WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Сафенкова Ирина Викторовна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСОВ РАСТЕНИЙ

С АНТИТЕЛАМИ: КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ

И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Б.Б. Дзантиев кандидат биологических наук А.В. Жердев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин доктор биологических наук, профессор О.В. Игнатов

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Защита состоится 28 октября 2010 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан _ сентября 2010 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Работа посвящена характеристике биохимических и биоаналитических аспектов взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с наночастицами коллоидного золота. Большинство вирусов растений состоит из нуклеиновой кислоты, полностью покрытой упорядоченными копиями белка оболочки. Такая морфология позволяет отнести вирусы растений к поливалентным антигенам с регулярным расположением детерминант. При взаимодействии вирусов со специфическими антителами происходит образование сложных иммунных комплексов, состав которых определяется соотношением реагентов и константами иммунохимической реакции. Возможность поливалентных взаимодействий обусловлена близким расположением идентичных антигенных детерминант на поверхности вирусной частицы и подвижностью Fab-фрагментов иммуноглобулинов.

Определение количественных характеристик реакции поливалентных антигенов с антителами является необходимой основой для описания процессов формирования ими иммунных комплексов разного состава.

Вирусы растений – информативный природный материал для изучения поливалентных взаимодействий. В то же время иммунохимическая характеристика вирусов растений создает научную основу для создания высокочувствительных биоаналитических систем их детекции, что имеет большое практическое значение. Для этой цели также необходимо выявление корреляций между свойствами иммунореагентов и физикохимическими характеристиками процессов образования иммунных комплексов вирус–антитело. Эффективным инструментом для такого исследования являются конъюгаты антител и наноразмерных носителей, в первую очередь коллоидного золота, которое благодаря своим уникальным свойствам широко используется в биоаналитических системах.

Используемые сокращения: АСМ – атомно-силовая микроскопия, АТ – антитела, БСА – бычий сывороточный альбумин, ВКГ – вирус крапчатости гвоздики, ВТМ – вирус табачной мозаики, ВШС – вирус шарки сливы, ИФА – иммуноферментный анализ, ИХА – иммунохроматографический анализ, МАт – моноклональные антитела, НКЗ – наночастицы коллоидного золота, о.е. – относительная единица, ПАт – поликлонвльные антитела, ПВП – поливинилпирролидон, ППР – поверхностный плазмонный резонанс, ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия, ФБС – 50 мМ K-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl, ФБС-Т – ФБС с добавлением 0,05% Тритона Х-100, IgG – иммуноглобулины класса G, ХВК – Х-вирус картофеля.

Одним из активно развивающихся направлений биоанализа являются иммунохроматографические тест-системы. Экспрессное определение растительных вирусов методом иммунохроматографии на основе коллоидного золота – эффективный подход для выявления различных фитопатологий, что обусловливает актуальность разработки и производства этих тест-систем в России.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение количественных закономерностей взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с наночастицами коллоидного золота и применение полученных результатов для разработки экспрессных методов иммунохроматографического анализа вирусов растений.

Достижение этой цели включало решение следующих задач:

1. Исследовать процессы иммобилизации антител на поверхности наночастиц коллоидного золота разного размера.

2. Изучить количественные закономерности взаимодействия вирусов растений с нативными антителами.

3. Сравнить количественные характеристики взаимодействия между вирусами и конъюгатами антител с наночастицами коллоидного золота, различающимися по составу.

4. Изучить влияние состава и свойств иммунореагентов на аналитические характеристики иммунохроматографических тест-систем.

5. Разработать иммунохроматографические тест-системы для детекции вирусов растений.

Научная новизна. Разработаны экспериментальные подходы для анализа поливалентных иммунохимических взаимодействий с использованием методов иммуноферментного анализа (ИФА), атомносиловой микроскопии (АСМ), просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), поверхностного плазмонного резонанса (ППР), проточной цитофлуориметрии и динамического светорассеяния. Получены физикохимические характеристики взаимодействия четырех вирусов растений (вирус крапчатости гвоздики (ВКГ), вирус табачной мозаики (ВТМ), Х-вирус картофеля (ХВК), вирус шарки сливы (ВШС)) с поли- и моноклональными антителами и их конъюгатами с коллоидным золотом. Количественно охарактеризованы силы единичного взаимодействия бивалентного антитела с поливалентным вирусным антигеном методом атомно-силовой микроскопии. Получены количественные характеристики взаимодействия между вирусами растений и конъюгатами антител с наночастицами коллоидного золота (НКЗ) разного состава. Экспериментально установлено, что при варьировании размера наночастиц изменение валентности конъюгата влечет за собой изменение его аффинности. С ростом диаметра НКЗ, входящих в состав конъюгатов, кинетическая константа ассоциации увеличивается, а кинетическая константа диссоциации уменьшается. На основе полученных данных предложены подходы для направленной оптимизации экспрессных систем детекции вирусов растений с применением НКЗ.

Практическая значимость работы. Разработаны способы получения конъюгатов антител и НКЗ с контролируемыми свойствами. Определены оптимальные свойства иммунореагентов для применения в иммунохроматографическом анализе вирусов растений. Разработаны и изготовлены экспериментальные образцы иммунохроматографических тест-систем для экспрессного (10 минут) выявления ВКГ, ВТМ, ХВК и ВШС в листьях растений. Показано, что тест-системы, изготовленные в соответствии с обоснованными в работе требованиями к иммунореагентам, по эффективности выявления зараженных вирусами растений не уступают иммуноферментному анализу, но позволяют значительно сократить время определения.

Связь работы с государственными программами. Работа была поддержана ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг. (государственный контракт № П975 от 20 августа 2009 г.).

представлены на следующих научных мероприятиях: Первая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии" (Москва, 2007), Международная научно-практическая конференция «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), конференция «Химический анализ» в рамках 32-ой Годичной сессии Научного совета по аналитической химии РАН (Московская обл., 2008), Четвертый съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва–Пущино, 2009), Четвертая международная конференция "Современные достижения бионаноскопии" (Москва, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, публикация в которых рекомендуется ВАК, и тезисов в материалах конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (3 главы) и списка литературы (282 наименования). Работа изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит 80 рисунков и 17 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали вирусы растений: ВКГ, ВТМ, ХВК и ВШС и поликлональные антитела (ПАт) к ним, предоставленные кафедрой вирусологии МГУ им. М.В. Ломоносова. IgG-фракцию выделяли из кроличьих антисывороток ионообменной хроматографией на ДЭАЭсефацеле. Моноклональные антитела (МАт), специфичные к ХВК (3G4, 1A5) и ВШС (1D5B1, 2H2F6, 2F12E8), получены в ЦНИИ туберкулеза РАМН. МАт осаждали из асцитной жидкости сульфатом аммония и очищали на колонке с белок А–сефарозой.

Наночастицы коллоидного золота получали цитратным методом [Frens G. Nat. Phys. Sci. 1973. V. 241. P. 20–22]. При синтезе препаратов НКЗ с диаметром от 10 до 60 нм к 0,01%-ному раствору HAuСl4 добавляли цитрата натрия до конечной концентрации от 0,06 до 0,01%. Для получения НКЗ с диаметром менее 10 нм дополнительно вносили танниновую кислоту и К2СО3. Смесь кипятили до полного восстановления золотохлористоводородной кислоты и получения стабильного коллоидного раствора, затем охлаждали и хранили при 4–6оС.

Получение конъюгатов антител с НКЗ. Для получения конъюгата антитела переводили в 10 мМ буфер со значением рН от 7,5 до 10,0. К НКЗ добавляли раствор антител, инкубировали при комнатной температуре и дополнительно стабилизировали раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) [Hermanson G.T. Bioconjugate Techniques, Academic Press.

2008. P. 924–934]. НКЗ с иммобилизованными молекулами IgG отделяли от несвязавшихся молекул антител центрифугированием. После удаления супернатанта осадок ресуспендировали в 50 мМ K-фосфатном буфере, рН 7,4, с 0,1 М NaCl (ФБС), содержащем 0,25% БСА и 0,25% Твин 20.

Определение констант реакции взаимодействия вирусов с антителами (АТ) и конъюгатами АТ методом поверхностного плазмонного резонанса.

Реагенты ковалентно иммобилизовали на поверхности СМ5 или СМ3 чипа, затем регистрировании образование иммунных комплексов на приборе «Biacore X» («Biacore AB», Швеция). Взаимодействия антиген–антитело проводили в HEPES-P буфере. Константы рассчитывали, используя программу «BIAevaluation» («Biacore AB», Швеция) для аппроксимации концентрационных зависимостей или в режиме «Steady state affinity».

Спектрофотометрические измерения препаратов коллоидного золота и их конъюгатов проводили на приборе «Shimadzu UV-1202» («Shimadzu Corporation», Япония) в диапазоне длин волн от 200 до 800 нм.

Динамическое светорассеяние регистрировали с использованием приборного комплекса «Photocor» («Photocor Instruments», США), анализируя данные с помощью программного обеспечения «DynaLS»

(«Alango», Израиль). Распределение частиц коллоидного золота и их конъюгатов с антителами по величине гидродинамического радиуса получали при 25 °С, регистрируя рассеяние под углом 90°.

Просвечивающая электронная микроскопия. Препараты НКЗ, конъюгатов и вирусов наносили на медные сеточки (300 меш., «Pelco International», США), покрытые пленкой из поливинилформаля. Для получения изображения использовали технику негативного контрастирования (на основе 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты). Снимки получали на электронном микроскопе JEM-100CX/SEG («Jeol», Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Фотографии в цифровой форме анализировали с использованием программы «UTHSCSA Image Tool»

(«UTHSCSA», США).

Атомно-силовая микроскопия. Препараты вируса и конъюгатов наносили на поверхность свежесколотой слюды («SPI Supplies, Structure Probe», США). Сканирование образцов проводили на атомно-силовом микроскопе «SmartSPM» («АИСТ-НТ», Россия) с использованием кантилеверов fpN01HR («Нанотюнинг», Россия), радиус кривизны ~1 нм.

Полученные изображения анализировали, используя программу «Gwiddion»

(Czech Metrology Institute, Чехия).

Для количественной регистрации сил единичных взаимодействий антитела с вирусом поверхность кантилевера последовательно модифицировали 3-аминопропилтриэтоксисиланом и N-сукцинимидил 3-(2-пиридилдитио) пропионатом, затем добавляли антитела, модифицированные малеимидометилциклогексан-1-карбокси гидроксисукцинимидным эфиром. В жидкостной ячейке сканировали образец с иммобилизованным вирусом в полуконтактном режиме, после чего в контактном режиме снимали зависимость силы по координате Z от расстояния зонд–поверхность.

Иммуноферментный анализ. Вирусы (конкурентный формат ИФА) или антитела («сэндвич»-формат ИФА) иммобилизовали в лунках полистиролового планшета (Сostar 9018, «Corning-Costar», США) при 37 С в течение 2 ч. После отмывки в планшет вносили пробы, содержащие определяемый вирус, и антитела в ФБС с добавлением 0,05% Тритона Х-100 (ФБС-Т), инкубировали при 37 С и отмывали (конкурентный формат ИФА) или проводили последовательные взаимодействия с вирусом и антителами в ФБС-Т («сэндвич»-формат ИФА). Затем добавляли пероксидазный конъюгат антивидовых антител, инкубировали при 37 С и отмывали. Для определения пероксидазной активности добавляли раствор 3,3',5,5'-тетраметилбензидина и Н2О2 в 30 мМ Na-цитратном буфере, рН 4,0, инкубировали 15 мин при комнатной температуре, останавливали реакцию добавлением 1 М H2SO4 и измеряли А450 на вертикальном фотометре «Zenyth 3100» («Anthos», Австрия). Полученные зависимости степени связывания антител от концентрации вируса в пробе аппроксимировали посредством программы «Origin», версия 7.5 («OriginLab», США).

Изготовление иммунохроматографических тест-полосок. Реагенты наносили на мембраны («Advanced Microdevices», Индия) с использованием автоматического диспенсера «IsoFlow» («Imagene Technology», США). Для получения индивидуальных тест-полосок из мультимембранного композита применяли автоматический гильотинный нарезчик «Index Cutter-1» («A-Point Technologies», США). На миниконвейере FR-900 («Wenzhou dingli packing machinery», Китай) тест-полоски герметично упаковывали в пакеты из ламинированной алюминиевой фольги, используя в качестве осушителя силикагель.

Иммунохроматографический анализ проводили при комнатной температуре. Экстракты из листьев растений получали, растирая в течение 1 мин навеску листьев массой 200±20 мг в 2 мл экстрагирующего буферного раствора, далее использовали полученный неосветленный экстракт или экстракт, осветленный центрифугированием при 10.000 g в течение 5 мин при комнатной температуре. Тест-полоску погружали в анализируемую пробу на 1,5 мин в вертикальном положении, извлекали и помещали на горизонтальную поверхность. Качественный результат ИХА оценивали визуально через 10 мин. Цифровую регистрацию осуществляли с помощью сканера, количественную оценку связывания НКЗ – с помощью программы «TotalLab», версия 2.01 («Nonlinear Dynamics», Великобритания).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика иммунореагентов Поскольку морфология вирусных частиц, наличие агрегатов и отдельных субъединиц влияют на процесс иммунохимического взаимодействия, была проведена характеристика вирусных препаратов.

Рис. 1. Изображения ВШС, полученные методами ПЭМ (А) и АСМ (Б). Линией на рис. Б обозначено место проведения сечения; В – профиль сечения Препараты вирусов растений (ВКГ, ВТМ, ХВК, ВШС) были охарактеризованы методами ПЭМ и АСМ. Данные электронной и атомносиловой микроскопии подтвердили соответствие размерных параметров вирусов в препаратах теоретическим представлениям (база данных ICTVdB). У нитевидных и палочковидных вирусов, помимо целых вирионов, отмечены структуры меньшей длины (что, возможно, объясняется воздействием центрифугирования на стадии получения вирусного препарата) и вирионы, агрегированные торец в торец. На рис. представлены изображения ВШС, полученные методами ПЭМ и АСМ. Для препарата ВШС атомно-силовая характеристика была проведена впервые.

Диаметр вирусных частиц, определенный методом АСМ, составил для ВТМ ~14 нм, ХВК ~7 нм, ВШС ~12 нм. Отметим, что регистрируемая высота варьирует в зависимости от типа подложки, способа адсорбции (физическая адсорбция или ковалентная иммобилизация), рН буфера нанесения и присутствия двухвалентных ионов, что согласуется с результатами, полученными в работе [Knez M. et al. Langmuir. 2004. V. 20.

P. 441-447].

Помимо визуализации вирусных частиц методами электронной и атомно-силовой микроскопии, их состав был идентифицирован методом денатурирующего электрофореза. Молекулярная масса детектируемого белка для каждого вируса соответствовала массе мономерного белка оболочки, примеси других белков обнаружены не были.

Для получения моновалентного препарата, содержащего одну антигенную детерминанту, ХВК разрушали раствором 2 М LiCl и выделяли белковую субъединицу. Характеристика методами кругового дихроизма и высокоэффективной жидкостной хроматографии показала, что выделенный препарат субъединицы структурно соответствует нативному белку оболочки.

Вторым компонентом изучаемой реакции взаимодействия являются антитела, специфичные к вирусам. В работе использовали четыре поликлональных антитела (против ВКГ, ВТМ, ХВК, ВШС) и пять моноклональных антител (1А5, 3G4 – против ХВК, 1D5B1, 2H2F6, 2F12E8 – против ВШС).

Методом АСМ были получены изображения монослойных пленок антител, сформированных на поверхности слюды методом физической сорбции из концентрированного раствора. Высота пленки равна 5 нм, что близко к литературным данным [Tronin A. et al. Sensors and Actuators B. V. 34. P. 276Применяя расщепление эластазой, пепсином или папаином, получили моновалентные препараты (Fab-фрагменты) моноклональных антител 3G (против ХВК) и 1D5B1 (против ВШС).

Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом ППР Для прямой детекции иммунных взаимодействий в режиме реального времени применяли регистрацию эффекта ППР на приборе «BIAcore X». На рис. 2 представлены три экспериментальные схемы, которые были использованы для изучения взаимодействия вирусов с антителами.

Рис. 2. Схемы экспериментов, проводимых на приборе «Biacore X».

Константы определяли на стадиях, отмеченных красными стрелками По схеме №1 получены значения равновесной константы диссоциации (Кд) (в расчете на моль вирусных частиц) для ВКГ и ПАт – 1,6·10-12 М, для ВТМ и ПАт – 7,3·10-12 М. При этом кинетические константы ассоциации составляли 2,7·107 (ВКГ) и 7,8·106 (ВТМ) М-1с-1, диссоциации – 4,2·10-5 (ВКГ) и 5,7·10-5 (ВТМ) с-1. Однако схема №1 малоинформативна в условиях плотной посадки антивидовых антител на поверхность чипа (что необходимо для получения регистрируемого сигнала) и больших размеров вирусных частиц; в этом случае отличия между разными антителами практически отсутствовали в связи с поливалентным характером взаимодействия.

Схема №2 представляет собой самый простой вариант, включающий наименьшее количество этапов в цикле. Однако в этом случае этап регенерации не только удаляет специфические антитела с поверхности вирусных частиц, но и разрушает РНК-белковый комплекс вируса, постепенно удаляя белковые субъединицы. Таким образом, концентрация антигенных детерминант на поверхности чипа уменьшается с каждым циклом.

В схеме №3 реализована возможность использовать в каждом цикле вирусы в нативном состоянии (не подвергавшиеся воздействию агрессивных сред). К недостаткам данной схемы следует отнести длительность цикла. Преимущества схемы:

взаимодействие антител с вирусами, не подвергавшимися модификации (в отличие от прямой ковалентной иммобилизации в уменьшение диффузионных ограничений при взаимодействии антител в растворе;

возможность контролировать количество иммобилизованного вируса.

Взаимодействие вируса с иммобилизованными антителами в схеме №3 характеризовалось высокой воспроизводимостью: например, в серии из 12 измерений при среднем значении сигнала 10,37 RU стандартное отклонение составило 0,42 RU, т.е. около 4%. На рис. 3 приведены концентрационные зависимости взаимодействия ВШС с наиболее (1D5B1) и наименее (2F12E8) аффинными антителами. Для МАт к ВШС (1D5B1, 2H2F6, 2F12E8) и ХВК (3G4, 1A5) были получены следующие значения Кд (при расчете на моль антител): 1,46·10-8 M (1D5B1), 1,73·10-8 M (2H2F6), 5,5·10-7 M (2F12E8), 1,0·10-9 M (3G4), 3,1·10-8 M (1A5). Таким образом, МАт к ХВК и МАт 1D5B1 и 2H2F6 были сходными по аффинности, МАт 2F12E характеризовались худшим сродством к ВШС. Для Fab-фрагментов МАт 3G4, полученных расщеплением папаином (данный вариант методики обеспечивал лучшую антиген-связывающую активность), Kд составила 4,9·10-8 M, что в 50 раз выше по сравнению с нативными антителами.

Рис. 3. Концентрационные зависимости взаимодействия ВШС (иммобилизован на фазе) с моноклональными антителами (в растворе) 1D5B1 (А) (кривые 1–8 соответствуют концентрациям МАт 400, 200, 100, 60, 30, 15, 8 и 4 нМ) и 2F12E8 (Б) (кривые 1–6 соответствуют концентрациям МАт 500, 400, 300, 200, 100 и 60 нМ) Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом АСМ В работе впервые был применен метод атомно-силовой микроскопии для количественной регистрации сил единичных взаимодействий бивалентного антитела с поливалентным вирусным антигеном (на примере ВШС и МАт 1D5B1).

Взаимодействие происходило при подводе кантилевера с ковалентно иммобилизованным антителом (специфичным или неспецифичным к ВШС) к поверхности с адсорбированным вирусом. В момент отвода регистрировали силу, необходимую для разрушения взаимодействия (рис. 4). Для каждого антитела было получено не менее 100 силовых кривых. Установлено, что сила отрыва для специфичных к ВШС моноклональных антител 1D5B1 составляет 229±90 пН, что сопоставимо с другими видами близких по аффинности взаимодействий белковых молекул, ранее охарактеризованными методом АСМ.

Рис. 4. Зависимость силы по координате Z от расстояния зонд–поверхность для кантилевера, модифицированного специфичными (А) и неспецифичными (Б) антителами. Красными стрелками обозначены значения сил, которые необходимо приложить для разрыва комплекса вирус–антитело Предложенная методика может найти применение для оценки свойств конъюгатов антител, в частности – для сравнения конъюгатов разного состава.

Характеристика взаимодействия вирусов растений с антителами методом ИФА Наряду с представленными выше экспериментами с прямой регистрацией формирования иммунных комплексов в реальном времени, использовали методики ИФА, характеризующие взаимодействия по концентрации несвязавшихся с антигеном антител.

Определение параметров реакции вирусов растений с антителами проводили по методике [Friguet B. J. Immunol. Meth. 1985. V. 77. P. 305–331].

Для охарактеризованных пар антитело–вирус были получены два линейных участка кривой связывания. Рассчитанные по данным ИФА (линеаризация на участке с избытком вирусных частиц) эффективные значения Кд для вирусной частицы как целого антигена и ПАт составили: ВКГ – (0,3–1,0)·10- М; ХВК – (2,7–4,7)·10-12 М; ВТМ – (0,2–1,7)·10-12 М. Значения Кд близки к величинам, измеренным на приборе «Biacore X» с использованием схемы №1 (см. рис. 2). Кд, рассчитанные для второго линейного отрезка (избыток антител), были выше в среднем на два порядка. По-видимому, низкие значения Кд (при избытке вирусных частиц) характерны для бивалентного взаимодействия антитело–вирус. В условиях избытка антител реализуются по преимуществу моновалентные взаимодействия, отличающиеся, как известно, меньшим аффинитетом.

Характеристики иммунореагентов были также определены в конкурентном и «сэндвич»-вариантах ИФА. Примеры зависимостей, полученных для антител к ХВК в ИФА, приведены на рис. 5. Для восьми пар вирус–антитело установлены высокие аналитические характеристики в конкурентном ИФА (IC10 до 10 нг/мл, IC50 до 100 нг/мл), для пары ВШС – МАт 2F12E8 отмечено наибольшее значение предела обнаружения – 700 нг/мл. Данные соответствуют теоретически рассчитанным значениям пределов обнаружения, если исходить из равновесных констант взаимодействия вирусов с антителами, полученных на приборе «Biacore X»

по схеме №3.

Получение и характеристика НКЗ Для синтеза поливалентных конъюгатов антител нами были получены НКЗ разного диаметра. Контроль гомогенности препаратов и измерение параметров частиц проводили с помощью электронной микроскопии (на рис. 6 представлены микрофотография препарата НКЗ и гистограмма распределения частиц по диаметру), динамического светорассеяния и спектрофотометрически. Для конъюгации с антителами было отобрано пять гомогенных (стандартное отклонение диаметра – до 22%) препаратов НКЗ со средним диаметром в диапазоне от 5 до 60 нм. Раствор коллоидного золота с частицами в этом диапазоне стабилен длительное время. Изменяя размер частиц, можно регулировать валентность конъюгата. Исходя из того, что одно антитело на поверхности НКЗ занимает около 45 нм2 [Harris L.J. et al. J. Mol. Biol. 1998. V. 275. P. 861–872], содержание антител в конъюгатах с отобранными препаратами НКЗ может варьировать от 2 до 250.

Рис. 6. Электронная микрофотография препарата НКЗ (А) и гистограмма распределения НКЗ по диаметру (Б). Среднее значение диаметра НКЗ – 26,0 нм, стандартное отклонение – 5,7 нм (выборка – 160 частиц) Получение конъюгатов НКЗ с антителами На основании полученных коллоидов золота были синтезированы конъюгаты с антителами. Для каждого конъюгата были подобраны условия иммобилизации, отличающиеся по концентрации антител и значениям рН.

Концентрацию антител выбирали с учетом количества белка, необходимого для стабилизации поверхности НКЗ. Концентрацию антител, стабилизирующую конъюгат, определяли методом флоккуляции. Были измерены спектры НКЗ до и после добавления коагулирующего агента (хлорида натрия). Максимум поглощения для НКЗ со средним диаметром от 5 нм до 60 нм находится в интервале 520–540 нм. Для построения флоккуляционных зависимостей в соответствии с [Geoghegan W.D., Ackerman G.A. J. Histochem. Cytochem. 1977. V. 25. P. 1187–1200] использовали величины поглощения при 580 нм, поскольку они составляют не более 35% от максимального поглощения НКЗ в видимой области и позволяют контролировать формирование агрегатов НКЗ. На рис. представлена характерная зависимость, полученная для МАт 1А5 и НКЗ со средним диаметром 23,4 нм, которая проиллюстрирована электронными микрофотографиями в ключевых точках. Исходя из полученной зависимости, выбирали концентрацию АТ, на 10–15% превосходящую точку выхода флоккуляционной кривой на плато.

Выход на плато отражает только переход НКЗ в стабильное состояние благодаря формированию белковой оболочки, но может не совпадать с насыщением НКЗ антителами. Концентрация антител, оптимальная по флоккуляционной кривой, соответствует 53–87% от максимального связывания согласно теоретическому расчету. В связи с этим были получены конъюгаты НКЗ при концентрациях антител 10, 15, 20, 40, 60 и 100 мкг/мл. Этот диапазон включает концентрации, которые существенно превосходят величину, выбираемую по флоккуляционной кривой.

Рис. 7. Флоккуляционная кривая для НКЗ (средний диаметр 23,4 нм) и МАт 1А5. 1–4 – электронные микрофотографии для препаратов, соответствующих концентрациям антител, которые отмечены такими же цифрами на флоккуляционной кривой Чтобы описать формирование белковых полислоев на поверхности НКЗ, размеры конъюгатов были охарактеризованы методом динамического светорассеяния. На рис. 8 показаны зависимости гидродинамического радиуса от концентрации МАт 3G4, добавленных при конъюгации, для НКЗ со средними диаметрами 23,4 и 33,4 нм (согласно данным электронной микроскопии). Для НКЗ (d=23,4 нм) небольшое увеличение гидродинамического радиуса достигается при концентрации антител 100 мкг/мл, что может быть связано с их дополнительной сорбцией. Для НКЗ (d=33,4 нм) такой же эффект наблюдается уже при концентрации антител, равной 60 мкг/мл.

Характер адсорбции антител на поверхности НКЗ обуславливает их ориентацию на поверхности частицы, возможность взаимодействия с антигенными детерминантами и, соответственно, аффинность конъюгата.

НКЗ со средним диаметром 23,4 нм конъюгировали с МАт 1А5 при шести значениях pH: 7,5; 8,0; 8,5; 9,0; 9,5 и 10,0 для определения оптимальных условий процесса.

Таблица 1. Оптимальные* значения рН конъюгации НКЗ и МАт Диаметр НКЗ Оптимум рН конъюгации * Соответствующие максимальному связыванию конъюгатов с ВШС в иммунохроматографической системе.

Максимальное связывание с вирусом в системах ИФА и ИХА наблюдалось для конъюгатов, синтезированных при рН 9,0, минимальные значения получены при крайних рН конъюгации – 7,5; 8,0; 10,0. Аналогичная тенденция наблюдалась при характеристике взаимодействия вирус– конъюгат методом ППР. Оптимум рН конъюгации, равный 9,0, соответствует лучшей ориентации антител для взаимодействия с вирусными частицами. Для НКЗ разного размера и разных препаратов антител рН-оптимум отличался незначительно (см. таблицу 1).

Характеристика взаимодействия вирусов с конъюгатами антитело– НКЗ методом ППР Следующей задачей являлась количественная характеристика взаимодействия вирусов с конъюгатами антитело–НКЗ. Для ее решения использовали несколько подходов, один из них – характеристика взаимодействия вирус–конъюгат методом ППР на приборе «Biacore X».

Таблица 2. Равновесные константы взаимодействия ВШС (закреплен на поверхности чипа) и конъюгатов антитело–НКЗ (в растворе), измеренные в экспериментах с регистрацией ППР Диаметр НКЗ (среднее Рис. 9. Концентрационные зависимости взаимодействия в системе “BIAcore X” между ВШС (иммобилизован на фазе) и конъюгатами МАт 1D5B1–НКЗ (d=6,4 нм) (А; кривые 1–7 соответствуют А520 конъюгата: 3; 1; 0,7; 0,3; 0,1; 0, и 0,01) и МАт 2F12E8–НКЗ (Б; кривые 1–3 соответствуют следующим сочетаниям НКЗ и А520: 1 – d=23,4, A520=1; 2 – d=6,4, A520=1; 3 – d=6,4, A520=0,1) Значения Кд были определены по схеме №3 (см. рис. 2). В таблице 2 в качестве примера представлены равновесные константы взаимодействия ВШС и конъюгатов. Для конъюгатов 2F12E8 не удалось получить константы, что, видимо, связано с их низким значением и, как следствие, необходимостью очень высоких концентраций реагентов, недостижимых в наших условиях измерений. Отличия между взаимодействием конъюгатов на основе высокоаффинных (1D5B1) и низкоаффинных (2F12E8) антител наглядно иллюстрирует рис. 9: при равных концентрациях конъюгатов степень их связывания отличается примерно в 25 раз.

Нативные антитела характеризуются существенно более низкой аффиностью взаимодействия с ВШС по сравнению с конъюгатами антитело–НКЗ; степень отличия варьирует от одного (при диаметре НКЗ 6,4 нм) до трех порядков (диаметр – 52 нм) (рис. 10). Для конъюгатов НКЗ большего размера кинетическая константа диссоциации уменьшается, а кинетическая константа ассоциации увеличивается. Данная закономерность может объясняться тем, что с ростом валентности конъюгата количество точек связывания внутри комплекса увеличивается.

Рис. 10. Кинетические (А) и равновесные (Б) константы ассоциации реакции ВШС и конъюгатов антител (1D5B1 – черные столбцы, 2H2F6 – красные столбцы) с НКЗ разного диаметра Незначительные отличия в аффинности антител к ВШС 1D5B1 и 2H2F обеспечили отличия в аффинности конъюгатов – из антител с большей равновесной константой ассоциации получены конъюгаты также с большей константой (см. рис. 10, Б). С ростом размеров НКЗ аффинность конъюгата увеличивается, о чем свидетельствуют величины, приведенные в табл. 2.

Данные закономерности были подтверждены при взаимодействии конъюгатов на основе МАт к ХВК и НКЗ с диаметрами от 6,4 до 52 нм.

Характеристика взаимодействия вирусов с конъюгатами НКЗ с антителами методами ПЭМ и АСМ Помимо данных об аффинности взаимодействия между вирусами с конъюгатами антител, представляется существенным получение информации о пространственной организации и составе комплексов вирус– антитело–НКЗ. Для решения этих задач была проведена визуализация иммунных комплексов методами микроскопии.

контрастирования показало, что конъюгаты антител с НКЗ располагаются последовательно по периферии вирусных частиц (рис. 11, А). Минимальное расстояние между соседними НКЗ, расположенными на поверхности ВШС, составляет 3,5 нм, максимальное, не превышающее размеры собственно НКЗ, – 28,8 нм. Среднее расстояние между НКЗ равняется 11,4 нм и соответствует пространству, занимаемому двумя монослоями антител на частицах. Отметим, что метод АСМ дает возможность визуализировать конъюгаты, которые расположены над вирусными частицами, лежащими на подложке (рис. 11, Б). Следствием структуры вируса с эпитопами, регулярно повторяющимися на поверхности, является возможность образования комплексов с высокими соотношениями конъюгат : вирус, вплоть до 37 : 1 (пример такого комплекса представлен на рис. 11).

Рис. 11. Изображения комплексов ВШС и конъюгата МАт 1D5B1–НКЗ (d=26,0 нм), полученные методами ПЭМ (А) и АСМ (Б) Разработка иммунохроматографических тест-систем для детекции вирусов растений На основании полученных данных о взаимодействии вирусов, специфичных к ним антител и конъюгатов НКЗ с этими антителами были разработаны тест-системы для иммунохроматографической детекции ВКГ, ВТМ, ХВК и ВШС.

Поскольку вирусы растений являются поливалентными антигенами, для их детекции использовали двухсайтный («сэндвич») формат анализа (рис. 12). В этом случае в аналитической зоне системы иммобилизованы специфические антитела и при прохождении вирусов с потоком жидкости происходит образование тройного комплекса – вирусы связываются с иммобилизованными антителами на мембране и с антителами на поверхности НКЗ. В контрольной зоне тест-полоски нанесены антитела против IgG мыши (при использовании специфических МАт) или кролика (при использовании специфических ПАт); поэтому в ней образуется комплекс иммобилизованные антитела – конъюгат независимо от наличия вируса в образце.

Рис. 12. Схема иммунохроматографической тест-системы для «сэндвич»анализа поливалентного антигена Сравнение конъюгатов, синтезированных при разных начальных концентрациях антител, проводили по связыванию в аналитической зоне на примере пары ХВК – МАт 3G4. На рис. 13 представлены измеренные для этих конъюгатов величины интенсивности окраски аналитической зоны.

Отличия по степени связывания для конъюгатов, полученных при разных концентрациях, были незначительны, хотя крайние концентрации антител – с недостатком (10 мкг/мл) и с большим избытком (40, 60, 100 мкг/мл) относительно точки насыщения по флоккуляционной зависимости – характеризовались несколько меньшей степенью связывания конъюгатов.

Эти результаты согласуются с данными [Thobhani S. et al. J. Immunol. Meth.

2010. V. 356. P. 60–69], которые показали снижение пределов обнаружения в электрохимическом анализе и ИФА при использовании конъюгатов на основе больших концентраций антител, иммобилизованных на НКЗ.

Разработка иммунохроматографических тест-систем включала определение мембран, концентраций конъюгатов, условий нанесения реагентов в аналитической и контрольной зонах. Исходя из результатов проведенных сравнительных характеристик и оптимизаций, в качестве мембраны для нанесения конъюгата использовали PTR-5, мембраны для нанесения образца – GFB-R4 (0.6), конечной адсорбирующей мембраны – AP045, рабочей мембраны – CNPC-10µ (при 10 мМ фосфатном буфере, рН 7-8). В аналитической зоне иммобилизовали антитела, обладающие большей аффинностью: 1,46·10-8 M (1D5B1) – для ВШС, 1,0·10-9 M (3G4) – для ХВК. Максимальная интенсивность окраски аналитической и контрольной зон достигалась при нанесении МАт из раствора с концентрацией 0,5 мг/мл и ПАт – 0,75 мг/мл (при скорости нанесения 0,2 мкл/мм) и не увеличивалась при иммобилизации антител из более высоких концентраций. С увеличением А520 конъюгата от 0, интенсивность окраски аналитической зоны возрастает и при значении 2, выходит на постоянный уровень. В соответствии с этой зависимостью для ИХА использовали конъюгат с А520 = 2,0.

Рис. 13. Зависимости интенсивности окраски аналитической зоны иммунохроматографической тест-системы от концентрации МАт 3G (столбцы 1–6 на нижней проекции соответствуют концентрациям 10, 15, 20, 40, 60 и 100 мкг/мл), использованной при их конъюгации с НКЗ диаметром 23,4 нм (А), 33,4 нм (Б) и 52 нм (В). В аналитической зоне иммобилизованы МАт 3G4 (0,5 мг/мл, скорость нанесения 0,2 мкл/мм); A520 конъюгатов антител с НКЗ равно 2, Определение предела обнаружения иммунохроматографических тестсистем Аналитические характеристики тест-систем изучали с использованием стандартных растворов очищенных вирусных препаратов. Пределы их обнаружения были сопоставлены для тест-систем, отличающихся по размеру использованных НКЗ. На рис. 14 приведены характерные зависимости интенсивности окраски аналитической зоны от концентрации добавленного вируса (ХВК). В ряду НКЗ с диаметрами от 6,4 до 33,4 нм рост размеров носителя сопровождался снижением предела обнаружения.

Эта тенденция наблюдалась для четырех антител – 1D5B1, 2H2F6, 3G4 и 1A5. При переходе к конъюгату на основе HКЗ с диаметром 52 нм, несмотря на максимальные размеры, предел обнаружения ХВК увеличивался (см.

рис. 14). Возможно, это связано с меньшей стабильностью конъюгатов большего размера в иммунохроматографических системах. Конъюгаты на основе антител 1D5B1 и 3G4 с большей аффинностью характеризовались более низким пределом обнаружения по сравнению с конъюгатами на основе менее аффинных антител 2H2F6 и 1A5.

Отметим соответствие размеров НКЗ, аффинностей конъюгатов и пределов обнаружения иммунохроматографических тест-систем на их основе. На рис. 15 показана зависимость предела обнаружения системы определения ВШС от размера коллоидного золота и аффинности конъюгата. Как видно, предел обнаружения увеличивается до НКЗ со средним диаметром 33 нм. Сравнение характеристик тест-систем на основе МАт и ПАт (для ХВК и ВШС) показало, что минимальный предел обнаружения (3 нг/мл) достигается при использовании МАт. Этот результат ниже предела обнаружения тест-систем для детекции соответствующих вирусов на основе ПАт в ~25 раз.

Применение разработанных тест-систем для определения вирусов в растительном материале По данным цифровой регистрации максимальная окраска аналитической и контрольной зон достигалась через 10 мин после начала анализа при детекции вирусов (ВКГ, ВТМ, ХВК, ВШС) в рабочем буфере ФСБ-Т. Стандартное отклонение сигнала для оптимизированной по всем параметрам иммунохроматографической системы в рабочем буфере составило ±4,7% для аналитической и ±2,6% для контрольной зоны.

Иммунохроматографический анализ в растительных матриксах сопряжен с необходимостью оптимизации состава экстрагирующего буфера, т.к. скорость движения фронта жидкости изменяется по сравнению с модельными системами. Была изучена кинетика изменения сигнала в аналитической зоне при добавлении в экстрагирующий буфер детергентов и экстрагирующих компонентов (Тритон Х-100; Твин 20; ПВП с разной молекулярной массой) для проб неосветленного образца. С учетом кинетики комплексообразования оптимальный состав экстрагирующего буфера – 50 мМ K-фосфатный буфер, рН 7,4, с 0,1 М NaCl, 1% Твин 20, 1% ПВП40.

Апробация аналитических систем на экстрактах из листьев показала, что соотношение (растительный матрикс) : (экстрагирующий буфер) может достигать 1:5 без потери интенсивности сигнала. Для оптимизированных условий экстракции наблюдалось соответствие пределов обнаружения в биопробах и в буфере. На рис. 16, А представлен внешний вид тестполосок после проведения анализа, а на рис. 16, Б – зависимость интенсивности окраски в аналитической зоне от концентрации ВШС в неосветленном образце. Видно, что тест-полоски позволяют детектировать ВШС в диапазоне концентраций от 3 до 1000 нг/мл.

В результате проведенных исследований разработаны иммунохроматографические тест-системы для экспрессного выявления практически значимых фитопатогенов:

инфицирующих картофель вирусов – ВТМ и ХВК;

вируса, поражающего косточковые культуры, – ВШС;

вируса, поражающего растения семейства гвоздичные, – ВКГ.

Тест-системы на основе поликлональных антител обеспечивают детекцию вирусов в неосветленных экстрактах листьев с пределами обнаружения 0,2 мкг/мл для ВТМ и ВКГ, на основе моноклональных антител – 3 нг/мл для ХВК и ВШС. Время анализа – 10 минут.

Рис. 16. Иммунохроматографическое определение ВШС в неосветленных экстрактах листьев с добавленным препаратом ВШС. А – внешний вид тестполосок после проведения анализа (К – контрольная зона, А – аналитическая зона); Б – зависимость интенсивности окраски аналитической зоны от концентрации ВШС Апробация аналитических систем проводилась при участии кафедры вирусологии Московского государственного университета им. М.В.

Ломоносова, ВНИИ карантина растений и Никитского ботанического сада.

Тест-системы для детекции ХВК были апробированы на растениях картофеля сорта Невский, зараженных вирусом, и здоровых растениях, проверенных коммерческими иммуноферментными наборами «Пиротест»

фирмы «НВО Иммунотех» (Россия). Наблюдалось полное соответствие результатов диагностики методами ИФА и ИХА.

Тест-системы для детекции ВШС были апробированы на растениях косточковых плодовых культур – 18 образцов с симптомами заражения ВШС и 11 бессимптомных образцов. Для проверки результатов использовали коммерческие иммуноферментные наборы фирмы «Agdia»

(США). Вирус шарки сливы был обнаружен методами ИХА и ИФА в образцах с симптомами, тогда как в остальных 12 образцах с симптомами и во всех 11 бессимптомных образцах вирус отсутствовал, что подтверждает ненадежность отбора проб по симптомам и необходимость применения аналитических методов для выявления зараженных растений.

Полученные результаты показывают, что разработанные иммунохроматографические тест-системы могут использоваться для экспрессдиагностики вирусных инфекций растений, в том числе в полевых и внелабораторных условиях.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что изменение валентности конъюгата антител с наночастицами коллоидного золота за счет увеличения площади носителя приводит к изменению его аффинности. Равновесная константа ассоциации взаимодействия вирусов с конъюгатами выше, чем взаимодействия с нативными антителами, причем разница данных величин составляет от одного (частицы с диаметром 6,4 нм) до трех порядков (частицы с диаметром 52 нм).

2. Изучены кинетические зависимости взаимодействия вирусов с антителами и их конъюгатами. Показано, что для конъюгатов коллоидного золота большего размера (в ряду наночастиц с диаметром от 5 до 60 нм) кинетическая константа диссоциации комплекса вирус–конъюгат уменьшается, а кинетическая константа ассоциации увеличивается более чем на два порядка.

3. Проведено сравнительное изучение свойств конъюгатов, полученных при разной степени заполнения антителами поверхности частиц коллоидного золота. Показано, что увеличение содержания антител в конъюгате выше величины, минимально необходимой для стабилизации коллоидных частиц, не приводит к существенным отличиям в связывании вирусов.

4. Установлена зависимость между размером коллоидных частиц в конъюгатах с антителами и пределом обнаружения вирусов в иммунохроматографическом анализе. Показано, что минимальный предел обнаружения достигается при использовании частиц с диаметром 33 нм.

5. Разработаны иммунохроматографические тест-системы для экспрессного (10 мин) выявления Х-вируса картофеля, вируса табачной мозаики, вируса крапчатости гвоздики и вируса шарки сливы. Показана их эффективность для детекции вирусов в растительном материале.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Бызова Н.А., Сафенкова И.В., Чирков С.Н., Жердев А.В., Блинцов А.Н., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. Разработка иммунохроматографических тестсистем для экспрессной детекции вирусов растений // Прикладная биохимия и микробиология. 2009. Т. 45. № 2. С. 225–231.

2. Safenkova I.V., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Correlation between the composition of multivalent antibody conjugates with colloidal gold nanoparticles and their affinity // Journal of Immunological Methods. 2010. V. 357. № 1–2. P. 17–25.

Материалы конференций:

1. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Блинцов А.Н., Чирков С.Н. Изучение взаимодействия антител с вирусами растений различной структуры // Сборник тезисов Первой международной конференции "Современные достижения бионаноскопии". Москва, 11–17 июня 2007 г. С. 50–51.

2. Сафенкова И.В. Иммунохроматографические тест-системы для детекции вирусных инфекций картофеля // Материалы Международной научнопрактической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты».

Москва, 11–13 марта 2008 г. С. 390.

3. Сафенкова И.В., Бызова Н.А., Чирков С.Н., Блинцов А.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. Иммунохроматографический анализ вирусов растений // Сборник докладов конференции «Химический анализ» в рамках 32-ой Годичной сессии Научного совета по аналитической химии РАН.

Московская обл., п. Паведники, 21–25 апреля 2008 г. С. 77–79.

4. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Бызова Н.А., Чирков С.Н., Блинцов А.Н., Дрыгин Ю.Ф., Дзантиев Б.Б., Атабеков И.Г. Изучение взаимодействия вирусов растений с антителами и их конъюгатами с коллоидными наночастицами // Сборник материалов Четвертого съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 11–15 мая 2008 г. С. 374.

5. Сафенкова И.В., Жердев А.В. Дзантиев Б.Б. Корреляция между составом поливалентных конъюгатов антител с наночастицами коллоидного золота и их аффинностью // Сборник тезисов Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю. А. Овчинникова. Москва – Пущино, 28 сентября – 1 октября 2009 г. С. 210–211.

6. Сафенкова И.В., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Изучение взаимодействия антител с вирусом шарки сливы методом атомно-силовой микроскопии // Сборник тезисов Четвертой международной конференции "Современные достижения бионаноскопии". Москва, 15–18 июня 2010 г. С. 64–65.



 


Похожие работы:

«Качалов Иван Юрьевич ЛАНДШАФТНО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФИТОРАЗНООБРАЗИЯ ЛУГОВ В БАССЕЙНЕ НИЖНЕГО ТЕЧЕНИЯ Р. ВЯТКА Специальность 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2006 Работа выполнена на кафедре общей экологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет имени В. И. Ульянова-Ленина Научный руководитель : доктор...»

«Верещагин Владимир Александрович Молекулярное типирование клинических штаммов Neisseria gonorrhoeae 03.00.04 – Биохимия 03.00.03-Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2006 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Научноисследовательском институте физико-химической медицины Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ Научные руководители: доктор биологических...»

«ЕФРЕМЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 03.00.02 – биофизика 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный консультант : Варфоломеев Сергей Дмитриевич, доктор...»

«Тишин Денис Владимирович ВЛИЯНИЕ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА РАДИАЛЬНЫЙ ПРИРОСТ ОСНОВНЫХ ВИДОВ ДЕРЕВЬЕВ СРЕДНЕГО ПОВОЛЖЬЯ Специальность 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань - 2006 2 Работа выполнена в лаборатории биомониторинга Института экологии природных систем АН РТ, г. Казань Научный руководитель : кандидат биологических наук Аськеев Олег Васильевич Официальные оппоненты : доктор биологических...»

«Кекишева Юлия Евгеньевна Разнообразие сообществ еловых лесов западной части подзоны средней тайги Архангельской области 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Поморском государственном университете им. М. В. Ломоносова Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор Наквасина...»

«ФОМИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ВЗАИМОСВЯЗЬ СПЕКТРОВ КОЛЕБАНИЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И КРОВОТОКА ПАЛЬЦЕВ РУК 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Саратов 2013 Работа выполнена на кафедре медицинской физики ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : Заслуженный деятель науки РФ, доктор физико-математических наук, профессор Усанов Дмитрий Александрович Официальные...»

«ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Пономарева Анастасия Алексеевна ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИЙ СТАТУС ГЕНОВ ОПУХОЛЕВОЙ СУПРЕССИИ И КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЦИРКУЛИРУЮЩИХ ДНК В КРОВИ ПРИ РАКЕ ЛЕГКОГО 03.02.07 – генетика 14.01.12 – онкология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Научно-исследовательском институте онкологии Сибирского отделения РАМН, г. Томск и Федеральном государственном бюджетном...»

«Заводовский Петр Геннадьевич АФИЛЛОФОРОИДНЫЕ ГРИБЫ В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ВОДЛОЗЕРЬЯ 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университета Научный руководитель : член-корр. РАН, доктор биологических наук,...»

«КАНЦЕРОВА Надежда Павловна Са2+-ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ НЕКОТОРЫХ ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И РЫБ Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН Научный руководитель : член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор НЕМОВА Нина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«Нефедова Наталия Сергеевна МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В ИССЛЕДОВАНИИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск 2013 2 Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Министерства...»

«БОРОДИН Всеволод Игоревич ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ РОДА ВЁШЕНКА (PLEUROTUS (FR.) P. KUMM.) ГОРНО-ЛЕСНЫХ ФИТОЦЕНОЗОВ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.02.08 Экология (Биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Краснодар – 2013 Работа выполнена на кафедре биологии и экологии растений ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Криворотов Сергей...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«Зангелиди Вероника Владимировна ВЛИЯНИЕ ТЕХНОГЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ НА СОСТОЯНИЕ ПОЧВ Г. ВЛАДИКАВКАЗА 03.00.27 – Почвоведение Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2009 Работа выполнена на кафедре геоэкологии и землеустройства ФГОУ ВПО Северо-Осетинский государственный университет им. К. Л. Хетагурова Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор Бясов Казбек Харитонович Официальные оппоненты : доктор...»

«ТУЖИКОВ АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА ФИТАСПАЗЫ NICOTIANA TABACUM 03.01.03 – Молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в отделе химии и биохимии нуклеопротеидов Научно-исследовательского Института физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. доктор химических наук, профессор Научные руководители:...»

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«ВЕРХУША Владислав Витальевич ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ МАРКЕРЫ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ И КЛЕТОЧНОЙ БИОЛОГИИ: ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЕ ТАЙМЕРЫ, ПОСТОЯННО ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИЕ И ФОТОАКТИВИРУЕМЫЕ БЕЛКИ 03.01.03 - молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии РАН и в Медицинском колледже им. А. Эйнштейна в Нью-Йорке Научный консультант : доктор...»

«Розломий Наталья Геннадьевна Зелёная зона г. Уссурийска Приморского края (состояние естественных и искусственных насаждений, оптимизация рекреационного лесопользования) 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Владивосток 2010 2 Работа выполнена в Институте лесного и лесопаркового хозяйства Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Приморская...»

«Лобуничева Екатерина Валентиновна ЗООПЛАНКТОН МАЛЫХ ВОДОЕМОВ РАЗНЫХ ЛАНДШАФТОВ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.00.16 – экология 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук БОРОК – 2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет и Вологодской лаборатории ФГНУ ГосНИОРХ Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Болотова Наталья Львовна кандидат биологических наук, доцент...»

«Димитриев Юрий Олегович СОВРЕМЕННОЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ФЛОРЫ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА УЛЬЯНОВСКА) 03.02.01 – Ботаника 03.02.08 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2011 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Масленников Андрей...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.