WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Космачевская Ольга Владимировна

Влияние физиологических лигандов

на функционирование легоглобина

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук А.Ф. Топунов

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.С. Капрельянц, Доктор биологических наук В.П. Реутов,

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, г. Саратов

Защита диссертации состоится 27 мая 2008 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета (Д 002.247.01) при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1).

Автореферат разослан 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

За последние 20 лет в области изучения гемоглобинов в связи с открытием новых представителей этого суперсемейства белков произошел переворот. Изучение новых гемоглобинов привело к выяснению важности таких функций этих белков, как детоксикация и детекция NO, которые, как полагают многие ученые, являются первичными функциями гемоглобинов. В свете этих данных возникла необходимость изучения альтернативных функций и легоглобина – растительного гемоглобина бобовых, функционирование которого, по-видимому, не ограничивается только переносом кислорода к микросимбионту симбиотической азотфиксирующей системы. Также очень важным является изучение физиологических внешних лигандов гемоглобина, модулирующих его активность по отношению к активным формам кислорода и азота.





Цель и задачи работы. Целью работы было исследование влияния физиологических лигандов на функционирование легоглобина, в том числе и при посттрансляционной модификации в условиях in vivo и in vitro.

В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1) Изучить влияние редокс-медиаторов на рост клеток Escherichia coli, содержащих ген легоглобина, и синтез Lba клетками E. coli;

2) Определить характер соединений, модифицирующих легоглобин;

3) Изучить влияние модификации легоглобина на его функционирование, в том числе в условиях окислительного и нитрозативного стресса;

4) Изучить влияние динитрозильных комплексов железа, связанных с гемоглобином, на степень окислительной модификации гемоглобина.

Научная новизна. Показано, что легоглобин в системе in vivo может образовывать нитрозильные комплексы с гемовым и негемовым железом. Впервые показано, что динитрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, защищают его от окислительной деструкции. Также впервые установлено, что легоглобин, выделенный из клубеньков, содержит долю гликозилированного Lb, устойчивого к действию гидропероксидов. Продукты гликоокисления, связанные с белками, могут функционировать как кофакторы в окислительно-востановительных реакциях, причем реакция взаимодействия модифицированного легоглобина с H2O2 при определенных концентрациях субстрата протекает в автоколебательном режиме. Показано, что ранее обнаруженные в клубеньках бобовых низкомолекулярные восстановители (B и R), скорее всего, представляют собой продукты гликозилирования аминокислот и пептидов.

Практическая ценность работы. Полученные в работе данные могут помочь выяснению механизмов ответа азотфиксирующей системы на окислительный, нитрозативный и карбонильный стресс, что важно для селекции бобовых растений, устойчивым к внешним воздействиям, а также при их выращивании в неблагоприятных условиях. Гликозилированный легоглобин может быть использован как маркер физиологического состояния корневых клубеньков. Разработанный метод определения концентрации гемоглобинподобных белков может быть применен для изучения гемоглобинов разного происхождения, в том числе в гетерогенных смесях.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 193 страницах машинописного текста, содержит 50 рисунков и 9 таблиц. Список цитируемой литературы включает 345 наименований, из них 290 работ зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:

Всероссийской конференции «Физиология растений и экология на рубеже веков».

(Ярославль, 2003), Межвузовской научной конференции «Биология растений в новом тысячелетии»

(Калининград, 2007), XIV и XV международных конференциях «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», сателлитный симпозиум «Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии» (Гурзуф, Украина, 2006, 2007).





Доклад на XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» был отмечен как лучший доклад молодого ученого.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (4 статьи, 5 тезисов).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Растительный и бактериальный материал, использованный в работе. Были использованы растения гороха посевного (Pisum sativum L.) сорта Sparkle и бобов (Faba bona Medik) сорта «Русские черные», выращенные в полевых условиях Московской области.

Растения были инокулированы клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv.

Viciae, штамм CIAM 1026 из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург). Клубеньки собирали на стадии бутонизации начала цветения.

В работе были использованы клетки Escherichia coli штамма TB-1, модифицированного плазмидой pEMBL18+::SyLba со встроенным геном Lba сои, полученного сотрудниками Автономного университета штата Морелос (Мексика) и Университета штата Небраска (США).

Выращивание и обработка клеток редокс-медиаторами. Маточную культуру (15 ч роста) использовали для заcева серии колб объемом 350 мл, содержащих 60 мл жидкой среды LB с ампициллином (50 мкг/мл – в случае модифицированного штамма) до А600 = 0, 0,03. Режим аэрации меняли путем варьирования объема питательной среды в колбах.

Выращивание клеток осуществляли при 37 оС на термошейкере фирмы «Биоком» (Россия) с частотой орбитального движения 200 об/мин. Гидропероксид трет-бутила (t-BOOH), бензилвиологен (Bv) и S-нитрозоглютатион (GSNO) в различных концентрациях вносили в среду через 3 ч после засева (А600 = 0,120,15). Концентрацию клеток в культуре измеряли через каждые 2 ч по величине оптической плотности при 600 нм в 0,1 см кювете.

Получение различных форм гемопротеидов. Окисленные гемопротеиды получали их окислением феррицианидом калия. Для получения восстановленных гемопротеидов белок восстанавливали дитионитом натрия. Нитрозилированный Lb получали обработкой белка GSNO. Образование соответствующих форм гемоглобинов контролировали спектрофотометрически, используя следующие коэффициенты миллимолярной экстинкции (мМ-1·см-1): оксиLb 411=125, 541= 15,0, 575=14,8 (Herold, 2005), дезоксиLb 427=111, 554,5=13,3, метLb 403=157, 626=4,92 (Jones et al., 1998), нитрозилLb 418=130, 545=12,6, 575=13,0 (Ernesto, Di Iorio, 1981).

Определение концентрации гемопротеидов. Для образца гемопротеида в щелочном растворе пиридина определяли разницу: D = (D556red – D 556oxi ) – (D 539red – D 539oxi) (Riggs, 1981). Концентрацию гемовых белков рассчитывали, используя значение коэффициента миллимолярной экстинкции E = 4,3 ммоль-1см-1, определенное в нашей работе для данного D. Концентрацию Lb в смесях, содержащих примеси, определяли по разработанному нами методу (Космачевская, Топунов, 2007).

Определение общего белка. Количество общего белка определяли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976).

Электрофорез белков в ПААГ. Денатурирующий электрофорез Hb проводили в блоках 15% ПААГ размером 150*150*1 мл по методу Лэммли (Laemmli, 1970) с модификациями, используя прибор для вертикального электорофореза серии VE («Хеликон», Россия). Реакционная смесь содержала 25 мкл Hb, Hb-ДНКЖ или Hb с ДНКЖ после распада в 0,2 М K-Na фосфатном буфере (рН 7,4) и 5 мМ DTPA. H2O2 добавляли к смеси до концентраций 400, 800 и 1600 мкМ. Концентрация Hb во всех случаях была 560 мкМ (HbДНКЖ —780 мкМ). Конечный объем смеси составлял 45 мкл. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. ДНКЖ после распада были получены при инкубации в течении 5 ч при комнатной температуре.

Электрофорез белков легоглобинсодержащей фракции клеточного экстракта E. coli в неденатурирующих условиях проводили в 15% ПААГ без SDS. Буфер для образцов был приготовлен на основе 125 мМ Tris -HCl буфера (рН 6,8) с 0,1 М феррицианидом калия и 15% глицерином. Белок на гель наносили в количестве, содержащем 100 мкг белка на дорожку.

Выделение и очистка лигандов Y’, Y, Z. Лиганды (Y’, Y, Z) отделяли от легоглобина, используя модифицированный метод (Fluckiger et al., 1997), суть которого заключается в мягком кислотном гидролизе кетоаминной связи в гликозилированном Lb.

Получение гликозилированных гемопротеидов. К растворам гемопротеидов в концентрации 0,3 мМ в 0,1 М К-фосфатном буфере (рН 7, 4), содержавшем 0,02% азида натрия, предварительно деаэрированных продувкой аргоном, добавляли метилглиоксаль до концентрации 5,5 мМ. Растворы инкубировали в темноте при 30 оС.

Определение пероксидазной активности. При измерении пероксидазной активности в качестве субстрата использовали пероксид водорода, уменьшение концентрации которого регистрировали спектрофотометрически при 240 нм (240 = 43,6 M-1см-1) (Arnao et al., 1990). Для определения кинетических параметров использовали очищенные препараты легоглобина в 0,02 М К-фосфатном буфере (рН 7,2), измерения проводили не менее, чем в трех повторностях, при 20 оС.

Регистрация ДНКЖ в клетках и модельных системах. После инкубации с GSNO (6,5 мМ) и t-BOOH клетки концентрировали в 75 раз, помещали в пластиковые трубки и быстро замораживали при температуре жидкого азота (-170 °С). Измерения проводили также при температуре -170°С. Количество ДНКЖ оценивали по интенсивности характерного сигнала ЭПР парамагнитной формы комплекса (g = 2,034). ЭПР спектры снимали на спектрометре X-диапазона («Varian», США) при следующих параметрах измерения: частота модуляции 100 кГц, мощность микроволнового излучения 10 мВ, частота микроволнового излучения 9,15 ГГц и амплитуда модуляции 0,2 или 0,1 мТл для спиновых аддуктов ДНКЖ или DEPMPO соответственно.

Регистрация спиновых аддуктов DEPMPO со свободными радикалами.

Исследование генерации свободных радикалов при взаимодействии гемоглобина с гидропероксидом трет-бутила проводили с использованием спиновой ловушки DEPMPO в среде, содержавшей: 150 мМ K-Na фосфатный буфер (pH 7,4); 40 мM DEPMPO; 1,6 мМ ДТПА; 235 мкM гемоглобина и гидропероксид трет-бутила в концентрациях 0,4 и 0,8 мМ.

В экспериментах с Hb-ДНКЖ их концентрация составляла 340 мкM.

Стандартный ЭПР спектр аддукта DEPMPO с тиильным радикалом был зарегистрирован в смеси, содержавшей 0,5 мM пероксида водорода, 0,8 мМ восстановленного глютатиона и пероксидазу хрена (0,2 мг/мл). В аналогичной системе, содержавшей вместо глютатиона 2 мМ тирозина, был получен аддукт DEPMPO с тирозиновым радикалом. Спектры аддуктов DEPMPO с алкокси- и алкилпероксильными радикалами были зарегистрированы при взаимодействии 1,4 мM гидропероксида третбутила с 0,45 мM гемином. Во всех экспериментах реакционная среда содержала 0,15 M KNa-фосфатный буфер (pH 7,4), 40 мM DEPMPO, 1,6 мM ДТПА. Спектры ЭПР записывались через 3 мин после смешивания всех компонентов реакционной среды.

Регистрация спектров поглощения. Спектры поглощения растворов белков, лигандов и целых клеток записывали на спектрофотометре “Beckman Coulter DU 650” (США) в 1 см кювете. Запись спектров осуществляли при комнатной температуре со скоростью 600 нм/мин.

Спектрофлуориметрия. Регистрацию спектров флуоресценции проводили при 20 оС в 0,02 М К-фосфатном буфере, (рН 7,2) на спектрофлуориметре “Shimadzu RF-5301 PC” (Япония). Длина волны возбуждения составляла 320 нм.

ИК-спектроскопия. ИК-спектры образцов снимали на Фурье-спектрометре “AFSV/S” фирмы “Brucker” (Германия). Исследуемый материал прессовали в виде таблеток с KBr. Спектры снимали в области 400 – 4000 см-1. Разрешающая способность составляла 1 см-1.

КД-спектроскопия. Спектры кругового дихроизма соевого Lba снимали на спектрометре “Chirascan” фирмы “Applied Photophysics” (США) в 0,2 см кварцевой кювете при температуре 5 °С, со скоростью сканирования 0,6 нм/с.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Функционирование легоглобина в системе E. coli В качестве модели для изучения функционирования легоглобина в условиях окислительного стресса использовали клетки E. coli с встроенным геном легоглобина сои.

Для создания в клетках условий окислительного и нитрозативного стрессов использовали следующие вещества: гидропероксид трет-бутила, бензилвиологен и S-нитрозоглутатион.

Исследования были проведены на трех типах культур клеток: не синтезирующие легоглобин (С-Lb) 0,08 мкг гема/мг белка, синтезирующие Lb в малых количествах (С±Lb) 0,15 мкг гема/мг белка, и активно синтезирующие Lb (С+Lb) 0,45 мкг гема/мг бела.

В наших экспериментах рост культур С-Lb, С±Lb и С+Lb в середине логарифмической фазы роста (7 ч) подавлялся гидропероксидом трет-бутила в равной степени (~ 45%) (рис.

1). Культуры С+Lb и С±Lb обнаруживали большую чувствительность к t-BOOH уровень роста С+Lb и С±Lb к 24 ч по сравнению с контролем составлял 88% и 60% соответственно. В случае С-Lb рост достигал уровня контроля в стационарной фазе. Этот факт согласуется с результатами, ранее полученными в нашей лаборатории (Петрова, 2002) в аналогичных опытах с использованием штамма E. coli BL21(DE3)pLysS с встроенным в плазмиду pET-3a геном LbII люпина.

S-нитрозоглютатион в концентрациях до 200 мкМ существенно не ингибировал рост исследуемых бактериальных культур. Более того, рост всех типов клеток E. coli в условиях индуцированного t-BOOH окислительного стресса стимулировался GSNO (рис. 1). Защитный эффект GSNO являлся дозозависимым. Следует отметить, что восстановление роста бактериальных культур наблюдалось даже при добавлении GSNO вместе с t-BOOH, при концентрациях последнего, вызывавших практически полное подавление роста исследуемых штаммов.

Роль оксида азота в биологических системах двойственна. С одной стороны, NO и другие активные метаболиты азота обладают цитотоксическим действием, а, с другой, NO способен непосредственно взаимодействовать с возникающими в ходе окислительного стресса феррилгемопротеидами и органическими радикалами (Bastian et al., 2002) в соответствии с реакциями:

гем-FeIV=O•+ NО• гем-FeIII-ONO гем-FeIII + NO2- (1) Протекторные свойства NO могут проявляться при восстановлении t-BOOH согласно реакции (Gorbunov et al., 1997):

Fe(II)-NO + t-BOOH +H2O Fe(III) + t-BOH + HNO2 + OH- (3) В то же время эффект совместного действия GSNO и бензилвиологена существенно отличался от такового при действии GSNO совместно с t-BOOH. В случае Bv мы наблюдали отсутствие защитного действия GSNO (рис. 1), хотя бензилвиологен также, как и гидропероксид трет-бутила, является индуктором окислительном стресса.

Гемоглобин является уникальным белком, поскольку способен связывать NO тремя различными способами (рис. 2). Оксид азота может взаимодействовать с гемовой группой и остатками цистеина с образованием нитрозилгемоглобина (HbFe(II)NO) и Sнитрозогемоглобина соответственно. Кроме того, с участием различных белковых групп, в первую очередь тиолсодержащих, могут формироваться динитрозильные комплексы железа (ДНКЖ). Впервые образование ДНКЖ в биосистемах было показано в клетках дрожжей Ваниным (Ванин, Налбандян, 1965).

рост, % от контроля рост, % от контроля Рис. 1. Влияние редокс-медиаторов на рост E. coli. Bv0,125 мМ;

контрольных клетках, так и в клетках, синтезирующих легоглобин, инкубированных с нитрозоглютатионом (рис. 3). В случае легоглобинсодержащих клеток, инкубированных с GSNO и t-BOOH, мы наблюдали спектр, являющийся суперпозицией двух спектров ДНКЖ и нитрозилLb, который отсутствовал в контрольных клетках (рис. 3).

S RS NO N

низкомолекулярных ДНКЖ Рис. 2. Взаимодействие NO с гемоглобинами.

Это показывает, что в С+Lb имеются разные пути утилизации оксида азота. Из рис. также видно, что гидропероксид трет-бутила не приводил к существенным изменениям в спектрах ЭПР бактериальных культур, но снижал уровень образующихся в них ДНКЖ.

Интенсивность сигнала ДНКЖ при инкубации контрольных клеток с t-BOOH уменьшалась ~ на 40%. В аналогичных условиях в культуре С+Lb, сигнал ЭПР ДНКЖ снижался лишь ~ на 10%. Этот эффект может быть обусловлен, с одной стороны, защищающей ДНКЖ от окислительной деструкции.

Более низкий уровень ДНКЖ в культуре С+Lb, по сравнению с С-Lb, при инкубации только с GSNO (рис. 3) можно объяснить процессом окисления NO оксигенированным легоглобином, что приводит к снижению концентрации оксида азота в системе согласно реакции:

С помощью метода ЭПР мы показали возможность образования нитрозиллегоглобина нитрозилированного по железу гемовой группы гемоглобина и полученного в аналогичных условиях нитрозилированного легоглобина. Как видно, значения g-факторов для обоих спектров совпадают.

На основании полученных данных можно утверждать, что связывание легоглобином NO имеет протекторное значение в условиях окислительного стресса. С одной стороны, это приводит к выведению NO из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления. С другой стороны, NO, как гемовый лиганд легоглобина, ингибирует образование феррилформы при взаимодействии легоглобина с гидропероксидами.

сигнал ЭПР, отн. ед.

Рис. 3. Низкотемпературные спектры ЭПР клеток E. coli C-Lb А и C+Lb B.

1-не обработанные бактерии; 2- бактерии после инкубации с t-BOOH; 3- после инкубации с GSNO; 4- после инкубации с GSNO и t-BOOH.

Рис. 4. Спектры ЭПР нитрозилHb (А), ДНКЖ-PO4 (B, 1) и нитрозилLb (B, 2).

2. Модифицированные легоглобины 2.1 Образование модифицированных Lb in vivo Помимо способности взаимодействовать с классическими низкомолекулярными лигандами, многие гемоглобины способны формировать прочные комплексы и с довольно крупными молекулами, например, с ароматическими и гетероциклическими соединениями с атомом азота (нитрозобензолом (Murayama, 1960), изохинолином (Сафонова с соавт., 1991), никотиновой кислотой (Appleby et al., 1976; Lee et al., 1995) и др.) Используемая в наших исследованиях модель клетки E. coli со встроенным геном Lba сои, позволяет спектрофотометрически регистрировать состояние Lb в целых клетках.

При росте в условиях нормальной аэрации (коэффициент заполнения колбы = 0,10,3) клетки имели розовый цвет благодаря наличию в них LbO2. Оптический спектр целых клеток являлся характерным спектром восстановленного оксигенированного Lb (541 и 575 нм) (рис.

5 А). Это свидетельствует о том, что в клетках E. coli имеются вещества, возможно и белковой природы, способные восстанавливать Lb и, тем самым, поддерживать его в функциональном состоянии. Отметим, что ранее в нашей лаборатории в клетках E. coli был обнаружен фермент, способный восстанавливать гемоглобинподобные белки (Талызин с соавт., 1988).

При выращивании культуры в условиях с уменьшенной аэрацией, мы получали клетки, имеющие не розовую, а оранжевую окраску. Такое изменение окраски клеток отражало изменение состояния Lb. Спектры поглощения, снятые с этих клеток, имеют гемохромогенный характер, что свидетельствует о том, что Lb в этих условиях представляет собой гемохром (522 и 552 нм) (рис. 5 В).

Рис. 5. Спектры поглощения целых клеток E. coli, содержащих LbO2 (А) и Lb-Z относительно клеток С-Lb (В).

В зависимости от природы соединения легоглобин приобретал специфическую окраску, что отражалось и на цвете клеток: Lb-Y розово-оранжевый, Lb-Z яркооранжевый. Этим комплексам мы дали названия Lb-Y и Lb-Z, в соответствии с традицией:

название Lb-Х было ранее дано Эпплби комплексу легоглобина с никотиновой кислотой до определения структуры лиганда (Appleby et al., 1973).

Как показано на рисунке 6, спектры поглощения восстановленных комплексов Lb-Y и Lb-Z являются классическими спектрами гемохромов с характерными максимумами поглощения в полосах и. При этом спектр Lb-Y представляет собой двойной гемохромоген, с расщеплением в полосах (523, 532 нм) и (552, 560 нм).

Рис. 6. Спектры поглощения восстановленного легоглобина сои, выделенного из клеток E. coli, с лигандами Y (А) и Z (B).

Поэтому мы предполагаем, что лиганд Y структурно отличается от лиганда Z и размещение лиганда Y в гемовой полости происходит с пространственными затруднениями.

При выделении легоглобина из клубеньков гороха мы также получили Lb, частично связанный с лигандом, который мы обозначили как Y’. Спектры Lb(II) –Y’, Lb(II) –Y и Lb(II) -Z по некоторым параметрам были подобны спектрам цитохромов группы b.

Для выяснения природы лигандов, модифицирующих легоглобин in vivo, эти вещества были нами выделены и охарактеризованы. Из сравнения спектров поглощения нативного и модифицированного легоглобинов видно, что имеются существенные отличия в их спектрах в УФ-области (рис. 7 А). Величина отношения поглощения при 275 нм к поглощению в полосе Соре для LbО2 А275/А411= 0,51, что ~ в 20 раз меньше, чем для Lb-Z (А275/А412 =12±3) (рис. 8 А). Известно, что поглощение при 250-280 нм обусловлено апобелковым компонентом молекулы и осуществляется хромофорными группами остатков очищенных лигандов имеют максимум в диапазоне 205-210 нм, плечо при 240-290 нм и плато постепенного снижения оптической плотности до 390 нм (рис. 7 B). Увеличение поглощения в УФ области модифицированных легоглобинов обусловлено, вероятно, наличием большого числа ароматических соединений. При этом спектры флуоресценции (возб.= 320 нм) модифицированных Lb имели четко выраженный максимум в видимой области.

Рис. 7. А. Оптические спектры Lbа сои: LbO2 и Lb-Z. B. Оптические спектры лигандов, отделенных от Lbа сои (Y, Z) и Lb гороха (Y’).

На рис. 8 приведены инфракрасные спектры исследованных веществ. Как видно из рисунка, спектры трех лигандов довольно сильно отличаются, что является прямым указанием на то, что это структурно разные вещества. Анализ ИК-спектров лигандов Y и Y’ показал, что широкая полоса с плечами в области 3800-3200 см-1 обусловлена поглощением ОН-групп, а сложные полосы в интервале 1200-1030 см-1, относятся к валентным колебаниям эфирной и гидроксильной групп. Полосы в области 1720 (C=O) отсутствуют. Такое соотношение полос присуще такому классу соединений, как углеводы (Наканиси, 1965). Что касается спектра лиганда Z, то две полосы в области 1300-1100 см-1 и отсутствие полос в области 2950-2850 см-1 указывают на наличие валентных колебаний C-С. Отсутствие полос в интервале 3800-3200 см-1 в спектре лиганда Z, в отличие от спектров лигандов Y и Y’, также свидетельствует о том, что это структурно разные вещества.

Поглощение Рис. 8. ИК-спектры лигандов, выделенных из Lba сои (Y и Z) и Lb гороха (Y’) модификацию белков в реакции Майларда in vivo (Thorpe, Baynes, 2003). Классическая реакция Майларда это взаимодействие альдегидной группы углевода с аминогруппой аминокислоты. В результате этой реакции образуются короткие фрагменты сахара, а также химически реактивные интермедиаты: глиоксаль и метилглиоксаль.

Накопление -кетоальдегидов (глиоксаля, метилглиоксаля и 3-дезоксиглюкозонов), образующихся в результате автоокисления глюкозы, приводит к так называемому «карбонильному стрессу». Глиоксаль и метилглиоксаль могут взаимодействовать с остатками лизина и аргинина белка с образованием широкого спектра связанных с белком продуктов гликоокисления (Thorpe, Baynes, 2003). Конечные продукты гликоокисления могут иметь различную химическую структуру. Приведем формулы некоторых таких веществ:

Известно, что в наибольшей степени в молекуле белка модификации подвержены остатки лизина, аргинина и цистеина. При этом в молекулах различных легоглобинов содержится достаточно большое количество лизинов. Также известно, что модификация остатков лизина в белках ускоряется, если они примыкают к основным аминокислотным остаткам (Thorpe, Baynes, 2003). В молекуле Lba сои содержится 7 таких пар: 4 Lys-Glu, Lys-Asp и одна Lys-Lys (Jones et al., 1998).

Следует отметить еще одну особенность строения легоглобинов наличие лизина в гемовом кармане. Этот лизин расположен в паре с глутаминовой кислотой и, может быть подвержен модификации углеводами с образованием гетероциклических соединений, которые образуют шестую координационную связь с железом гема, что видно по гемохромному типу спектра модифицированного Lb.

2.3. Взаимодействие метилглиоксаля с гемопротеидами Предположение, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда, мы проверяли, используя модельную систему, содержащую гемопротеид и метилглиоксаль (MG). Степень модификации белков определяли по изменению интенсивности флуоресценции после отделения несвязавшихся веществ диализом.

Использование метилглиоксаля в качестве модифицирующего агента обусловлено тем, что это вещество является наиболее активным карбонильным соединением, в основном взаимодействующим с остатками лизина. В последнее время MG рассматривают как универсальный медиатор образования конечных продуктов гликоокисления.

Из литературы известно, что при окислительном гликозилировании белков происходит образование конечных флуоресцирующих продуктов, имеющих желтую и коричневую окраску. Желтые пигменты обладают интенсивной флуоресценцией в области 398 нм при длине волны возбуждения 320 нм и охарактеризованы как имидазолоны (Lo et al., 1994; Yim et al., 1995).

Уже в первые часы инкубации гемопротеидов с MG мы наблюдали появление желтых флуоресцирующих продуктов, причем их концентрация возрастала со временем (рис. 9).

Интенсивность флуоресценции Рис. 9. Изменение интенсивности флуоресценции гемопротеидов, инкубированных с метилглиоксалем (возб=320 нм, исп=390 нм).

Как видно из рисунка 9, легоглобин в большей степени подвержен модификации метилглиоксалем, чем другие исследованные гемопротеиды. Нами было установлено, что по гемоглобинами и альбуминами. В данной реакции в легоглобинах могут участвовать как поверхностные группы, так и гем.

легоглобина бобов (120 ч инкубации) (рис. 10) по структуре были идентичны аналогичному спектру легоглобина, выделенного из клубеньков бобов, после обработки t-BOOH (рис. 11 B, врезка). Поэтому мы пришли к выводу, что легоглобиновая фракция клубеньков бобов содержала определенную долю гликозилированного белка, который устойчив к действию гидропероксидов.

обработанного метилглиоксалем (20 и соотношении Lb : MG = 1:200).

В наших экспериментах мы не наблюдали изменений в спектрах флуоресценции бобового Lba, предварительно модифицированного метилглиоксалем (120 ч), при добавлении t-BOOH. В аналогичном опыте с модифицированным соевым легоглобином (Lb-Y и Lb-Z) происходило уменьшение одного из максимумов флуоресценции (исп= нм) (рис. 11 А), однако окончательный спектр был подобен спектру модифицированного бобового Lbа (рис. 10 и рис. 11 В, врезка). Вероятно, эти изменения были вызваны разрушением под действием t-BOOH продуктов гликоокисления, отличных от конечных продуктов превращения метилглиоксаля.

исчезновению флуоресценции при 395 нм бобового Lba в отличие от модифицированного Lb-Z. Этот факт показывает, что продукты гликозилирования легоглобина, отвечающие за флуоресценцию в области 395 нм, могут защищать белок от окислительной деструкции, вызванной t-BOOH, подвергаясь при этом структурным изменениям.

Интенсивность флуоресценции, % от исходного уровня 2.4. Восстановительные свойства модифицированного Lbа сои При исследовании гликозилированных белков неясными остаются вопросы о физиологическом и патологическом значении этой посттрансляционной модификации.

При выращивании клеток, содержащих Lb-Z, в присутствии Bv, рост клеток не ингибировался в течение 4-х часов, в отличие от клеток, содержащих oxyLb (рис. 12). Также было показано, что при увеличении концентрации Bv происходила деградация Lb (рис. А). Неаэрируемые клетки, предварительно культивируемые с различными дозами Bv, обладали различной скоростью восстановления этого вещества (рис. 13 В), которая коррелировала с количеством оставшегося модифицированного легоглобина в клетках (рис.

13 А). Это указывает на возможность того, что модифицированный Lb способен выступать в качестве донора электронов на компоненты дыхательной цепи. Кстати, имеются работы, в которых показано, что в анаэробных условиях гликозилированные аминокислоты способны восстанавливать цитохром с (Степуро с соавт., 1997; 1999).

А (600 нм) Рис. 12. Кривые роста клеток E. coli, содержащих Lb-Z (А) и LbО2 (В) в присутствии различных концентраций бензилвиологена: без Bv (черная линия), 125 мкМ (черная пунктирная линия), 250 мкМ (серая линия), 375 мкМ (серая пунктирная линия).

Бензилвиологен вносили в среду после 2 ч инкубации клеток в среде LB.

Известно, что такая посттрансляционная модификация, как гликозилирование, изменяет структуру, функции и физико-химические свойства белков. Принимая во внимание обнаруженное в описанных выше опытах протекторное действие модифицированного Lbа в условиях окислительного стресса, мы решили проверить наличие пероксидазной активности у этих модифицированных легоглобинов. Было показано, что модифицированные легоглобины достаточно эффективно катализируют восстановление пероксида водорода, в том числе и без внешних доноров электронов, то есть проявляют каталазную активность.

Рис. 13. А. Количество Lbа в клетках E. coli Lb-Z и LbO2, выращенных в присутствии различных концентраций Bv. В. Динамика восстановления Bv клетками E. coli с Lb-Z. Цвет столбцов и кружков соответствует определенной концентрации Bv: 125 мкМ (белый), мкМ (серый) и 375 мкМ (черный).

Кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата в случае Lb-Y и Lb-Z имела явно выраженный индукционный период, что, по-видимому, связано с установлением равновесия между реакциями восстановления перекиси и восстановления автоколебательном режиме.

Табл.1. Скорости каталазной реакции, катализируемой модифицированными Lb Мы полагаем, что значительную роль в активации пероксидазной активности легоглобина при его модификации продуктами превращения углеводов играют изменения окружения гема и конформационные перестройки. Как видно из рис. 14, спектр КД гликозилированного Lba имел интенсивную положительную полосу в области Соре, в отличие от нативного Lba. Такое изменение знака в полосе Соре, как показано для гемоглобинов (Nicola et al., 1975), зависит от вклада ароматических групп, окружающих гем, которые в случае Lb-Z появились в результате модификации гемового кармана продуктами гликоокисления.

[] (град·см2·дмоль-1) - - - - 350 400 450 500 550 различные гемсодержащие белки (Lb, Mb и Hb) в отсутствие искусственных переносчиков и доноров электронов. Характеристики спектров поглощения и флуоресценции соединений B и R были близки к спектрам веществ, имеющих в своем составе имидазольный и/или индольный циклы. Изучение электрохимических свойств соединения R показало, что восстановление Lb компонентом R осуществляется по одноэлектронному механизму (Шлеев, 2000). В работе (Becana, Klucas, 1990) было установлено, что соединение В восстанавливает гемопротеиды через О2•-. Однако несмотря на проведенные исследования, природа низкомолекулярных восстановителей до настоящего времени оставалась неизвестной.

На основании обобщения экспериментальных данных в работе (Шумаев с соавт., 2008) был предложен механизм образования О2•- в результате восстановления О свободнорадикальными интермедиатами метилглиоксаля, образующимися в ходе реакции Lлизина с метилглиоксалем. Принимая во внимание этот факт, а также характеристики низкомолекулярных восстановителей и лигандов Y, Y’ и Z, мы пришли к заключению, что этими восстановителями неизвестной природы являются продукты гликозилирования аминокислот и небольших пептидов. Восстановительные свойства соединений Y, Y’, Z, B и R связаны с наличием в их составе как индольного цикла, так, возможно, и с их способностью генерировать супероксид, аналогично лизину, модифицированному метилглиоксалем.

3. Антиоксидантное действие ДНКЖ, ассоциированных с Hb Гемоглобины в биологических системах в условиях окислительного и нитрозативного стрессов играют противоречивую роль. С одной стороны, гемоглобины обладают рядом антиоксидантных функций. Гемоглобины могут восстанавливать пероксиды, восстанавливать и окислять NO, а также катализируют реакцию изомеризации пероксинитрита в нитрат. С другой стороны, гемоглобины являются основной мишенью действия органических перекисей (Gorbunov et al., 1995; Reeder and Wilson, 2005), что приводит к образованию таких активных интермедиатов, как оксоферрилгемоглобин (HbFeIV=O), алкокси- (RO•) и алкилпероксильные (ROO•) радикалы в следующих реакциях (Zee, 1997; Kagan et al., 2001):

Таким образом, гемоглобины, в отличие от каталаз и гемсодержащих пероксидаз, стимулируют процессы перекисного окисления.

В настоящее время установлено, что важную роль в ходе окислительного стресса играют ДНКЖ низкомолекулярные и связанные с белками (Шумаев с соавт, 2006). В частности, ДНКЖ могут ассоциироваться на SH-группах цистеинов -субъединицы Hb (Vanin et al., 1998; Gow et al., 1999). В то же время эти группы одними из первых подвергаются окислительной модификации в условиях генерации активных форм кислорода и азота.

Спектры ЭПР спиновых аддуктов DEPMPO показывают, что при взаимодействии гемоглобина с гидропероксидом трет-бутила образуются алкилпероксильные радикалы и свободные радикалы аминокислотных остатков белка, в том числе тирозиновые и тиильные радикалы (Рис. 15, А и B).

Однако при взаимодействии гидропероксида трет-бутила с Hb-ДНКЖ выход свободнорадикальных интермедиатов снижается (Рис. 15 А, спектры 3-5). Причем максимальное уменьшение уровня тиильного радикала наблюдается при эквимолярных концентрациях гидропероксида трет-бутила и ДНКЖ-Hb (Рис. 15 А, спектры 4 и 5). Эти данные свидетельствует о том, что ДНКЖ перехватывают свободнорадикльные интермедиаты, реагирующие с SH-группой цистеина.

На рисунке 16 методом электрофореза показано образование димеров Hb, образующихся при обработке его различными концентрациями пероксида водорода.

Пероксид водорода в концентрации 400 и 800 мкМ вызывает образование димеров субьединиц гемоглобина (Рис. 16 A, линия 2 и 3). Известно, что формирование таких димеров может быть следствием образования дисульфидной связи между остатками цистеинов -93 и димеризации тирозиновых свободных радикалов (Romero et al., 2003). Под действием пероксида водорода в концентрации 1600 мкM наблюдается фрагментации белковой цепи (Рис. 16 A, линия 4). В то же время видно, что ДНКЖ эффективно ингибируют окислительную модификацию связанного с ними гемоглобина (Рис. 16 B).

Необходимо отметить, что ДНКЖ после распада практически не ингибируют окислительную модификацию metHb (Рис. 16 C).

Сигнал ЭПР, отн.ед.

Рис. 15. Cпектры ЭПР спиновых аддуктов DEPMPO.

А. Cпиновый аддукт DEPMPO со свободными радикалами, образующийся после добавления к 235 мкМ metHb 0,8 мМ (2) или 0,4 мМ (4) t-BOOH и добавлением к 340 мкМ Hb-ДНКЖ 0, мМ (3) или 0,4 мМ (5) t-BOOH к реакционной смеси.

Реакционная смесь содержала 0,15 М фосфатный буфер (рН 7,4), 40 мМ DEPMPO и 1,6 мМ ДТПА. Спектры (А1) показывают сумму ЭПР спектра спинового аддукта, рассчитанного по следующей формуле: (А1)=0,75(B1)+(B2)+0,2(B3).

В. Cпиновые аддукты с тиильными (1) и тирозиновыми (3) радикалами и свободнорадикальные продукты t-BOOH (2).

ВЫВОДЫ

1) Показано, что легоглобин способен связывать оксид азота двумя способами, исключая его из редокс-цикла реакций свободнорадикального окисления;

2) Легоглобин может функционировать и как про-, и как антиоксидант, причем проявление им этих свойств зависит от его концентрации в клетках;

3) Обнаружено образование модифицированного легоглобина в клубеньках гороха и клетках E. coli, экспрессирующих его;

4) Показано, что модификация легоглобина вызвана образованием ковалентно связанных с белком продуктов гликоокисления, образующихся в результате реакции Майларда;

5) Модифицированный легоглобин имеет гемохромный характер спектра и способен восстанавливать бензилвиологен in vivo, то есть функционирует как донор электронов;

6) Модифицированный легоглобин (комплексы Lb-Y и Lb-Z) является эффективным катализатором реакции разложения Н2О2 в отсутствие внешних восстановителей;

7) Показано, что динитрозильные комплексы железа, связанные с гемоглобином, действуют как сайт-специфические антиоксиданты, защищающие белок, с которым они связаны, от окислительной модификации.

ПУБЛИКАЦИИ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Космачевская О.В., Топунов А.Ф. Метод определения содержания гемоглобинподобных белков в гетерогенных смесях. // Прикл. биохимия и микробиология.

2007. Т. 43. № 3. С. 347-353.

2. Kosmachevskaya O.V., Shumaev K.B., Arredondo-Peter R., Topunov A.F. Influence of tert-butyl hydroperoxide and nitrosoglutathione on Esherichia coli cells expressing leghemoglobin.

// J. Stress Physiology & Biochemistry. 2007. V. 3. N 1. P. 18-24.

3. Shumaev K.B., Kosmachevskaya O.V., Timoshin A.A., Vanin A.F., Topunov A.F.

Dinitrosyl iron complexes bound with haemoglobin as markers of oxidative stress. // Methods in Enzymology. 2008. V. 436. Globins and Other Nitric Oxide-Reactive Proteins. P. 441-457.

4. Shumaev К.B., Gubkin А.А., Serezhenkov V.А., Lobysheva I.I., Kosmachevskaya O.V., Ruuge E.К., Lankin V.Z., Topunov А.F., Vanin А.F. Interaction of reactive oxygen and nitrogen species with albumin- and hemoglobin-bound dinitrosyl iron complexes // Nitric Oxide. 2008. V.

18. N 1. P. 37-46.

Тезисы докладов:

5. Космачевская О.В., Петрова Н.Э., Шумаев К.Б., Топунов А.Ф. Окислительный стресс в азотфиксирующих клубеньках бобовых растений. // Физиология растений и экология на рубеже веков. Материалы конференции. Ярославль: ЯГУ, 2003. С. 158-159.

6. Topunov A.F., Petrova N.E., Shumaev K.B., Zhabaeva M.U., Kosmachevskaya O.V.

Leghemoglobin functioning as part of symbiotic interactions in nitrogen-fixing legume nodules. // Molecular Plant-Microbe Interactions: New Bridges between Past and Future. Volume of Abstracts.

St-Petersburg, July 18-26 2003. P. 97.

7. Космачевская О.В., Шумаев К.Б., Топунов А.Ф. Действие активных форм кислорода и азота на клетки Escherichia coli c встроенным геном легоглобина. // Материалы XIV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф, Украина, 2006. С. 431-432.

8. Shumaev K.B., Kosmachevskaya O.V., Timoshin A.A., Vanin A.F., Arredondo-Peter R., Topunov A.F. Influence of NO metabolites on interaction of animal and plant hemoglobins with reactive oxygen species. // XIV International Conference on Dioxygen Binding and Sensing Proteins. Book of Abstracts. Stazione Zoologica Anton Dohrn, Naples. September 3-7, 2006. P.98.

9. Космачевская О.В., Шумаев К.Б., Ванин А.Ф., Топунов А.Ф. Влияние экспрессированного легоглобина на устойчивость бактериальных клеток к активным формам кислорода и азота. // Материалы XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Гурзуф, Украина, 2007. С.

425-426.



 
Похожие работы:

«Спангенберг Виктор Евгеньевич Динамика структурной организации хромосом в профазе I мейоза у мыши и человека 03.02.07 – генетика Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена в лаборатории цитогенетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики имени Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Коломиец...»

«СУСЛОВА Мария Юрьевна РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РАЗНООБРАЗИЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ 03.00.16 – экология 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2007 Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск Научный кандидат биологических наук руководитель: ст.н.с. Парфенова Валентина Владимировна Официальные Доктор биологических наук...»

«САДЕКОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА Генетические маркеры привычного невынашивания беременности I триместра 14.01.01 - Акушерство и гинекология 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Научные руководители: ООО Клиника на Петровке доктор медицинских...»

«Красникова Мария Сергеевна ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ TAS3, КОДИРУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ta-siРНК У НЕЦВЕТКОВЫХ НАЗЕМНЫХ РАСТЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ У НЕКОТОРЫХ ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ 03.01.03 - молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного...»

«Шиенок Александр Николаевич ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КОРМОВЫХ РЕСУРСОВ ОСТРОВНОЙ ПОПУЛЯЦИЕЙ ПЕСЦА (Vulpes lagopus semenovi Ognev, 1931) 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2014 Работа выполнена на кафедре зоологии позвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный руководитель : доктор биологических наук Крученкова Елена Павловна Официальные оппоненты :...»

«ГОГОЛЬ Эллина Владимировна СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ ХОЛИНЭСТЕРАЗНЫХ СЕНСОРОВ НА ОСНОВЕ УГЛЕРОДИСТЫХ МАТЕРИАЛОВ ДЛЯ ДЕТЕКТИРОВАНИЯ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПЕСТИЦИДОВ 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук К А З А Н Ь - 2000 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии экологического факультета Казанского государственного университета. Научный руководитель : доктор химических наук, профессор...»

«Смирнов Иван Алексеевич Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов Специальность 03.00.24 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный...»

«НАМЗАЛОВА БАИРМА ДАМДИН-ЦЫРЕНОВНА ПАПОРОТНИКИ БУРЯТИИ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2011 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Алтайский государственный университет, г. Барнаул Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Шмаков Александр Иванович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Ревякина Надежда Васильевна кандидат биологических наук Крещенок...»

«Горобцова Ольга Николаевна Экологическая оценка уровня загрязнения почв и растительности 3,4-бенз(а)пиреном в зоне влияния Новочеркасской ГРЭС 03.00. 27 – почвоведение 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2007 2 Работа выполнена на кафедре агроэкологии и физиологии растений Донского государственного аграрного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Назаренко Ольга...»

«ПЕТРОВА НАДЕЖДА ЭДУАРДОВНА ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЛЕГОГЛОБИНА В КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2002 Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им. А.Н.Баха РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук А.Ф.Топунов. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор А.С.Капрельянц...»

«Рыжакова Ольга Сергеевна ИНТЕРСТИЦИАЛЬНАЯ КОЛЛАГЕНАЗА (ММП-1) И ЕЁ ЭНДОГЕННЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРИ ТРАНСФОРМАЦИИ ФИБРОБЛАСТОВ ГЕНОМ Е7 ВИРУСА ПАПИЛЛОМЫ ЧЕЛОВЕКА 16 ТИПА (HPV16) 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича Российской академии медицинских наук Научный руководитель : доктор...»

«Кекишева Юлия Евгеньевна Разнообразие сообществ еловых лесов западной части подзоны средней тайги Архангельской области 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Поморском государственном университете им. М. В. Ломоносова Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор Наквасина...»

«КОРМИЛЬЦЕВА ИННА ПЕТРОВНА ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ПРИ ВНЕСЕНИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет. Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Куриненко Борис Михайлович Официальные оппоненты :...»

«САВИНОВ Иван Алексеевич Система и эволюция порядка Celastrales на основе данных сравнительной морфологии 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург - 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН и в ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор,...»

«Чирков Сергей Николаевич Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений 03.00.06 – Вирусология 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН. Научный консультант : доктор...»

«Александрова Елена Александровна Картирование регуляторных последовательностей в составе ретротранспозонов HERV-K (HML-2) и L1. Специальность – 03.01.03 – молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 Работа выполнена в группе геномного анализа сигнальных систем клетки Учреждения Российской...»

«Кляйн Ольга Ивановна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ С ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова...»

«Калмыкова Ольга Геннадьевна ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ БУРТИНСКОЙ СТЕПИ (ГОСЗАПОВЕДНИК ОРЕНБУРГСКИЙ) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2008 Работа выполнена в лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна Официальные...»

«МОРОЛДОЕВ ИГОРЬ ВИКТОРОВИЧ СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ ЖУКОВ-ЖУЖЕЛИЦ (COLEOPTERA, CARABIDAE) КРИОАРИДНОЙ ЛЕСОСТЕПИ ЮГА ВИТИМСКОГО ПЛОСКОГОРЬЯ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Амшеев Роман Маньярович, Научный руководитель : доктор биологических наук Хобракова Лариса Цыренжаповна, Научный консультант : кандидат биологических наук...»

«Соколова Ирина Владимировна ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА РЕКУЛЬТИВАЦИОННЫХ ПОЧВЕННЫХ КОНСТРУКЦИЙ С ДИФФЕРЕНЦИРОВАННЫМИ ПО ГРАНУЛОМЕТРИЧЕСКОМУ СОСТАВУ СЛОЯМИ 06.01.03 – агропочвоведение, агрофизика 03.00.27 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук г. Москва 2009 г. Работа выполнена на кафедре физики и мелиорации почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова. Научные руководители:...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.