WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ДУХОВЛИНОВА

Елена Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНА env ШТАММОВ ВИЧ-1,

ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ГРУППАХ РИСКА В САНКТПЕТЕРБУРГЕ

03.01.04 – Биохимия

03.01.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена в лаборатории негосударственного научноисследовательского учреждения «Биомедицинский центр», Санкт-Петербург.

Научный руководитель - доктор биологических наук профессор Козлов Андрей Петрович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Евтушенко Владимир Иванович кандидат биологических наук доцент Тищенко Людмила Ивановна Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт гриппа СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится « »_ 2010 г. в _часов на заседании Совета Д.212.232.09 по защите кандидатских и докторских диссертаций при СанктПетербургском государственном университете (199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., д.7/9, ауд. 90)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. А. М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « »2010 г.

Ученый секретарь кандидат биологических наук Л.С. Курилова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В России и других странах бывшего СССР в настоящее время наблюдаются самые высокие в мире темпы роста числа новых случаев ВИЧ-инфекции. Подавляющее большинство случаев ВИЧ-инфекции происходит за счет инъекционного употребления наркотиков. В октябре года общее число случаев ВИЧ-инфекции, зарегистрированных в России с момента начала эпидемии, составило 516167 [Федеральный центр СПИД, 2009].

В такой ситуации для эффективной борьбы против эпидемии необходима разработка вакцины против ВИЧ/СПИД. Одной из проблем в создании эффективной вакцины против ВИЧ-1 является его высокий уровень генетического разнообразия. Высокие частоты мутационных и рекомбинационных процессов, высокая скорость размножения и большой размер вирусной популяции ведут к высокой изменчивости вируса в каждом инфицированном организме [Ho et al., 1995, Hu et al., 1990, Roberts et al., 1988].





Создание кандидатных вакцин против ВИЧ/СПИД считается целесообразным проводить на основе генов и белков субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ-1, распространенных в регионе, для которого эти вакцины предназначены [Hanke et al., 2000]. ДНК-вакцина против ВИЧ, создающаяся исследовательской группой под руководством А.П. Козлова в Санкт-Петербурге, содержит ген белков оболочки ВИЧ-1 восточно-европейского варианта субтипа A, поскольку в момент разработки вакцины именно этот вариант доминировал в регионе [Мурашев и др., 2003]. Мониторинг генетического разнообразия ВИЧ-1 в популяции, а особенно в группах повышенного риска инфицирования ВИЧ, необходим для совершенствования профилактики, терапии и создания эффективной вакцины.

В момент инфицирования, за счет индивидуальных особенностей защитных реакций организма, происходит отбор новых вирусных вариантов, увеличивающий генетическое разнообразие ВИЧ-1 в человеческой популяции [Lawson et al., 2002]. В настоящее время существует теория о передаче половым путем (гетеро- и гомосексуально) преимущественно единичных геномов ВИЧ [Wolfs et al., 1992, Derdeyn et al., 2004, Long et al., 2000, Sagar et al., 2003].

Наличие подобной избирательности при парентеральной передаче ВИЧ-1 ранее установлено не было.

Детальная генетическая и иммунологическая характеристика переданных изолятов может помочь в разработке эффективной вакцины против ВИЧ.

[Derdeyn et al, 2004, Gottlieb et al, 2008, Keele et al, 2008]. Разработан новый подход лабораторной оценки эффективности кандидатной вакцины – определение иммунологических свойств белков оболочки ВИЧ и особенностей их взаимодействия с нейтрализующими антителами на стандартизованных панелях псевдовирусов, полученных на основе переданных изолятов ВИЧ [Mascola et al, 2005]. Изучение разнообразия гена env передаваемых изолятов ВИЧ и создание панели псевдовирусов на их основе является одним из наиболее перспективных подходов к созданию эффективной вакцины против ВИЧ [Li et al, 2005].

Цель и задачи исследования. Целью данного исследования являлось изучить разнообразие гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в Санкт-Петербурге, для последующего использования полученной информации в целях разработки отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.

Задачи исследования:

Определить нуклеотидные последовательности фрагмента гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группах риска в СанктПетербурге.

Сравнить генетическое разнообразие ВИЧ-1 в различных группах риска.

полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в крови ПИН с острой и ранней стадиями ВИЧ-инфекции.

Оценить количество вариантов ВИЧ-1, передаваемых парентерально.

Изучить свойства гликопротеина оболочки gp120 переданных штаммов ВИЧ-1.





Получить панель псевдовирусных конструкций, содержащих белки оболочки переданных изолятов ВИЧ-1 варианта А-ЕЕ для последующего изучения иммунологических свойств кандидатных вакцин Научная новизна работы. Впервые показано особое положение штаммов субтипа В из стран бывшего СССР на филогенетическом дереве ВИЧ-1.

Обнаружен первый случай инфицирования штаммом ВИЧ-1, относящимся к циркулирующей рекомбинантной форме СRF06_cpx, в Санкт-Петербурге, и показана его вторичная рекомбинация с восточно-европейским вариантом субтипа А.

Впервые секвенированием единичных копий полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в организме ПИН, установлено наличие т.н.

«бутылочного горлышка», т.е. избирательности при передаче штаммов ВИЧ парентеральным путем.

Впервые создана панель псевдовирусных конструкций на основе переданных штаммов восточно-европейского варианта субтипа А для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ-1.

Научно-практическая значимость работы. Показано наличие двух независимых эпидемий ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге в группах риска ПИН и МСМ. Среди ПИН было выявлено присутствие преимущественно штаммов восточно-европейского варианта субтипа А (А-ЕЕ), тогда как среди МСМ циркулировали штаммы субтипа В. Показано, что новые случаи ВИЧ-инфекции вызываются штаммами А-ЕЕ, и таким образом установлена целесообразность испытания кандидатных вакцин против ВИЧ-1, содержащих гены варианта АЕЕ среди ПИН. В рамках данной работы получены фрагменты и полноразмерные копии гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди групп риска в Санкт-Петербурге. Определены и проанализированы их нуклеотидные последовательности, которые депонированы в международную базу данных GenBank. Выявлено наличие «бутылочного горлышка» при парентеральной передаче ВИЧ-1. Получена панель псевдовирусных конструкций на основе штаммов субтипа А, которая будет использована для проведения испытаний кандидатных вакцин против ВИЧ.

Полученные результаты представляют большой интерес для молекулярной эпидемиологии ВИЧ-инфекции в России и являются важным достижением в области создания реагентной базы для разработки, производства и испытания отечественной вакцины против ВИЧ/СПИД.

Форма выполнения диссертационной работы. Работа выполнялась в рамках финансирования ННИУ «Биомедицинский центр» по федеральному проекту, выполняемому в соответствии с распоряжением Правительства РФ №1905-р «Разработка ДНК-вакцины против ВИЧ и молекулярноэпидемиологический мониторинг разнообразия ВИЧ в Санкт-Петербурге», а также по грантам Международного центра Фогарти (Fogarty International Center) «Подготовка специалистов и исследования по превенции ВИЧинфекции в России» (№ 5D43TW01028) и Американского фонда гражданских исследований и развития (CRDF) «Исследования в области ВИЧ и туберкулеза»

(№ RUB1-7000-ST-08).

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 16-й, 17-й и 18-й Международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье», Санкт-Петербург, Россия, в 2007, 2008 и 2009 годах; 14й, 15-й и 17-й конференциях по ретровирусам и оппортунистическим инфекциям, США, в 2007, 2008 и 2010 годах; 4-й конференции по патогенезу и лечению СПИДа Международного Общества по СПИДу, Сидней, Австралия, 2007;

Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва, Россия, 2009. По теме диссертации опубликовано 2 статьи и тезисов докладов.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 173 страницах машинописного текста, иллюстрирована рисунками, 10 таблицами и 2 приложениями. Список литературы содержит литературных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Сыворотки крови. В данной работе использовались образцы сыворотки крови, полученные от участников различных исследований, проводившихся в Биомедицинском центре с 2002 по 2009 год. Образцы сывороток хранились при температуре -80°С и использовались для данного исследования с письменного согласия участников. Все образцы крови были протестированы на антитела к ВИЧ-1 и маркеры гепатита С и ИППП (сифилис, гонорея, ВПГ-2).

Для анализа разнообразия гена env в группах риска использовали образцы сыворотки крови, полученные в Санкт-Петербурге в 2005-2008 годах от : (1) Потребителей иньекционных наркотиков (ПИН) - активные наркопотребители и те, кто имел опыт использования иньекционных наркотиков в течение жизни.

(2) Половые партнеры ПИН, никогда не употребявшие наркотиков. (3) Мужчины, имеющие секс с мужчинами (МСМ). Среди 127 ВИЧположительных участников мы выявили 26 случаев недавней (до полугода) ВИЧ-инфекции и 16 случаев хронической инфекции ВИЧ.

Для анализа популяции ВИЧ-1 в крови ПИН в начальной фазе инфекции использовали образцы сыворотки крови, полученные с 2002 по 2008 год от участников с т.н. острой и ранней ВИЧ-инфекцией в соответствии с классификацией по Фибигу [Fiebig et al, 2003] (см. табл. 2) Демографические, клинические и и поведенческие характеристики участников с острой и участника ВН-вирусная нагрузка; 2 Рискованное использование наркотиков за счет использования нестерильного оборудования или чужих шприцев; 3 Безопасное использование наркотиков в течение последних 30 дней.

Нуклеотидные последовательности фрагмента гена env были получены матрице неразведенной кДНК и представляли собой консенсусные последовательности.

Для полноразмерного гена env были получены единичные ампликоны по методу АЕГ [Salazar-Gonsalez et al., 2008]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разнообразие субтипов ВИЧ-1 в Санкт-Петербурге. В нашем исследовании мы обнаружили присутствие штаммов ВИЧ-1 восточноевропейского варианта субтипа А (А-ЕЕ) в 126 образцах крови, полученных от ПИН и их половых партнеров в Санкт-Петербурге в 2005-08 годах. Наличие данного варианта было показано с помощью секвенирования и филогенетического анализа коротких фрагментов гена env (109 из образцов) и полноразмерного гена env (16 из 17 образцов) штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе ПИН. Полученные результаты соответствуют предыдущим наблюдениям нашей группы и других авторов о том, что в СанктПетербурге среди ПИН циркулирует и передается половым путем восточноевропейский вариант субтипа А, или А-ЕЕ.

Среди ПИН с ранней ВИЧ-инфекцией мы обнаружили одного участника, в крови которого циркулировали штаммы CRF06_cpx. Наличие ЦРФ CRF06_cpx в крови данного участника было подтверждено секвенированием и филогенетическим анализом полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1 этого пациента. Это первый случай выявления данной ЦРФ в Санкт-Петербурге.

Помимо изолятов CRF06_cpx, которые доминировали в образце крови пациента SC1283, мы обнаружили уникальные рекомбинанты между CRF06_cpx и A-ЕЕ.

филогенетическим анализом (Рис.1) и сканирующим анализом генетического расстояния между нуклеотидными последовательностями (данные не представлены) участков единичных ампликонов. Отдельно штаммов A-EE в данном образце выявлено не было.

Секвенирование и филогенетический анализ коротких фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска МСМ, показали, что из проанализированных образцов 17 содержали штаммы ВИЧ-1 субтипа В (Рис.2).

Филогенетический анализ выявил, что большинство штаммов ВИЧ-1, обнаруженных в Санкт-Петербурге, оказались родcтвенными штаммам ВИЧ- из других регионов России и стран бывшего СССР. Это наблюдение свидетельствует о том, что эпидемия ВИЧ-1 субтипа В развивается в СанктПетербурге главным образом за счет распространения из других регионов России, а не только благодаря заносам из Западной Европы и США, как было раньше.

Один образец крови был получен от участника, который указал повышенный риск не только полового гомосексуального, но и парентерального заражения ВИЧ, и содержал штамм ВИЧ-1 варианта А-EE. Мы предполагаем, что данный индивид, несмотря на принадлежность к группе риска МСМ, заразился ВИЧ-1 парентеральным путем.

Результаты, полученные в данной части нашего исследования, Рис. 1. Результаты филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей 3'-концевого фрагмента ампликонов SC1283 с координатами 8330- п.н. в геноме HXB2. Исследуемые последовательности отмечены кружками, референсные – названиями в формате GenBank.

свидетельствуют о том, что в Санкт-Петербурге среди ПИН циркулируют штаммы ВИЧ-1 варианта А-EE. Учитывая эти данные, а также высокий уровень заражаемости ВИЧ в данной группе риска [Kozlov et al., 2006, Verevochkin et al., 2008], среди ПИН обосновано применение ДНК-вакцины против ВИЧ, несущей гены варианта А-ЕЕ. В группе риска МСМ обосновано применение ДНКвакцины против ВИЧ, несущей гены субтипа B.

Генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри субтипов. Значения генетического расстояния, полученные для штаммов субтипа А, были достоверно ниже значений, полученных для штаммов субтипа В. Это наблюдение согласуется с историей развития эпидемии ВИЧ в России и в мире.

Эпидемия ВИЧ-1 субтипа В в России началась на десятилетие раньше, чем эпидемия ВИЧ-1 субтипа А, и пути распространения этих субтипов различались. Давняя история эпидемии ВИЧ-1 субтипа В, половой путь передачи и множество заносов штаммов данного субтипа в страну из-за границы создали предпосылки для более высокой гетерогенности вируса.

Эпидемия ВИЧ-1 субтипа А среди ПИН имела «эффект основателя», т.е.

началась с единичного случая, и за счет высокой заражаемости парентеральным путем за короткий промежуток времени охватила большое число людей. При этом вирус не успевал значительно дивергировать внутри отдельного Рис. 2. Результаты филогенетического анализа 17 нуклеотидных последовательностей фрагмента гена env, полученных из группы риска полового инфицирования ВИЧ (МСМ). Кружками обозначены изучаемые последовательности.

Черным цветом обозначены референсные последовательности ВИЧ-1, взятые из GenBank.

Референсная последовательность субтипа А использована в качестве внешней группы.

индивида, поэтому долгое время генетическое разнообразие ВИЧ-1 в популяции остается на относительно низком уровне.

При сравнении генетического расстояния в подгруппах ПИН с недавней (менее полугода) и хронической (более года) ВИЧ-инфекцией мы обнаружили статистически достоверные различия: в подгруппе ПИН с недавней инфекцией генетическое разнообразие было ниже, чем в подгруппе с хронической инфекцией (Рис. 3). Это может быть связано с тем, что большая часть заражения происходит от пациентов, находящихся в ранней стадии инфекции.

Рис. 3. (A) Сравнительный анализ генетического разнообразия фрагмента гена env для штаммов ВИЧ-1 субтипа А (ПИН) и субтипа В (МСМ). (Б) Сравнительный анализ генетического разнообразия фрагмента гена env для штаммов ВИЧ-1 субтипа А из разных подгрупп ПИН. На оси абсцисс отмечены изучаемые подгруппы, на оси ординат - значения генетического расстояния, полученные при попарном сравнении нуклеотидных последовательностей.

Генетическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧинфицированных ПИН. С помощью секвенирования, анализа нуклеотидных различий и филогенетического анализа единичных копий полноразмерного гена env мы обнаружили множественную передачу вирусных вариантов (два и более) в 4 случаях из 13, что составило 30.7% (См. Табл.2). Это несколько больше, чем было обнаружено при передаче ВИЧ половым путем [Keele et al, 2008, Abrahams et al, 2009], хотя данное превышение не является статистически достоверным.

Данные генетического разнообразия полноразмерного гена env изолятов ВИЧ-1, полученных от ПИН с острой и хронической инфекцией Таким образом, почти в 70% случаев мы наблюдали А.

популяцию ВИЧ в крови ПИН с острой и ранней инфекцией (по Фибигу). Поведенческие (отсутствие презервативов, большое число сексуальных партнеров или наличие ИППП) позволили нам полностью исключить половой путь передачи ВИЧ пациентов с острой/ранней ВИЧ-инфекцией (R163, R497, R575, K08 и K84, см. Табл 1).

Для этих 5 пациентов анализ Б.

нуклеотидных различий и филогенетический анализ единичных ампликонов показал наличие в крови единичных вариантов ВИЧ-1.

Образец крови SC содержал два типа изолятов, соответствовал CRF06_cpx, а другой – рекомбинанту по 3' CRF06_cpx и вариантом A-ЕЕ (Рис 1). Участок 5', общий для CRF06_cpx/A-ЕЕ, высокой гомогенностью, и отдельно вариантов A-ЕЕ в образце обнаружено не было.

Эти два наблюдения позволяют популяции в образцах H410. (А) Диаграмма предположить, что нуклеотидных различий, где ампликоны рекомбинация произошла в сортированы по наличию мутаций. (Б) Результат организме донора, и пациент филогенетического анализа полученных SC указанными рекомбинантами скобками и стрелкой справа.

ВИЧ от одного донора в один момент времени. Однако, мы не можем исключать версию того, что индивид SC1283 заразился двумя вирусными вариантами – варианта А-ЕЕ и CRF06_cpx, после чего на самых ранних стадиях инфекции произошла рекомбинация этих двух вариантов. Штаммы рекомбинантной формы CRF06_cpx могли оказаться более приспособлеными и размножились в организме, а штаммы субтипа А могли элиминироваться из организма за счет гипермутирования и нарушений репликации. Косвенно в пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что среди ПИН в Эстонии штаммы CRF06_cpx доминируют, практически вытеснив штаммы A-EE. Мы не можем полностью исключать и суперинфекцию, т.е. заражение уже инфицированного организма штаммами другого субтипа.

Хотя теоретически в когорте ПИН должна наблюдаться большая частота передачи нескольких вирусных вариантов при заражении ВИЧ по сравнению с когортами, где доминирует половой путь передачи, большинство инфекций в нашем случае было инициировано одним вирусным вариантом.

Особенности использования наркотиков, частота половых контактов и распространенность ИППП влияют на число передаваемых при заражении ВИЧ вирусных вариантов в любой когорте. Кроме того, в популяции со столь высокой заражаемостью ВИЧ-1, какая наблюдается в Санкт-Петербурге [Kozlov et al., 2006], большинство доноров ВИЧ-инфекции могут находиться в стадии острой или ранней инфекции с низким уровнем генетического разнообразия вируса, и поэтому даже в случае передачи нескольких вариантов они будут не отличимы друг от друга. Мало что известно о вирусных популяциях в течение первых нескольких дней после передачи ВИЧ-1. Согласно одной из гипотез, единственная вирусная частица заражает одну клетку, после чего вирус успешно размножается и данное событие дает начало продуктивной инфекции. По другой гипотезе, в организм проникают многочисленные вирусы, но в результате отбора при размножении в клетках реципиента вирусная популяция становится гомогенной. [Learn et al, 2002] Мы обнаружили примера, подтверждающих вторую гипотезу. В образцах крови H410 мы наблюдали на стадии III – 3 вирусных варианта, а на стадии IV – только два, что было подтверждено анализом нуклеотидных различий и филогенетическим анализом единичных ампликонов env этих образцов (См. Рис 4). Для образцов R053 мы выяснили, что вирусный вариант, который в популяции на стадии V был минорным, на стадии IV стал доминировать (данные не представлены) Мы изучили генетическую сложность вирусной популяции в крови ПИН с острой и ранней ВИЧ-инфекцией. Множественные вирусные варианты были представлены лишь в 30% (4 из 13 пациентов) случаев.

Филогенетический анализ показал, что штаммы ВИЧ-1, обнаруженные у разных ПИН, не образуют эпидемиологический кластер, и генетическое разнообразие ВИЧ-1 внутри организма ПИН с хронической ВИЧ-инфекцией значительно выше, чем в случаях недавней ВИЧ-инфекции. Эти факты свидетельствуют о том, что низкая сложность вирусной популяции у недавно инфицированных ПИН может обьясняться передачей низких инфекционных доз при заражении среди ПИН. Однако более низкая общая сложность местной эпидемии вследствие начальной стадии ВИЧ-инфекции у доноров и высокой заражаемости в популяции также может быть причиной наблюдаемого эффекта «бутылочного горлышка».

Фенотипическое разнообразие вирусной популяции в организме ВИЧ-инфицированных ПИН. При анализе аминокислотных последовательностей единичных ампликонов env, полученных от ПИН с острой/ранней и хронической стадией ВИЧ-инфекции, мы обнаружили, что по правилу 11/25 и суммарному заряду V3-петли (Табл. 3) большинство вирусов имеют R5-фенотип.

Результаты анализа аминокислотной последовательности V3-петли Номер Аминокислотная последовательность Правило заряда

CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAYC

CSRPGNNTRTSVRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAHC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAHC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFFGTGDVIGDTRKAHC

CIRPSNNTRTGIRIGPGQTFYATGNVIGDIRKAYC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQAFYATGDVIGDIRKAHC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAYC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDPRKAHC

CIRPGNNTRTSVRIGPGQTWYATGGVTGDIRRAYC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAYC

CIRPGNNTRTSMRIGPGQTFYATGDVTGDIRKAYC R5 R

CIRPSNNTRTSIRIGPGQTFYATGEVVGNIRKAYC

CIRPSNNTRTSIRIGPGQTFYATGKVVGNIRKAYC

CTRPYNNTRKSIHIGPGQSFYATGAIIGDIRQAHC

CIRPGNNTRTGIHIGPGQTFFATGAVIGDIRKAHC

SC1457-B12 CIRPSSKTRASIRIGPGRTFYAMDGVGGNPRKAYC

CTRPGNNTRKSTRIGPGQTFYTTGEIIGDIRKAHC

CIRPGNNTRTSVRIGPGQTFYATGDVIGDIRRAHC

CIRPGNNTRTSIRIGPGQAFYATGEVTGDIRKAHC R5 R

В двух случаях в популяции ВИЧ внутри пациента мы обнаружили и R5-, и X4-варианты, причем в случае пациента SC1457 результаты предсказания фенотипа двумя различными методам различались: фенотип Х4 в случае одного из изолятов определялся лишь по правилу заряда, которых был равен шести.

Наличие вариантов, различных по фенотипу, в вирусной популяции одного пациента свидетельствует об эволюции вируса внутри хозяина.

Мы сравнивали число потенциальных сайтов гликозилирования между хронически инфицированными пациентами и пациентами с острой и ранней ВИЧ-инфекцией и выяснили, что достоверных различий в количестве сайтов между этими группами не наблюдается. При анализе количества потенциальных сайтов отдельных образцов мы заметили уменьшение числа сайтов на один при прогрессии инфекции в образцах R497. Сайт отсутствовал в участке между V2 и V3 петлями. Литературных данных, которые бы свидетельствовали о влиянии наличия сайта гликозилирования в данном положении на фенотип, на данный момент нет. В образце SC1475-B12 помимо увеличения суммарного заряда наблюдалось отсутствие консервативного сайта гликозилирования в начале V3 петли. Наличие этого сайта гликозилирования ассоциировано с R5-фенотипом, а его отсутствие является дополнительным признаком фенотипа X4 исследуемого варианта SC1457 [Ogert et al, 2001, Pollakis et al, 2001]. Мы обнаружили два изолята, соответствующие ампликонам SC1457-В12 и R526, которые обладали двойным тропизмом и могли использовать как CCR5-, так и CXCR4-корецепторы. Остальные изоляты имели фенотип R5. (Рис.5).

Рис. 5. Анализ вирусных культуре клеток ингибиторов корецепторов CCR5 (R5) и CXCR4 (X4).

Таким образом, теоретические методы предсказания использования корецептора, построенные на модели субтипа В, в нашем случае с изолятами субтипа А оказались неточными (см. табл. 3.2.3). Присутствие в образцах в основном вирусов фенотипа R5 согласуется с тем фактом, что большинство образцов были получены на острой и ранней стадиях ВИЧ-инфекции.

Отсутствие вирусов фенотипа X4 в образцах с хронической инфекцией может быть связано с небольшой выборкой (4 образца). В данной части исследования мы получили панель псевдовирусов восточно-европейского варианта субтипа А, состоящую из 8 образцов c различными фенотипическими свойствами, которые выражались в использовании корецптора ССR5 или CCR5/CXCR4.

Данная панель будет использована для будущего исследования эффективности кандидатных вакцин против ВИЧ-1.

ВЫВОДЫ

1) Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска парентерального заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует восточно-европейский вариант субтипа А с низким уровнем генетического разнообразия.

2) Секвенирование и филогенетический анализ фрагментов гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в группе риска гомосексуального полового заражения ВИЧ-1, показали, что в данной группе риска доминирует субтип В с высоким уровнем генетического 3) Сравнение попарных значений генетического расстояния фрагмента гена env в группе риска парентерального заражения ВИЧ показало, что генетическое разнообразие штаммов в подгруппе с недавней инфекцией было меньше, чем в подгруппе с хронической 4) Методом амплификации и секвенирования единичных копий полноразмерного гена env штаммов ВИЧ-1, циркулирующих среди ПИН с острой и ранней инфекцией ВИЧ, в 70% случаев была показана парентеральная передача генетически однородных вирусных вариантов, т.е. впервые продемонстрирован эффект генетического «бутылочного горлышка» при передаче ВИЧ-1 у 5) Анализ гликопротеина gp120 оболочки штаммов ВИЧ-1 с использованием подходов биоинформатики и изучение тропизма псевдовирусных конструкций показал наличие в вирусной популяции ПИН, находящихся на стадиях острой и ранней ВИЧинфекции, преимущественно CCR5-тропных вирусов.

6) В рамках данного исследования впервые получена панель псевдовирусных конструкций с охарактеризованным нуклеотидным и белковым составом гена env изолятов ВИЧ-1 восточноевропейского варианта субтипа А, которая будет использована для вакциновых препаратов.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

1. Murashev B.V., Kazennova E.V., Kozlov A.A., Murasheva I.V., Dukhovlinova E.N., Galachyants Y.P., Dorofeeva E.C., Dukhovlinov I.V., Smirnova G.V., Masharsky A.E., Klimov N.A., Kozlov A.P. Immunogenicity of candidate DNA vaccine based on subtype A human immunodeficiency virus type 1 predominant in Russia.// Biotechnol. J. – 2007. – V.2. – P.871- 2. Beyrer C., Baral S., Shaboltas A., Dukhovlinova E., Masharsky A., Verevochkin S., Latkin C., Heimer R., Hoffman I., Kozlov A. The feasibility of HIV vaccine efficacy trials among Russian injection drug users. // Vaccine. Vol. 25(41). –P.7014-7016.

3. Dukhovlinova E., Masharsky A., Solovjeva T., Verevochkin S., Toussova O., Klimov N., Alexander L., Heimer R., Kozlov AP. The Surveillance of HIV- Subtype Distribution in the Year 2005 to 2006 in Saint Petersburg, Russia.//

Abstract

#515 of the 15th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, Boston, MA, USA. - 2008. - Р.515.

Духовлинова Е.Н., Машарский, А.Э., Мерингоф М., Веревочкин С.В., Тюсова О.В., Климов Н.А., Волкова Г.В., Андерсон Дж., Сванстрём Р., Хаймер Р., Козлов А.П. Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 в СанктПетербурге в 20052008 гг.//Тезисы Конференции по вопросам ВИЧ/СПИДа в Восточной Европе и Центральной Азии, Москва. - 2009. Т.2. - С.245.

5. Dukhovlinova E., Masharsky A., Verevochkin S., Shevchenko A., Toussova O., Skochilov R., Anderson J, Cohen M., Swanstrom R., Kozlov A. A significant transmission bottleneck among newly and recently HIV-1 infected injection drug users in St. Petersburg, Russia.//Abstract #477 of the 17th Conference on Retroviruses and Opportunistic Infections, san Francisco, СA, USA. – 2010. - Р. 477.



 
Похожие работы:

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ШЕСТАК Анна Александровна АКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОДА И ИХ ИСТОЧНИКИ В ПРОГРАММИРОВАННОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ И ЦИАНОБАКТЕРИИ АNABAENA VARIABILIS 03.00.2503 – гистология, цитология, клеточная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов биологического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова. Научный руководитель : доктор...»

«Миронова Виктория Владимировна КОМПЬЮТЕРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ АУКСИНА В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ КОРНЯ РАСТЕНИЙ 03.01.09 – математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории теоретической генетики, г. Новосибирск Научный руководитель : Доктор биологических наук,...»

«Бруевич Оксана Михайловна ВЛИЯНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НА ЛАБИЛЬНЫЕ ГУМУСОВЫЕ ВЕЩЕСТВА ДЕРНОВОПОДЗОЛИСТОЙ ПОЧВЫ Специальность: 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 1 Работа выполнена на кафедре почвоведения, геологии и ландшафтоведения факультета почвоведения, агрохимии и экологии Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научный руководитель...»

«САПРЫКИНА Ирина Николаевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МЕСТНЫХ И ИНТРОДУЦИРОВАННЫХ КУЛЬТИВАРОВ CERASUS MILL., PRUNUS L. В УСЛОВИЯХ ОРЕНБУРЖЬЯ Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учной степени кандидата биологических наук Оренбург – 2014 Работа выполнена на Оренбургской опытной станции садоводства и виноградарства Всероссийского селекционно–технологического института садоводства и питомниководства Россельхозакадемии и в Федеральном...»

«Свинарева Людмила Владимировна Влияние модифицированных ДНК- и РНКолигонуклеотидов, содержащих теломерные повторы, на активность теломеразы и рост опухолевых клеток 03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2010 Работа выполнена в ГУЗ Московском НИИ медицинской экологии Департамента здравоохранения г. Москвы и на кафедре биотехнологии и бионанотехнологии...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007 Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»

«ГЫНИНОВА АЮР БАЗАРОВНА ПОЧВЫ ДЕЛЬТЫ р. СЕЛЕНГИ (ГЕНЕЗИС, ГЕОГРАФИЯ, ГЕОХИМИЯ) 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории географии и экологии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный консультант : Член-корреспондент РАН, профессор Шоба С.А. Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Г.Д. доктор биологических...»

«КЛЕВЦОВА Ирина Николаевна ЭКОЛОГИЯ И ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЧВ ОРЕНБУРГСКОГО ПРЕДУРАЛЬЯ 03.00.16 - Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург-2008 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Русанов Александр Михайлович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ГУЧАСОВ ЗАУРБЕК МУАЕДОВИЧ Флора Скалистого хребта и Юрской депрессии Кабардино-Балкарии (Центральный Кавказ) и ее анализ. Специальность 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ставрополь 2003 Работа выполнена на кафедре ботаники биологического факультета Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х. М. Бербекова. Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Шхагапсоев С. Х. Официальные...»

«Левицкая Наталья Николаевна Критерии и индикаторы для оценки состояния лесов Московской области Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН Научный руководитель : Черненькова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник...»

«МАТЫЧЕНКОВ ВЛАДИМИР ВИКТОРОВИЧ РОЛЬ ПОДВИЖНЫХ СОЕДИНЕНИЙ КРЕМНИЯ В РАСТЕНИЯХ И СИСТЕМЕ ПОЧВА-РАСТЕНИЕ 03.00.12 – физиология и биохимия растений 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пущино 2008 Работа выполнена в Институте фундаментальных проблем биологии Российской академии наук Научные консультанты: доктор биологических наук Биль Карл Яковлевич доктор биологических наук, профессор Ерохин Юрий Евдокимович...»

«СМЕКАЛОВ Михаил Андреевич ВЛИЯНИЕ БИОВЕРМИКУЛИТА НА ВЫВЕДЕНИЕ ТЯЖЕЛЫХ МЕТАЛЛОВ ИЗ ОРГАНИЗМА И НОРМАЛИЗАЦИЮ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ У КОРОВ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕННОЙ ЗОНЫ 03.01.04 — Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Дубровицы, 2011г. Работа выполнена в отделе биохимических и химико-аналитических исследований Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«Воронкова Валерия Николаевна ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОШАДЕЙ САЯНО-АЛТАЙСКОГО РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК МАРКЕРОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2012г. Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва Научный...»

«ЮРЦЕВА АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И АКВАКУЛЬТУРЕ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 1 Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«ОВСЯНИКОВ Никита Гордеевич ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ АРКТИКИ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном бюджетном государственном учреждении “Государственный природный заповедник Остров Врангеля” Официальные оппоненты : доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник каф. Высшей нервной деятельности Биологического...»

«ИСАБАЕВ Берик Мухтарович СОСТОЯНИЕ БИОРАЗНООБРАЗИЯ СЕВЕРО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ ПОБЕРЕЖЬЯ КАСПИЙСКОГО МОРЯ В УСЛОВИЯХ РАЗРАБОТКИ НЕФТЯНЫХ МЕСТОРОЖДЕНИЙ 03.02.01 — Ботаника, 03.02.08 — Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург 2011 2 Работа выполнена на кафедре экологии Актюбинского государственного университета им. К. Жубанова и на кафедре ботаники и физиологии растений ГОУ ВПО Оренбургский государственный педагогический...»

«Шамсувалеева Эльмира Шамилевна ОСОБЕННОСТИ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ ДОМАШНИХ ЖИВОТНЫХ (НА ПРИМЕРЕ СОБАК) С ДИКОЙ ФАУНОЙ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ - 2008 Работа выполнена на кафедре биоэкологии естественно-географического факультета Татарского государственного гуманитарно-педагогического университета (ТГГПУ) Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Рахимов Ильгизар Ильясович...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.