WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Свиридов Алексей Владимирович

ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ КАТАБОЛИЗМА

ОРГАНОФОСФОНАТОВ У ПОЧВЕННЫХ БАКТЕРИЙ

Achromobacter sp. и Ochrobactrum anthropi GPK 3

03.01.04 Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пущино – 2012

Работа выполнена в лаборатории микробной энзимологии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина Российской академии наук, Пущино

Научный руководитель доктор биологических наук Леонтьевский Алексей Аркадьевич

Официальные оппоненты Бурьянов Ярослав Иванович доктор биологических наук, профессор, Филиал Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, заведующий лабораторией Кулаковская Татьяна Валентиновна доктор биологических наук, Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, заведующая лабораторией

Ведущая организация Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова, Биологический факультет

Защита диссертации состоится « 29 » июня 2012 г. в 10 часов 00 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской области, Проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН.

Автореферат размещен на сайтах http://vak.ed.gov.ru и http://www.ibpm.ru, Автореферат разослан «_»2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук Доронина Нина Васильевна Актуальность проблемы Неизбежным результатом технологического прогресса является поступление в окружающую среду различных типов ксенобиотиков. К их числу относятся фосфонаты, содержащие прямую ковалентную связь углерод-фосфор (С–Р). Такая связь чрезвычайно устойчива к химическим и физическим воздействиям, вследствие чего фосфонаты способны накапливаться в окружающей среде. Синтетические фосфонаты входят в состав многих пестицидов, могут поступать в среду как отходы химической индустрии и продукты детоксикации фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ).





Глифосат (ГФ) является одним из наиболее распространенных синтетических фосфонатов и применяется как действующий компонент популярных гербицидов (Roundup, Ground-Bio и др.). К 2010 г. объемы поступления ГФ в среду превысили 800 тыс. тонн в год. По данным независимых исследований, ГФ способен сохраняться в почвах в течение многих лет, изменяя состав почвенной микрофлоры, проникая в культурные растения и просачиваясь в водоемы. У животных ГФ может вызывать поражения печени, иммунной системы и нарушения эмбрионального развития.

Метилфосфоновая кислота (МФК) один из основных продуктов переработки ФОВ и побочный продукт ряда промышленных процессов, крайне стабильна в окружающей среде и может сохраняться в почве в течение десятков лет, проявляя фитотоксические свойства.

В связи с этим актуален поиск способов ремедиации почв и водоемов, загрязненных фосфонатами. Из-за высокой стойкости подобных соединений единственный рациональный подход к решению данной проблемы предполагает применение микроорганизмов-деструкторов. Однако разработка подобных технологий затрудняется недостатком сведений об организации путей метаболизма фосфонатов.

Считается, что С–Р связь большинства фосфонатов, в том числе МФК, неспецифически расщепляется ферментным комплексом «С–Р лиаза», необратимо инактивирующимся при дезинтеграции клеток. Известно единственное сообщение о возможном существовании разновидности С–Р лиазы, специфически разлагающей ГФ (в настоящей работе обозначенной как C–Р лиаза II). Существует предположение об альтернативном пути разложения ГФ, где начальную реакцию расщепления ГФ может катализировать фермент глифосат-оксидоредуктаза с образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК). Однако ГФ-оксидоредуктаза не была очищена и охарактеризована.

Путь дальнейшего метаболизма АМФК, связанный с разрывом С–Р связи, также неясен.

Дефицит знаний о метаболизме фосфонатов во многом объясняется отсутствием доступных и достоверных методов идентификации активности соответствующих ферментов, а также анализа их метаболитов. Разработка подобных методов и исследование метаболизма синтетических фосфонатов бактериями-деструкторами является одной из приоритетных задач современной биохимии.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы было изучение путей катаболизма глифосата и метилфосфоновой кислоты у почвенных бактерий-деструкторов фосфонатов.

Для достижения цели работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработка методов количественного и качественного анализа исследуемых фосфонатов и их метаболитов, а также методик измерения активности ферментов их деструкции.

2. Подбор объектов исследования – штаммов, обладающих наибольшей эффективностью деструкции в отношении изучаемых фосфонатов.

3. Изучение возможности адаптации штамма, выделенного под селективным давлением метилфосфоновой кислоты к утилизации глифосата.





4. Выявление путей метаболизма фосфонатов у отобранных штаммовдеструкторов.

5. Очистка нового фермента первичной атаки глифосата – глифосатоксидоредуктазы.

6. Характеристика глифосат-оксидоредуктазы.

Научная новизна Разработаны новые методы идентификации и измерения активности ферментов метаболизма ГФ и МФК с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), тонкослойной хроматографии (ТСХ) и спектрофотометрического определения, отличающиеся высокой достоверностью.

Впервые показана возможность адаптации штамма-деструктора МФК (Achromobacter sp. MPS 12), первоначально не способного утилизировать ГФ, к использованию этого соединения как единственного источника фосфора.

Адаптированный штамм Achromobacter sp. MPS 12A по показателям деструкции ГФ был близок к O. anthropi GPK 3.

Доказано существование двух С–Р лиазных систем с различающейся субстратной специфичностью: С–Р лиаза I разлагала МФК, C–Р лиаза II – ГФ.

Впервые выявлено различие в путях метаболизма ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением двух разных фосфонатов: Achromobacter sp. MPS 12А разлагал этот фосфонат с помощью ГФ-специфичной С–Р лиазы II с образованием саркозина. Ферментом первичной атаки ГФ у O. anthropi GPK 3 была ГФ-оксидоредуктаза; продуктами этой реакции были АМФК и глиоксилат.

У O. anthropi GPK 3 был идентифицирован ранее не описанный путь метаболизма АМФК, который включал стадии переаминирования и разрыва С–Р связи при вероятном участии фермента фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).

ГФ-оксидоредуктаза O. anthropi GPK 3 была впервые очищена до электрофоретически гомогенного состояния. Изучены ее основные характеристики, определен кофактор, выявлены параметры, способствующие повышению выхода фермента.

Практическая значимость Разработанные высокоточные методы анализа фосфонатов и продуктов их метаболизма отличаются универсальностью и могут применяться для обнаружения фосфонатов в природных образцах почвы и грунтовых вод, сточных водах, а также в лабораторных исследованиях при анализе гомогенатов клеток и культуральной жидкости.

Изученные физиологические и биохимические особенности отобранных штаммов-деструктров ГФ и МФК позволяют давать точную оценку деструктивного потенциала таких микроорганизмов. Обнаруженный эффект адаптации изучаемых бактерий к утилизации фосфонатов разных типов открывает новые возможности селекции универсальных и высокоэффективных деструкторов, активных в отношении широкого диапазона этих соединений.

Данные о различиях в путях деструкции ГФ у штаммов, выделенных под селективным давлением разных фосфонатов, позволяют осуществлять более эффективный скрининг и отбор микроорганизмов, пригодных для последующего дальнейшего применения их в технологиях очистки природных сред от загрязнения фосфонатами. Сведения о факторах, способствующих индукции ГФ-оксидоредуктазы у O. anthropi GPK 3, дают возможность подобрать условия, способствующие наибольшей экспрессии данного фермента.

Впервые полученные сведения об организации и распределении ферментных систем катаболизма фосфонатов у бактерий являются основой для разработки биотехнологий очистки и восстановления природных сред, загрязненных фосфонатами.

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из 7 разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение результатов, выводы, список литературы. Работа изложена на 152 страницах, содержит 10 таблиц и 42 рисунка.

Библиографический указатель содержит 294 источника литературы.

Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: 10th International UFZ-Deltares/TNO conference on soilwater systems «ConSoil 2008» (Milan, Italy, 2008), 12-я международная школаконференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2008), 5-я международная конференция «Наука и образование для целей биобезопасности» (Пущино, 2008), Международная школа-конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Пущино, 2008), Всероссийская конференция с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009.

Современные биоаналитические системы, методы и технологии» (ПущиноТула, 2009), 3rd International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology «BioMicroWorld 2009» (Lisbon, Portugal, 2009), Пущинская научно-практическая конференция «Системная биология» (Пущино, 2009), Международный молодежный научный форум «Ломоносов-2010» (Москва, 2010), 14-я международная школа-конференция молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2010), 2-й международный конкресс-партнеринг и выставка по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio» (Москва, 2010), VI Московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2011). По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в изданиях из списка, рекомендованного ВАК и 10 тезисов в сборниках отечественных и зарубежных конференций.

Исследования поддерживались грантом Российского фонда фундаментальных исследований 09-04-00320 «Глифосат-оксидоредуктаза бактерии Ochrobactrum anthropi GPK 3» и в рамках проекта РНП 2.1.1.9227 «Создание ассоциаций грибов и бактерий для биодеструкции устойчивых гетероциклических соединений».

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Среды для культивирования бактерий. Для культивирования бактерий использовали минеральную среду MS1 (Ермакова с сотр., 2008). Источниками фосфора служили МФК в концентрации 0,3 г/л, ГФ в концентрации 0,05-20 г/л в составе гербицида Roundup, 2-аминоэтилфосфоновая кислота (2АЭФ) и АМФК в концентрации 0,2 г/л, неорганический фосфат (Pi) в концентрации 0,3 г/л. Источниками углерода служили глутамат натрия, сукцинат натрия, глицерин и глюкоза в концентрации 10 г/л.

Микроорганизмы. Использовали два штамма бактерий-деструкторов фосфонатов: Ochrobactrum anthropi GPK 3 (ВКМ B-2554D), выделенный из почв, загрязненных ГФ, и Achromobacter sp. MPS 12 (ВКМ B-2694), выделенный из сайтов загрязнения метилфосфоновой кислотой (МФК). При адаптации последнего к росту на средах с ГФ был получен деструктор МФК и ГФ Achromobacter sp. MPS 12А.

Условия культивирования. Выращивание культур проводили 1) в колбах объемом 750 мл со 100 мл среды на качалке при температуре 28 °С; 2) в ферментерах АНКУМ-2 (ИБП РАН, Россия) объемом 10 л при температуре 28 °С и интенсивности аэрации 50 % от насыщения; 3) в герметически закрытых 15-мл пробирках с 5 мл среды.

Субклеточное фракционирование. Клетки фракционировали по методо Nossal и Heppel (1966) с модификациями: биомассу ресуспендировали в мл 33 мМ Трис-HCl рН 7,65, добавляли 40 мл 33 мМ Трис-HCl рН 7,65, содержавшего 40% сахарозу и 100 мМ ЭДТА. После 10 мин инкубации при °С клетки осаждали (18000 g х 5 мин) и отбирали фракцию периплазмы.

Сферопласты разрушали с помощью ИБФМ-пресса при рабочем давлении 0, МПа. Гомогенат помещали в ледяную баню, вносили 100 Ед ДНКазы I, осаждали центрифугированием (120000 g х 1 ч, 4 °С). Отделяли супернатант с водорастворимыми белками цитоплазмы. Осадок ресуспендировали в 10 мл буфера 100 мМ Трис-HCl рН 7,65, 100 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 20% глицерин, 0,001 мМ фенилметилсульфонилфторид с 2% Тритон Х-100 и инкубировали 30 мин при 22 °С. Суспензию осаждали (120000 g х 1 ч, 22°С), отбирали надосадочную жидкость.

Аналитические методы. Хроматографический анализ ГФ и его метаболитов в культуральных жидкостях, бесклеточных экстрактах и реакционных смесях проводили методами тонкослойной хроматографии (ТСХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), получая ацильные, бензоильные и дансильные производные (Свиридов с сотр., 2011). Концентрацию фосфонатов и Pi измеряли спектрофотометрическим методом с малахитовым зеленым (Hess and Derr, 1975) после гидролиза С–Р связи персульфатом аммония (Schowanek and Verstraete, 1990a).

Определение активности ферментов. Активность С–Р лиазы в интактных клетках I определяли: 1) по выделению метана при культивировании бактерий на среде с МФК в герметичных пробирках (концентрацию метана измеряли методом газовой хроматографии с помощью калибровочной кривой); 2) по убыли МФК и накоплению Pi (определяли спектрофотометрически по цветной реакции Pi с молибдатом аммония в присутствии малахитового зеленого) (Sviridov et al., 2012).

Активность С–Р лиазы II в интактных клетках идентифицировали по присутствию в бесклеточных экстрактах саркозина, который обнаруживали методом ВЭЖХ в виде ацильных, дансильных и бензоильных производных (Свиридов с сотр., 2011).

Определение активности ГФ-оксидоредуктазы в субклеточных фракциях O. anthropi GPK 3 проводили 1) спектрофотометрическим методом по образованию окрашенного комплекса продукта реакции (глиоксилата) с фенилгидразином (Свиридов с сотр., 2011); 2) методом ВЭЖХ, определяя концентрацию глиоксилата и АМФК (в виде производных) в реакционных смесях (Sviridov et al., 2012).

Убыль АМФК, образующейся при расщеплении ГФ глифосатоксидоредуктазой, обнаруживали методом ВЭЖХ в реакционной смеси, содержавшей ГФ, бесклеточный экстракт, пиридоксаль-5’-фосфат и пируват натрия.

Активность фосфонатазы определяли по окислению НАДН в сопряженной реакции с алкогольдегидрогеназой, восстанавливавшей один из продуктов фосфонатазной реакции – ацетальдегид.

Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Белки бесклеточного экстракта осаждали сульфатом аммония до 80% насыщения, осадок отделяли центрифугированием, растворяли в буфере 50 мМ Трис-HCl рН 7,65, 100 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2, 0,05 мМ ЭДТА и подвергали гель-фильтрации на колонке Superdex 200 (2,6 х 60 см). Активные фракции наносили на колонку OctylSepharose (1 х 6 см), элюировали буфером, содержавшим 1 М сульфата аммония. Препарат затем подвергали гель-фильтрации на колонке Toyopearl HW-60 (1,6 х 100 см).

Характеристика ГФ-оксидоредуктазы. Денатурирующий электрофорез проводили по Laemmli (1970), белковые полосы проявляли по Fairbanks (1971). Нативный электрофорез проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) с градиентом концентрации 4-10% в системе для кислых белков.

Окрашивание белков проводили 0,2% раствором нитратом серебра в 0,4% растворе формальдегида.

Молекулярную массу (ММ) фермента определяли по электрофоретической подвижности и с помощью гель-фильтрации на колонке Superdex 200, предварительно калиброванной с помощью набора Gel Filtration Molecular Weight Markers (Sigma, США).

Изоэлектрофокусировку проводили в 5% ПААГ в градиенте рН 3,0-10,0 с амфолинами фирмы Pharmacia (pharmalytes). Белковые полосы проявляли последовательной инкубацией геля в смеси уксусной кислоты, этанола и воды (19 : 25 : 65), содержащей 0,1% CuSO4 и 0,05% кумасси R-250. Изоэлектрическую точку определяли с помощью набора Calibration Kit for pI Determinations using Isoelectric Focusing Broad Range pI (pH 3-10) (GE Healthcare, США).

Определение зависимости активности ГФ-оксидоредуктазы от рН среды проводили спектрофотометрически в буфере Britton и Robinson (1931) в интервале рН 6,8-9,6.

Температурный оптимум фермента определяли спектрофотометрически в диапазоне 20-60 °С при термостатировании измерительной кюветы.

Термостабильность определяли путем инкубирования ферментного препарата при температурах 22, 25, 30, 40, 45, и 50 °С в течение часа; измерения остаточной активности проводили через 5, 10, 15, 30 и 60 мин после начала инкубации.

Спектры поглощения препаратов ГФ-оксидоредуктазы и реакционных смесей в диапазоне 300-560 нм записывали на спектрофотометре Shimadzu UV-1650PC (Япония). Апофермент отделяли от кофактора после инкубации в буфере 33 мМ Трис-HCl рН 8,05 с помощью ультрафильтрации.

Свободный кофактор получали кипячением препарата ГФ-оксидоредуктазы и анализировали методом ВЭЖХ на колонке Lichrospher 100 RP 250 x 4 мм (Dr. Maisch, Германия) в подвижной фазе метанол : 5 мМ ацетат аммония рН 6,0 (20 : 80 ) с детектором оптического поглощения при 450 нм.

Значения Km и Vmax определяли с линеаризацией данных в координатах Хейнса-Вольф. Влияние ионов металлов изучали в реакционных смесях, содержавших очищенный ферментный препарат, 2 мМ ГФ и соли: MgCl2 в концентрации 1-20 мМ; NiCl2, CuSO4, MnCl2, ZnCl2, FeSO4, CoCl2 в концентрации 10 мМ.

Ингибиторный анализ ГФ-оксидоредуктазы проводили в реакционных смесях, содержавших очищенный фермент, 2 мМ ГФ и глицин, саркозин, AgNO3, ФМСФ, p-хлормеркурийбензойную кислоту (рХМБ), MnCl2, CuSO4 в концентрации 0,1-4 мМ.

Определение концентрации белка. Концентрацию белка определяли с помощью реактива Брэдфорд (Sigma) в соответствии с рекомендациями производителя.

Статистическая обработка результатов. Все эксперименты проводили в трех повторностях. На основании полученных выборок определяли стандартное отклонение и доверительный интервал при уровне значимости 0,95.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка методов анализа ГФ и его метаболитов. Были предложены новые методы обнаружения и количественного определения ГФ и соединений, образующихся при его деструкции с помощью ВЭЖХ (табл. 1) и ТСХ (табл. 2). Получение ацильных, бензоильных и дансильных дериватов проб позволяло значительно снизить предел обнаружения, и достичь высокой достоверности анализа. В рутинных экспериментах использовалось ацилирование проб, требовавшее наименьших временных затрат. Бензилирование и дансилирование применялось для верификации полученных данных.

Отбор и характеристика штаммов-деструкторов фосфонатов. По результатам скринига лабораторной коллекции микроорганизмов были отобраны:

1) штамм Achromobacter sp. MPS 12, отличавшийся наибольшей эффективностью утилизации МФК (табл. 3); 2) штамм Ochrobactrum anthropi GPK 3 – лучший деструктор ГФ (табл. 3).

Анализ производных ГФ и его метаболитов методом ВЭЖХ Соединение Время Предел об- Время удер- Предел обна- Время удер- Предел обнаудержания, наружения, жания, мин ружения, жания, мин ружения, * н/о – не определяли Хроматографическая подвижность и пределы обнаружения ГФ и его метаболитов методом ТСХ в немодифицированном виде и в виде дансилпроизводных * Определение саркозина проводили методом двумерной ТСХ Адаптация штамма Achromobacter sp. MPS 12 к утилизации ГФ. В отличие от прочих изученных деструкторов МФК, не способных расти на средах с ГФ, у Achromobacter sp. MPS 12 был обнаружен крайне слабый рост на среде с этим фосфонатом (табл. 3), в связи с чем данный штамм был подвергнут адаптации к утилизации ГФ путем последовательных пассажей на жидких средах, содержавших данный фосфонат (рис. 1). После 8 пассажей ростовые характеристики Achromobacter sp. MPS 12 стабилизировались (рис. 1, 8). Адаптированная форма получила обозначение Achromobacter sp. MPS 12A (табл. 3).

Подобный эффект адаптации не описан в литературе и мог объясняться исходной генетической неоднородностью популяции Achromobacter sp. MPS 12, которая могла содержать незначительную долю клеток, способных утилизировать ГФ и получивших решающее конкурентное преимущество при росте на средах с данным фосфонатом.

Обнаружение активности С–Р лиазы I. Активность МФК-специфичной С–Р лиазы (обозначена нами как «C-P лиаза I») обнаружена у всех исследованных штаммов по выделению метана при росте на среде с МФК, но не на среде с ГФ Выделение метана и убыль МФК в среде были эквимолярными (табл. 4).

Ростовые характеристики O. anthropi GPK 3, Achromobacter sp. MPS 12 и Микроорганизм среде куль- биомасса, г/л Achromobacter sp.

Achromobaсter sp.

Achromobacter sp.

Achromobacter sp.

ОП560, ед.

** По данным спектрофотометрического измерения с малахитовым зеленым Achromobacter sp. MPS 12A и O. anthropi GPK 3 шла по двум метаболическим путям. Achromobacter sp. MPS 12A обладал ГФ-специфичной С–Р лиазой (обозначена нами как «С-Р лиаза II»), что подтверждалось наличием саркозина в бесклеточном экстракте при культивировании на ГФ, и метаболитов саркозина – глицина и формальдегида (табл. 5). У Achromobacter sp. MPS 12, не способного утилизировать ГФ, саркозин отсутствовал, а концентрация глицина была значительно ниже. У O. anthropi GPK 3 основным метаболитом ГФ была АМФК (табл. 5), что указывало на наличие ГФ-оксидоредуктазы, катализирующей первичную атаку ГФ (рис. 2, А).

Внутриклеточные концентрации ГФ и его метаболитов у штаммов Соединение Фосфонатазный путь минерализации ГФ у O. anthropi GPK 3. В присутствии пиридоксаль-5’-фосфата и пирувата в бесклеточных экстрактах O.

anthropi GPK 3 наблюдалась убыль АМФК, образующейся при расщеплении ГФ (рис. 2, Б). Такие кофакторы указывали на реакцию переаминирования, ожидаемым продуктом которой должен был быть фосфоноформальдегид, близкий по структуре фосфоноацетальдегиду – субстрату фосфоноацетальдегидгидролазы (фосфонатазы).

Рисунок 2. Убыль ГФ и образование АМФК и глиоксилата в бесклеточных экстрактах O. anthropi GPK3. А – при рН среды 8,0 (буфер В); Б – при рН среды 8,5 в присутствии пирувата натрия и пиридоксаль-5’-фосфата. – Глифосат; – АМФК; – Глиоксилат.

Для проверки гипотезы об участии фосфонатазы в деструкции ГФ, активность этого фермента измеряли в бесклеточных экстрактах O. anthropi GPK 3 выращенных на средах с Pi, МФК, 2-АЭФ (предшественник фосфоноацетальдегида), АМФК и ГФ. В первых двух случаях активность фосфонатазы не обнаружено, в остальных случаях она была практически идентичной (0,05±0,005 Ед/мг белка). Индукция фосфонатазы происходит: а) при отсутствии иных источников Pi и б) в присутствии подходящего субстрата. Тем самым подтверждалось предположение об образовании в ходе деструкции ГФ (и АМФК как его метаболита) субстрата, расщепляемого фосфонатазой с образованием Pi и формальдегида.

Рисунок 3. Схема путей метаболизма фосфонатов у Achromobacter sp. MPS 12, MPS 12A и Ochrobactrum anthropi GPK 3.

Таким образом, у O. anthropi GPK 3 выявлен не описанный ранее путь полной минерализации ГФ, не связанный с экскрецией в среду культивирования АМФК, характерной для большинства известных деструкторов ГФ.

Пути деструкции фосфонатов, обнаруженные у исследованных штаммов, представлены на рис. 3.

Влияние условий культивирования на активность ГФ-оксидоредуктазы.

Удельная активность ГФ-оксидоредуктазы в бесклеточных экстрактах O.

anthropi GPK 3 зависела от таких факторов, как тип источника углерода (рис. 4, А), фаза роста культуры (рис. 4, Б) и концентрация ГФ в среде. Получение биомассы для исследования ГФ-оксидоредуктазы проводили с помощью сред с глутаматом натрия в фазе замедления роста, так как при росте культуры на сукцинате натрия, несмотря на несколько большую активность фермента, наблюдали быстрое защелачивание среды, затруднявшее контроль рН, а также агрегацию клеток в результате образования слизистых капсул.

(рис. 4, Б), однако количество биомассы в лаг-фазе было недостаточным.

Удельная активность ГФ-оксидоредуктазы, Ед/мг белка Рисунок 4. Активность ГФ-оксидоредуктазы в бесклеточных экстрактах O. anthropi GPK 3. А – Влияние источника углерода в среде; Б – Влияние фазы роста при культивировании на среде с глутаматом: лаг-фаза (ОП560=0,15), фаза экспоненциального роста (ОП560=2,00), фаза замедления роста (ОП560=4,20), стационарная фаза (ОП560=4,90) Очистка ГФ-оксидоредуктазы. Использованная схема очистки позволила получить электрофоретически гомогенный препарат ГФ-оксидоредуктазы с выходом 33,3% (табл. 6, рис. 5). ММ субъединицы, по данным денатурирующего электрофореза в ПААГ, составила 61,4 кДа (рис. 5, А), в то время как ММ нативного фермента составляла около 620 кДа (рис. 5, Б), что указывало на гомодекамерную структуру ГФ-оксидоредуктазы.

По данным изоэлектрофокусировки в ПААГ ГФ-оксидоредуктаза имела изоэлектрическую точку при рН 6,85 (рис. 6).

Бесклеточный экстракт Очищенный препарат ГФ-оксидоредуктазы имел максимумы оптического поглощения, характерные для флавоферментов (рис. 7, 1). Кофермент реакции (рис. 7, 2) был идентифицирован как ФАД методом ВЭЖХ. Связывание ФАД с молекулой фермента имело нековалентный характер: кофермент десорбировался в относительно мягких условиях (кипячение, денатурация мочевиной, инкубирование в буферах с низкой ионной силой) без проведения реакций пептидолиза, необходимых для выделения ковалентно связанного ФАД (Mewies, 1998). Восстановления активности после инкубации апофермента в буферах, содержавших различные концентрации ФАД, не происходило. Причиной этого, по-видимому, была характерная для многих флавоферментов крайне низкая стабильность апофермента, лишенного кофактора, приводящая к необратимому изменению структуры активного центра (Hefti et al., 2003).

карбоангидраза (30 кДа), ингибитор трипсина (20 кДа), -лактоальбумин (14,4 кДа); окрашивание кумасси. Б – Нативный электрофорез в ПААГ с градиентом концентрации 4M2 – белки-маркеры: тироглобулин M – белковые маркеры (pI): амилогликозидаза (3,50), соевый ингибитор трипсина (4,55), -лактоголобулин А (5,20), цепь миоглобина лошади (7,35), кислая цепь лектина чечевицы (8,15), средняя цепь лектина чечевицы (8,45), щелочная цепь лектина чечевицы (8,65), трипсиноген (9,30);

Участие ФАД в реакции расщепления ГФ было продемонстрировано при инкубации фермента в присутствии субстрата без доступа кислорода.

При этом наблюдали изменение максимумов поглощения, что указывало на восстановление ФАД (рис. 7, 4) (Pedotti et al., 2009). Данный эффект нивелировался в присутствии убихинона Q-10.

ГФ-оксидоредуктаза обладала относительно узким диапазоном оптимальных значений рН (рис. 8); максимальная активность наблюдалась при оксидоредуктазы, % Помимо ГФ, фермент проявлял активность в отношении иминодиацетата (ИДА) и фосфонометилиминодиацетата (ФИА). Для ГФ, ИДА и ФИА были определены основные кинетические константы (табл. 7). ИДА был лучшим субстратом и обладал наибольшим сродством к ферменту. Высокое значение Km для ФИА могло объясняться наличием у этого соединения третичного азота и дополнительной фосфонометильной цепью, в отличие от ИДА, Температурный оптимум активности ГФ-оксидоредуктазы был равен 40 °С (рис. 9, А); время полуинактивации в этих условиях составляло около 60 мин (рис. 9, Б).

Рисунок 9. А. Температурный оптимум глифосат-оксидоредуктазы. Б. Термостабильность фермента: – 30 °С; – 40 °С; – 45 °С; – 50° С; – 60 °С.

Ингибиторами ГФ-оксидоредуктазы были ионы Ag+, Cu2+, Mn2+, а также р-хлормеркурийбензоат (рХМБ), атакующий прежде всего тиоловые группы белков. Весьма слабыми конкурентными ингибиторами являлись глицин и саркозин. Впервые описано субстратное ингибирование фермента при больших концентрациях ГФ (табл. 8).

Ионы металлов (Mg2+, Zn2+, Ni2+) могли оказывать не только ингибирующее, но и активирующее действие на ГФ-оксидоредуктазу (рис. 10). Процесс расщепления ГФ шел быстрее всего в присутствии MgCl2, оптимальное значение концентрации которого составляло 10-15 мМ. Реакция ускорялась в меньшей степени в присутствии NiCl2 и ZnCl2 (рис. 10). Ионы Fe2+ и Co2+ заметного влияния на скорость реакции не оказывали (данные не приведены).

Значения IC50 для различных ингибиторов ГФ-оксидоредуктазы Учитывая данные о способности ГФ связываться с активным центром алкогольдегидрогеназы через атом цинка (Жемчужин и Горобец, 1989), можно предположить, что различия во влиянии металлов на активность ГФоксидоредуктазы зависят от константы устойчивости возникающих комплексов ГФ-металл-фермент, которые могут как облегчать связывание субстрата в активном центре, так и препятствовать катализу. Так, в присутствии ионов Cu2+ и Mn2+, ингибирующих ГФ-оксидоредуктазу, ГФ образует устойчивые комплексы с рядом органических функциональных групп (Barrett and McBride, 2005).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны качественные и количественные методики ВЭЖХ- и ТСХанализа глифосата и его метаболитов, включая их ацил-, бензоил-, дансилпроизводные. Предложен новый спектрофотометрический экспрессметод измерения активности глифосат-оксидоредуктазы, основанный на образовании фенилгидразона глиоксилата как продукта реакции.

2. Деструктор метилфосфоновой кислоты Achromobacter sp. MPS 12 был впервые адаптирован к потреблению глифосата как источника фосфора;

биодеструктивные характеристики адаптированного штамма MPS 12А были близки к таковым у O. anthropi GPK 3.

3. Доказано существование у бактерий двух С–Р лиазных систем, специфичных для разных субстратов: С–Р лиаза I (расщепление метилфосфоновой кислоты) и С–Р лиаза II (расщепление глифосата).

4. Изучение путей катаболизма фосфонатов у бактерий показало, что метилфосфоновая кислота и глифосат у Achromobacter sp. MPS 12A расщеплялись, соответственно, С–Р лиазой I и С-Р лиазой II, а у O. anthropi GPK 3 – С–Р лиазой I и глифосат-оксидоредуктазой.

5. Впервые идентифицирован путь катаболизма глифосата с участием глифосат-оксидоредуктазы, продукт которой – аминометилфосфоновая кислота, минерализовался по ранее не описанному метаболическому пути с участием аминометилфосфонат-специфичной аминотрансферазы и фосфонатазы.

6. Впервые очищен до гомогенного состояния и охарактеризован фермент первичной атаки глифосата – глифосат-оксидоредуктаза. В нативной форме фермент являлся гомодекамером (ММ 620 кДа); ММ субъединицы 61,4 кДа; кофактор ФАД; оптимум рН 8,05, температуры – 40 °С; pI 6,85; ингибиторы рХМБ, Ag+, Cu2+, Mn2+.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН Винокуровой Н. Г. и к.х.н. Зеленковой Н. Ф. за помощь в создании методов анализа органофосфонатов и синтез фосфоноацетальдегида, а также д.б.н. Моргунова И. Г. за помощь в разработке метода измерения активности фосфонатазы.

Автор глубоко признателен к.б.н. Ермаковой И. Т. и д.б.н. Леонтьевскому А. А. за помощь в подготовке настоящей работы и плодотворное обсуждение ее этапов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Свиридов А. В., Зеленкова Н. Ф., Винокурова Н. Г., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Новые подходы к идентификации и определению активности ферментов деградации глифосата. Биохимия. 2011. № 6. C. 880-887.

Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Биодеструкция глифосата почвенными бактериями: оптимизация процесса культивирования и способ сохранения активной биомассы. Микробиология. 2012. № 1. C. 48-55.

3. Sviridov, A. V., Shushkova, T. V., Zelenkova, N. F., Vinokurova, N. G., Morgunov, I.

G., Ermakova, I. T., Leontievsky, A. A. Distribution of Glyphosate and Methylphosphonate Catabolism Systems in Soil Bacteria Ochrobactrum anthropi and Achromobacter sp. Appl.

Microbiol. Biotechnol. 2012. V. 97. P. 787-796.

Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Обнаружение и очистка нового фермента первичной атаки органофосфонатов – глифосатоксидоредуктазы. Сб. тез. 12-й международной школа-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». 2008. Пущино. C. 104-105.

Свиридов А. В., Ермакова И. Т., Шушкова Т. В., Леонтьевский А. А. Ремедиация загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных биопрепаратов. Материалы 5-й международной конференции «Наука и образование для целей биобезопасности».

2008. Пущино. C. 108-109.

Свиридов А. В., Шушкова, Т. В., Ермакова, И. Т., Леотьевский, А. А. Разработка научных основ для создания методов ремедиации загрязненных органофосфонатами почв с помощью микробных препаратов. Сб. тез. международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». 2008. Пущино. С. 78.

Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Метаболические пути деструкции глифосата у почвенных бактерий. Сб. статей всероссийской конференции с элементами научной школы для молодежи «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». 2009. Пущино-Тула. С. 84-85.

5. Sviridov A. V., Leontievsky A. A. Enzymes of phosphonates metabolism in soil bacteria.

Abstr. 3rd International conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology http://www.formatex.org/biomicroworld2009/abstracts/htm/167.htm Свиридов А. В., Шушкова Т. В., Ермакова И. Т., Леонтьевский А. А. Биохимические основы разработки микробных препаратов для ремедиации загрязненных органофосфонатами почв. Сб. тез. Пущинской научно-практической конференции «Системная биология». 2009. Пущино. С. 34-35.

Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Характеристика нового фермента первичной атаки органофосфонатов – глифосат-оксидоредуктазы. Сб. тез. 14-й международной школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века». 2010. Пущино. Т. 1. С.

59-60.

Свиридов А. В. Глифосат-оксидоредуктаза — новый фермент первичной атаки органофосфонатов. Материалы международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010». 2010. Москва. С. 62-63.

Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Глифосат-оксидоредуктаза: новый фермент деструкции органофосфонатов у бактерий. Сб. тез. 2-го международного конгресспартнеринга и выставки по биотехнологии и биоэнергетике «EurasiaBio». 2010. Москва.

С. 161-162.

Свиридов А. В., Леонтьевский А. А. Пути утилизации глифосата почвенными 10.

штаммами-деструкторами Ochrobactrum anthropi GPK 3 и Achromobacter sp. MPS 12A.

Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2011. Москва. С. 59-60.



 
Похожие работы:

«ЮРЦЕВА АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И АКВАКУЛЬТУРЕ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 1 Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«ЛОСИЧ Милана Анатольевна ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ШТАММА ERA-СВ 20М ВИРУСА БЕШЕНСТВА И РАЗРАБОТКА НА ЕГО ОСНОВЕ АНТИРАБИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ 03.02.02. – вирусология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2014 г. Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского Минздрава РФ и Автономной некоммерческой организации Научноисследовательский...»

«Курбанова Патимат Магомедкадиевна ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ ПО ЭФФЕКТИВНОЙ ВОЗРАСТНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ЛИСТОВОЙ РЖАВЧИНЕ Специальность: 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Диссертационная работа выполнена в лаборатории иммунитета отдела генетики Всероссийском научно-исследовательском институте растениеводства им. Н.И. Вавилова в 2005 – 2009 гг. Научный руководитель :...»

«НИМБУЕВА АЮНА ЗОРИКТОЕВНА ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ В ОРГАНИЧЕСКОМ ВЕЩЕСТВЕ ЛУГОВО-ЧЕРНОЗЕМНЫХ МЕРЗЛОТНЫХ И СЕРЫХ ЛЕСНЫХ ПОЧВ ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.00.27 – Почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук г. Улан- Удэ 2007 Работа выполнена в лаборатории биохимии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Галина Доржиевна Официальные оппоненты : доктор...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«Воронкова Валерия Николаевна ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОШАДЕЙ САЯНО-АЛТАЙСКОГО РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК МАРКЕРОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2012г. Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва Научный...»

«СУДНИК Светлана Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРАТЕГИЙ КРЕВЕТОК 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград - 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Буруковский Рудольф Николаевич Официальные...»

«Абуладзе Александр Викторович ХИЩНЫЕ ПТИЦЫ ГРУЗИИ 03.00.08 - зоология Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Тбилиси - 2006 1 Работа выполнена в лаборатории позвоночных животных Института зоологии Республики Грузии Научный руководитель : Галушин Владимир Михайлович доктор биологических наук, Официальные оппоненты : Чолокава Автандил Олифантович. доктор биологических наук, 03.00.08. Эдишерашвили Гия Вахтангович...»

«Цыганов Андрей Николаевич Морфологическая изменчивость, видовой состав и структура сообществ сфагнобионтных раковинных амёб Специальность 03.00.18 – Гидробиология 03.00.08 – Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на кафедре гидробиологии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Научные руководители:...»

«Красникова Мария Сергеевна ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ TAS3, КОДИРУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ta-siРНК У НЕЦВЕТКОВЫХ НАЗЕМНЫХ РАСТЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ У НЕКОТОРЫХ ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ 03.01.03 - молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного...»

«Шамсувалеева Эльмира Шамилевна ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ СОБАК) С ДИКОЙ ФАУНОЙ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ - 2008 Работа выполнена на кафедре биоэкологии естественно-географического факультета Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (ТГГПУ) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Рахимов Ильгизар Ильясович...»

«ТРУШКОВА Марина Александровна СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ МЕЛКИХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ЛАНДШАФТАХ РАЗЛИЧНОГО РАНГА (на примере Нижегородского Поволжья) Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 2 Работа выполнена на кафедре зоологии и общей биологии естественно-географического факультета ГОУ ВПО Нижегородский государственный педагогический университет Научный руководитель : доктор биологических...»

«Семенькова Елена Геннадьевна БИОЛОГИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРОМЫСЛА ЯПОНСКОГО МОХНАТОРУКОГО КРАБА ERIOCHEIR JAPONICA В ВОДОЕМАХ ПРИМОРЬЯ 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2007 2 Работа выполнена в лаборатории ресурсов промысловых беспозвоночных прибрежных вод и континентальных водоемов и в секторе экосистемных исследований биоресурсов прибрежных вод Федерального государственного унитарного...»

«Меркулова Ольга Сергеевна ЛИШАЙНИКИ СТЕПНОЙ ЗОНЫ ЮЖНОГО УРАЛА И ПРИЛЕГАЮЩИХ ТЕРРИТОРИЙ 03.00.24 — Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2006 Работа выполнена в Лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи УрО РАН. Научный руководитель : кандидат географических наук Урбанавичюс Геннадий Пранасович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Голубкова Нина Сергеевна...»

«АШИБОКОВА ЛИАНА РАШИДОВНА ЭКОЛОГО-ЦЕНОТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДГОРНЫХ СТЕПЕЙ КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕСИИ И ИХ ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена в ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхозакадемии Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Дзыбов Джантемир Сосренович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Акатов...»

«Семенова Ольга Владимировна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА НАСЕЛЕНИЯ ЖУЖЕЛИЦ ПАРКОВОЙ ЗОНЫ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА НА ПРИМЕРЕ НИЖНЕГО ТАГИЛА 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург - 2008 2 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской Академии Наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Ольшванг Владимир Николаевич Официальные оппоненты : доктор...»

«ФИЛИППОВ Дмитрий Андреевич СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЭКОСИСТЕМ ПОЙМЕННЫХ БОЛОТ БАССЕЙНА ОНЕЖСКОГО ОЗЕРА (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.16 – экология 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор БОЛОТОВА Наталья Львовна доктор биологических наук,...»

«Лысак Людмила Вячеславовна Бактериальные сообщества городских почв Специальность 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Звягинцев Дмитрий Григорьевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Карпачевский Лев Оскарович...»

«1 НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Анисимова Марина Анатольевна Детоксицирующая способность почв и выделенных из них гуминовых кислот по отношению к гербицидам 03.00.27-почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 1997 2 Актуальность темы. Применение средств химической защиты растений, ставшее неотъемлемым элементом практики современного земледелия, привело к возникновению проблемы загрязнения почвенного покрова остаточными количествами гербицидов и их...»

«Устименко Елена Александровна БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ У ТИХООКЕАНСКИХ ЛОСОСЕЙ ПРИ ИСКУССТВЕННОМ ВОСПРОИЗВОДСТВЕ НА КАМЧАТКЕ 03.02.06 — ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2012 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Камчатский государственный технический университет и Камчатском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (КамчатНИРО) Научный руководитель : доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.