, всего с 2005 по 2008 гг. в России было выявлено 179 очагов высокопатогенного гриппа Н5N1 в 20 субъектах, суммарные потери от которого составили 2, млн. голов птицы.

С середины 70-х гг. ИББ и ИБК широко распространены практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством. При вспышках ИББ заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать 90% (Chette N., 1989), при этом переболевшие птицы приобретают восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бактериальной этиологии (Rosenberger J., 1978). Экономические потери при ИБК складываются в основном из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодняка до 30-дневного возраста. Ситуация осложняется регулярным появлением новых вариантов вируса ИБК с низким уровнем родства к традиционным вакцинным штаммам. (Bochkov Y. A. e.a., 2006, Torregino C. e.a., 2008) Реовирус птиц вызывает развитие теносиновита, малабсорбционного синдрома, заболевания респираторного и кишечного трактов. Ежегодный ущерб, наносимый птицеводству в США от болезней скелета у домашних птиц, основными возбудителями которых являются в равной степени реовирус и M.synoviae, составляют от 80 до 120 млн. долларов (Sullivan T.V.,1994).

Экономический ущерб от болезней, вызываемых M.gallisepticum и M.synoviae, складывается из потерь, связанных с гибелью эмбрионов и цыплят, снижением массы тела птиц, уменьшением яйценоскости, оплодотворяемости яиц, выводимости цыплят (Ley et al., 2003, Kleven S.H., 2003).

В крупных птицеводческих хозяйствах синдром снижения яйценоскости -76 приносит ущерб из-за снижения яичной продуктивности и качества товарного яйца. (Eck J.H.,1982).

Инфекционный энцефаломиелит вызывает заболевание кур, которое охватывает практически все поголовье в промышленном птицеводстве как мясного, так и яичного направления, причем летальность может составлять 20-50%. (Calnek B.W, 1997, 1998) Необходимость анализа результатов исследования значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, а также хранения полученных данных делает актуальной задачу автоматизации учета результатов ИФА.

Существующие программы компьютерной поддержки ИФА, как правило, разрабатываются фирмой-изготовителем диагностикумов и предназначены для работы только с наборами данной фирмы. Таким образом, возникла необходимость разработать универсальную компьютерную программу, в которой предусматривалась бы возможность работы с наборами для ИФА и спектрофотометрами-ридерами разных производителей.

Применение в диагностических исследованиях наборов и реактивов зарубежного производства существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественную ветеринарию зависимой от импортных поставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечественных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагностикумов является важной задачей.

Объем проводимых мониторинговых исследований болезней птиц с каждым годом увеличивается и требует принципиально новых подходов к технологии тестирования. За рубежом в ведущих ветеринарных диагностических лабораториях, в частности референтных по особо опасным болезням, в последние годы активно внедряются новые методы постановки ИФА, включая основанные на технологии высокопроизводительного скрининга (Сheu M., 2001, McGiven J., 2007) с применением роботизированных устройств. Замена «ручных» технологий серологических исследований на автоматизированные позволяет достичь повышения воспроизводимости результатов, стандартизации процесса исследований и их автоматического поддержания на соответствующем уровне, повышения производительности и безопасности работы персонала.

Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было создание системы комплексного серологического мониторинга на основе иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям девяти наиболее экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении и ее внедрение в промышленное птицеводство.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

-усовершенствовать методики очистки и концентрирования антигенов возбудителей НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем;

-оптимизировать схемы иммунизации кур для получения специфических контрольных положительных сывороток;

-разработать иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня антител в сыворотках крови кур к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС при тестировании в одном разведении;

-определить чувствительность и специфичность при сравнительном анализе данных, полученных с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций и коммерческих иммуноферментных наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ;

-определить диагностическую значимость результатов, полученных с использованием разработанных тест-систем на основе ИФА, для изучения эпизоотической ситуации в птицехозяйствах и оценке иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин;

- разработать научно-техническую документацию и регламенты для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на проб);

-разработать универсальную компьютерную программу регистрации, сбора, анализа и хранения результатов с учетом возможности использования наборов для диагностики болезней птиц отечественных и ведущих зарубежных фирм-производителей;

-разработать технологию производства коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств;

-провести оценку качества разработанных тест-систем в сравнительных испытаниях, проводимых международными референтными лабораториями МЭБ и ФАО;

-внедрить в работу ветеринарных лабораторий и птицефабрик комплексную систему серологической оценки иммунного статуса кур разного возраста, основанную на ИФА, с использованием комплекта стандартизированного оборудования и универсальной компьютерной программы обработки и хранения полученных результатов.

Научная новизна. Впервые разработаны отечественные иммуноферментные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям основных экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при тестировании проб сывороток крови в одном разведении.

Впервые в России создана комплексная система серологического мониторинга в птицеводстве, основанная на методологии ИФА с применением отечественных диагностических наборов, сертифицированного оборудования, реагентов и компьютерной программы, которая обеспечивает получение надежных данных об иммунном статусе птицепоголовья.

Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности реакций по результатам, полученным с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций (РДП, РТГА) и коммерческих наборов зарубежных производителей, зарегистрированных на территории РФ.

Определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансовариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин в промышленном птицеводстве.

Разработана и сертифицирована компьютерная программа регистрации, анализа и хранения результатов для работы с отечественными и зарубежными иммуноферментными коммерческими наборами ведущих фирмпроизводителей.

Утверждена научно-техническая документация и регламент для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах:

при визуальной детекции и инструментальном учете с применением программного обеспечения.

Качество лабораторных исследований с применением коммерческих наборов для ИФА на основе разработанных тест-систем подтверждено результатами международных сравнительных испытаний, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг. при тестировании зашифрованных проб сывороток с разным уровнем антител к НБ, ГП, ИБК, ИББ, МГ и МС.

Научная новизна исследований подтверждена 3 патентами на наборы и свидетельством на компьютерную программу «СИНКО-ИФА», зарегистрированную в Российском агенстве по патентам и товарным знакам.

Практическая значимость. Методики, разработанные в ходе научноисследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника:

“Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом” (1998 г.) и “Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций” (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных Россельхознадзором.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 81 научная работа, в том числе 22 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ.

Апробация работы. Основные материалы исследований по теме диссертации опубликованы, доложены и обсуждены: на конференциях, проводимых в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 1995, 1997-2000, 2003, 2008); на международной конференции «Птицеводство – мировой и отечественный опыт», Москва, 2002; на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветлабораторий - субъектов РФ «Совершенствование ветеринарной лабораторно-диагностической работы в Российской Федерации», Брянск, 2004; Международных ветеринарных конгрессах по птицеводству, Москва, 2005, 2006;

на Международных научных конференциях и конгрессах в Российской Федерации (Москва, 2001; Казань, 2005; Покров, 1999, 2000; Новосибирск, 2008),в Украине (Харьков, 2001-2003, 2006-2008; Крым, 2006-2008), Казахстане (Алматы, 2000), Республике Беларусь (Минск, 2000; Витебск, 2001), Марокко (Маракеш, 2009), Австрии (Вена, 2009), на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1995-2009 гг.

Основные положения, выносимые на защиту:

- разработка иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения антител к возбудителям девяти экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении;

-результаты определения корреляционной зависимости при сравнении данных, полученных с использованием разработанных тест-систем, базовых тестов и коммерческих наборов зарубежного производства;

-программное обеспечение для учета, обработки и хранения результатов анализа «СИНКО-ИФА»;

-результаты исследований сывороток крови кур с применением разработанных наборов для ИФА при ретроспективной диагностике заболеваний и оценке поствакцинального иммунитета после применения живых и инактивированных вакцин в птицехозяйствах РФ в 1995-2008 гг.;

-результаты лабораторных исследований в международных сравнительных испытаниях, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг.;

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 322 страницах, иллюстрирована 55 таблицами и 41 рисунками. Список цитируемой литературы включает 363 источников, из них 311 иностранных.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 1993-2009 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. «Всероссийский научно-исследовательский институт защиты животных» (г. Владимир).

Основные результаты работы получены лично автором, под его руководством или при его непосредственном участии в планировании, проведении и анализе экспериментов. Имена соавторов, выполнявших отдельные этапы работы, указаны в соответствующих публикациях, за что автор выражает им глубокую благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.1. Материалы Штаммы вирусов и микоплазм:

-штамм вируса ИБК «Чапаевский», Н120 (серотип Массачусетс) из коллекции ФГУ «ВГНКИ»;

-вакцинный производственный штамм «БГ» вируса ИББ (ФГУ «ВГНКИ»);

-производственный штамм Ла-Сота вируса НБ (ФГУ «ВГНКИ»);

-вирус гриппа птиц А/duck/Novosibirsk/2/2005 Н5N1(ФГУ «ВНИИЗЖ»);

- штамм В 8/78 вируса ССЯ-76, адаптированный к утиным эмбрионам (ФГУ «ВГНКИ»);

-вакцинный штамм S1133 реовируса птиц (ФГУ «ВГНКИ»);

- штамм вируса ИЭП «Calnek 1143М» (ФГУ «ВГНКИ»);

-вакцинный штамм 6/85 МГ и штамм WVU1853 МС (ФГУ «ВГНКИ»).

Эмбрионы кур. Использовали куриные эмбрионы (КЭ), полученные от СПФ-кур (фирма Lohmann Tiehrzucht, Германия).

Культура клеток. Использовали перевиваемую культуру клеток МДСК (НИИ гриппа, г. Санкт-Петербург) и первичную культуру фибробластов эмбрионов кур (ФЭК).

Сыворотки. Вирусспецифические сыворотки крови кур, используемые в качестве положительного контроля, получали путем иммунизации доноров очищенными инактивированными препаратами антигенов выбранных возбудителей.

В качестве исследуемых проб использовали сыворотки крови кур, экспериментально вакцинированных против возбудителей болезней кур или присланных из более 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ.

Пероксидазный конъюгат. В работе применяли антивидовой коммерческий конъюгат (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РФ), представляющий собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией животных-продуцентов IgG курицы, меченную пероксидазой, а также антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG кур производства фирмы KPL (США).

Коммерческие диагностические наборы. Применяли коммерческие наборы для определения антител к возбудителям инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, РВП, ИЭП, МГ и МС) в ИФА фирмы Synbiotics (KPL, США), зарегистрированные на территории РФ.

Оборудование. Использовали стандартное лабораторное оборудование и автоматические станции модульного типа FREEDOM EVO-150 фирмы Tecan (Австрия) для роботизации отдельных стадий анализа и производства наборов.

Реактивы и растворы. Применяли реактивы отечественного и импортного производства марки «о.с.ч.», из которых готовили растворы, необходимые для очистки и концентрирования антигенов. Для постановки ИФА использовали следующие растворы: 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl рН 7,4-7,6;

0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6-9,5; испытуемые и контрольные сыворотки и антигены, конъюгаты антивидовых антител разводили в растворе 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl, 0,1% твин-20, для блокировки применяли раствор 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl, 0,1% твин-20 с 10% сыворотки крови лошадей; отмывку сорбента от несвязавшихся компонентов проводили раствором 0,05 М трис-НСl с 0,2 М NaCl и 0,1% твин 20 рН 7,4-7,6; в качестве субстрата пероксидазы использовали: 0,04% раствор ортофенилендиамина в фосфатно-цитратном буфере рН 4,9 с 0,04 % перекиси водорода;

2,2’-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту(АБТС) с перекисью водорода; для остановки реакции применяли 10% раствор серной кислоты, а также 5 % раствор додецилсульфата натрия (ДСН).

Получение антигенов вирусов и микоплазм. Проводили согласно методикам, описанным ранее (Бочков Ю.А. и соавт., 1997; Грибанов О.Г. и соавт., 1997; Куприянов А.И. и соавт., 2000; Волкова И.А. и соавт., 2000; Циванюк М.А. и соавт., 2007).

Серологические и иммунохимические методы исследования.

Активность гемагглютинирующих вирусов ГП, ССЯ-76 и НБ, а также антигенов M. gallisepticum и M. synoviae определяли в реакции гемагглютинации (РГА) в планшетах с использованием 1% суспензии эритроцитов кур.

РТГА и РДП проводили в соответствии с Руководством по диагностическим тестам и вакцинам в отношении наземных животных (МЭБ, 2008).

Электрофорез проводили по Laemmli U.K. (1970) с некоторыми модификациями.

Определение относительной специфичности и чувствительности.

Относительную чувствительность и специфичность исследований подсчитывали по методу, предложенному Hayhow C. S. (1993).

Статистический анализ материалов. Для статистической обработки данных использовали компьютерную программу «Statistica» (USA, StatSoft Inc., Release 6.0, 2001) Компьютерный учёт результатов. Учёт результатов непрямого варианта ИФА, обработку, хранение и воспроизведение полученных данных проводили с использованием разработанной компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГУ «ВНИИЗЖ»).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.2.1. Усовершенствование методики очистки и концентрирования антигенов вирусов и микоплазм, применяемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем В качестве исходного материала для получения антигенов вирусов и микоплазм использовали гомогенаты тканей, экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) куриных эмбрионов, вируссодержащую культуральную жидкость. При этом осуществляли оптимизацию условий очистки и концентрирования с учетом особенностей морфологии, строения и физико-химических свойств возбудителя.

Вируссодержащие препараты после инактивации очищали от балластных белков путём низкоскоростного центрифугирования. Затем проводили очистку высокоскоростным центрифугированием через 20% раствор сахарозы или через линейный градиент CsCl-сахароза.

При концентрировании антигенов вирусов ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП к инактивированной антигенсодержащей суспензии, после предварительной очистки хлороформом или фреоном 113 (для РВП), добавляли 7-7,5% полиэтиленгликоль (М 6000-8000), полученные осадки ресуспендировали в ФБР из расчета от 1/20 до 1/70 от исходного объема.

Полученную биомассу M.gallisepticum концентрировали центрифугированием при 8000 об/мин., для разрушения клеток применяли: ультразвук, лизирование материала с помощью карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), обработку ДНК-зой и РНК-зой, обработку ДСН. Наилучшие результаты были получены при обработке ДСН. Антигенсодержащее сырье M.synoviae дважды центрифугировали и клеточную массу суспендировали в ФБР с последующей обработкой ДСН.

После ресуспендирования осадков в ФБР получали препараты, cодержащие антигены вирусов и микоплазм с концентрацией белка не менее 1 мг/см3. Для гемагглютинирующих вирусов активность препаратов в РГА составляла 7,0-9,0 log2, в «сэндвич»-варианте ИФА – 1:6400-12800.

В процессе электронно-микроскопических исследований выявляли вирионы с характерной структурой. Данные электрофореза в 12,5% полиакриламидном геле свидетельствовали об отсутствии или минимальных количествах посторонних белков.

Полученные препараты антигенов и микоплазм сохраняли специфическую активность при иммобилизации на планшетах в течение длительного времени (не менее 12 месяцев). При проверке на активность и специфичность в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками из наборов фирмы Synbiotics (KPL) были получены титры не менее 1:1600 для положительных и менее 1:200 для отрицательных контрольных сывороток со всеми препаратами антигенов и установлена строгая специфичность в отношении гетерологичных сывороток.

Очищенные и концентрированные препараты антигенов использовали для получения специфических контрольных сывороток, оптимизировав схемы иммунизации птицы с учетом особенностей биологии возбудителя.

2.2.2. Разработка тест-систем на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к возбудителям болезней птиц Для разрабатываемых тест-систем необходимо было установить оптимальные рабочие разведения сыворотки, коэффициенты уравнения линейной регрессии для количественной оценки, позитивно-негативный порог для качественной интерпретации данных, диапазон допустимых значений оптической плотности (ОП) контрольных сывороток.

2.2.2.1. Выбор рабочего разведения сыворотки Задачей данного этапа исследований было нахождение величины разведения сыворотки, которая имеет наибольший коэффициент корреляции с экспериментально установленным значением титра. Были использованы пробы специфических сывороток с разным уровнем антител, для которых методом последовательных разведений определяли титр (наибольшее разведение, ОП которого равна удвоенному значению ОП отрицательного контроля).

Изучали взаимосвязь между экспериментально полученными значениями титров (T), определенных методом последовательных разведений, и величинами (S/P)-отношений, установленных при исследовании сывороток крови кур в разведениях 1:100, 1:200, 1:400 и 1:800. Для каждого из указанных разведений между значениями lgT и lg(S/P) определяли коэффициенты корреляции (r), а также коэффициенты (А и В) для уравнения модели связи вида lgT= A + B lg(S/P). Полученные значения r, представленные в табл.1., показывали высокую степень корреляции между исследованными показателями lgT и lg(S/P) Коэффициенты корреляции между логарифмами титров (lg T), установленных методом последовательных разведений, и логарифмами S/P – отношения (lg S/P**) для заданных разведений сывороток крови кур *Все коэффициенты были получены в результате не менее 60 измерений и имели значимость (p0,01) **S/P – отношение - ------------------------------------------------------------ОП положительного контроля - ОП отрицательного контроля Для прогнозирования титра сыворотки по S/P-отношению были использованы регрессионные модели связи для всех испытанных разведений сывороток. В качестве примера на рис. 1 приведен график зависимостии lg T от lg S/P и соответствующая регрессионная модель для разведения 1:400 в тестсистеме для выявления антител к вирусу НБ.

Рис. 1. График зависимости lg Т антител к вирусу НБ, определённого методом последовательного разведения от lg S/P в разведении сыворотки 1: Полученные модели связи, за исключением модели для разведения 1:100, были адекватны (p0,01), однако наименьшую остаточную дисперсию наблюдали в разведении 1:400 для всех антигенов. При достаточном уровне значимости (р 0,05) коэффициентов корреляции и адекватности используемой модели связи возникала возможность прогнозировать титр, используя S/P-отношение единственного разведения сыворотки.

Уравнения для вычисления логарифмированного значения титра в разведении сыворотки 1:400 представлены в табл. 2.

Уравнения для вычисления логарифмированного значения 2.2.2.2. Определение диапазона значений показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролей Для получения корректных результатов реакции, при условии неизбежного варьирования величин оптической плотности (ОП), необходимо, чтобы оптические характеристики обеих контрольных сывороток были количественно определены в виде диапазонов допустимых значений. При этом для отрицательного контроля значима верхняя допустимая граница, а для положительного - обе границы. Выход за рамки допустимых значений ведет к получению в ИФА либо ложноположительных, либо ложноотрицательных результатов.

На планшетах с антигеном ИББ более чем в 50 повторностях исследовали вариации значений ОП отрицательной и положительной контрольных сывороток в разведениях 1:400. Полученные выборки значений ОП позволили расcчитать соответствующие средние величины и их статистические характеристики в виде дисперсий () и 95,5% доверительных интервалов (2).

Для отрицательного контроля в качестве максимально допустимой (пороговой) величины была принята верхняя граница доверительного интервала, которая составила 0,144. Было определено, что пороговые значения ОП положительного контроля находились в диапазоне от 0,518 до 0,838.

Установленные таким же образом пороговые значения ОП контрольных сывороток для разрабатываемых тест-систем представлены в табл. 3.

Пороговые значения оптической плотности положительных и отрицательных контрольных сывороток № п/п Название воз- ОП отрицательного ОП положительного 2.2.2.3. Определение значений титров для разграничения отрицательной, сомнительной и специфической реакций Для всех разрабатываемых тест-систем определяли максимальное значение S/P, соответствующее неспецифической реакции, и минимальное значение S/P для специфической реакции. Для этого, соблюдая ранее выработанные условия проведения анализа (рабочее разведение, допустимые значения ОП контрольных сывороток), тестировали с каждым антигеном не менее 30 проб сывороток крови, не содержащих специфических антител к выбранным возбудителям заболеваний, но имеющих определенный уровень неспецифической реакции, который в среднем превышал ОП отрицательного контроля.

Статистические характеристики среднего значения оптической плотности для неспецифической реакции вычисляли в виде дисперсии (), на основе которой определяли верхние границы 95% доверительных интервалов. В качестве примера приведены расчеты определения качественной характеристики результатов ИФА для НБ и ИБК. Были использованы результаты выявления специфических антител к вирусу НБ в 109 пробах сывороток крови кур параллельно в двух реакциях - ИФА и РТГА. Среднее значение титра антител для сомнительного результата оказалось равным 1:356 при доверительном интервале для Р=95% от 1:250 до 1:500. Для положительного результата средний титр специфических антител оказался равным 1:470 при доверительном интервале для Р=95% от 1:418 до 1:528. Таким образом, сыворотки с титром антител, равным или выше значения 1:500, считали с достаточной вероятностью положительными, сомнительный результат реакции характеризовали величиной интервала 1:250 - 1:500, меньше или равный 1:250 говорит об отсутствии специфических антител к вирусу НБ.

Для установления позитивно - негативного порога (ПНП) 33 заведомо отрицательных к вирусу ИБК сыворотки крови от СПФ-цыплят исследовали методом последовательных разведений. Среднее значение оптической плотности нормальных сывороток, суммированное с утроенным значением стандартного отклонения, составило для разведения 1:100 0,3298, 1:200 0,244, 1:400 0,1818, 1:800 0,1628, 1:1600 0,1366, 1:3200 0,1225, 1: 0,1174. Оптическая плотность, соответствующая минимальному положительному титру антител к вирусу ИБК, была равна 0,185. Определялось пороговое значение S/P = (0,185 - 0,106) / (0,703 - 0,106) = 0,1323, lg S/P = -0,8783. По формуле был найден наименьший положительный титр= 362. С учетом возможных погрешностей, допустимых в пределах одного разведения, где T/ T T 2, выделялась сомнительная зона. Таким образом, титр антител до 361 считался отрицательным, 362 724 сомнительным, от 725 и выше положительным. Вычисленные таким образом значения титров представлены в табл.4.

Значения титров, соотвествующие отрицательным, сомнительным и положительным результатам ИФА № Название воз- Отрицательный Сомнительный ре- Положительный 2.2.3. Установление корреляции между результатами, полученными с применением разработанных тест-систем, серологических тестов и коммерческих наборов на основе ИФА Важнейшим показателем качества диагностических тест-систем являются результаты их применения для анализа проб сывороток крови при сравнении с лучшими импортными аналогами, т.е. с диагностическими тестсистемами фирм, продукция которых имеет давнюю и устойчивую репутацию на мировом рынке. С этой целью мы сравнивали диагностические возможности разработанных тест-систем и коммерческих наборов фирмы Synbiotics (KPL, США).

График зависимости между десятичным логарифмом титра, определенного с использованием разработанной тест- системы ИФА для НБ, и десятичным логарифмом титров, определенных с помощью коммерческого набора фирмы «Synbiotics» (KPL), представлен на рис. 2. Коэффициент корреляции между значениями титров антител, определённых в обеих иммуноферментных тест-системах, составил 0.84.

На основе данных, полученных с использованием разработанной тестсистемы ИФА и коммерческого набора KPL, были рассчитаны относительная чувствительность (ОЧ) и специфичность (ОС) по отношению к базовой реакции РТГА. Было исследовано 170 заведомо положительных и 76 отрицательных сывороток по результатам РТГА.

Рис.2. График зависимости значений титров (lg Т), полученных с применением разработанного набора и набора KPL при исследовании сывороток крови кур, вакцинированных против НБ Представленные в табл.5. данные показывают, что разработанная тестсистема ИФА не уступала по чувствительности и специфичности коммерческому набору Synbiotics (KPL).

Результаты ИФА для вычисления относительной чувствительности и хар-ка

ВНИИЗЖ ВНИИЗЖ ВНИИЗЖ

KPL KPL KPL

Примечание: А - «сомнительные» титры ИФА (1:250-1:500) отнесены в группу отрицательных; Б – результаты ИФА по отношению к результатам РТГА.

ОЧ (тест-система ВНИИЗЖ)=151/170100%=89%;

ОС (тест-система ВНИИЗЖ)=71/76100%=93% ОЧ (тест-система KPL)=148/170100%=87%;

ОС (тест-система KPL)=71/76100%=93% 59 проб гетерологичных сывороток, референтных сывороток против ГП разных подтипов, сывороток после однократной вакцинации против ГП подтипа Н5 были протестированы с применением набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц фирмы Synbiotics. Относительная чувствительность тест-системы с использованием антигена вируса ГП подтипа Н5N1 составила 100 %, относительная специфичность – 79 %. Диагностическая чувствительность составила 93 %, диагностическая специфичность – 95 %. Результаты, полученные с использованием разработанной тест- системы и коммерческого, совпадали по качественным характеристикам на 93 %.

Коэффициент корреляции 0.933 (р0,05) характеризовал устойчивую взаимосвязь между тест-системой ИББ и набором Synbiotics.

Относительная чувствительность и относительная специфичность разработанной тест-системы РВП по отношению к набору фирмы «Synbiotics»

составила: для сывороток крови от непривитой птицы: 95,4% и 94,7%; для сывороток крови вакцинированной против РВП кур - 98,3% и 94,1%, соответственно.

С применением тест-системы для выявления антител к вирусу ИБК и набора фирмы Synbiotics было протестировано 518 полевых сывороток. Корреляция между результатами составила 91%.

После параллельного тестирования с использованием двух наборов проб полевых сывороток чувствительность по отношению к наборам фирмы Synbiotics составила для тест-систем M.gallisepticum - 98%, M.synoviae - 96%;

специфичность была 97% и 90%, соответственно.

В опытах было протестировано 400 полевых сывороток крови кур на наличие антител к вирусу ИЭП. Было установлено, что чувствительность разработанной тест-системы по отношению к набору фирмы Synbiotics составила 91%, а специфичность - 94%. Таким образом, корреляция между результатами составила 96%.

Статистический анализ результатов выявления антител к вирусу ССЯв ИФА и РТГА показал наличие парной корреляции (R=0,863), причем специфичность ИФА была 1,0 (30/30), и, соответственно, чувствительность 1,0 (80/80) или 0,9 (72/80) и 0,93 (102/110), в зависимости от того, были ли сомнительные результаты сгруппированы с положительными или с отрицательными результатами.

2.2.4. Разработка программного обеспечения «СИНКО-ИФА» для учета, обработки и хранения результатов ИФА в ветеринарии Программа "СИНКО ИФА" по болезням птиц представляет собой модульную программную систему, созданную на языке програмирования Visual Basic версии 3.0. Программа позволяет считывать с ридера или вводить с клавиатуры данные по оптической плотности, указывать расположение испытуемых и контрольных проб на планшете, рассчитывать по формулам, предложенным разработчиком набора, значения титров или других показателей, принятых для характеристики исследуемых материалов, сохранять как первичные (оптические плотности), так и обработанные (значения титров) данные.

В 2000 г. программа «СИНКО-ИФА» была зарегистрирована в Российском агенстве по патентам и товарным знакам и получено соотвествующее свидетельство. Текущая рабочая версия 2.1C работает в операционной среде Windows 3.X и Windows 9X, позволяет непосредственно из программы подключаться к различным базам данных и сохраняет подключение к последней базе данных по желанию пользователя. Предусмотрен поиск в базе результатов теста по дате анализа, исполнителю, хозяйству, производителю наборов, болезням, возрасту птиц. По мере появления новых моделей спектрофотометров-ридеров составляются коммуникационные модули для новых приборов. В настоящее время программа совместима с четырнадцатью моделями спектрофотометров-ридеров отечественного и зарубежного производства и предусматривает возможность работы с наборами зарубежных (IDEXX, Synbiotics, Guildhay, BioChek) и отечественных (ФГУ «ВНИИЗЖ») производителей, в которых используется непрямой вариант постановки реакции при тестировании проб в одном рабочем разведении.

2.2.5. Практическое использование разработанных тест-систем на основе непрямого варианта ИФА В целях испытания разработанных тест-систем исследовали пробы сывороток крови кур, направленные для анализа в ФГУ «ВНИИЗЖ» из птицеводческих хозяйств России в период 1998-2008 гг. с сопроводительными документами, где были указаны сведения об эпизоотической обстановке в хозяйстве и о мероприятиях по специфической профилактике инфекционных болезней птиц. Наборы использовались для определения уровня гуморальных антител в экспериментальных условиях, при оценке иммунного статуса поголовья кур на птицефабриках, в частности, при контроле материнского иммунитета у цыплят в первые недели жизни, поствакцинального и постинфекционного иммунитета. За 1998-2008 гг. были исследованы пробы сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств России и других стран СНГ.

2.2.5.1. Определение уровня трансовариального иммунитета у цыплят разных пород Исследование уровня пассивного иммунитета при разных болезнях является важным для корректировки сроков первой вакцинации живой вакциной, особенно при ИББ. Тестировали сыворотки крови цыплят в возрасте от до 20 дней, полученных от кур яичных и мясных пород, вакцинированных против ИББ. Для каждой породы, с интервалом в 1 день в 3-6 образцах сывороток определяли значения титров антител. Средний показатель титра сывороточных антител на первый день жизни цыплят мясной породы составил 1:3890, у цыплят яичной породы - 1:5702. На 20 день средние значения титров составили 1:80 у мясных пород и 1:356 у яичных. Были определены коэффициенты корреляции между значениями титров и возраста у цыплят мясных пород (r=0,928, p0,01) и яичных пород (r=0,954, p0,01). При известном значении исходного титра на основании регрессионного коэффициента, установленного для данной породы, уровень гуморального иммунитета у цыплят может быть достаточно надежно предсказан в период между 2-3 и 18-20 сутками. Падение уровня материнских антител против вируса ИБК наблюдали при анализе проб сывороток крови цыплят в возрасте 1, 7, 14, 18, 21 суток одного и того же птичника на четырех птицефабриках. В результате была выявлена общая закономерность в динамике снижения уровня антител к вирусу ИБК у цыплят в разные периоды жизни, который к 21 дню был ниже минимального положительного значения (Т 1:700).

Результаты показали, что уровень трансовариального иммунитета варьирует в зависимости от породы цыплят, вакцин, применяемых для иммунизации несушек, графика вакцинации. Показатели материнского иммунитета имеют большое практическое значение, поскольку позволяют рационально планировать сроки вакцинации.

2.2.5.2. Изучение динамики уровня антител в разные сроки после иммунизации живыми и инактивированными вакцинами Использование разработанных тест-систем для контроля гуморального иммунитета позволило наблюдать динамику роста иммунного ответа, судить об эффективности проведенной вакцинации.

Например, цыплят кросса “Родонит” в возрасте 22 дней, не имеющих антител к вирусу ИББ, прививали сухой вирус-вакциной против ИББ из штамма “БГ” в дозе 1000 ЭИД50. В период c 6 по 12 день после иммунизации происходило резкое увеличение средней концентрации антител до 1:4800.

Далее наблюдалось снижение интенсивности прироста иммунного ответа и тенденция к стабилизации средних значений титров. На 18-й день средний титр составил 1:6252. Следует отметить, что динамика роста титров сопровождалась уменьшением величины вариации индивидуальных иммунных ответов в группах вакцинированной птицы (коэффициент вариации убывал от 37% с 6-го дня до 10% в среднем для периода с 12-го по 20-й день).

Для однократной иммунизации вакциной против НБ шт. Ла-Сота с масляным адъювантом в дозе 0,5 см3 внутримышечно были сформированы группы цыплят в возрасте 50 дней, не имеющих специфических антител к вирусу НБ. Кровь отбирали на 7,10,14,21,24,28,31,45 и 52 дни опыта. Для изучения корреляции между результатами выявления антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА значения титров антител были переведены в десятичные логарифмы и подвергнуты регрессионному анализу.

титр(lg) Рис.3. Выявление антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА после однократной иммунизации цыплят живой вакциной шт. Ла-Сота. (положительные результаты: ИФА- 2,4 lg, РТГА- 1,0 lg) Как видно из данных, представленных на рис.3, уровень антител на 7 сутки достигал в ИФА и РТГА положительных значений. Пик выработки антител наблюдался в ИФА на 21 сутки и на 14 сутки в РТГА. Титр антител на конец периода наблюдения (52 суток) составил в ИФА- 1:3471, в РТГА – около 3,0 lg (10 log2), коэффициент корреляции между результатами тестов был 0,94.

При вакцинации птицы инактивированным препаратом наибольший титр специфических антител был выявлен в те же дни, что и при иммунизации цыплят живой вакциной. Титр антител в день завершения опыта (на сутки) составил в ИФА 1:4071, в РТГА 9,37 log2. В результате проведённого контрольного заражения было установлено, что на 52 день опыта цыплята, привитые вакцинами, имели 100% защиту от инфекции.

Продолжительность иммунитета после двукратной прививки живой вакциной против ИБК изучали, используя группу птиц из одного птичника на птицефабрике в течение 248 дней. Птиц вакцинировали в суточном возрасте спреем и на 30-й день-выпойкой. Сыворотки крови исследовали на 1, 7, 71, 99, 113 и 248 сутки. На 71-е сутки цыплята имели уровень антител с Т = 1:6712, на 99 день титр антител был равен 1:10002. На 113 день наблюдали снижение уровня антител (Т = 1:7339), а на 248 день он достиг порогового значения титра (Т = 1:666).

Для иммунизации инактивированной вакциной против ГП использовали 60 суточных цыплят без антител к вирусу гриппа птиц. Средние титры приведены по результатам исследования сывороток крови цыплят, иммунизированных вакцинами 17 серий.

Как представлено на рис.4, уже на 13 день после вакцинации средний титр антител был положительным и составил 1:1818 ± 386. На 28 день после иммунизации средний титр был 1:5354 ± 405. В течение последующих месяцев наблюдали постепенное снижение уровня антител, и через 6 месяцев после иммунизации средний титр составил 1:2659 ± 436.

Средний титр в ИФА Рис.4. Выявление антител в ИФА и РТГА к вирусу гриппа у цыплят, привитых вакциной против ГП подтипа Н5N В качестве подтверждающего теста использовали РТГА. При исследовании сывороток крови, полученных на 13 сутки после иммунизации, средний титр антител в РТГА к вирусу ГП подтипа Н5 составил 4,8 ± 1,54 log2.

Максимальную величину среднего титра, равную 7,9 ± 1,76 log2,также наблюдали через 28 суток после вакцинации. Через 6 месяцев средний титр составлял 5,1 ± 1,37 log2. Результаты, полученные в РТГА и ИФА, коррелировали друг с другом.

Для характеристики иммунного фона к M.gallisepticum и M.synoviae у невакцинированной птицы в ИФА были исследованы пробы сывороток крови кур, присланные в 1996-2003 гг. из 291 птицефабрики 56 областей РФ, относящихся к 7 регионам, а также из 26 предприятий Украины и Белоруссии.

Были обработаны данные исследований в ИФА 31650 полевых сывороток крови кур на присутствие антител к M.gallisepticum и 22696 – M.synoviae.

Часть этих сывороток была исследована одновременно на наличие антител к обоим возбудителям. Для исследования динамики изменения уровня антител в течение жизни все поступающие пробы из разных птицехозяйств были разделены по возрастным группам: 1-5, 6-10, 11-20, 21-30, 31-60, 61-90, 91-120, 121-150, 151-200, 201-300, 301-400, 401 и более дней. На основании полученных результатов были построены графики, которые подтвердили, что к трехнедельному возрасту у цыплят полностью исчезают материнские антитела к M.gallisepticum и M.synoviae, уровень которых в суточном возрасте был максимальным, до пятинедельного возраста антитела отсутствовали, затем начинался их постепенный прирост к 90 дням, при этом заболевание протекало зачастую субклинически. Однако любой стресс, ведущий к снижению иммунитета, может изменить ситуацию по данным заболеваниям.

Таким образом, определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансовариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин, оценке иммунного фона у птицепоголовья в промышленном птицеводстве.

2.2.6. Создание коммерческих наборов на основе разработанных тест-систем Проведенные исследования по разработке и испытанию иммуноферментных тест-систем на основе непрямого варианта ИФА явились основанием для создания коммерческих наборов для выявления в ИФА антител к возбудителям инфекционных болезней птиц. Производство наборов для ИФА представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, химических и биологических процессов, включающих разнотипное оборудование и образующих единую технологическую линию (рис.8).

2.2.6.1. Разработка технологии и организация производства коммерческих наборов и контроль качества с внедрением автоматизированных роботизированных устройств В настоящее время в ФГУ «ВНИИЗЖ» выпускается свыше 20 наименований коммерческих наборов для серологической диагностики наиболее значимых для промышленного птицеводства болезней. Ключевым моментом при изготовлении наборов на основе непрямого варианта ИФА является подготовка сенсибилизированных антигенами планшетов, поскольку состояние иммобилизованных на планшетах антигенов непосредственно влияет на результативность теста.

Был проведен сравнительный анализ технических характеристик приборов и устройств ведущих фирм-производителей оборудования. Автоматизированный комплекс в виде раскапывающей рабочей станции вместе с другими периферическими устройствами фирмы «Tecan» (Австрия) интегрировали в технологический цикл производства коммерческих наборов ФГУ «ВНИИЗЖ» (рис.5). При этом для проведения и контроля различных этапов сенсибилизации планшетов было разработано программное обеспечение. Было проведено испытание точности внесения разных объемов растворов в лунки трех планшетов. Сравнение теоретической и реальной массы выбранных объемов показало, что их совпадение составило: для 15 мкл — 96,83 %, 50 мкл — 98,36 % и 100 мкл — 99,35 %., т.е. чем объем был меньше, тем ниже была точность их внесения в лунки. Коэффициент вариации между наконечниками был очень низким (0,29%), что подтверждало высокую точность модуля.

Рис. 5. Стадии основного технологического процесса при изготовлении диагностических наборов В результате для приготовления планшетов серии наборов одного наименования (в среднем 100 наборов из 200 планшетов) требовалось, в общей сложности, в 3-4 раза меньше времени и трудозатрат по сравнению с «ручным» способом. Для проверки иммуноспецифических компонентов готовых серий наборов на активность и специфичность с панелью контрольных сывороток использовали раскапывающую станцию Freedom EVO 150-8. Эксперименты показали, что роботизация отдельных стадий ИФА значительно увеличивает скорость, точность, качество и вопроизводимость результатов теста.

При внедрении роботов на стадии отбора проб, перемешивания, приготовления рабочего разведения, переноса на планшет с антигеном, отмывки, внесения других компонентов реакции производительность повышалась в раза.

2.2.6.2. Проведение оценки качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в международных сравнительных испытаниях, организованных референтными лабораториями Лаборатория R&D GD (Dutch Animal Health Service, Deventer, Нидерланды) официально аккредитована в соответствии с международными требованиями ILAC-G13:2007 для проведения международных сравнительных испытаний (МСИ) по болезням птиц.

Начиная с 2006 года, ФГУ «ВНИИЗЖ» (единственный в Российской Федерации) участвовал в испытаниях, проводимых GD лабораторией по выявлению антител к возбудителям НБ, ГП, ИББ, ИБК, МГ, МС в зашифрованных пробах сывороток крови кур. Помимо основной задачи - оценки возможностей отечественных коммерческих иммуноферментных наборов при диагностике болезней птиц, определяются пути решения вопросов, связанных с улучшением их качества. В испытаниях принимали участие от 48 лабораторий (в МСИ по ИБК) до 60 лабораторий (в МСИ по НБ) из более чем 30 стран Африки, Азии, Центральной Америки, Европы. Следует отметить, что практически все лаборатории, включая ФГУ «ВНИИЗЖ», правильно определяли статус сывороток от СПФ-кур во всех МСИ, показывая высокую специфичность используемых диагностических наборов. С применением коммерческих наборов, созданных на основе разработанных тест-систем, выявлялось от 75% (в МСИ по ИБК) до 87,5 % (в МСИ по МС) проб сывороток с разным уровнем специфических антител. В ходе международных сравнительных испытаний было выявлено, что, в основном, затруднения возникали при определении статуса сывороток крови, отобранных на ранних сроках (7 суток) после иммунизации живыми вакцинами. Судя по отчетам, присылаемым лабораторией-организатором, такие же проблемы, в большей или меньшей степени, испытывали участники, работавшие с наборами других производителей (IDEXX, Synbiotics, BioChek).

Таким образом, результаты проведенного внешнего контроля по оценке качества исследований показали, что наборы производства ФГУ «ВНИИЗЖ» дают достоверные результаты при проведении диагностических исследований.

2.2.7. Внедрение системы комплексной серологической диагностики болезней кур на основе ИФА в промышленное птицеводство Перед нами стояла цель создать комплексную систему серологического мониторинга при определении иммунного статуса птицы и внедрить ее в лаборатории птицеводческих хозяйств. Для опытно-промышленного производства коммерческих наборов была подготовлена научно-техническая документация и регламенты. В настоящее время Россельхознадзором утверждены СТО и технический регламент на изготовление свыше 20 диагностических наборов, что позволило наладить их серийное производство.

В течение нескольких лет проводили тестирование существующих на рынке спектрофотометров-ридеров, отмывочных устройств, автоматических дозаторов и расходных материалов как отечественного, так и зарубежного производства, что позволило выбрать оптимальную конфигурацию формирования комплектов для постановки ИФА в условиях птицеводческих ветеринарных лабораторий.

В течение 14 лет (1995-2009 гг.) было укомплектовано оборудованием для ИФА свыше диагностических лабораторий научноисследовательских учреждений, диагностических центров, республиканских, краевых, областных ветеринарных лабораторий, а также птицефабрик России, Р. Беларусь, Украины, Молдовы, Узбекистана, Грузии, Казахстана и Армении (рис.6).

Внедрение системы комплексной серологической диагностики на основе автоматизированного иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) позволяет птицеводческим предприятиям отслеживать эпизоотическую ситуацию по наиболее опасным болезням, оценивать напряженность поствакцинального иммунитета, оптимизировать схемы вакцинации, что в конечном счете дает возможность повысить сохранность птицепоголовья.

Рис.6. Регионы России и стран СНГ, где установлены комплекты оборудования и программное обеспечение «СИНКО-ИФА»

1. Создана система комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней кур в промышленном птицеводстве с применением иммуноферментных тест-систем и компьютерного обеспечения для получения, обработки, учета и хранения данных.

2. Усовершенствованы методики очистки и концентрирования антигенов НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем, определены условия получения под контролем электронной микроскопии и электрофореза вирусных белков, при которых выход очищенных препаратов антигенов составлял 1- мг/см3.

3. Отработаны схемы иммунизации кур для получения контрольных положительных сывороток с активностью препаратов не менее 1:3200, определены допустимые значения оптических плотностей контрольных сывороток при постановке реакции в одном разведении, находящиеся в диапазоне 0,4для положительных контролей и 0,04-0,160 для отрицательных сывороток.

4. Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления и количественного определения уровня специфических антител к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении: определены оптимальные концентрации (для антигенов, конъюгата) и условия взаимодействия компонентов реакции;

выбрано рабочее разведение тестируемых сывороток (1:400), установлены критерии качественной и количественной оценки результатов, выведены уравнения линейной регрессии и определены коэффициенты для формулы расчета числового значения титра по одному разведению испытуемых сывороток.

5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных при исследовании свыше 3000 проб сывороток с помощью разработанных тест-систем ИФА, базовой реакции РТГА и коммерческих наборов производства фирмы Synbiotics (KPL, США), зарегистрированных на территории РФ. Корреляция составила от 84% до 96 %, относительная чувствительность – от 89% до 98 % и относительная специфичность – от 79% до 94%.

6. За период с 1998 по 2008 гг. разработанные тест-системы проверены при исследовании проб сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ для оценки иммунного статуса поголовья при контроле трансовариального, поствакцинального иммунитета против возбудителей экономически значимых болезней кур в промышленном птицеводстве.

7. На основе разработанных иммуноферментных тест-систем для выявления и количественного определения уровня антител к возбудителям выбранных болезней птиц в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении разработана и утверждена Россельхознадзором научнотехническая документация и регламенты для опытно-промышленного производства 16 наименований коммерческих наборов в двух вариантах: для визуальной детекции ( на 40 проб) и инструментального учета ( на 180 проб).

8. Создана и зарегистрирована в Российском агенстве по патентам и товарным знакам универсальная компьютерная программа «СИНКО-ИФА» для сбора, анализа и хранения результатов ИФА с учетом возможности работы с иммуноферментными наборами, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ» и зарубежных фирм-производителей.

9. Разработана технология, организовано опытно-промышленное производство и оптимизирован контроль качества 16 коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств.

10. Проведена оценка качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в 8 международных сравнительных испытаниях, проводимых аккредитованной референтной лабораторией (Голландия) и установлено, что статус зашифрованных проб определяется не менее чем в 75 %.

11. В ветеринарных лабораториях и на птицефабриках РФ внедрена комплексная система серологической диагностики, основанная на постоянном мониторинге иммунного статуса птицы разного возраста, с использованием наборов для ИФА, комплекта стандартизированного оборудования для постановки реакции и компьютерной программы для обработки и хранения полученных результатов анализа. В РФ и странах СНГ установлено и используется свыше 100 комплектов оборудования с универсальной компьютерной программой.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: “Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом” (1998 г.) и “Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций” (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.

Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные документы по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных Россельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу ньюкаслской болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0054-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0043-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 00495527от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0042-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0057-2006 от 29.12.2006) и при тестировании в одном разведении (СТО 00495527-0044-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0045от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-133-00495527-2005 от 15.02.2006); наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0056-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0041-2006 от 27.06.2007); наборы для определения антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0038-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-117-00495527-2005 от 30.05.2006); наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза (Mycoplasma gallisepticum) иммуноферментным методом (СТО 00495527-0109-2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0111-2009 от 31.03.2009); набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0034-2006 от 29.12.2006);

набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527от 09.12.2008).

На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология производства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с применением автоматизированных роботизированных устройств. В течение с 1997 по 2009 г.г. было произведено около 21000 наборов для визуальной детекции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ 1. Мудрак Н.С., Дрыгин В.В. Создание иммуноферментных тестсистем для серологической диагностики в птицеводстве с применением компьютерной программы для учета, обработки и хранения результатов анализа // Ветеринарная патология. – 2006. – № 4 (19). – С. 165-168.

2. Мудрак Н.С. Применение роботизированных автоматических устройств в производстве диагностикумов и при проведении ИФА // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – 2008. - Сент. – С. 74-78.

3. Мудрак Н.С. Разработка и внедрение комплексной системы серологической диагностики болезней птиц в ИФА с компьютерным обеспечением // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – 2008. – Сент. – С. 78-80.

4. Иммунитет у кур, привитых инактивированной ассоциированной вакциной / В.Н. Ирза, В.В. Борисов, A.В. Борисов, С.К. Старов, О.А. Борисова, Н.С. Мудрак, Н.П. Курлова, А.Б. Сарбасов, Г.И. Кожаева // Ветеринария.

– 2002. – № 4. – С. 21-23.

5. Серологический мониторинг птицехозяйств Российской Федерации по ареовирусной инфекции и синовиальному микоплазмозу / А.И. Куприянов, И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В. Шкиря, В.Н. Ирза, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Аграрная Россия. – 2002. – № 2. – С. 20-24.

6. Комплексное использование серологических методов для обнаружения антител к вирусу гриппа птиц Н5 в сыворотках крови диких и домашних птиц / Н.Н. Луговская, М.А. Циванюк, С.В. Фролов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. – 2006. – №4 (19). – С. 58-62.

7. Формирование гуморального иммунитета к вирусу инфекционного энцефаломиелита у цыплят, вакцинированных живой вакциной из штамма «CALNEK 1143M» / А.Э. Меньщикова, А.Н. Колотилов, Н.В. Беляева, В.Н.

Ирза, В.Н. Решетникова, Н.С. Мудрак // Ветеринарная патология. – 2006. – № 4 (19). – С. 137-139.

8. Определение генотипа и степени патогенности изолята вируса инфекционного бронхита / О.Н. Чупина, Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.И. Диев, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. – 2007. – № 4 (23). – С. 121-126.

9. Разработка конкурентного варианта ИФА для выявления антител к вирусу гриппа подтипа Н5 у различных видов птиц / М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик // Ветеринарная патология. С. 126-132.

10. Непрямой вариант ИФА для выявления и количественного определения антител к вирусу гриппа птиц при тестировании проб в одном разведении / М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 132-137.

11. Оценка иммунобиологических свойств изолятов Mycoplasma gallisepticum с использованием трахеальных органных культур / И.А. Рунина, О.Н.

Чупина, М.И. Сорокина, Д.Б. Андрейчук, А.В. Спрыгин, Н.С. Мудрак, В.В.

Дрыгин, В.Н. Ирза // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 171-174.

12. Получение специфических антисывороток и антигенов вируса болезни Марека для иммуноферментного анализа / М. А. Волкова, М. И. Шульпин, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Ш.К. Куляшбекова // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2008. - Сент. - С. 69-72.

13. Случай выделения вируса гриппа А подтипа H4N6 в популяциях синантропных птиц в Российской Федерации / И.А. Чвала, А.В. Андриясов, Н.С. Мудрак, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Л. Ю. Абрамова // Ветеринария. С. 19- 14. Особенности течения гриппа А у уток-крякв, вызванного A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 / И.А. Чвала, Л.О. Щербакова, М.И. Шульпин, Ю.Ю. Бабин, А.В. Варкентин, М.Ю. Щелканов, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Л.Ю. Абрамова, Н.А. Власов // Ветеринария. - 2009. - № 10. - С. 25-26.

15. Detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus by a recombinant nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay / N.N. Lougovskaia, A.V. Scherbakov, A.S. Yakovleva, M.A. Tsyvanyuk, N.S. Mudrak, V.V. Drygin A.V. Borisov // J. Virology Methods. – 2006. – Vol. 135. – P. 292Detection and estimation of avian infetious bronchitis virus antigen by a novel indirect liquid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay using chicken and rabbit affinity purified immunoglobulins / N.N. Lougovskaia, A.A.

Lougovskoi, Y.A. Bochkov, G.V. Batchenko, N. S. Mudrak, V.V. Drygin, A.V.

Borisov, V.V. Borisov // Avian Pathology. – 2002. – Vol. 31, № 6. – P. 549-557.

17. Облучатель рециркулятор ОРУБ-01»КРОНТ» для обеззараживания воздуха в лабораториях ветеринарного профиля / А.В. Спрыгин, И.А. Рунина, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Ветеринария. – 2006. – № 9. – С. 36-37.

18. Оценка иммунного ответа у цыплят, привитых мукозальными вакцинами против ньюкаслской болезни / М.А. Волкова, А.В. Ирза, И.А. Рунина, С.В. Фролов, М.Е. Качалова, И.А. Чвала, Е.И. Чубукова, Н.С. Мудрак, В.В.

Борисов, В.В. Дрыгин // Ветеринария. – 2009. – № 10. – С. 20-25.

19. Genetic diversity of Mycoplasma gallisepticum field isolates using partial sequencing of the pvpA gene fragment in Russia / A.V. Sprygin, D.B. Andreychuk, N.P. Elatkin, N.G. Zinyakov, S.N. Kolosov, N.S. Mudrak, V.N. Irza, V.V. Drygin, A.V. Borisov, N.A. Perevozchikova // Avian Diseases. - 2010. - Vol. 54. - P. 899Development of a duplex real-time Tag-Man PCR assay with an internal control for the detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in clinical samplex from commercial and backyard poultry / A.V. Sprygin, D.B. Andreychuk, A. N. Kolotilov, M.S. Volkov, I.A. Runina, N.S. Mudrak, A.V. Borisov, V.N. Irza, V.V. Drygin, N.A. Perevozchikova // Avian Pathology. - 2010. - Vol. 39, N 2. - P. 99-109.

21. Выделение аденовирусов 1 группы методом перемежающихся пассажей / С.П. Лазарева, А.В. Ирза, М.И. Шульпин, Б.Л. Манин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 158-162.

22. Непрямой блокирующий вариант иммуноферментного анализа для определения аденовирусов птиц 4 серотипа / М.А. Волкова, В.А. Лобанов, Г.В. Батченко, Н.С. Мудрак, Д.С. Сурнев, В.В. Дрыгин, В.В. Борисов // Ветеринария. – 2003. – № 11. – С. 18-22.

23. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 кур: пат. 2167673 Российская Федерация: МПК7 A61K 39/00 / А.В. Борисов, В.Н. Кузнецов, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, В.В.

Борисов; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл.

04.09.2000; опубл. 27.05.2001, Бюл. № 15.

24. Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни птиц: пат. 2192014 Российская Федерация: МПК7 G01N 33/545 / А.В.

Борисов, В.Н. Кузнецов, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, Т.В. Оковытая; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл. 05.02.2001;

опубл. 27.10.2002, Бюл. № 30.

25. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: пат. 2189042 Российская Федерация: МПК7 G01N 33/545 / А.В. Борисов, В.Н. Кузнецов, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, Н.Н. Луговская, С.В.

Фролов; заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл.

02.03.2001; опубл. 10.09.2002, Бюл. № 25.

26. Программа для регистрации, обработки, хранения результатов иммуноферментного анализа в ветеринарии / А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С.

Мудрак, Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов. – Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2000611338. – М., 2000.

27. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни / Т.В.

Оковытая, К.Ю. Федосеев, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов // Вирусные болезни с.-х. животных: тез.докл. Всерос. научн.-практ. конф.Владимир, 1995. - С. 245.

28. Расчет титра сывороток по одному разведению при иммуноферментной диагностике инфекционного бронхита кур / Н.Н. Луговская, Н.С.

Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с.-х.

животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997. - С. 161.

29. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. – Владимир, 1997. – С. 160.

30. Оптимизация метода выделения и очистки вируса болезни Ньюкасла / О.Г. Грибанов, Н.С. Мудрак, И.Я. Курман, Н.Н. Дрягалин // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. – Владимир, 1997. – С. 164.

31. Количественная оценка концентрации антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни в сыворотках крови кур по одному разведению в иммуноферментном тесте / Т.В. Оковытая, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В.

Борисов // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 162-163.

32. Антигенные, иммуногенные и реактогенные свойства живой сухой вакцины против инфекционного бронхита кур / А.В. Борисов, А.А. Гусев, С.В. Фролов, Н.С. Мудрак, Т.В. Хлыбова, Т.В. Никитина // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 147-148.

33. Сравнительная оценка ИФА и РЗГА в диагностике синдрома снижения яйценоскости / М.А. Волкова, О.А Борисова, Н.С. Мудрак, Т.И.Назарова, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с.х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997. - С. 158.

34. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур методом одного разведения / М.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В.Борисов, В.В.Дрыгин // Современные аспекты ветеринарной патологии животных: материалы конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ. – Владимир, 1998. – С. 224-235.

35. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ у цыплят, полученных от непривитых и вакцинированных кур / С.А. Гусев, Т.В.

Оковытая, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, К.Ю. Федосеев, З.Я. Михалишина, М.В. Гирин, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин // Современные аспекты ветеринарной патологии животных: материалы конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ. - Владимир, 1998. - С. 192-196.

36. Расчёт титра антител в сыворотках крови кур при тестировании в одном разведении для иммуноферментной диагностики ССЯ-76 / М.А. Волкова, Н.С. Мудрак, О.А. Борисова, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Производство и контроль мед., ветеринарных препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ: тез. докл. конф., посвящ. 30-летию ПЗБ. - Вольгинский, 1999. - С. 83.

37. Изучение антигенной активности ассоциированной инактивированной вакцины против ССЯ-76, ИБ и ИББ у кур / О.А. Борисова, В.В. Борисов, Н.С. Мудрак, С.А. Гусев, А.В. Борисов, З.Я. Михалишина // Производство и контроль мед., ветеринарых препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ: тез.докл. конф., посвящ. 30-летию ПЗБ. - Вольгинский, 1999. С. 53.

38. Получение антигена реовирусной инфекции птиц для постановки непрямого варианта ИФА / А.И. Куприянов, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак, Г.М. Фалина, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Актуальные проблемы патологии с.-х. животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Минск, 2000. - С.

131-132.

39. Разработка непрямого варианта ИФА для количественного определения антител к возбудителю ареовирусной инфекции в сыворотках крови кур методом одного разведения / А.И. Куприянов, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 173-179.

40. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, С.В. Фролов, А.В. Борисов, В.В. Борисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых).

- Владимир, 2000. - С. 140-144.

41. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления и количественной оценки антител к вирусу ньюкаслской болезни методом одного разведения / Т.Б.Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин, М.И. Маркина // Достижения молодых ученых - в ветеринарую практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 165-170.

42. Применение набора по определению антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении для контроля материнского иммунитета и поствакцинального иммунитета / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 150-155.

43. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: специфичность, чувствительность, воспроизводимость результатов, стабильность антигена при хранении / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 145-150.

44. Компьютерная программа «Иммуноферментный анализ» / Ю.В.

Зинковский, С.Н. Колосов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых).

- Владимир, 2000. - С. 197-198.

45. Выбор оптимальных условий очистки антигена возбудителя респираторного микоплазмоза птиц для непрямого варианта ИФА / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, М.В. Гирин, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 200-201.

46. Разработка диагностической тест-системы на основе непрямого варианта ИФА и ее применение для эпизоотологического мониторинга реовирусной инфекции птиц / А.И. Куприянов, Н.С. Мудрак, В.И. Шкиря, С.К.

Старов, В.В. Дрыгин // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства:

материалы Междунар. науч.-произв. конф. – Алматы, 2000. – С. 124-126.

47. Применение иммуноферментной тест-системы для выявления и оценки антител к вирусу ньюкаслской болезни для контроля напряженности поствакцинального иммунитета / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. – Алматы, 2000. – С. 144-146.

48. Контроль иммунного статуса поголовья кур на птицефабриках с применением иммуноферментного набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В.

Борисов // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. – Алматы, 2000. – С. 137-138.

49. Изучение основных характеристик иммуноферментного набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, С.В. Фролов, А.В. Борисов // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф.

– Алматы, 2000. – С. 141-142.

50. Определение напряженности иммунитета против ньюкаслской болезни с помощью непрямого варианта ИФА и РТГА / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзот. и зооантропоноз. болезнями животных: Сб. статей Междунар. науч.-практ. конф. – Покров, 2000. – С. 170-172.

51. Сравнительная оценка РТГА и непрямого варианта ИФА при определении антител к Mycoplasma gallisepticum / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, М.В. Гирин, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Совершенствование методов контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: тез. докл. – М., 2001. – С. 123-124.

52. Разработка тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum при тестировании сывороток в одном разведении / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, М.В. Гирин, А.В. Борисов, В.Н. Ирза // Ученые записки Витебской гос. акад. ветеринарной медицины. – Витебск, 2001. – Т. 37, Ч. 2. – С. 23-24.

53. Применение коммерческих тест-систем на основе РТГА и ИФА для выявления антител и оценки поствакцинального иммунитета к вирусу ньюкаслской болезни / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, Н.Н. Дрягалин, Г.И. Кожаева, Т.Л. Лядская, В.В. Дрыгин // Проблеми зооiнженерii та ветеринарноi медицини: зб. наук. праць «Ветеринарнi науки». – Вип. 7(31).

Материалi 5-го з`iзду паразитоценологiв в Украiни. – Харкiв, 2001. – С. 122Разработка и применение тест-системы на основе непрямого иммуноферментного анализа для определения антител к возбудителю инфекционного синовита в сыворотках крови кур методом одного разведения / И.А.

Волкова, М.С. Волков, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, В.Н. Ирза // Актуальные проблемы инфекц. патологии животных: материалы Междунар. науч. конф., посвящ. 45- летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – Владимир, 2003. – С. 260-265.



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«Кармазина Елена Владимировна ЭКОЛОГО-ЦЕНОТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИТИКА МОХООБРАЗНЫХ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА РУССКИЙ СЕВЕР (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) Специальность: 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре геоботаники Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова доктор...»

«ХЛУДЕНЁВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕФТЕХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ НА ОБЪЕКТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ 03.00.16 — Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Пермь 2007 2 Работа выполнена в Пермском государственном техническом университете Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент, Рябчиков Николай Михайлович Официальные оппоненты : доктор технических наук Швецова-Шиловская...»

«ЗАБРОДИН ИВАН ВИКТОРОВИЧ СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЦЕНОПОПУЛЯЦИЙ СОСНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ (Pinus sylvestris L.) В СМЕШАННЫХ ПОСАДКАХ НАЦИОНАЛЬНОГО ПАРКА МАРИЙ ЧОДРА 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань, 2011 Работа выполнена на кафедре экологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Марийский государственный университет Научный руководитель...»

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«МАМАДЮСУФОВА МЕНУ ГУЛОМАЙДАРОВНА ОСОБЕННОСТИ БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ У ПШЕНИЦЫ И ЕЕ ДИКИХ СОРОДИЧЕЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В РАЗНЫХ ЗОНАХ ТАДЖИКИСТАНА (03.01.04 –биохимия) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Душанбе – 2014 1 Работа выполнена в Институте ботаники, физиологии и генетики растений Академии наук Республики Таджикистан Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Насырова Фируза Юсуфовна Официальные оппоненты :...»

«БАИШЕВА ЭЛЬВИРА ЗАКИРЬЯНОВНА ЭКОЛОГО-ФИТОЦЕНОТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА БРИОКОМПОНЕНТА ЛЕСНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук УФА – 2010 Работа выполнена в Лаборатории геоботаники и охраны растительности Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН Научный консультант Миркин Борис Михайлович доктор биологических наук, профессор Официальные...»

«ЮРЦЕВА АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И АКВАКУЛЬТУРЕ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 1 Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«ШИРОКИХ ПАВЕЛ СЕРГЕЕВИЧ СИНТАКСОНОМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШИРОКОЛИСТВЕННЫХ И ХВОЙНОШИРОКОЛИСТВЕННЫХ ЛЕСОВ КЛАССА QUERCO-FAGETEA В ЮЖНО-УРАЛЬСКОМ РЕГИОНЕ 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2007 Работа выполнена в лаборатории геоботаники и охраны растительности Института биологии Уфимского научного центра Российской академии наук Научный руководитель : кандидат биологических наук, Мартыненко Василий Борисович...»

«СИНЕНКО Николай Николаевич БИОЛОГО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РЕСНИЧНЫХ ИНФУЗОРИЙ НЕКОТОРЫХ ВОДОЕМОВ ЮЖНОЙ ЛЕСОСТЕПИ ОМСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.04 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Омск - 2014 Работа выполнена на кафедре биологии ФГБОУ ВПО Омский государственный педагогический университет. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Лихачев Сергей Федорович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«БОЧАРОВА Екатерина Сергеевна ОСОБЕННОСТИ РАЗМНОЖЕНИЯ AULACTINIA STELLA (VERRILL, 1864) (HEXACORALLIA, ACTINIIDAE) В БЕЛОМ И БАРЕНЦЕВОМ МОРЯХ Специальности 03.02.04 – зоология и 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре зоологии беспозвоночных биологического факультета Московского государственного факультета имени М.В. Ломоносова и в лаборатории популяционной биологии...»

«Марина Ласхишвили Галофильные микроскопические грибы распостраненные в солончаках Грузии 03.00.07.-Микробиология АВТОРЕФЕРАТ Диссертации, представленной на соискание учёной степени кандидата биологических наук Тбилиси 2006 Работа выполнена в Институте Биохимии и Биотехнологии им. С. Дурмишидзе Научные руководители: Гeоргий Квеситадзе, Доктор биологических наук Лали Кутателадзе Кандидат биологических наук Официальные...»

«Пономарева Анастасия Алексеевна ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС ГЕНОВ ОПУХОЛЕВОЙ СУПРЕССИИ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК В КРОВИ ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО 03.02.07 – генетика 14.01.12 – онкология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательском институте онкологии Сибирского отделения РАМН, г. Томск и Федеральном государственном бюджетном...»

«ВАСИЛЬЧЕНКО Алексей Сергеевич ИССЛЕДОВАНИЕ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ РЕАКЦИИ БАКТЕРИЙ НА РАЗЛИЧНЫЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 03.02.03 – микробиология Aвтореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Оренбургский государственный университет на кафедре микробиологии и в Центре коллективного пользования приборным оборудованием Институт микро- и нанотехнологий доктор медицинских...»

«БЕРСЕНЕВА Оксана Андреевна ЭКОЛОГО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НАЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ В РАЙОНЕ ПРЕДПРИЯТИЙ АЛЮМИНИЕВОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ 03.02.08 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ - 2010 Работа выполнена на кафедре физико-химической биологии Иркутского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Саловарова Валентина Петровна Официальные оппоненты : доктор...»

«Ковешников Михаил Иванович Пространственное распределение, сезонная динамика зообентоса и оценка экологического состояния водных объектов бассейна реки Бия Специальность 03.00.16 Экология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул-2009 2 Работа выполнена в лаборатории водной экологии Института водных и экологических проблем СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Яныгина Любовь Васильевна Официальные...»

«ШАДРИНА МАРИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 03.01.07 – Молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН доктор биологических наук, профессор Научный консультант : Петр Андреевич Сломинский Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной...»

«Хутакова Светлана Владимировна ГИДРОМОРФНЫЕ ПОЧВЫ БАЙКАЛЬСКОГО РЕГИОНА Специальность 03.00.27 - почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2007 Работа выполнена на кафедре почвоведения и агрохимии ФГОУ ВПО Бурятская государственная сельскохозяйственная академия имени В.Р. Филиппова Научный руководитель : доктор биологических наук Убугунова Вера Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Бадмаев...»

«Безина Ольга Вячеславовна Экологические особенности распределения наземных моллюсков в разнотипных биоценозах лесостепи Правобережного Поволжья 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов - 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенский государственный педагогический университет имени В.Г. Белинского на кафедре зоологии и экологии Научный...»

«ДЕНИСОВА Ольга Николаевна ОСОБЕННОСТИ МИКРОЭЛЕМЕНТНОГО СОСТАВА РАСТЕНИЙ ПРИДОРОЖНОЙ ЗОНЫ В УСЛОВИЯХ ОСТАТОЧНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ СВИНЦОМ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук КАЗАНЬ–2006 Работа выполнена на кафедре химии ФГОУ ВПО Марийский государственный технический университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Винокурова Раиса Ибрагимовна Официальные оппоненты : доктор химических наук, профессор...»

«Горовцов Андрей Владимирович ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Внуков Валерий Валентинович Официальные оппоненты : Киреева Валерия Васильевна,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.