WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

МОЛЧАНОВА Елена Владимировна

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МУТАНТОВ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ РОДА BURKHOLDERIA

С ИЗМЕНЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ

03.02.03 – микробиология

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Волгоград – 2011

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Меринова Людмила Константиновна доктор биологических наук, доцент Викторов Дмитрий Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна доктор медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Ведущая организация – ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научноисследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится «_» _апреля_2011 г. в «» часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан «_» 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа (Burkholderia mallei) являются известными патогенными видами рода Burkholderia. Их роль в инфекционной заболеваемости человека и некоторых животных рассматривается, главным образом, в связи с существованием эндемичных районов, появлением завозных случаев инфекций, а также потенциальной опасностью преднамеренного использования этих микроорганизмов в качестве агентов биотерроризма [Dance A., 2000; Coenye T., Li-Puma J.J., 2003; Inglis T.J., Rolim D.B., Sousa A.Q., 2006].





В последнее время отмечено повышение интереса к другим, имеющим медицинское значение, филогенетически родственным B. pseudomallei и B. mallei микроорганизмам комплекса Burkholderia cepacia – оппортунистическим патогенам, поражающим больных муковисцидозом и грануломатозом и нередко становящимся причиной развития тяжелого cepacia-синдрома у лиц со сниженным иммунитетом [Holmes A., Govan J., Goldstein R., 1998; Plesa M., Kholti A., Vermis K., et al., 2004].

Как возбудители мелиоидоза и сапа, так и B. cepacia, с некоторыми отличиями, характеризуются высокой природной резистентностью к ингибиторам, в том числе к антибактериальным препаратам, используемым для лечения. Особенности организации геномов обеспечивают патогенным Burkholderia spp. значительные возможности для адаптации в различных неблагоприятных условиях, позволяя им с достаточной легкостью повышать резистентность в процессе лечения и формировать штаммы с множественной лекарственной устойчивостью [Ciss M.F., Dian Y.D., Sow A.I. et al, 1998; Kenny D.J. Russel P., Rogers D. et al, 1999].

Показано, что множественная лекарственная резистентность бактерий обусловлена функционированием различных молекулярных механизмов, таких как модификация мишеней, снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поровых белков наружной мембраны, активный транспорт из клетки антимикробных соединений и т.д. [Li X.Z., Nikaido H., 2004].

Изучение механизмов формирования резистентности является важным направлением в исследованиях биологии представителей рода Burkholderia.

Оно представляет перспективу для решения целого ряда научнопрактических задач, направленных на оценку значения измененной чувствительности штаммов в развитии инфекционного процесса, установление связи резистентности с вирулентными и персистентными свойствами микроорганизма, поиск оптимальных путей преодоления устойчивости к антибактериальным средствам, разработку новых способов лечения и профилактики инфекционных заболеваний и т.д. Одновременно определение молекулярных маркеров, ассоциированных с теми или иными типами резистентности, может занять важное место в эпидемиологическом мониторинге этих патогенов.

Необходимой моделью для оценки особенностей природной резистентности микроорганизмов и изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в ее основе, являются экспериментально полученные штаммы, устойчивые к антибиотикам различных групп. Селекция таких штаммов и их последующее изучение составляли основу настоящей работы.

Цель работы заключалась в изучении основных закономерностей формирования резистентности множественного типа у B. pseudomallei, B. mallei и B. cepacia.

Задачи исследования:

Дать сравнительную характеристику природной чувствительности к антибактериальным препаратам патогенных буркхольдерий и исследовать особенности формирования у них антибиотикорезистентности; получить коллекцию мутантов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia с маркерами резистентности/чувствительности к антибиотикам групп фторхинолонов и цефалоспоринов.





Оценить участие в формировании резистентности механизмов, связанных с проницаемостью наружных мембран (изменение уровня антибиотикоустойчивости в присутствии блокатора мембранных каналов и продукции некоторых внеклеточных ферментов).

Провести сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта у мутантов буркхольдерий с различными фенотипами резистентности к антибиотикам.

Определить вирулентность мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам для экспериментальных животных и разработать метод ее оценки на модели простейших.

Охарактеризовать генетический полиморфизм резистентных мутантов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia с использованием метода RAPD, анализа фрагментов ДНК, гомологичных генам интеграз и изучить изменчивость пориновых генов с помощью ПЦР.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей формирования резистентности к антибиотикам классов фторхинолонов и цефалоспоринов у патогенных филогенетически родственных видов Burkholderia (B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia). Установлено, что направленно селекционированные мутанты (SMR) этих микроорганизмов с маркерами резистентности к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, приобретают фенотип множественной устойчивости к препаратам других классов высокого уровня.

Оформлен патент на изобретение «Инсерционный мутант Burkholderia pseudomallei KM31 – модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий» (заявка №2009141036 от 5 ноября 2009 г., положительное решение о выдаче патента от 13 октября 2010 г.).

На основании изучения устойчивости к антибиотикам в присутствии блокатора мембранных каналов – верапамила и секреции внеклеточных ферментов дана предварительная оценка возможных механизмов формирования множественной резистентности, связанных с процессами проницаемости клеточных мембран.

У мутантов всех трех видов Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам проведен сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта и секреции и обнаружены различия в профилях белков наружных мембран, варьирующие при изменении резистентности к ингибиторам.

Для определения вирулентности мутантных штаммов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia в качестве альтернативной модели впервые предложен вид простейших Paramecium caudatum и осуществлено моделирование локального инфекционного процесса (феномен Штрауса), вызываемого B. cepacia, на золотистых хомячках. Установлено, что развитие исследуемых типов резистентности или повышенной чувствительности приводит к снижению вирулентности мутантов для данных моделей.

Впервые изучен генетический полиморфизм мутантов патогенных видов Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием метода RAPD и проведен анализ изменчивости пориновых генов методом ПЦР. Показано, что штаммы B. pseudomallei, резистентные к пефлоксацину, офлоксацину, цефтазидиму (SMR), образовывали две группы сходства, отдельные от групп, объединяющих транспозонные мутанты (TTM) этого вида, чувствительные к антибиотикам.

На основании результатов анализа аллельного полиморфизма пориновых генов opcP1/omp39, показавшего модификацию их структуры у SMRштаммов B. mallei и B. cepacia, высказано предположение о возможной роли полифункциональных поринов OpcP1/Omp39 в формировании у патогенных буркхольдерий множественной резистентности. Роль порина ОрсР B. cepacia в развитии резистентности подтверждена комплементацией дефекта по продукции белка при трансформации по признаку устойчивости с выявлением специфического ПЦР-продукта, соответствующего последовательности opcР1/omp39 генов.

Практическая ценность. Получена коллекция мутантов B.pseudomallei, B. mallei, B. cepacia, включающая штаммы как с фенотипом множественной резистентности, так и штаммы с множественной чувствительностью к антибиотикам, предназначенных для изучения молекулярногенетических механизмов резистентности и вирулентности буркхольдерий.

Мутанты B. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR) и B. cepacia 25416 NSP депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского НИПЧИ «Микроб», ГКПБ с присвоенными номерами B. cepacia КМ 197 и B.cepacia КМ 196 соответственно.

Модель простейших (P. caudatum), предложенная для ускоренного определения вирулентности, и мутантные штаммы используются в работе профильных лабораторий ВолгоградНИПЧИ при изучении вирулентности и способности к персистированию патогенных буркхольдерий.

Материалы диссертационной работы вошли в раздел методических указаний МУК 4.2.2495-09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам», утвержденных Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 1 апреля 2009 г. (с введением в действие 1 июня 2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полученные методом направленной селекции мутантные SMRштаммы B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia, резистентные к фторхинолонам (пефлоксацину, офлоксацину) и цефалоспоринам (цефтазидиму), характеризуются стабильным наследованием приобретенных признаков с развитием перекрестной устойчивости к антибиотикам других классов.

2. Мутанты патогенных буркхольдерий с множественной устойчивостью к антибиотикам отличаются измененной проницаемостью клеточных мембран, что фенотипически проявляется в снижении продукции внеклеточных ферментов и изменении резистентности к антибактериальным препаратам при воздействии на клетки верапамила, блокирующего мембранные каналы.

3. У резистентных мутантов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia наблюдается варьирование состава мажорных протеинов наружных мембран с возрастанием экспрессии ряда белков, при этом у мутантов B. cepacia с повышенной чувствительностью происходит снижение продукции протеинов (Mr 21, 27, 71, 110 kDa) и отсутствие экспрессии порина Mr 36 kDa (OpcР1).

4. Развитие у буркхольдерий измененной чувствительности к антибиотикам, приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных (белых мышей, золотистых хомячков) и простейших вида P. caudatum.

5. В развитии резистентности множественного типа у патогенных буркхольдерий принимает участие порин наружной мембраны ОрсР1/Оmp39, что подтверждается наличием модификаций в структуре пориновых генов opcР1/omp39 резистентных штаммов. При трансформации мутантов B. cepacia с повышенной чувствительностью к антибиотикам, дефектных по гену opcР1, наблюдается компенсация признака сниженной резистентности, восстановление геномной последовательности, соответствующей opcР1/omp39 и продукция белка Mr 36 kDa.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (СанктПетербург, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); V Международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007); IX Межгосударственной научнопрактической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств:

проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2008); а также на ежегодных итоговых научных конференциях ВолгоградНИПЧИ (2002-2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 – в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 1 – в зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, иллюстрированных 14 таблицами и 33 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего литературных источника (38 отечественных и 194 иностранных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В работе были использованы штаммы B. pseudomallei, B. mallei и B. cepacia дикого типа различного происхождения, хранящиеся в коллекционном центре культур ВолгоградНИПЧИ. Культуры микроорганизмов инкубировали при 32 °С, 37 °С в течение 24 – 72 ч на плотных и в жидких питательных средах, приготовленных на основе кислотного гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, а также на питательных средах фирмы "Difco", (США) – L, Nutrient, Muller Hinton.

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибактериальных препаратов определяли методом кратных разведений на плотных питательных средах [МУК 4.2.1890 – 04, 2004].

Для получения мутантных штаммов буркхольдерий, обладающих повышенной устойчивостью к антибиотикам пефлоксацину, цефтазидиму, офлоксацину, канамицину и хлорамфениколу, дикие штаммы микроорганизмов пассировали на плотных питательных средах с добавлением антибиотиков в повышающихся концентрациях. Для получения чувствительных мутантов B.cepacia использовали химический мутагенез, воздействуя N-метил-N'нитро-N-нитрозогуанидином (НГ) [Меринова Л.К., Пивень Н.Н., Замараев В.С., 1990]; для получения чувствительных штаммов B. pseudomallei – транспозонный мутагенез [Меринова Л.К., Тимофеева Е.В., Сеимова И.К., 1997].

Ферментативную активность определяли на плотных питательных средах, содержащих необходимые субстраты: раствор "Skim milk", лецитин, "Twin 80" ("Difco", США).

При выделении клеточных мембран использовали методические приемы Hankock, Nikhaido [Hancock R, Nikaido H, 1978]. Для приготовления рабочих растворов применяли реактивы категории "аналитический" ("Serva", Германия и "LKB", Швеция). Определение концентрации белка проводили по методу Bredford [Bredford M.M., 1976] на фотоколориметре (КФК – 2МП, Россия) и спектрофотометре (СФ-46, Россия).

Анализ препаратов белков проводили с помощью оборудования для вертикального электрофореза ("HSI", США). Для приготовления гелей применяли стандартный набор реактивов ''ультрачистый" и ''аналитический", акриламид, метиленбисакриламид, ТЕМЕД, персульфат аммония (PSA), додецилсульфат натрия (SDS), ("Serva", Германия).

Для электрофореза использовали SDS-полиакриламидные гели (10 – 11 % полиакриламид; 0,1 % SDS), приготовленные по методу Laemmli [Laemmli U.K., 1970]. Электрофорез проводили при стабилизированном токе 5 – 8 mА в течение 18 ч или 30 mА в течение 4,5 – 5,0 ч. Для контроля скорости фракционирования в образцы вносили 0,004 % бромфенолового синего ("Serva", Германия). В качестве эталонов молекулярных масс использовали наборы маркерных белков 10 – 78 кDа, ("LKB", Швеция) и 25 – 92,5 кDа, ("Serva", Германия). Для окрашивания белковых фракций использовали спиртово-водные или водные растворы кумасси бриллиантового синего (СВВ), G-250 или R-250, ("Serva", Германия), согласно стандартным методикам [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984].

Выделение хромосомной ДНК производили по методу Маниатис [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984]. Амплификацию исследуемых последовательностей проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНКтехнология, Россия) по программе: начальный прогрев 95 °С 5 мин, реакционных циклов (94 °С 30 с, 57 °С 30 с, 72 °С 60 с), финальная элонгация 72 °С 10 мин. Электрофоретический анализ ПЦР-ампликонов проводили в 1,5 – 2% агарозных гелях, окрашивая ДНК этидиум бромидом.

Для анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP, single strand conformation polymorphism) продукты ПЦР объемом 5 мкл смешивали с равным объемом денатурирующего раствора (95% формамид, 0,05 % бромфеноловый синий, 0,05 % ксиленцианол), инкубировали 2 мин при 94 °С на водяной бане, охлаждали на льду и подвергали электрофорезу в 10 % полиакриламидном геле с 10 % глицерина, термостатируемом при 10 C. Гели окрашивали нитратом серебра [Bassam B.J., Caetano-Annoles G., Gresshoff P.M., 1991] и анализировали характер миграции одноцепочечных и двухцепочечных фрагментов ДНК в образцах (SSCPпрофиль).

Для амплификации полиморфных регионов геномной ДНК буркхольдерий использовали рекомендованный Leelayuwat 10-членный праймер 5’GTTTCGCTCC-3’ [Leelayuwat C., Romphruk A., Lulitanond A. et al., 2000].

Амплификацию участков хромосом, гомологичных последовательностям генов интеграз/транспозаз, проводили с праймерами 5’CCTCCCGCACGATGATC-3’ и 5’-TCCACGCATCGTCAGGC-3’, специфичными фрагменту гена intI1, консервативному у различных грамотрицательных бактерий [Martinez-Freijo P., Fluit A., Schmitz F. et al., 1998; Bennett P.M., 1999]. Электрофорез ДНК проводили в 6 % полиакриламидном геле, которые визуализировали окраской серебром [Bassam B.J., Caetano-Annoles G., Gresshoff P.M., 1991].

Программное обеспечение RFLPscan 3,12 (CSP Inc., USA) и Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA) использовали для обработки ДНК – профилей и кластерного анализа. Группирование матрицы дистанций несоответствия (dd), где dd (x,y) = (число xi yi)/i, проводили с использованием невзвешенного парно-группового метода, UPGMA [Sneath P.H., Sokal R.R., 1973].

Для проведения трансформации компетентность реципиентных чувствительных культур B. cepacia индуцировали, применяя систему СаСl2 и метод замораживания-оттаивания при -40 °С и в жидком азоте [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984].

Вирулентность штаммов буркхольдерий определяли на лабораторных животных – золотистых хомячках и беспородных белых мышах, которых заражали внутрибрюшинно 24-часовыми культурами B. pseudomallei, B.mallei в дозах 1103 – 1104 м.к. и учитывали динамику гибели в группах.

Острую форму инфекции, вызываемую B. cepacia, моделировали с использованием иммунодепрессантов при заражении дозой 5108 м.к.

Фитопатогенность штаммов B. cepacia определяли по методу, описанному Wigley и Burton [Wigley P., Burton N.E., 1999].

Для определения вирулентности на модели простейших P. caudatum культуры исследуемых штаммов в концентрации 1107м.к./мл соединяли в соотношении объемов 1:10 с культурой инфузорий и переносили на предметное стекло с лункой для микроскопирования, изолировали покровным стеклом, фиксированным вазелиновым маслом. Время гибели 100% простейших определяли при световой микроскопии препаратов, начиная от контакта с культурами бактерий до полного прекращения подвижности инфузорий [МР №ЦОС ПВ Р 005-95; Прошина О.Б., Замарина О.В., Жукова С.И. с соавт., 2005].

1. Получение штаммов патогенных буркхольдерий с измененной чувствительностью к антибиотикам Была создана коллекция, полученных методом направленной селекции, мутантных штаммов буркхольдерий филогенетически родственных видов SMR-типа, которая включала мутанты B. pseudomallei, B. mallei и B. cepacia, резистентные к пефлоксацину и цефтазидиму, а также штаммы B. cepacia, устойчивые к канамицину и хлорамфениколу. Мутантные штаммы отличались последовательностью селектированных маркеров, способом получения и уровнем приобретенной резистентности и показывали ее повышение в несколько раз в сравнении с исходными культурами дикого типа.

Помимо устойчивых мутантов, мы получили с помощью транспозонного или химического мутагенеза штаммы, утратившие исходную резистентность к одному или к ряду антибиотиков. В частности, был селекционирован штамм B. pseudomallei 57576 SMRT21, обладающий чувствительностью к цефтазидиму, и мутанты B. cepacia 25416/8235 NSP/NSK, характеризующиеся чувствительностью множественного типа.

2. Фенотипическая характеристика мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам Определение перекрестной резистентности у SMR-мутантов, устойчивых к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, показало, что она сформировалась к препаратам различных классов, что характеризовало ее как множественную (рис. 1, 2).

Рисунок 1. Перекрестная резистентность мутантов штамма B. pseudomallei Обозначения: W.t. – дикий тип; SMR1 –штаммы, резистентные к пефлоксацину, цефтазидиму; SMR2 –штаммы, резистентные к цефтазидиму, пефлоксацину; Amp – ампициллин; Chl – хлорамфеникол; Str – стрептомицин.

Рисунок 2. Показатели множественной лекарственной резистентности штаммов B. cepacia Обозначения: W.t. – дикий тип; SMR1 – штаммы, резистентные к пефлоксацину, цефтазидиму; Amp – ампициллин; Chl – хлорамфеникол; Tet – тетрациклин.

Было установлено, что в зависимости от последовательности маркеров, наблюдается некоторое варьирование характера перекрестной устойчивости.

Так, мутантные штаммы буркхольдерий с фенотипом SMR1 (PfxRCzfR) чаще приобретали дополнительную резистентность к хлорамфениколу и ампициллину, с фенотипом SMR2 (CzfRPfxR) – к ампициллину и стрептомицину.

При этом, штаммы B. cepacia, отобранные на хлорамфениколе, характеризовались устойчивостью не только к этому препарату, но и к пефлоксацину. Фенотип резистентности к цефтазидиму, напротив, выявлялся у штаммов с маркером KanR. Можно предположить, что существует тенденция взаимосвязи развития указанных типов перекрестной устойчивости друг от друга в направлении: Chl – Pfx и Kan – Cfz, когда повышение резистентности к одному препарату ведет к возрастанию МПК другого (рис.3). Подобная тенденция в развитии устойчивости множественного типа у B. cepacia была описана в работах Rajyaguru, Muszynski [Rajyaguru J.M., Muszynski M.J., 1998].

Одновременно нужно отметить, что для штаммов B. cepacia с маркерами ChlR или KanR общий уровень перекрестной устойчивости был ниже, чем у мутантов, устойчивых к пефлоксацину или цефтазидиму. В свою очередь, среди последних, штаммы, полученные на средах с постепенно возрастающими концентрациями антибиотиков отличались также более низким общим уровнем множественной резистентности по сравнению со штаммами, выделенными другим способом.

Рисунок 3. Зависимость уровня резистентности штаммов B. cepacia от первоначального фенотипа антибиотикоустойчивости Обозначения: W.t. – дикий тип; SMRА11 – штамм, резистентный к хлорамфениколу; SMRА12 – штамм, резистентный к канамицину; Pfx – пефлоксацин; Cfz – цефтазидим.

Для предварительной оценки возможных механизмов, посредством которых формируется устойчивость у Burkholderia spp., мы использовали один из известных приемов преодоления множественной резистентности, обусловленной multidrug efflux pumps, который заключается в блокировании мембранных каналов клеток бактерий, в частности B. pseudomallei [Moore R.A., Woods D.E., 1998].

В наших исследованиях для блокирования мембранных каналов был использован верапамил, с помощью которого выявлялось изменение динамики чувствительности к антибиотикам у мутантов B. pseudomallei, B. mallei и B. cepacia в зависимости от селектированных фенотипов на основании сравнения выживаемости культур на средах с возрастающими концентрациями гентамицина и некоторых других антибиотиков без и в присутствии данного блокатора.

Прежде всего, было установлено, что верапамил практически не изменяет уровень резистентности к гентамицину и хлорамфениколу дикого штамма B. cepacia АТСС 25416.

В отличие от этого, у дикого штамма B. pseudomallei 56770 в присутствии верапамила наблюдалось отчетливое снижение устойчивости, проявляющееся в уменьшении числа жизнеспособных клеток на 20 – 40%.

Полирезистентные мутанты показали различное отношение к блокирующему действию верапамила. Так, на среде с верапамилом штаммы B. cepacia и B. pseudomallei, устойчивые к пефлоксацину и цефтазидиму, снижали резистентность к гентамицину и хлорамфениколу, тогда как штаммы устойчивые к цефтазидиму и пефлоксацину отчетливо повышали ее (рис.4).

Рисунок 4. Влияние верапамила на чувствительность к антибиотикам резистентных мутантов B. pseudomallei SMR-типа Обозначения: ось ординат – количество колониеобразующих единиц (%); а – B. pseudomallei 56770 SMR1 (PfxRCfzR); b – B. pseudomallei 57576 SMR (PfxRCfzR); c – B. pseudomallei 56770 SMR2 (CfzRPfxR); d – B. pseudomallei 57576 SMR2 (CfzRPfxR) Таким образом, установленные различия находятся у обоих видов буркхольдерий в связи с последовательностью селектированных маркеров:

если первым был маркер устойчивости к пефлоксацину, а вторым к цефтазидиму, то в присутствии верапамила резистентность культур увеличивалась, если же первым являлся маркер цефтазидимрезистентности, а вторым пефлоксацинустойчивости, то такие мутанты демонстрировали снижение выживаемости.

Резистентные SMR мутанты B. mallei Ц-5, как и чувствительные B. cepacia 25416 NSP/NSK, показали лишь снижение резистентности в присутствии верапамила независимо от приобретенного фенотипа.

Поскольку формирование антибиотикорезистентности связано с комплексным изменением процессов клеточного транспорта и характера секреции, то у мутантных штаммов буркхольдерий можно было ожидать изменения в продукции некоторых внеклеточных ферментов. Определение протеолитической, липазной и лецитиназной активностей установило, что резистентные мутанты B. pseudomallei и B. cepacia отличались от штаммов дикого типа. В наибольшей степени у них отмечалось варьирование продукции экзопротеаз. При этом штаммы B. cepacia 25416 NSP с фенотипом множественной чувствительности к ряду антибиотиков показали отсутствие всех трех исследованных типов ферментативной активности. Полученные результаты мы интерпретировали как наличие модификации у мутантов как в проницаемости, так и в мембранном транспорте по сравнению с исходными культурами, что, в свою очередь, позволяло предположить изменение в экспрессии белков наружных мембран.

Участие поринов и белков с транспортной функцией в развитии резистентности к антибиотикам было показано рядом исследователей [Nikaido H., 1989; Godfrey A.J., Wong S., Dance D.A. et al, 1991; Paulsen I.Т., Brown M.H., Skurray R.A., 1996; Mine T., Morita Y., Kataoka A., 1999; Moore A., DeShazer D., Reckseidler S. et al, 1999; Vorachit M., Chongtrakool P., Arkomsean S. et al, 2000; Pages J.M., Masi M., Barbe J., 2005].

Проведенное нами сравнение профилей белков наружных мембран полирезистентных штаммов всех трех видов (B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia) выявило определенные различия в их экспрессии. Так, мутанты B. pseudomallei и B. mallei SMR-типа характеризовались в основном некоторым повышением продукции отдельных мембранных белков с Мr 21, 27, 39 и 71 kDa. При этом у резистентных штаммов B. mallei было отмечено уменьшение продукции протеина цитоплазматической мембраны Mr 110 kDa, в то время как у мутантов B. pseudomallei, наоборот, некоторое повышение экспресии данного белка (рис. 5).

Рисунок 5. SDS-PAGE белков клеточных мембран полирезистентных штаммов B. mallei.

Обозначения штаммов: 1 – B. mallei Ц-5 W.t, 2 – B. mallei Ц- SMR1*(PfxRCfzR), 3 – B. mallei Ц-5 SMR11*(PfxRCfzR), 4 – B. mallei Ц- SMR2*(CfzRPfxR).

Что касается B. cepacia, то спектр белков наружной мембраны мутантов, резистентных к канамицину и хлорамфениколу, в наименьшей степени отличался от такового дикого штамма. Более значительное снижение экспрессии отдельных мембранных белков (Mr 21, 27, 36 kDa) у штаммов B. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR), B. cepacia 25416 SMR3 (CfzR) или наоборот, повышение экспрессии целого ряда отдельных мембранных протеинов (Mr 21, 36, 71, 150, 200 kDa) у мутантных штаммов B. cepacia SMR111 – (PfxR – PfxRCfzR) можно расценивать как преобладание различных механизмов формирования устойчивости: снижение проницаемости клеточной оболочки или экспрессия multi-drug efflux pumps. У чувствительных мутантов выявлялись дефекты в продукции отдельных мажорных белков с Mr 27 и kDa – у B. pseudomallei и Mr 36 kDa – у B. cepacia.

В связи с формированием антибиотикорезистентности штаммы B. pseudomallei, B. mallei и B. cepacia изменяли, наряду с указанными признаками, также и вирулентность, определение которой проводили на различных лабораторных моделях (экспериментальных животных – золотистых хомячках и белых мышах – а также простейших P. caudatum).

В результате было установлено, что резистентные мутанты всех трех видов снизили вирулентность по сравнению с исходными штаммами. Однако высокоустойчивые штаммы B. pseudomallei и B. mallei со сниженной вирулентностью остаются опасными, так как обладают способностью к длительному внутриклеточному выживанию на фоне антибиотикотерапии и персистенции на протяжении многих лет, что при снижении иммунитета приводят к развитию острой формы инфекции. Что касается B. cepacia, то острую форму инфекции моделировали с применением иммунодепрессантов, что вызывало гибель белых мышей, в среднем, в течение 3 – 5 суток при заражении культурами диких штаммов в высоких дозах (5108), тогда как животные, инфицированные культурами резистентных мутантов, оставались живыми в срок наблюдения 21 день (табл. 1).

Вирулентность штаммов B. cepacia для белых мышей при заражении Штамм Иммунодепрессант Средняя продолжительность жизни, сут B. cepacia B. cepacia B. cepacia 25416 SMR116* гидрокортизон Примечания: SMR1, SMR116* – штаммы, резистентные к пефлоксацину, цефтазидиму.

Хроническая форма инфекции, вызываемая B. cepacia была наглядно продемонстрирована у золотистых хомячков в виде феномена Штрауса, описанного при мелиоидозе и сапе. Клинические изоляты B. cepacia показывали более высокий уровень вирулентности в сравнении с ризосферными штаммами.

Для оценки патогенности полученных мутантных штаммов всех трех видов мы использовали в качестве альтернативной модели P. caudatum – инфузорию-туфельку (табл.2). Одновременно с результатами, полученными на лабораторных животных, модель простейших показала, что приобретение резистентности (или чувствительности) ведет к снижению вирулентных свойств. При этом, показатели вирулентности штаммов имели прямую корреляцию с таковыми, полученными на моделях золотистых хомячков и белых мышей.

Взаимодействие патогенных видов Burkholderia с инфузориями Следует также отметить, что с помощью лабораторных животных нам не удалось выявить штаммовые различия в уровне вирулентности резистентных культур B. cepacia, тогда как модель простейших это четко выявляла.

Интересен и тот факт, что мутант B. cepacia 25416 SMR112*, полученный отбором в процессе смены селективного фактора (пефлоксацина на цефтазидим) характеризовался более высоким уровнем вирулентности для парамеций, по сравнению с исходным штаммом B. cepacia 25416 SMR111*, устойчивым к пефлоксацину.

3. Генетический анализ множественной резистентности Генетическую гетерогенность штаммов буркхольдерий с различными фенотипами устойчивости к антибиотикам для предварительной оценки общности или различия механизмов реализации того или иного спектра резистентности исследовали с использованием методов типирования, основанных на амплификации полиморфных и специфических последовательностей хромосомной ДНК буркхольдерий (RAPD), а также анализа конформационного полиморфизма денатурированных одноцепочечных участков ампликонов последовательности поринового гена opcP1/omp39 (SSCP).

Сравнение RAPD-профилей штаммов B. pseudomallei, резистентных к фторхинолонам и цефтазидиму и транспозонных TTM-мутантов B. pseudomallei со сниженной устойчивостью к этим антибиотикам обнаружило распределение их в обособленные друг от друга группы сходства. В целом же развитие данных селектированных фенотипов патогенных видов буркхольдерий по-видимому сопровождалось сходными геномными перестройками у мутантов внутри каждой из групп. Последнее подтверждалось и при исследовании фингерпринтов фрагментов ДНК, содержащих последовательности интеграз, показавшем фактическую идентичность этих профилей у двух из трех изученных SMR-штаммов B. pseudomallei.

Довольно четкое возрастание экспрессии мажорного порина наружных мембран Mr 39 kDa (Omp39) у полирезистентных мутантов B. pseudomallei и его аналога Mr 36 kDa (OpcP1) у полирезистентных штаммов B. cepacia, а также наличие дефекта, как в его экспрессии, так и в детерминирующей его геномной последовательности у чувствительных мутантов B. cepacia, позволили предположить возможную роль данного белка как компонента транспортной системы в формировании устойчивости к рассматриваемым группам антимикробных соединений.

Мы исследовали наличие возможных мутационных изменений в последовательности генов opcP1/omp39 буркхольдерий при формировании различных фенотипов антибиотикорезистентности (рис. 6).

Рисунок 6. ПЦР-SSCP последовательности гена opcP1/omp39 у исходных штаммов и полирезистентных мутантов B. cepacia и B. mallei. Электрофорез в 10 % полиакриламидном геле при 10 С.

Обозначения: 1 – B. cepacia 25416 SMR1; 2 – B. cepacia 25416 SMR2; 3 – B. cepacia 8235 SMR1; 4 – B. cepacia 8235 SMR2; 5 – B. cepacia SMRА11; 6 – B. cepacia 25416 SMRА12; 7 – B. cepacia 25416 SMRА13; 8 – B. cepacia 8235 SMRА11; 9 – B. cepacia 8235 SMRА12; 10 – B. cepacia SMRА13; 11 – B. mallei Ц-5; 12 – B. mallei Ц-5 SMR1*; 13 – B. mallei Ц- SMR11*; 14 – B. mallei Ц-5 SMR2*.

Проведенный ПЦР-SSCP анализ последовательности поринового гена opcP1/omp39 показал отчетливые мутационные изменения у двух резистентных производных B. mallei Ц-5 SMR11* (PfxRCfzR) и B. mallei Ц-5 SMR2* (CfzRPfxR), треки 13, 14, что выражалось в изменении у них электрофоретической подвижности как двуцепочечных, так и одноцепочечных фрагментов ДНК относительно соответствующих фрагментов штамма дикого типа. Одновременно у большинства резистентных мутантов B. cepacia наблюдается вариабельность SSCP-профиля в виде изменения числа и электрофоретической подвижности продуктов частичной реассоциации одноцепочечных фрагментов ДНК. Последнее также может быть следствием мутаций гена типа единичных нуклеотидных замен, не приводящих к изменениям пространственной структуры анализируемого фрагмента. Точное определение типа и характера мутаций поринового гена opcP1/omp39 при формировании устойчивости к антибиотикам требует определения нуклеотидных последовательностей ампликонов с атипичными SSCP-профилями.

Таким образом, проведенное исследование показало модификацию структуры пориновых генов opcP1/omp39 у штаммов B. cepacia и B. mallei с повышенной устойчивостью к антибиотикам, что может быть свидетельством определенной функциональной значимости этих мажорных поринов в реализации резистентности.

Для оценки влияния порина OpcP1/Omp39 на устойчивость к антибиотикам мы провели комплементацию дефекта последовательности opcP1/omp39 с помощью трансформации у мутантов B. cepacia 25416 NSP и NSK с фенотипом множественной чувствительности, утративших способность к синтезу порина OpcP1.

Трансформация мутантов B. cepacia 25416 NSP/NSK, чувствительных к антибиотикам, как гомологичной ДНК, так и гетерологичной последовательностью гена оmp39 B. pseudomallei комплементировала признак сниженной резистентности к антибиотикам. При этом у трансформантов выявлялась исследуемая геномная последовательность opcP1/оmp39 и восстанавливалась продукция белка-порина OpcP1 (рис. 7, 8).

Рисунок 7. SDS-PAGE белков наружной мембраны трансформантов B. cepacia 25416 NSPТ.

Обозначения: 1 – B. cepacia АТСС 25416, 2 – B. cepacia 25416 NSP, 3 – B. cepacia 25416 NSPТ-1, 4 – B. cepacia 25416 NSPТ-2, 5 – B. cepacia 25416 NSPТ-3.

Рисунок 8. ПЦР-анализ пориновых генов omp39 и opcP1 c праймерами bpsomp39s – bpsomp39as. Электрофорез в 1.5 % агарозном геле.

Обозначения: 1 – B. pseudomallei 140; 2 – B. cepacia АТСС 25416; 3 – B. cepacia 25416 NSK; 4 – B. cepacia 25416 NSK t7.

Таким образом, отличительные черты полирезистентных мутантов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia, выявленные при изучении их фенотипов и генотипов, позволили установить основные закономерности и оценить некоторые принципиально возможные механизмы, посредством которых формировалась устойчивость. Представленные данные могут найти развитие в дальнейших исследованиях молекулярно-генетических основ резистентности у этих видов микроорганизмов, а также оказаться полезными в разработке перспективных средств лечения инфекций, вызываемых патогенными буркхольдериями.

1. Получена коллекция мутантных штаммов B. pseudomallei, B. mallei, B. cepacia с измененной чувствительностью к антибиотикам, состоящая из SMR-мутантов с селектированными признаками устойчивости к пефлоксацину, офлоксацину, цефтазидиму и штаммов чувствительных к антибиотикам этих классов. Штаммы B. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR) и B. cepacia 25416 NSP с множественной чувствительностью к антибиотикам депонированы в ГКПБ с присвоенными номерами КМ 197 и КМ 196 соответственно.

2. Установлено, что у всех трех видов буркхольдерий резистентность SMR-типа носит множественный характер, формируется с участием процессов снижения проницаемости клеточных мембран и сопровождается варьированием белковых профилей. Резистентные SMR-мутанты отличаются, главным образом, повышением экспрессии мажорных протеинов с Mr 27, 39, 71, 110 kDa, тогда как штаммы B. cepacia NSP-типа с множественной чувствительностью имеют сниженную продукцию этих белков и отсутствие экспрессии порина OpcР1.

3. Показано, что развитие у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia измененной чувствительности к антибиотикам приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных. Данные по предварительной оценке вирулентности, полученные с использованием альтернативной модели простейших (P. caudatum), коррелируют с показателями вирулентности резистентных штаммов B. pseudomallei для белых мышей и B. mallei для золотистых хомячков.

4. Установлено, что для RAPD-профилей и фингерпринтов фрагментов ДНК, содержащих интегразу патогенных видов Burkholderia, характерна межвидовая вариабельность, тогда как у производных отдельного вида RAPD-профили более консервативны. При этом резистентные SMR-мутанты B. pseudomallei и чувствительные транспозонные мутанты оказались распределенными в обособленные друг от друга группы сходства, что свидетельствует об однотипном характере перестроек их геномов, связанных с формированием соответствующих фенотипов.

5. В формировании множественной резистентности буркхольдерий показано участие порина ОpcP1/Оmp39. Чувствительные мутанты NSP-типа B. cepacia, утратившие белок OpcP1, были дефектны по кодирующей последовательности этого порина. При трансформации чувствительных мутантов по признаку резистентности гомологичной ДНК и гетерологичной последовательностью omp39 B. pseudomallei наблюдали восстановление фенотипа резистентности, продукции белка OpcP1 и выявляли детерминирующую его геномную последовательность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калинкина Е.В.*, Викторов Д.В., Меринова Л.К. Характеристика штаммов Burkholderia cepacia, резистентных к цефалоспоринам и фторхинолонам // Санитарная охрана территорий государаств – участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях. Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. – Волгоград. – 2005. – С.147 – 148.

2. Калинкина Е.В.*, Сеимова И.К., Меринова О.А., Викторов Д.В., Меринова Л.К. Мутанты Burkholderia cepacia с множественной резистентностью к антибиотикам // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. – 2006. – №3. – С.25 – 27.

3. Калинкина Е.В.*, Сеимова И.К., Меринова О.А., Викторов Д.В., Меринова Л.К. Мутанты Burkholderia cepacia резистентные к антибиотикам // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых. – СанктПетербург. – 2006. – С.277 – 278.

4. Калинкина Е.В.*, Сеимова И.К., Меринова О.А., Агеева Н.П., Викторов Д.В., Лобойко А.Д., Меринова Л.К. Применение модели простейших для определения вирулентности штаммов патогенных Burkholderia с множественной резистентностью к антибиотикам // ММСП и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств. Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государствучастников СНГ. – Саратов. – 2007. – С.212 – 214.

5. Сенина Т.В., Лобойко А.Д., Калинкина Е.В.* Алгоритм идентификации Burkholderia cepacia. Вестник Российской военно-медицинской академии.– 2008. – № 2 (22). – С.201 – 202. (Журнал из перечня ВАК) 6. Калинкина Е.В.*, Меринова О.А., Агеева Н.П., Лобойко А.Д., Викторов Д.В., Меринова Л.К. Фенотипическая характеристика штаммов патогенных Burkholderia, резистентных к цефалоспоринам и фторхинолонам. Пробл.

особо опасных инф.– 2008.– №1.– С. 32 – 34. (Журнал из перечня ВАК) 7. Калинкина Е.В.*, Меринова О.А., Захарова И.Б., Викторов Д.В., Меринова Л.К. Трансформация чувствительных к антибиотикам мутантов Burkholderia cepacia по признаку резистентности // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств.

Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. – Волгоград. – 2008. – С.85 – 86.

8. D.V. Viktorov, I. B. Zakharova, M.V. Podshivalova, E.V. Kalinkina*, O.A. Merinova, N.P. Ageeva, V.A. Antonov, L.K. Merinova, V.V. Alekseev Highlevel resistance to fluoroquinolones and cephalosporins in Burkholderia pseudomallei and closely related species // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. – 2008. – Vol.

102:51. – P. 544 – 551.

9. Молчанова Е.В., Захарова И.Б., Меринова О.А., Агеева Н.П., Викторов Д.В. Полиморфизм генов мажорного порина opcP1/omp39 у мутантов патогенных буркхольдерий с повышенной резистентностью к антибиотикам // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ. Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. – Ставрополь. – 2010. – С. 212 – 213.

10. Трушкина М.Н., Шубникова Е.В., Молчанова Е.В., Викторов Д.В.

Изучение факторов, влияющих на объективную оценку чувствительности патогенных буркхольдерий к химиопрепаратам // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государствучастников СНГ. Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. – Ставрополь. – 2010. – С. 234 – 235.

11. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам: Методические указания / Онищенко Г.Г., Илюхин В.И., Андропова Н.В., Сенина Т.В., Калинкина Е.В.,* Трушкина М.Н. – М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. – 2010. – 59 с.

* фамилия автора Калинкина Е.В. изменена на Молчанова Е.В.

Подписано к печати …………..

Формат 60х84 1/16. Печать лазерная Бумага офисная Объем 1,0 усл.п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано на полиграфическом оборудовании ……

 
Похожие работы:

«Чистякова Наталья Сергеевна ОСОБЕННОСТИ АДАПТАЦИИ ПОПУЛЯЦИЙ ДИКОРАСТУЩИХ ЗЛАКОВ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА (Leymus chinensis, Stipa krylovii, Zizania latifolia) 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 Работа выполнена в ФГОУ ВПО Иркутской государственной сельскохозяйственной академии Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Илли Иван Экидиусович...»

«СМЕКАЛОВ Михаил Андреевич ВЛИЯНИЕ БИОВЕРМИКУЛИТА НА ВЫВЕДЕНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ИЗ ОРГАНИЗМА И НОРМАЛИЗАЦИЮ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ У КОРОВ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОЙ ЗОНЫ 03.01.04 — Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Дубровицы, 2011г. Работа выполнена в отделе биохимических и химико-аналитических исследований Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии...»

«Благодатский Сергей Александрович МИКРОБНАЯ БИОМАССА И МОДЕЛИРОВАНИЕ ЦИКЛА АЗОТА В ПОЧВЕ Специальность 03.02.03 – микробиология 03.02.13 – почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино – 2011 Работа выполнена в лаборатории почвенных циклов азота и углерода Учреждения Российской академии наук Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, г. Пущино, Московская обл. Научный консультант : д.б.н.,...»

«Спангенберг Виктор Евгеньевич Динамика структурной организации хромосом в профазе I мейоза у мыши и человека 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории цитогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Коломиец...»

«СЕРГЕЕВА ЛЮДМИЛА ВАСИЛЬЕВНА ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЗАКВАСОК ДЛЯ ОПТИМИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МЯСНОГО СЫРЬЯ И УЛУЧШЕНИЯ КАЧЕСТВА ПОЛУЧАЕМОЙ ПРОДУКЦИИ 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ульяновск- 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования национальный исследовательский...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«Чирков Сергей Николаевич Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений 03.00.06 – Вирусология 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН. Научный консультант : доктор...»

«Прутенская Екатерина Анатольевна Микробиологическая конверсия растительных отходов в гуминовые вещества 03.00.07 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена на кафедре биотехнологии и химии Тверского государственного технического университета. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Воробьева Галина Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор...»

«Закария Давидович Гинтури Псиллиды (Hemiptera, Psylloidea) междуречья рек Малого Лиахви и Меджуды: фауна, биология, результаты использования инсектицидов - энтомология 03.00.09 АВТОРЕФЕРАТ диссертации представленной на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук _ 2006 Тбилиси Диссертационная работа выполнена на кафедре зоологии Тбилисского Государственного Университета им. Ив. Джавахишвили. Научный...»

«Милютина Дарья Игоревна ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ СОСТАВ ПОПУЛЯЦИЙ И УСТОЙЧИВОСТЬ К НЕКОТОРЫМ ФУНГИЦИДАМ ШТАММОВ PHYTOPHTHORA INFESTANS (MONT) de BARY ИЗ РЕСПУБЛИКИ МАРИЙ-ЭЛ И МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.00.24 – Микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 2 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова в 2004-2008 годах....»

«ПАВЛОВА ИРИНА ИВАНОВНА НАКОПЛЕНИЕ И РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ В АЛЛЮВИАЛЬНЫХ ПОЧВАХ ДЕЛЬТЫ Р. СЕЛЕНГИ 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Макушкин Эдуард Очирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Абашеева...»

«СОРОКАНЬ АНТОНИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА РЕГУЛЯЦИЯ УСТОЙЧИВОСТИ КАРТОФЕЛЯ К ВОЗБУДИТЕЛЮ ФИТОФТОРОЗА Phytophthora infestans (MONT.) DE BARY САЛИЦИЛОВОЙ И ЖАСМОНОВОЙ КИСЛОТАМИ 03.01.04. – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2013 1 Работа выполнена в лаборатории биохимии иммунитета растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Научный...»

«СУЛЕЙМАНОВА АЛИЯ ДАМИРОВНА НОВАЯ ГИСТИДИНОВАЯ КИСЛАЯ ФИТАЗА PANTOEA VAGANS: ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2013 Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Шарипова...»

«Токарь Ольга Егоровна ВОДНЫЕ МАКРОФИТЫ РЕКИ ИШИМ И ПОЙМЕННЫХ ОЗЕР (флора, растительность и фитоиндикация экологического состояния экотопов) 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Омск – 2005 Диссертация выполнена на кафедре ботаники и основ сельского хозяйства Омского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Борис Федорович Свириденко Официальные...»

«БЛИНОВА Илона Владимировна БИОЛОГИЯ ОРХИДНЫХ НА СЕВЕРО-ВОСТОКЕ ФЕННОСКАНДИИ И СТРАТЕГИИ ИХ ВЫЖИВАНИЯ НА СЕВЕРНОЙ ГРАНИЦЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ Специальность 03. 00. 05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук в Полярноальпийском ботаническом саду-институте им Н. А. Аврорина (ПАБСИ КНЦ РАН) Официальные оппоненты : доктор биологических наук Коломейцева Галина...»

«СЕМЕНОВ Георгий Александрович ГИБРИДИЗАЦИЯ БЕЛОЙ (MOTACILLA ALBA LINNAEUS, 1758) И МАСКИРОВАННОЙ (M. (A.) PERSONATA GOULD, 1861) ТРЯСОГУЗОК НА ЮГЕ СИБИРИ Специальность: 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2011 Работа выполнена в лаборатории тематической группы Экология птиц Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, Юрлов Александр...»

«Галицкая Анна Алексеевна ЭКОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКАЯ АДАПТАЦИЯ WOLFFIA ARRHIZA (L.) К АБИОТИЧЕСКИМ И БИОТИЧЕСКИМ ФАКТОРАМ СРЕДЫ 03.02.08 – экология (биология) 03.01.04 – биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук (ИБФРМ РАН) Научные руководители: доктор...»

«ЯРОСЛАВЦЕВА Ольга Николаевна ИММУННАЯ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩАЯ СИСТЕМЫ НАСЕКОМЫХ ПРИ РАЗВИТИИ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ МИКОЗОВ 03.02.05 – энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2012 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных СО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Глупов Виктор Вячеславович (Институт систематики и экологии Животных СО РАН, г....»

«Агафонов Леонид Иванович ДРЕВЕСНО-КОЛЬЦЕВАЯ ИНДИКАЦИЯ ГИДРОЛОГОКЛИМАТИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте экологии растений и животных Уральского отделения РАН Научный консультант доктор биологических наук, профессор Шиятов Степан Григорьевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ДРАЧЕВ Никита Сергеевич ФЛОРА ПОДЗОНЫ ЮЖНОЙ ТАЙГИ В ПРЕДЕЛАХ ТЮМЕНСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск - 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской Академии наук Центральном сибирском ботаническом саду Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. кандидат биологических наук, с. н. с. Научный руководитель Шауло Дмитрий Николаевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.