WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

СГИБНЕВ АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПРО- И АНТИОКСИДАНТЫ КАК ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ И

РЕГУЛЯЦИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ С УЧАСТИЕМ

ПРОКАРИОТ

03.02.03 – Микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Оренбург – 2013

Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении науки Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН академик РАН и РАМН,

Научный консультант:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Бухарин Олег Валерьевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор, ГБОУ ВПО Оренбургская государственная медицин- Красиков ская академия Росздрава Сергей Иванович Доктор биологических наук, доцент, ГБОУ ВПО Тюменская государственная медицинская Тимохина академия Татьяна Харитоновна Доктор биологических наук, доцент, ФГБУН Институт клеточного и внутриклеточного сим- Яценко-Степанова биоза УрО РАН Татьяна Николаевна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО Южно-Уральский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита состоится 19 декабря 2013 г. в 10 ч. 00 мин. на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03 при ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул.

Советская, 6, конференц-зал (аудитория № 205) тел.: (3532)40-35-62, факс:

(3532)77-24-59, e-mail: orgma_dsl@esoo.ru, официальный сайт: http://orgma.ru/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО Оренбургской государственной медицинской академии Росздрава.

Автореферат разослан _ 2013 г., автореферат и текст объявления размещены на официальном сайте ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Немцева Наталия Вячеславовна Актуальность проблемы Рассматривая симбиоз в качестве формы существования организмов в биосфере, его по праву считают основой современного разнообразия форм жизни, положившего начало появлению эукариот (Margulis, 2002).





Появление эукариот связано с воздействием активных форм кислорода - побочных продуктов локального повышения концентрации кислорода в процессе фотосинтеза (Gross, Bhattacharya, 2010). Дополнением к этому служат материалы о том, что исходно эндосимбиотические предки митохондрий не могли ни импортировать белки, ни экспортировать АТФ, но, получая от клетки-хозяина пируват, обезвреживали токсичный для нуклеоцитоплазмы кислород (Kurland, Andersson, 2000). В последние годы получены новые доказательства роли кислорода в развитии современных симбиотических систем - это симбиоз между жёлтопятнистой амбистомой (Ambystoma maculatum) и микроскопической водорослью Oophila amblystomatis (Kerney и др., 2011), где водоросли, используя метаболиты животного, в процессе фотосинтеза вырабатывают кислород, необходимый для получения химической энергии митохондриями хозяина.

Появление около 3 миллиардов лет назад процессов оксигенного фотосинтеза (Buick, 2008) способствовало накоплению в биосфере кислорода (Farquhar, J. et al., 2000), что, в свою очередь, повлекло ряд как благоприятных, так и неблагоприятных моментов для живых организмов.

С одной стороны, кислород стал причиной мощного эволюционного скачка, проявившегося как в появлении новых механизмов добывания энергии, так и появлении принципиально новых организмов – эукариот (Anbar, Knoll, 2002), с другой - участие кислорода в метаболизме способствовало формированию оксидативного стресса, который отражает существующий в биологических системах дисбаланс между образованием и детоксикацией легко возникающих активных форм кислорода (Sies, 1997).

Негативное действие физиологически высоких концентраций АФК на структуры клетки, проявляющееся в повреждении ДНК, белков, липидов и других компонентов (Beckman, Ames, 1998) хорошо изучено, но известен и «положительный» биологический эффект АФК на клетку и ее системы. Так, например, была выявлена стимуляция активности фермента гуанилатциклазы и повышение концентрации вторичного мессенджера цГМФ под влиянием гидроксильного радикала (Mittal, Murad, 1977) и пероксида водорода (White et al., 1976), образующихся из супероксиданиона. В настоящее время растет число работ, посвященных биорегуляторной роли про- и антиоксидантов в реакции организмов на различные медиаторы и факторы внешней среды (Torres, 2010, Mittler et al., 2011).

Возможность образования прооксидантов и антиоксидантов в биологических объектах известна (Commoner et al., 1954), и было показано, что прооксиданты, в частности, активные формы кислорода, будучи побочными продуктами аэробного метаболизма, являются важнейшей причиной повреждений в клетке (Harman, 1981), а открытие фермента-антиоксиданта - супероксиддисмутазы (McCord, Fridovich, 1969) подтвердило их важную регуляторную роль в биологии.

Оксидативный стресс, его причины и последствия чаще всего рассматриваются применительно к отдельным клеткам, тканям и органам многоклеточных (Владимиров, 2009). Понятие оксидативного стресса, по всей вероятности, применимо и для сообществ: например, продукция активных форм кислорода распространенное явление в водных экосистемах, а окислительный стресс является важным компонентом реакции организмов на изменения условий окружающей среды (Lesser, 2006).





В то же время остается открытым вопрос о биологической роли про- и антиоксидантов в межклеточных и межвидовых взаимоотношениях, в частности их участии в процессах формирования симбиотических отношений между прокариотами и другими организмами.

А между тем, именно эти симбиотические взаимоотношения прокариот с многоклеточным организмом (хозяином) имеют существенное значение, получив в последнее время поддержку с появлением новой концепции в симбиологии – ассоциативного симбиоза (Бухарин и др., 2007).

Рассмотрение инфекции в качестве модельной системы ассоциативного симбиоза определило «инфектологическое поле» как пригодное для изучения регуляторной функции про- и антиоксидантов в симбиотической системе «паразит – хозяин», обозначив новые перспективы в управлении инфекционным процессом (Бухарин и др., 2011).

Именно эти моменты и определили цель и задачи нашей работы.

Целью исследования является характеристика роли про- и антиоксидантов, продуцируемых микроорганизмами, в формировании и регуляции симбиозов с участием прокариот.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Изучение спектра метаболитов с про- и антиоксидантным действием, продуцируемых микрофлорой, установление распространенности и выраженности продукции этих веществ бактериями, определение факторов среды, регулирующих их синтез (на примере вагинального биотопа).

Исследование связи уровней про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием биотопа хозяина.

Характеристика влияния про- и антиоксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал (адгезивные характеристики, способность к биопленкообразованию, гидрофобность клеточной поверхности, каталазную, лизоцимную и антилизоцимную активности).

Определение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета макроорганизма.

Изучение возможности усиления антагонистической активности пероксидпродуцирующих доминантов путем подавления антиоксидантной защиты бактерий-ассоциантов и/или стимуляции образования из пероксида водорода активных форм кислорода с высокой реакционной способностью.

Установлена роль про- и антиоксидантов в обеспечении стабильного существования и функционирования симбиотических систем, включающих генотипически разнородные элементы. Показано, что изменение баланса продукции про- и антиоксидантов возникает как реакция микросимбионтов на внешние воздействия, через модификацию биологических свойств симбионтов, определяя стабильность сообщества в целом.

Изучен спектр метаболитов с про- и антиоксидантным действием (на примере вагинальной микрофлоры), установлены распространенность и выраженность продукции про- и антиоксидантов бактериями, определены факторы среды, регулирующие их синтез.

Синхронные высокие уровни продукции про- и антиоксидантов являются характерным признаком эубиоза, а дисбиотические состояния сопровождаются смещением баланса про- и антиоксидантов.

Обнаружена способность бактерий защищать другие микросимбионты от бактерицидного действия гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона (Патент РФ № 2279079). Механизмом, определяющим этот эффект являются способность бактерий окислять Fe2+ в Fe3+, что препятствует образованию гидроксильных радикалов в реакции Фентона, и продукция веществ, обладающих антиоксидантными свойствами - внеклеточных полисахаридов, пигментов и липидсодержащих соединений.

Выявлено наличие у микроорганизмов механизмов, запускающих при недостатке Fe2+ работу клеточных систем, синтезирующих метаболиты, инактивирующие гидроксильные радикалы или препятствующие их образованию в реакции Фентона.

Установлен механизм поддержания стабильности микробных биоценозов, основанный на синергидном эффекте факторов врожденного иммунитета хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормальной микрофлорой.

Показано, что антагонистический эффект лактобацилл, обусловленный продукцией пероксида водорода, усиливается метаболитами бактерий с прооксидантным действием, направленным на ингибирование ферментов антиокислительной системы и восстановление железа.

Выявлены дозозависимые эффекты изменения поверхностных свойств бактериальных клеток под влиянием продуцируемых нормальной микрофлорой активных форм кислорода, заключающиеся в снижении гидрофобности и адгезивности бактерий, уменьшении их способности сорбировать белки, модификации уровня биопленкообразования. Пероксидпродуцирующие микроорганизмы оказывают регулирующее влияние на характер взаимодействия бактерий с колонизируемыми ими поверхностями за счет продукции активных форм кислорода, определяя структурно-функциональное состояние микробных биоценозов.

На примере антилизоцимной и каталазной активностей бактерий обнаружено изменение гетерогенности бактериальных популяций по указанным признакам в результате воздействия про- и антиоксидантов бактериального происхождения.

Разработан новый подход к усилению бактерицидной эффективности пероксидпродуцирующих микроорганизмов, заключающийся в подавлении антиоксидантной защиты клетки и стимуляции образования из пероксида водорода гидроксильных радикалов и гипойодида - мощных антибактериальных агентов, не вызывающих к ним резистентность у микроорганизмов.

Получены новые данные, расширяющие представления о механизмах симбиотических взаимоотношений, обеспечивающих стабильное состояние симбиоза за счет изменения в нем баланса продукции про- и антиоксидантов.

Практическая ценность работы характеризуется возможностью создания препаратов и технологий для терапии и профилактики инфекций человека и животных, а также контроля за санитарным состоянием среды обитания. Определены принципы создания оптимальных условий для генерации гидроксильных радикалов путем подбора соответствующих концентраций ионов железа.

На основании полученных данных о чувствительности микроорганизмов к гидроксильным радикалам предложены «Способ дезинфекции объектов окружающей среды» (Патент РФ № 23221426) и инновационная разработка «Технология контроля численности нежелательных микроорганизмов», удостоенная серебряной медали VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008).

Результаты работы по усилению бактерицидного эффекта пероксида водорода пероксидазой хрена и йодидом калия позволяют повысить эффективность применения пробиотиков, содержащих пероксидпродуцирующие микроорганизмы.

Баланс про- и антиоксидантов в симбиотических системах с участием прокариот – инфектологический феномен, обеспечивающий регуляцию и поддержание стабильности биоценоза за счет модификации биологических свойств симбионтов и создающий препятствия колонизации биотопа аллохтонными микроорганизмами.

Потенцирование метаболитами пероксидпродуцирующих микроорганизмов бактерицидного эффекта факторов врожденного иммунитета хозяина является одним из механизмов формирования стабильного микробного биоценоза человека, связанным со способностью нормальной микрофлоры регулировать функции биологически активных молекул макроорганизма.

Пероксидпродуцирующие микроорганизмы определяют механизм защиты биотопа, связанный с дифференцированным влиянием пероксида водорода на факторы колонизации автохтонных и аллохтонных микроорганизмов (адгезия и гидрофобность) и изменением их адаптивного потенциала (антилизоцимной и каталазной активностей и способности к биопленкообразованию).

Изменения в балансе продукции про- и антиоксидантов - биологическая основа регуляции гомеостаза симбиотической системы, где выявленные закономерности реакций симбионтов на эти изменения открывают возможности управления исходом микробиоценоза.

Основные положения работы доложены на: IV - VII Российских научных конференциях «Персистенция микроорганизмов», г. Оренбург, 2003, 2006, 2009, 2012; Российской научной конференции «Репродуктивное здоровье населения» г. Оренбург, 2005; Международной конференции «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания», г. Москва, 2004;

Конференции «Фундаментальные науки - медицине» по программе фундаментальных исследований Президиума РАН, г. Москва, 2004; «Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах», г.Москва, 2006, 2009, IV Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», г. С-Петербург, 2008.

По теме диссертации опубликовано 18 работ, в том числе 12 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, получено 3 патента РФ на изобретения.

Диссертация изложена на 247 страницах и содержит введение, обзор литературы, описание материалов и методов, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 47 отечественных и 253 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 20 таблицами и рисунками.

Работа выполнена в Институте клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН в соответствии с планом научно-исследовательской работы: тема «Изучение симбиотических взаимоотношений в микробиоценозах тела человека», № гос. регистрации 01.2.00 104756; проект «Межбактериальные взаимодействия и их роль в формировании микробных биоценозов тела человека» по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине»; тема «Изучение механизмов взаимоотношений симбионтов и их регуляции в различных биологических системах», № гос. регистрации 0120.0 600145, программы инициативных фундаментальных исследований УрО РАН, проект № 12-Уи программы Президиума РАН №5 «Фундаментальные науки - медицине», проект № 12-П-4-1015.

Для изучения спектра, распространенности и выраженности метаболитов с про- и антиоксидантным действием использовали 522 штамма микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 220 женщин, проходивших обследование в Областном центре планирования семьи и репродукции г. Оренбурга (гл. врач М.Г. Шухман). Выделенные штаммы идентифицировали общепринятыми методами на основании морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств (Берджи, 1997).

Наличие метаболитов с прооксидантными (пероксида водорода, супероксиданиона, гидроксильных радикалов, ингибиторов каталазы, железовосстанавливающей способности) и антиоксидантными (общей антиоксидантной активности, каталазной активности, способности инактивировать гидроксильные радикалы и снижать их бактерицидность, железоокисляющей способности) свойствами определяли в фильтратах культуральных жидкостей исследуемых микроорганизмов.

Концентрацию образующегося пероксида водорода у микроорганизмов определяли по окислению раствора тетраметилбензидина (ТМБ) пероксидом в присутствии пероксидазы хрена (Wilks et al., 2004) и выражали в миллимолях (мМ).

Образование супероксиданиона определяли по восстановлению нитросинего тетразолия хлорида в формазан (Auclair, Voisin, 1985). Содержание гидроксильных радикалов оценивали по ранее описанному методу с использованием раствора бриллиантового зеленого (He et al, 2004).

Способность ингибировать каталазу определяли по снижению уровня каталазной активности тест-штамма Staphylococcus aureus ATCC 6538P (Бухарин и др., 2002) и выражали в процентах подавления.

Способность восстановления или окисления ионов железа определяли согласно рекомендациям (ГОСТ 4011-72, Вода питьевая…, 2003) с использованием сульфосалициловой кислоты, выражали в мкг/мл.

Общую антиоксидантную активность определяли с использованием 2,2дифенил-1-пикрилгидрозила (ДФПГ), в качестве положительного контроля использовали Тролокс™ (Brand-Williams et al., 1995) и выражали в условных единицах (у.е.). Каталазную активность внеклеточных метаболитов бактерий исследовали по описанному методу (Бухарин и др., 2002), активность выражали в мМ*мин/мг белка.

Для выяснения природы веществ, ответственных за антиоксидантную активность культуральные жидкости делили на фракции - внеклеточные полисахариды осаждали согласно рекомендациям (Кочетков и др., 1967), липиды и пигменты извлекались смесью гексан : изопропанол в соотношении 3:2 и ацетоном как описано ранее (Modern Experimental Biochemistry…, 2000).

Для оценки влияния факторов среды на способность микроорганизмов продуцировать про- и антиоксиданты использовали добавляемые в виде индивидуальных веществ до конечной концентрации 1мкМ/мл среды оксикислоты (лактат, цитрат сукцинат), летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная), гемсодержащие соединения (гемоглобин, гемин, каталаза), восстановители (ликопин, лютеин, -каротин, аскорбат), амины (триметиламин, этилендиамин, спермин), пероксид водорода, этанол, глюкозу, фруктозу, ионы железа и марганца.

При исследовании связи уровней про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием биотопа использовали 210 штаммов микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 116 женщин, находившихся на обследовании обследование в Областном центре планирования семьи и репродукции г. Оренбурга.

Женщины были разделены на 2 группы: 63 с эубиозом влагалища и 53 – с дисбиозом. Для оценки микроэкологического состояния вагинального биотопа использовали критерии, предложенные Соколовой с соавторами (1988).

Антилизоцимную (АЛА) активность микроорганизмов, способность ингибировать каталазу изучали по описанным методам (Бухарин и др., 1999).

Ферментативную активность лизоцима определяли по скорости лизиса ацетонированного порошка M.luteus (Бухарин и др., 1999). Изучение адгезивных свойств микроорганизмов проводили по методике В.И. Брилис с соавт.

(1986) с использованием фиксированных эритроцитов человека 0 (I) группы Rh (+). В качестве показателя адгезивности определяли индекс адгезии микроорганизмов (ИАМ) - среднее количество микробных клеток на одном эритроците, участвующем в адгезивном процессе.

Способность бактерий образовывать биопленки изучали по количеству связанного кристаллического фиолетового (O'Toole et al., 1999) в 96-луночных полистироловых планшетах, меченных коллагеном из фибробластов человека согласно рекомендациям (Егоров и др., 1991) и выражали в условных единицах (у.е.).

Влияние на выживаемость бактерий факторов врожденного иммунитета (лизоцим, лактоферрин и антимикробный белок тромбоцитов), пероксида водорода, гидроксильных радикалов, супернатантов пероксидпродуцирующих лактобацилл определяли путем высева серийных разведений бактериальных суспензий на агаризованные среды (American Society for Microbiology, 2003) и выражали в КОЕ/мл.

Антимикробный белок тромбоцитов получали согласно ранее описанной методике из тромбоцитов человека (Бухарин и др., 2000). Концентрацию белка в культуральных жидкостях исследуемых микроорганизмов, препаратах лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов определяли по Лоури (1951) и выражали в мг общего белка.

При статистической обработке полученных результатов проверка нормальности распределения данных проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, для оценки достоверности различий между опытными и контрольными группами использовался критерий Манна-Уитни. Для сравнения частот встречаемости использовали критерий согласия Пирсона (2). Исследование взаимосвязи между признаками осуществляли при помощи коэффициента корреляции Спирмена (r) (Гланц, 2004). В качестве минимально допустимого использовали уровень значимости р0,05.

На первом этапе работы нами были изучены спектр, распространенность и выраженность про- и антиоксидантов во внеклеточных метаболитах микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 220 женщин.

Для этого исследовали 522 культуры микроорганизмов – 175 штаммов лактобацилл, 27 – аэрококков, 65 –стрептококков, 141 – коринебактерий, 23 – микрококков и 91 – коагулазоотрицательных стафилококков. В фильтратах культуральных жидкостей исследуемых микроорганизмов определяли наличие прооксидантов и антиоксидантнов согласно описанным выше методикам.

Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с прооксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта При изучении способности исследуемых микроорганизмов продуцировать пероксид водорода было установлено, что это свойство было характерно только для представителей 3 родов бактерий, выделенных из женского репродуктивного тракта: Lactobacillus, Streptococcus и Aerococcus.

Отмечено, что частота встречаемости микроорганизмов, образующих пероксид водорода, выше при нормальном состоянии биотопа, чем при микроэкологических нарушениях (Рис. 1).

Так, среди 107 штаммов лактобацилл, выделенных при эубиозе, пероксид водорода продуцировали 78% штаммов, а из 68 культур, выделенных при дисбиозе - лишь 25%.

Из 16 штаммов аэрококков, выделенных при эубиозе, пероксид водорода выделяли 87%, и только 27% из 11 штаммов из биотопов с дисбиозом. Что касается стрептококков, из 33 выделенных при эубиозе были способны продуцировать пероксид водорода 57% культур, из 32 штаммов, изолированных при дисбиозе - 34 %.

частота встречаемости, % Рис. 1. Частота встречаемости Н2О2-продуцирующих микроорганизмов при эубиозе и дисбиотических нарушениях.

Принимая во внимание полученные данные о высокой распространенности при эубиозе пероксидпродуцирующих лактобацилл в сочетании с их численным доминированием в вагинальном биотопе, мы посчитали необходимым исследовать выраженность пероксидпродукции у исследуемых микроорганизмов.

продуцировала пероксид водорода в диапазоне концентраций 3,0-4,5 мМ, 33,7% – от 4,5 до 6 мМ, 3,5% - 6 - 7,5 мМ и 14% - 1,5-3 мМ. Лактобациллы, выделенные при дисбиозе продуцировали пероксид водорода в заметно меньших концентрациях: 47% до 1,5 мМ и 53% - от 1,5 до 3 мМ (Рис. 2).

среднепопуляционные значения продукции ими пероксида водорода – 4,4±0, мМ, тогда как при дисбиозе - 1,5±0,3 мМ (p0,01).

частота встречаемости, % Рис. 2. Разнообразие Н2О2-продуцирующих Lactobacillus spp. при эубиозе и дисбиозе.

стрептококками и аэрококками, выделенными при эубиозе, было значительно меньше и составило 1,3±0,3 и 1,7±0,2 мМ, соответственно. Стрептококки и аэрококки, выделенные при дисбиозе, образовывали соответственно 0,4±0,3 и 0,5±0,3 мМ пероксида водорода.

изученных бактерий не были обнаружены, вероятной причиной этому является короткий период существования этих активных форм кислорода (Imlay, 2003).

Таким образом, в противоположность дисбиотическому состоянию, наличие в вагинальном биотопе микроорганизмов с относительно высоким уровнем продукции пероксида водорода было характерной чертой эубиоза. Показанная ранее важная роль пероксида водорода в регуляции потоков энергии и углерода в бактериальном планктонном сообществе (Baltar et al., 2013) позволяет предположить его участие в подобных процессах и в организме человека, в частности в вагинальном биотопе женщин.

На следующем этапе исследования была определена способность изучаемых микроорганизмов ингибировать каталазу тест-штамма Staphylococcus aureus ATCC 6538P (Рис. 3).

Как и в случае с продукцией пероксида водорода, распространенность способности ингибировать каталазу у микроорганизмов, выделенных при эубиозе, была выше, чем при дисбиотических нарушениях. Так, выделенные из биотопов с нормальным микроэкологическим статусом Lactobacillus spp. ингибировали каталазу в 94% случаев, Streptococcus spp. – 80%, Aerococcus spp. Corynebacterium spp. – 98%, Micrococcus spp. – 87%, коагулазоотрицательные стафилококки – 94%. Среди микроорганизмов, выделенных при дисбиозе, частота ингибирования каталазы была существенно ниже: у Lactobacillus spp. – в 14%, Streptococcus spp. – 21%, Aerococcus spp. – 8,5%, Corynebacterium spp. – 43%, Micrococcus spp. – 57% и коагулазоотрицательных стафилококков – в 34% случаев.

Micrococcus Corynebacterium Aerococcus spp.

Streptococcus Lactobacillus Рис. 3. Частота встречаемости микроорганизмов, способных ингибировать бактериальную каталазу при эубиозе и дисбиотических нарушениях.

Широко распространенный эффект ингибирования каталазы S. aureus метаболитами нормальной микрофлоры можно рассматривать как один из возможных механизмов, определяющих стабильность эубиоза за счет усиления бактерицидного эффекта пероксидпродуцирующей микрофлоры, так как снижение уровня антиоксидантной защиты микроорганизмов при воздействии бактериальных ингибиторов каталазы увеличивает повреждающий эффект пероксида водорода (Бухарин и др., 2002).

Изучение спектра, распространенности и выраженности метаболитов с антиоксидантным действием у микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела женского репродуктивного тракта На следующем этапе работы мы изучили способность исследуемых микроорганизмов, выделенных из женского репродуктивного тракта, синтезировать метаболиты с антиоксидантным эффектом.

Micrococcus Corynebacterium Aerococcus spp.

Streptococcus Lactobacillus Рис. 4. Распространенность защитного действия бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов у микроорганизмов при эубиозе и дисбиозе.

Одним из проявлений такой способности стало снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов, образующихся в реакции Фентона. Среди культур Lactobacillus spp., выделенных при эубиозе, такой способностью обладали 47 %, Corynebacterium spp. –86%, Micrococcus spp. – 56%, Streptococcus spp. – 52%, Aerococcus spp. – 29%, и среди коагулазоотрицательных стафилококков - 88,2% (Рис. 4).

Микроорганизмы, выделенные при дисбиозе, в меньшей степени снижали бактерицидный эффект гидроксильных радикалов: Lactobacillus spp. - 14%, Streptococcus spp. – 21%, Aerococcus spp. – 27%, Corynebacterium spp. – 65%, Micrococcus spp. – 34% и коагулазоотрицательные стафилококки – в 46% случаев.

Уменьшение бактерицидной активности гидроксильных радикалов определялось падением их концентрации, о чем свидетельствовало полное отсутствие продуктов реакции гидроксильных радикалов с бриллиантовым зеленым.

Исследование общей антиоксидантной активности (ОАА) культуральных жидкостей исследуемых микроорганизмов с использованием ДФПГ показало, что способность бактериальных метаболитов снижать бактерицидную активность гидроксильных радикалов прямо зависит от их антиоксидантной активности. Так, Lactobacillus spp., снижающие бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, синтезировали метаболиты с общей антиоксидантной активностью 8,6±1,4 у.е., тогда как штаммы не обладающие такой способностью у.е. (p0,01), Corynebacterium spp. – 12,1±1,1 и 3,7±0,6 у.е. (p0,01), Micrococcus spp. – 4,8±0,2 и 2,8±0,5 у.е. (p0,05), Streptococcus spp. – 5,5±0,4 и 1,1±0,3 у.е. (p0,05), Aerococcus spp. – 5,8±0,7 и 1,6±0,4 у.е. (p0,01) и среди коагулазоотрицательных стафилококков - 6,9±1,1 и 3,8±0,3 у.е. (p=0,07), соответственно.

Для выяснения природы веществ, ответственных за антиоксидантную активность культуральные жидкости делили на фракции - внеклеточные полисахариды, липиды и пигменты и определяли способность этих фракций снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, одновременно с этим определяя у исследуемых бактерий способность окислять ионы железа (II) в ионы железа (III) и каталазную активность.

Результаты этих исследований суммированы в таблице 1, из которой видно, что для большинства исследуемых микроорганизмов характерно одновременное присутствие нескольких механизмов снижения бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов (Табл.1).

Так, способность окислять железо встречалось у 16,7 % исследуемых лактобацилл, 63,2 % - коринебактерий, 37,5 % - микрококков и 60 % - КОС. Среди лактобацилл и коринебактерий отмечена высокая частота встречаемости продукции полисахаридов – 100 и 57,9%, соответственно, а все изученные КОС и микрококки синтезировали пигменты.

Протективное действие бактериальных метаболитов от гидроксильных радикалов по отношению к микроорганизмам сопровождалось, в ряде случаев, способностью бактерий окислять ионы железа (II) в ионы железа (III), тем самым предотвращая их участие в реакции Фентона (Прайер, 1970).

Таблица 1 - Механизмы защитного действия бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов.

Corynebacterium С другой стороны, бактерии выделяли в окружающую среду большое количество метаболитов (полисахариды, липиды и пигменты), выделенные индивидуальные фракции которых реагировали с уже образовавшимися гидроксильными радикалами. Снижение бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов определялось концентрацией этих веществ – ловушек радикалов.

В случае коагулазоотрицательных стафилококков в среде культивирования обнаруживались незначительные уровни каталазной активности – 0,2 – 0, мМ/мин*мг белка. Мы полагаем, что даже такое небольшое количество этого антиоксидантного фермента, разлагающего пероксид водорода, достаточно для эффективного предотвращения образования гидроксильных радикалов. Следует также отметить, что у большинства изученных бактерий способность снижать бактерицидность гидроксильных радикалов осуществляется при помощи двух и более механизмов.

Таким образом, защитное действие бактериальных метаболитов от бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов обеспечивается продукцией микроорганизмами веществ инактивирующих их или препятствующих их образованию.

Изучение влияния факторов среды на способность микроорганизмов продуцировать про- и антиоксиданты На следующем этапе исследования была предпринята попытка изучения влияния факторов среды на способность лактобацилл продуцировать пероксид водорода и общую антиоксидантную активность. В качестве таких факторов мы использовали добавляемые в виде индивидуальных веществ до конечной концентрации 1мкМ/мл среды оксикислоты (лактат, цитрат сукцинат), летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная), гемсодержащие соединения (гемоглобин, гемин, каталаза), восстановители (ликопин, лютеин, каротин, аскорбат), амины (триметиламин, этилендиамин, спермин), пероксид водорода, этанол, глюкозу, фруктозу, ионы железа и марганца.

Полученные результаты показали, что ряд веществ оказывал стимулирующее влияние на продукцию пероксида водорода лактобациллами (Рис.5).

Продукция пероксида по сравнению с контролем (3,4±0,8 мМ) под влиянием лактата увеличивалась до 5,4±0,3 мМ, сукцината - 4,9±0,5 мМ, цитрата мМ, -каротина - 4,3±0,7 мМ, ликопина - 4,3±0,3 мМ, аскорбата мМ, лютеина - 4,0±0,4 мМ, этанола - 3,8±0,1 мМ, фруктозы - 3,5±0,1 мМ и глюкозы - 3,5±0,2 мМ.

пероксид водорода ионы марганца.(II) Рис. 5. Влияние различных факторов среды на продукцию пероксида водорода лактобациллами.

Напротив, добавление к культуре-продуценту ацетата приводило к угнетению пероксидпродукции до 1,9±0,13 мМ, пропионата - 1,62±0,11 мМ, этилендиамина - 1,17±0,08 мМ, триметиламина -1,16±0,08 мМ, бутирата - 1,13±0,08 мМ, пероксида водорода - 0,98±0,07 мМ, спермина - 0,72±0,05 мМ, гемина - 0,28±0, мМ, гемоглобина - 0,25±0,02 мМ, каталазы - 0,21±0,01 мМ, ионов железа (III) и марганца (II) - 0,32±0,02 и 1,2±0,08 мМ, соответственно.

Таким образом, проведенное исследование позволило установить, что продукция пероксида водорода лактобациллами стимулируется оксикислотами, такими как лактат, сукцинат и цитрат, наличие которых характерно для состояния эубиоза в нижнем отделе женского репродуктивного тракта (Черкасов, 2008). Напротив, гемсодержащие соединения (гемоглобин, гемин и каталаза), ионы железа и марганца существенно снижали продукцию пероксида. Особенно важным представляется тот факт, что вещества, присутствующие в биотопе при дисбиотических нарушениях - амины (триметиламин, этилендиамин, спермин) и летучие жирные кислоты (уксусная, пропионовая и масляная) также угнетают продукцию пероксида.

При изучении влияния факторов среды на общую антиоксидантную активность лактобацилл (Рис.6) было установлено, что по сравнению с контролем (12,8±0,9 у.е) пероксид водорода стимулировал ОАА до 22,4±1,5 у.е., лактат – 18,9±1,1 у.е., ионы железа (III) – 18,2±1,6 у.е., цитрат 14,5±0,3 у.е.. Напротив, добавление к продуценту спермина снижало ОАА до 6,4±0,7, пропионата этилендиамина - 6,0±0,8, триметиламина - 5,9±0,6, этанола -5,7±0,4, бутирата -5,4±0,5, ионов марганца (II) - 5,2±0,7, лютеина -5,0±0,3, аскорбата у.е.

Проведенное исследование позволило установить, что продукция антиоксидантов стимулируется факторами среды, наличие которых ассоциировано с состоянием эубиоза в женском репродуктивном тракте, такими как пероксид водорода и лактат (Черкасов, 2008).

Все это позволяет заключить, что продукция про- и антиоксидантов в микробном сообществе в немалой степени определяется окружением.

ионы марганца.(II) пероксид водорода Рис. 6. Влияние различных факторов среды на продукцию антиоксидантов лактобациллами.

Особый интерес вызывают полученные данные о стимуляции продукции пероксида водорода антиоксидантами растительного происхождения (каротин, ликопин, лютеин, аскорбат) и этанолом: вероятно эти вещества предохраняют продуцента от свободнорадикального повреждения (Владимиров, 2009) и, по-видимому, могут быть перспективны для применения в пробиотических препаратах, содержащих пероксидпродуцирующие бактерии.

Изучение связи уровня про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием вагинального биотопа Принимая во внимание высокую встречаемость и выраженность продукции про- и антиоксидантов микроорганизмами, выделенными из репродуктивного тракта женщин с нормальным состоянием микробиоценоза, была предпринята попытка изучить информативность наличия этих веществ для оценки микроэкологического состояния биотопа.

Для этой цели был осуществлен анализ данных, полученных при определении способности продуцировать про- и антиоксидантов у 210 микроорганизмов, выделенных из нижнего отдела репродуктивного тракта 116 женщин, находившихся на обследовании в Областном центре планирования семьи и репродукции, разделенных с использованием критериев, предложенных Соколовой с соавторами (1988), на 2 группы: 63 с эубиозом влагалища и 53 – с дисбиозом.

У всех выделенных микроорганизмов определяли наличие способности к продукции пероксида, ингибиторов каталазы, снижению бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов и общую антиоксидантную активность с использованием описанных выше методик.

В результате исследования установлено, что уровень продукции пероксида водорода лактобациллами, выделенными от женщин с эубиозом влагалища находился в диапазоне 1,5±0,3 - 6,4±0,7 мМ и был существенно выше чем при дисбиозе - 0,4±0,1 – 2,1±0,4 мМ (p0,01).

Способность ингибировать каталазу S. aureus у микроорганизмов, выделенных при эубиозе встречалась в 36–94% случаев, тогда как при дисбиозе – в 8–43% (p0,01).

Снижение бактерицидного действия гидроксильных радикалов внеклеточными метаболитами у микроорганизмов, выделенных при эубиозе встречалось в 59–96% случаев, при дисбиозе – 14–46% (p0,01).

Уровень общей антиоксидантной активности у микроорганизмов, выделенных при эубиозе составлял 4,8±0,5 - 9,7±0,4 у.е., тогда как при дисбиозе – 1,8±0,2 - 3,9±0,8 у.е. (p0,01).

В итоге применения неоднородной последовательной процедуры распознавания было выяснено, что исследуемые биотопы можно дифференцировать на 2 группы (эубиоз и дисбиоз) в зависимости от активности в них продуцентов про- и антиоксидантов. Наиболее значимыми признаками микроорганизмов, определяющими состояние биотопа в порядке убывания являются: продукция лактобациллами пероксида водорода в концентрации более 1,8 мМ, синтез ингибиторов каталазы, образование веществ, снижающих бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, одновременное присутствие в вагинальном биотопе двух и более штаммов, продуцирующих прооксиданты или антиоксиданты.

Одновременное присутствие в биотопе микроорганизмов с высоким уровнем продукции про- и антиоксидантов являлось признаком эубиоза, а дисбиотические состояния сопровождались смещением баланса про- и антиоксидантов (Рис.7).

При анализе результатов выяснено, что состоянию эубиоза и дисбиоза присущи свои соотношения уровней продукции про- и антиоксидантов. Так, для биотопов с эубиозом была характерна продукция антиоксидантов в диапазоне 3,65 - 9,8 у.е. при среднем значении 7,8±0,18 у.е., а для биотопов с дисбиозом диапазон был шире - 0,1 - 9,5 у.е. и в средний уровень составил 2,2±0, у.е. (p0,05). Среднее значение уровня продукции прооксидантов в биотопах с эубиозом было выше, чем при дисбиозе: 7,7±0,17 против 1,8±0,2 у.е. (p0,01), а диапазон соответственно составлял 4,9-9,9 и 0,16-6,5 у.е. В целом следует отметить, что соотношение уровней антиоксидантов к прооксидантам при эубиозе составляло в среднем 1,03±0,2 у.е., тогда как при дисбиозе 4,2±0,9 у.е. (p0,01).

Следует заключить, что для биотопов с эубиозом характерно наличие микроорганизмов с высокими уровнями продукции и прооксидантов и антиоксидантов, а их соотношение близко к единице, тогда как для дисбиоза характерно превышенное соотношение антиоксидантов над прооксидантами. Все это свидетельствует о том, что баланс про- и антиоксидантов обеспечивает регуляцию и поддержание стабильности биоценоза.

продукция прооксидантов Рис. 7. Связь между состоянием микробиоценоза и продукцией микроорганизмами про- и антиоксидантов.

Таким образом, полученные сведения о связи уровня про- и антиоксидантов, продуцируемых автохтонными микроорганизмами, с микроэкологическим состоянием вагинального биотопа свидетельствуют о важной роли этих веществ в поддержании гомеостаза биотопа.

Изучение влияния микробных про- и антиоксидантов на чувствительность бактерий к факторам микробного антагонизма и врожденного иммунитета Ранее нами было показано, что метаболиты представителей нормальной микрофлоры способны снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов и, одновременно с этим, ингибировать каталазу бактерий. Однако до настоящего времени не описаны эффекты сочетанного действия метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл и коринебактерий на выживаемость бактерий, тогда как получение таких данных позволило бы расширить представления о роли ассоциативных микроорганизмов в реализации доминирующей микрофлорой антагонистического потенциала. В связи с этим, мы изучили влияние метаболитов Corynebacterium minutissimum, обладающей одновременной способностью ингибировать каталазу и уменьшать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов, на проявление антагонистической активности Н2О2продуцирующих лактобацилл в отношении S. aureus и L. acidophylus (Рис. 8, 9).

lg КОЕ/мл Рис.8. Влияние внеклеточных метаболитов коринебактерий и Н2О2продуцирующих лактобацилл на выживаемость S. aureus.

Влияние метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на выживаемость каталазопозитивного S. aureus было незначительно (Рис. 8): с увеличением в метаболитах лактобацилл концентрации пероксида водорода с 0,14±0,02 до 1,78±0,09 мМ количество выживших клеток тест-штамма уменьшалось с 5,6±0,55 по 4,6±0,43 lg КОЕ/мл.

Обработка метаболитами коринебактерии угнетала каталазную активность стафилококка, это приводило к существенному снижению количества жизнеспособных клеток S. aureus с 5,6±0,39 до 1,54±0,11 lg КОЕ/мл при использовании тех же концентраций H2O2 (Рис. 8).

Бактерицидный эффект метаболитов лактобацилл наиболее ярко проявлялся в отношении каталазонегативного L. acidophylus (Рис. 9): по мере увеличения содержания пероксида водорода ПМО штамма снижался с 5,8±0,6 lg КОЕ/мл в контроле до 0,56±0,06 lg КОЕ/мл при концентрации Н2О2 1,78±0, мМ. Обработка метаболитами коринебактерий клеток L. acidophylus значительно снижала наблюдаемый ранее выраженный бактерицидный эффект метаболитов лактобацилл (Рис. 9), так при концентрации Н2О2 1,78±0,09 мМ ПМО составлял 4,6±0,34 lg КОЕ/мл, тогда как в контроле - 5,7±0,44 lg КОЕ/мл.

lg КОЕ/мл Рис.9. Влияние внеклеточных метаболитов коринебактерий и Н2О2продуцирующих лактобацилл на выживаемость L. acidophylus.

Таким образом, выявленные закономерности разнонаправленного влияния метаболитов коринебактерий на чувствительность представителей нормальной микрофлоры и условнопатогенных бактерий к метаболитам пероксидпродуцирующих лактобацилл свидетельствуют о существовании механизмов, определяющих формирование и стабильное существование многокомпонентных симбиотических систем, обусловленных продукцией про- и антиоксидантов участниками симбиозов.

Ограниченный бактерицидный эффект пероксида водорода определяется тем, что его низкая реакционная способность (Linley et al., 2012) в сочетании с широкой распространенностью и высокой активностью каталазы (Imlay, 2003) не влечет за собой выраженного повреждающего действия.

Стабильность вагинального микросимбиоза, проявляющаяся в относительном постоянстве численности и видового состава бактерий, предполагает наличие механизмов защиты биотопа, связанных с взаимодействием факторов местного иммунитета и антимикробных метаболитов представителей нормальной микрофлоры. Поэтому в последующем мы изучили влияние метаболитов пероксидпродуцирующих микроорганизмов на бактерицидную активность факторов врожденного иммунитета – лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов (Табл.2).

Таблица 2 - Изменение бактерицидной активности факторов врожденного иммунитета под влиянием метаболитов Н2О2-продуцирующих лактобацилл.

Вид бак- фактор врожденного имконтроль * - статистически значимые различия с контролем при р0. Пероксидпродуцирующие лактобациллы усиливали антимикробный эффект факторов врожденного иммунитета. Так, МБК лактоферрина в контроле составила для E.coli 47,2±3,6 мкг/мл, после обработки белка экзометаболитами лактобацилл – 28,6±1,8 мкг/мл (р0.05), для S.aureus, соответственно, 63,9±5, и 49,1±2,3 мкг/мл (р0.05). В случае лизоцима его МБК для E.coli в контроле составила 107±9,8 мкг/мл, после контакта белка с метаболитами лактобацилл мкг/мл, для S.aureus - 93±6,5 и 78±3,4 мкг/мл соответственно (р0.05).

Предварительная обработка клеток S.aureus и E.coli секреторными продуктами лактобацилл повышала их чувствительность к действию факторов врожденного иммунитета. Так, МБК лизоцима в отношении E.coli в контроле составила 107±9,8 мкг/мл, после обработки - 88±5,3 мкг/мл, в отношении S.aureus, и 73±5,9 мкг/мл, соответственно. МБК лактоферрина после контакта клеток тест-штаммов с метаболитами пероксидпродуцирующих лактобацилл также уменьшалась и составила для E.coli 47,2±3,6 мкг/мл в контроле и 42,2±2, мкг/мл после обработки (р0.05), для S.aureus, соответственно, 63,9±5,1 и 51,5±5,4 мкг/мл (р0.05) Для объяснения причин потенцирующего эффекта мы изучили влияние пероксидпродуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима в отношении E. coli и L. acidophilus (Рис.10).

МБК лизоцима, мг/мл Рис. 10. Влияние внеклеточных метаболитов лактобацилл с различным содержанием Н2О2 на ферментативную активность лизоцима и МБК по отношению к E. coli и L. acidophylus.

Ферментативная активность лизоцима, определяемая по скорости лизиса микрококка, снижалась с 27 до 8,5 у.е./мг белка*мин после его контакта с метаболитами лактобацилл, содержащими пероксид водорода в диапазоне концентраций 0-1,9 мМ (Рис.10), а степень этого подавления находилась в прямой зависимости от содержания в них Н2О2 (r=0.89, р0.01).

Снижение ферментативной активности лизоцима метаболитами лактобацилл сопровождалось уменьшением его бактерицидности для L. acidophylus и увеличением в отношении E. coli (Рис.10), что сопровождалось соответственным изменение МБК лизоцима с 7,8 до 25,2 мг/мл для лактобацилл и с 107 до 56,9 - для кишечной палочки.

Степень бактерицидности лизоцима, модифицированного метаболитами лактобацилл, зависела от количества продуцируемого этими бактериями пероксида водорода (r=0.93, р0.01 в случае с E. coli и r=-0.96, р0.01 для L. acidophylus). После обработки каталазой метаболиты пероксидобразующих бактерий не оказывали модифицирующего влияния на функциональную активность лизоцима.

С учетом имеющихся данных о способности активных форм кислорода изменять вторичную и третичную структуры протеинов (Davies, Delsignore, 1987), не исключено, что окисление лизоцима пероксидом, содержащимся в метаболитах лактобацилл, определяет снижение ферментативной активности и, как следствие, увеличение МБК в отношении представителя грамположительной флоры - L. acidophylus.

Ферментативная активность лизоцима не является необходимым условиям для проявления им бактерицидных свойств в отношении грамотрицательных бактерий (Nash et al, 2006), поэтому выявленное нами уменьшение МБК лизоцима в отношении чужеродной для вагинального биотопа E. coli можно объяснить ростом гидрофобности белка в результате окислительного повреждения.

Таким образом, выявленное влияние метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на функциональную активность лизоцима можно рассматривать в качестве механизма поддержания стабильности микробных биоценозов, основанного на синергизме эффектов факторов врожденного иммунитета хозяина и активных форм кислорода, продуцируемых нормальной микрофлорой.

Характеристика влияния прооксидантов на свойства микроорганизмов, определяющих их адаптационный и колонизационный потенциал Прооксиданты оказывали влияние и на факторы микроорганизмов, способствующие их колонизации, такие как адгезия и способность к биопленкообразованию.

Адгезивные характеристики E. coli и S. aureus значимо уменьшались после обработки бактерий метаболитами пероксидпродуцирующих лактобацилл (Табл. 3). Метаболиты лактобацилл, непродуцирующих пероксид водорода, существенного влияния на адгезивную активность бактерий не оказывали. Противоположный эффект наблюдался в отношении адгезивной способности Corynebacterium spp. и Lactobacillus spp.: индекс адгезии существенно увеличивался под влиянием метаболитов содержащих Н2О2, и незначительно уменьшался после обработки метаболитами, не содержащими пероксид водорода.

Биопленкообразование у Corynebacterium spp. и Lactobacillus spp. увеличилось под влиянием пероксидпродуцирующих лактобацилл на 10 и 47 % соответственно, этот эффект исчезал после обработки Н2О2-содержащих метаболитов лактобацилл каталазой (Табл. 4). Одновременно с этим наблюдалось незначительное уменьшение способности биопленкообразования этих бактерий под влиянием метаболитов лактобацилл, не образующих пероксид водорода. Напротив, пероксид водорода, продуцируемый лактобациллами, снижал способность E. coli и S. aureus образовывать биопленки, соответственно на 33 и 36% по сравнению с контролем (Табл. 4). Одновременно с этим способностью уменьшать биопленкообразование обладали и метаболиты лактобацилл, не продуцирующих Н2О2: на 15% у E. coli и 27 % у S. aureus.

Изменения адгезивных характеристик бактерий определялись Н2О2, так как после обработки супернатантов пероксидпродуцирующих лактобацилл каталазой значения индекса адгезии приближались к контрольным.

Таблица 3 - Влияние метаболитов лактобацилл на адгезию микроорганизмов к эритроцитам (индекс адгезии микроорганизмов, бакт/эр (M±m)) * - статистически значимые различия с контролем при р0. Таблица 4 - Влияние метаболитов лактобацилл на величину образования биопленок микроорганизмами (у.е.) вид обработки * - статистически значимые различия с контролем при р0. Таким образом, на основании полученных результатов можно предположить, что в микробных биоценозах активные формы кислорода, продуцируемые представителями нормальной микрофлоры, при взаимодействии с компонентами поверхностных структур микроорганизмов влияют на характер отношений бактерий с колонизируемой ими поверхностью. Не исключено, что оппозитные изменения в адгезивности бактерий и способности образовывать биопленки являются адаптивной реакцией микроорганизмов в условиях окислительного стресса, что позволяет рассматривать активные формы кислорода как регуляторный фактор, определяющий структурно-функциональную характеристику микробного сообщества.

Принимая во внимание тот факт, что стабильность вагинального биоценоза не всегда определяется только антагонистической активностью лактобацилл (Бухарин и др., 2007), мы посчитали необходимым исследовать характер влияния пероксидпродуцирующих лактобацилл на биологические свойства бактерий, определяющих их адаптационный потенциал – антилизоцимную и каталазную активности.

Оказалось, что добавление метаболитов лактобацилл, содержащих относительно высокие концентрации пероксида водорода, к растущим культурам S.

aureus и E.coli приводило к усилению продукции каталазы. После обработки бактерий 3,2 мМ пероксида каталазная активность культур возросла на 34 % для S. aureus и 22 % - E.coli соответственно. Добавление метаболитов с концентрациями 0,8 и 1,9 мМ пероксида водорода к культурам приводила к снижению активности каталазы на 14 и 18% - для S.aureus и 12 и 29 % для E.coli.

Характер влияния разнообразных биотических и абиотических факторов на антилизоцимную активность микроорганизмов позволяет предположить, что причиной изменения гетерогенности бактериальной популяции по антилизоцимному признаку могут являться активные формы кислорода, регулирующее действие которых на свойства микроорганизмов описано (Бухарин и др., 2008).

В связи с этим, представляло интерес изучить влияние пероксидпродуцирующих лактобацилл на гетерогенность бактериальной популяции по антилизоцимному признаку (Рис. 11).

В результате выяснено, что обработка клеток E.coli метаболитами лактобацилл с содержанием пероксида водорода 0,8 и 1,9 мМ приводит к снижению среднепопуляционного уровня АЛА до 2,9±0,7 и 2,5±0,4 мкг/мл*ОД, соответственно при 3,4±0,2 мкг/мл*ОД в контроле.

частота встречаемости, % Рис.11. Влияние метаболитов Lactobacillus spp. с различным содержанием пероксида водорода на гетерогенность популяции E.coli по антилизоцимному признаку.

Этот эффект связан со смещением популяционной структуры E.coli в сторону преобладания клонов с низкими уровнями антилизоцимной активности и появлению субпопуляций с АЛА меньшей, чем в контрольной популяции (Рис.11). После обработки бактерий метаболитами, содержащими 3,2 мМ пероксида водорода наблюдали повышение среднепопуляционного уровня антилизоцимной активности до 3,8±0,9 мкг/мл*ОД и исчезновение клонов с антилизоцимной активностью до 2,5 мкг/мл*ОД.

Таким образом, на основании полученных результатов, следует заключить, что пероксид водорода, продуцируемый вагинальными лактобациллами, можно рассматривать как экологический фактор, позволяющий реализовывать бактериям адаптационный потенциал за счет изменения внутрипопуляционной гетерогенности их персистентных характеристик.

Изучение механизмов усиления антагонистической активности пероксидпродуцирующих лактобацилл путем стимуляции образования из пероксида водорода активных форм кислорода с высокой реакционной способностью Выявленная возможность существенного увеличения бактерицидности пероксида водорода путем ингибирования каталазной активности (Бухарин и др., 2002) открывает новый подход к усилению его эффективности, подразумевающий подавление антиоксидантной защиты клетки. С нашей точки зрения также перспективным является подход, основанный на создании оптимальных условий для превращения пероксида водорода в более реакционноспособные формы активного кислорода, например гидроксильные радикалы или гипойодид.

Пероксид водорода в диапазоне концентраций до 150 мМ не оказывал значимого бактерицидного эффекта на S. aureus. 150 мМ пероксида водорода и более высокие концентрации снижали обсемененность S. aureus на 1-2,5 lg КОЕ/мл в течение 30 минут (Рис.12).

Использование в эксперименте сульфата железа (II) способствовало повышению чувствительности S. aureus к пероксиду водорода вследствие генерации гидроксильных радикалов. Так, при обработке взвеси бактерий растворами 5 или 10 мМ сульфата железа (II) и 50 мМ раствора Н2О2 количество жизнеспособных клеток S. aureus снижалось до 1,42 и 1,16 lg КОЕ/мл, соответственно, при контроле 3,8 lg КОЕ/мл. В случае совместного использования 5 или 10 мМ сульфата железа (II) и 100 мМ раствора Н2О2 выживали единичные клетки S.

aureus, а дальнейшее повышение концентрации пероксида водорода приводило к полной гибели бактерий. Сходный эффект наблюдался и при использовании в эксперименте 1 мМ раствора сульфата железа (II) – выживаемость S. aureus уменьшалась после добавления перокида водорода, однако это уменьшение было достоверно лишь в диапазоне концентраций 100-150 мМ Н2О2.

lg КОЕ/мл Рис. 12. Выживаемость Staphylococcus aureus АТСС 6538Р в системе генерации гидроксильных радикалов в зависимости от концентрации пероксида водорода и сульфата железа (II).

Скорость проявления бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов была значительно выше. За 10 минут инкубации с 300 мМ Н2О2 число жизнеспособных клеток S. aureus снизилось с 4,2 до 1,9 lg КОЕ/мл. Однако, предварительная обработка тест-штаммов 5 мМ сульфата железа (II) значительно увеличила скорость гибели бактерий. Так, уже через 2 минуты после обработки гидроксильными радикалами численность жизнеспособных клеток S. aureus снизилась с 4,2 до 0,39 lg КОЕ/мл, а к четвертой минуте бактерии погибли полностью.

Особый интерес представляло сочетание короткого периода существования гидроксильных радикалов с их высокой и быстрой биоцидной активностью, что позволило рассматривать системы, генерирующие гидроксильные радикалы, как средство продукции высокоэффективного природного дезинфектанта широкого спектра действия, к тому же не способного к накоплению в окружающей среде.

Существует мнение, что уровня пероксида водорода, образуемого лактобациллами, недостаточно для проявления ими антагонистической активности (Strus et al., 2006). Тем не менее, мы полагаем, что существует возможность усиления антагонистического потенциала пероксидпродуцирующих лактобацилл. Для реализации этой идеи были проведены исследования совместного влияния пероксидазы хрена, йодида калия, и метаболитов пероксидпродуцирующих лактобацилл на выживаемость S. aureus и E.coli.

Установлено, что метаболиты лактобацилл, содержащие пероксид водорода в диапазоне концентраций 0 – 5,4 мМ сами по себе не оказывали бактерицидного эффекта на S. aureus и E.coli. Однако, добавление к метаболитам лактобацилл пероксидазы хрена (10 мг/л) и йодида калия (2 г/л) приводило к снижению выживаемости бактерий. Так, при совместном действии метаболитов лактобацилл, пероксидазы хрена и йодида калия численность выживших клеток E.coli уменьшалась до 4,38±0,15, 3,84±0,13, 3,04±0,11, 2,73±0,1, 1,98±0,07, 1,61±0,06 lg КОЕ/мл при содержании пероксида водорода, соответственно, 1, 1,5, 3, 3,8, 4,6, 5,4 мМ, тогда как в контроле - 6±0,21 lg КОЕ/мл.

Сходный эффект оказывало совместное применение метаболитов лактобацилл, пероксидазы хрена и йодида калия и на S. aureus. Количество жизнеспособных клеток при содержании пероксида водорода 1мМ составило 4,9±0, lg КОЕ/мл, 1,5 - 4,8±0,23 lg КОЕ/мл, 3 - 4,6±0,2, 3,8 - 3,6±0,2, 4,6 - 3,1±0,15, 5, - 2,4±0,12 и в контроле 6,3±0,29 lg КОЕ/мл Полученные данные, вероятно, могут служить подтверждением того, что существующий in vivo антагонистический эффект пероксидпродуцирующих лактобацилл, определяющий высокую колонизационную резистентность вагинального биотопа, опосредован превращением малоактивного пероксида водорода в высокореакционноспособные активные формы кислорода.

Полученные в настоящем исследовании результаты о роли про- и антиоксидантов, продуцируемых микроорганизмами, в формировании и регуляции функционирования симбиозов с участием прокариот, позволяют обосновать значение этого явления для поддержания эубиоза.

Важным моментом в развитии и существовании биоценоза является возможность модификации метаболитами пероксидпродуцирующих свойств бактерий, ответственных за их адаптацию и колонизационный потенциал. Не менее существенное значение имеет и выявленная способность пероксидпродуцирующих бактерий потенцировать бактерицидный эффект факторов врожденного иммунитета (на примере лизоцима, лактоферрина и антимикробного белка тромбоцитов).

Значительную роль в поддержании стабильности эубиоза следует отвести антагонистическому эффекту лактобацилл, обусловленному продукцией пероксида водорода и усиленному метаболитами бактерий с прооксидантным действием, направленным на ингибирование ферментов антиокислительной системы и восстановление железа.

Также нужно отметить важное значение способности бактерий снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов и тем самым предохранять пероксидпродуцирующие микроорганизмы от самоуничтожения. Это дает основание признать, что равновесные состояния баланса про- и антиоксидантов способствуют стабилизации эубиоза, тогда как его изменения сопровождают дисбиотические состояния биотопа.

Наконец, высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов позволяет рассматривать генерирующие их системы, как природный высокоэффективный дезинфектант широкого спектра действия.

Оценивая изложенный материал в целом, следует выделить 3 основные положения:

- про- и антиоксидантов - регуляторы симбиотических отношений, определяющие уровень стабильности в биоценозе, за счет модификации биологических свойств симбионтов и препятствия колонизации биотопа аллохтонными микроорганизмами;

- выявленные закономерности участия про- и антиоксидантов в обеспечении стабильности симбиоза определяют экологическое состояние биотопа (на примере вагинального) за счет смещения баланса или изменения концентраций этих веществ.

- возможность усиления биоцидного эффекта пероксида водорода, продуцируемого лактобациллами, позволяет рассматривать эти бактерии как источник активных форм кислорода - высокоэффективного природного дезинфектанта широкого спектра действия.

Высокая распространенность и выраженность продукции про- и антиоксидантов представителями нормальной микрофлоры репродуктивного тракта женщин определяют экологическое благополучие биотопа.

Продукция про- и антиксидантов в микробном сообществе индуцируется факторами среды, определяя исход биоценоза.

Выявленная способность микроорганизмов снижать бактерицидный эффект гидроксильных радикалов – причина устойчивости пероксидпродуцирующих бактерий к оксидативному стрессу.

Инактивация гидроксильных радикалов антиоксидантами и препятствование их образованию за счет окисления двухвалентного железа в трехвалентное объясняют механизм снижения бактерицидности этих активных форм кислорода бактериальными метаболитами.

Снижение антиоксидантной защиты бактерий за счет ингибирования каталазы метаболитами нормальной микрофлоры является одним из механизмов потенцирования антагонистической активности пероксидпродуцирующих лактобацилл.

Модификация факторов врожденного иммунитета макроорганизма метаболитами пероксидпродуцирующих микроорганизмов, приводящая к оппозитному изменению его активности в отношении автохтонных и аллохтонных бактерий, является одним из механизмов формирования и регуляции стабильного микробного биоценоза в организме человека.

Разнонаправленное изменение уровня биопленкообразования и адгезивности микроорганизмов метаболитами лактобацилл, продуцирующих пероксид водорода, свидетельствует об определяющей роли этого метаболита в дифференциации автохтонных и аллохтонных бактерий.

Высокая биоцидная активность гидроксильных радикалов позволяет рассматривать генерирующую их систему, как природный высокоэффективный дезинфектант широкого спектра действия.

Черкасов С.В., Забирова Т.М., Сгибнев А.В., Черкасов И.В. Роль биологических свойств вагинальных лактобацилл в процессах колонизации // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2003. №4. С.

Сгибнев А.В. Механизмы выживания бактерий в условиях окислительного стресса и дефицита ионов железа // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2006. №4. С. 20-22.

Семёнов А.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Микробная регуляция антагонистической активности бактерий // Бюлл. эксперим. биол.

и мед., 2007. Т. 144. №11. С. 545-548.

Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Активные формы кислорода как фактор, регулирующий поверхностные свойства бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2008. №4. С. 3-6.

Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Бухарин О.В. Механизмы протективного действия внеклеточных метаболитов бактерий в снижении бактерицидного эффекта гидроксильных радикалов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2009. №4. С. 26-28.

Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Влияние активных форм кислорода на антилизоцимную активность бактерий // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2009. №4. С. 59-62.

Глухова Е.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В., Бухарин О.В. Характеристика микроэкологических нарушений при эндометрите // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии,. 2009. №4. С. 93-96.

Бухарин О.В., Сгибнев А.В. Влияние активных форм кислорода на адгезивные характеристики и продукцию биопленок бактериями // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №3. С. 70-73.

Бухарин О.В., Сгибнев А.В. Влияние метаболитов коринебактерий на антагонистическую активность Н2О2–продуцирующих лактобацилл // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. №4. С.48Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В. Роль ассоциативных микросимбионтов в функционировании ассоциативного симбиоза // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2012. № 6. С.89-95.

Бухарин О.В., Сгибнев А.В. Влияние метаболитов Н2О2-продуцирующих 11.

лактобацилл на функциональную активность лизоцима // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2013. № 4. С.60-64.

Бухарин О.В., Кремлева Е.А., Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Участие доминантной микрофлоры в механизмах защиты вагинального биотопа женщин // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии, 2013. № 6. С.65-69.

Черкасов С.В., Забирова Т.М., Сгибнев А.В., Черкасов И.В. Биологические свойства лактобацилл биотопов человека в норме и при дисбиозах //Сб. материал. междунар. конф. «Пробиотики, пребиотики, синбиотки и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы», Москва, 2004, с. 36-37.

Черкасов С.В., Сгибнев А.В. Бактериальные механизмы колонизационной резистентности //Физиология микроорганизмов в природных и экспериментальных системах (памяти профессора М.В. Гусева): Материалы междунар. науч. конф., Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 16-19 мая 2006 г. – М.: МАКС Пресс, 2006. – С. 43.

Сгибнев А.В. Влияние активных форм кислорода на культуральноморфологическую диссоциацию бактерий //Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы IV междунар. науч. конф., С-Петербург, НИИЭМ им. Пастера, 2 – 4 июня 2008 г. - С. 160.

Сгибнев А.В., Черкасов С.В., Забирова Т.М., Бухарин О.В. Способ выявления у микроорганизмов протективного действия в эффекте Фентона.

Патент РФ на изобретение № 2279079 от 27.06.2006. Бюл. №18.

Бухарин О.В., Сгибнев А.В., Черкасов С.В. Способ дезинфекции объектов окружающей среды. Патент РФ на изобретение № 23221426 от 10.04.2008. Бюл. №10.

Бухарин О.В., Семёнов А.В., Черкасов С.В., Сгибнев А.В. Способ определения способности микроорганизмов регулировать антагонистическую активность бактерий. Патент РФ на изобретение № 2376381 от 20.12. АЛА – антилизоцимная активность АФК – активные формы кислорода ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидрозил КОЕ – колониеобразующие единицы ОАА – общая антиоксидантная активность ПМО – показатель микробной обсемененности

СГИБНЕВ

АНДРЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ПРО- И АНТИОКСИДАНТЫ КАК ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ И

РЕГУЛЯЦИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ СИСТЕМ С УЧАСТИЕМ ПРОКАРИОТ

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать.09.2013 г. Формат 60х84 1/16. Печать оперативная. Усл. печ. листов – 2,0. Тираж 100 экз.

Оригинал-макет изготовлен с помощью текстового редактора Microsoft Word 2003 for Windows. Гарнитура Times.



 
Похожие работы:

«КОЛЕСОВА Мария Анатольевна ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ УСТОЙЧИВОСТИ ОБРАЗЦОВ D-ГЕНОМНОЙ ГРУППЫ РОДА AEGILOPS L. К ЛИСТОВЫМ БОЛЕЗНЯМ (ЛИСТОВАЯ РЖАВЧИНА, СЕПТОРИОЗ, ТЕМНО-БУРАЯ ЛИСТОВАЯ ПЯТНИСТОСТЬ) Специальности: 03.00.15 – генетика 06.01.05 – селекция и семеноводство АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург - 2007 Диссертационная работа выполнена в отделе иммунитета Государственного научного центра Российской Федерации...»

«ПАВЛУШИН Сергей Викторович ВЛИЯНИЕ ФЕНОЛОГИЧЕСКОГО ВОЗРАСТА ЛИСТЬЕВ БЕРЕЗЫ ПОВИСЛОЙ (Betula pendula Roth.) НА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (Lymantria dispar L.) И ТЕЧЕНИЕ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ 03.02.05 – энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2013 Работа выполнена в лаборатории патологии насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института систематики и экологии животных СО РАН Научный...»

«Цыренов Баир Солбонович Сезонные изменения физико-химических условий и активности микробного сообщества в содовом озере Белое (Западное Забайкалье) 03.00.16 - экология 03.00.07 - микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Абидуева Елена Юрьевна Научный консультант : кандидат биологических...»

«Аничкин Александр Евгеньевич Структура и функциональная роль животного населения почв муссонного тропического леса Вьетнама 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва, 2008 Институт проблем экологии и эволюции имени А.Н. Северцова Работа выполнена в Совместном Российско-Вьетнамском Тропическом научно-исследовательском и технологическом центре Научный руководитель : доктор биологических наук, член-корреспондент...»

«ИНДЖГИЯ ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ФЕРМЕНТНЫМИ СИСТЕМАМИ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS В ПРИСУТСТВИИ МЕДИАТОРОВ ФЕРРОЦЕНОВОГО РЯДА 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2010 Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. кандидат химических наук, доцент Научный руководитель :...»

«Горбачева Марина Анатольевна Биокаталитические свойства лакказ из различных источников Специальность 03.00.04 биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2009 1 Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н.Баха РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук С.В. Шлеев Официальные оппоненты : доктор химических наук И.Н. Курочкин кандидат химических...»

«Закария Давидович Гинтури Псиллиды (Hemiptera, Psylloidea) междуречья рек Малого Лиахви и Меджуды: фауна, биология, результаты использования инсектицидов - энтомология 03.00.09 АВТОРЕФЕРАТ диссертации представленной на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук _ 2006 Тбилиси Диссертационная работа выполнена на кафедре зоологии Тбилисского Государственного Университета им. Ив. Джавахишвили. Научный...»

«АНАНЬКО Григорий Григорьевич БИОНЕМАТИЦИД НА ОСНОВЕ ГРИБА-ГЕЛЬМИНТОФАГА DUDDINGTONIA FLAGRANS F-882 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Кольцово - 2012 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Теплякова Тамара Владимировна Официальные...»

«БЕЛЯЕВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА МИКРОБИОТА КИШЕЧНИКА КОРЕННОГО ЖИТЕЛЯ ЦЕНТРАЛЬНОГО ФЕДЕРАЛЬНОГО ОКРУГА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАК ОСНОВА ДЛЯ СОЗДАНИЯ РЕГИОНАЛЬНЫХ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2014 Работа выполнена в Государственном Бюджетном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального Образования Тверская государственная медицинская академия Министерства...»

«СМИРНОВ Дмитрий Григорьевич ОРГАНИЗАЦИЯ СООБЩЕСТВ И ПОПУЛЯЦИЙ РУКОКРЫЛЫХ (MAMMALIA: CHIROPTERA) В УСЛОВИЯХ УМЕРЕННО-КОНТИНЕНТАЛЬНОГО  КЛИМАТА  РОССИИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пенза – 2013 1 Работа  выполнена  в  федеральном  государственном  бюджетном  образовательном учреждении высшего профессионального образования “Пензенский государственный...»

«ПАНЬКОВА Виктория Владимировна АЛЛОЗИМНЫЕ СПЕКТРЫ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТ ИЗОМЕРАЗЫ У ПОЛИДОРИД (POLYCHAETA: SPIONIDAE) И ВОЗМОЖНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ ФОРМИРОВАНИЯ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2006 2 Работа выполнена в Институте биологии моря имени А. В. Жирмунского ДВО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Манченко Геннадий Петрович Официальные оппоненты : член-корреспондент РАН доктор...»

«ХЛУДЕНЁВ СЕРГЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ ОЦЕНКА ВОЗДЕЙСТВИЯ НЕФТЕХИМИЧЕСКИХ ПРОИЗВОДСТВ НА ОБЪЕКТЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ УСЛОВИЯХ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Пермь – 2007 2 Работа выполнена в Пермском государственном техническом университете Научный руководитель : кандидат технических наук, доцент, Рябчиков Николай Михайлович Официальные оппоненты : доктор технических наук Швецова-Шиловская...»

«Васильева Галина Валериевна СЕМЕННАЯ ПРОДУКТИВНОСТЬ И РОСТ ПОТОМСТВА ЕСТЕСТВЕННЫХ ГИБРИДОВ МЕЖДУ КЕДРОМ СИБИРСКИМ (PINUS SIBIRICA DU TOUR) И КЕДРОВЫМ СТЛАНИКОМ (P. PUMILA (PALL.) REGEL) 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте мониторинга климатических и экологических систем Сибирского отделения РАН, г. Томск Научный руководитель : кандидат...»

«КУШНИР Константин Яковлевич ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ ОБЕЗВРЕЖИВАНИЯ ВТОРИЧНЫХ ОТХОДОВ ПРИ ПОЛИГОННОМ ЗАХОРОНЕНИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ Специальность: 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук Москва-2010 Диссертационная работа выполнена в Московском государственном университете инженерной экологии (МГУИЭ) на кафедре Техника и технология переработки отходов. Научный руководитель : доктор технических...»

«Потапенко Наталья Христофоровна АДАПТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШЕЛКОВИЦЫ В УСЛОВИЯХ КЛИМАТИЧЕСКОГО СТРЕССА (НА ПРИМЕРЕ НИЖЕГОРОДСКОГО ПОВОЛЖЬЯ) Специальность: 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена на базе Ботанического сада Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Научный...»

«ЛИХАЦКАЯ Галина Николаевна МЕХАНИЗМЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТРИТЕРПЕНОВЫХ И СТЕРОИДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ С ЛИПИДНЫМИ МЕМБРАНАМИ Специальность: 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Владивосток 2006 2 Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии ДВО РАН Научный руководитель : Доктор физико-математических наук Ермишкин Лев Николаевич Официальные оппоненты : Профессор, доктор физико-математических наук...»

«ФИЛИППОВ Дмитрий Андреевич СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ЭКОСИСТЕМ ПОЙМЕННЫХ БОЛОТ БАССЕЙНА ОНЕЖСКОГО ОЗЕРА (ВОЛОГОДСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.00.16 – экология 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2008 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор БОЛОТОВА Наталья Львовна доктор биологических наук,...»

«БОЧКОВ Андрей Владимирович АКАРИФОРМНЫЕ КЛЕЩИ, ПОСТОЯННО ПАРАЗИТИРУЮЩИЕ НА МЛЕКОПИТАЮЩИХ: ФИЛОГЕНИЯ, СИСТЕМАТИКА И ПАРАЗИТО-ХОЗЯИННЫЕ СВЯЗИ 03.02.11 – паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург – 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Зоологический институт РАН Научный консультант доктор биологических наук Миронов Сергей Валентинович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Саптарова Лилияна Минкаировна ТЯЖЕЛЫЕ МЕТАЛЛЫ В СИСТЕМЕ ВОДА-ПОЧВА-РАСТЕНИЕ В УСЛОВИЯХ ОРОШЕНИЯ ТЕХНОГЕННО-ЗАГРЯЗНЕННОЙ ВОДОЙ Специальность 03.02.08 - Экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа – 2011 Работа выполнена в Государственном автономном научном учреждении Институт региональных исследований Академии наук Республики Башкортостан Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«Беляев Евгений Анатольевич ФИЛОГЕНИЯ, СИСТЕМА И ЭВОЛЮЦИЯ СЕМЕЙСТВА ПЯДЕНИЦ (LEPIDOPTERA: GEOMETRIDAE) 03.00.09 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт–Петербург 2009 Работа выполнена в лаборатории энтомологии Биолого-почвенного института Дальневосточного отделения Российской Академии наук Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сергей Юрьевич Синёв доктор биологических наук Олег Григорьевич Горбунов доктор...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.