WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ им. А.Н. БАХА

На правах рукописи

ЕГОРОВ Александр Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ЗАМЕЩЕННЫХ -МАННАНОВ

СЕМЯН БОБОВЫХ И СИНТЕЗ ИХ БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ СУЛЬФАТИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2004 2

Работа выполнена в лаборатории Инженерной энзимологии Института биохимии им. А.Н. Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор В.Д. Щербухин Официальные опоненты:

доктор биологических наук, профессор О.Л. Озерецковская доктор химических наук, профессор В.П. Варламов

Ведущая организация:

МГУ им. М.В. Ломоносова, химический факультет

Защита диссертации состоится «09» ноября 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «» 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Гетерополисахариды – замещенные -маннаны бобовых – относятся к группе запасных полисахаридов. Они локализованы в клеточных стенках эндосперма и являются углеводным энергетическим резервом семян. Замещенные маннаны способны удерживать значительное количество воды и, благодаря этому, служат регулятором водного баланса семени при прорастании.

У бобовых эта группа полисахаридов представлена исключительно галактоманнанами. Наличие близких им по структуре галактоглюкоманнанов, распространенных в семенах других семейств, например, ирисовых и лилейных, для бобовых оказалось уникальным, и к началу нашей работы такой полисахарид был изолирован из семян только одного вида. Помимо академического интереса эта группа полисахаридов имеет важное прикладное значение. По масштабу использования в различных отраслях промышленности галактоманнаны и их производные уступают только целлюлозе и крахмалу. Уникальные реологические свойства галактоманнанов в совокупности с отсутствием токсичности и наличием биологической активности позволяют применять их в пищевой, фармацевтической, медицинской промышленности, косметике и др. Следует отметить, что наряду с природными галактоманнанами используются и полусинтетические производные – например, этил-, карбоксиметил-, карбокси-, оксипропилгалактоманнаны (Cheng et al., 2002) и ряд других.

Особый интерес представляют сульфатированные галактоманнаны. К началу нашей работы исследования их не носили систематического характера. Известно, что три полученных деривата проявляли антикоагуляционную активность (Bode, Franz, 1989; Lima et al, 1996; Pires et al., 2001). Между тем, поиски и создание альтернативы гепарину признано в мировой науке важной областью исследования (Gunay, Linhardt, 1999; Yoshida, 2001). Причиной этого являются серьезные недостатки препаратов гепарина – естественного антикоагулянта прямого действия, используемого в клинике. Одним из путей создания т.н. «гепариноидов»

является сульфатирование полисахаридов растительного происхождения. Для построения обоснованных выводов относительно биологической (в том числе, антикоагуляционной) активности сульфатов галактоманнанов необходимо получение и исследование серии препаратов, различающихся своими характеристиками. Это необходимо для выявления корреляции структура – функция и направленного синтеза активных препаратов.

Изложенное выше определяет актуальность изучения новых замещенных -маннанов, а также получение сульфатированных производных, обладающих антикоагуляционной активностью.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы – исследование новых замещенных -маннанов семян бобовых и синтез сульфатов галактоманнанов, обладающих антикоагуляционной активностью.

Эта цель в рамках диссертационной работы диктовала следующие задачи:

Изолирование и исследование структуры галактоманнанов, представляющих научный и практический интерес.

Выделение и характеристика новых галактоглюкоманнанов из разных частей семени Cercis canadensis L. (багрянника канадского).

Разработка условий синтеза сульфатированных галактоманнанов с разными параметрами структуры. Тестирование их биологической активности.

Научная новизна работы. Выделены и изучены состав и структура галактоманнанов Gleditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus corniculatus L. У первых двух галактоманнанов охарактеризовано тонкое строение, т.е. распределение остатков -галактозы вдоль главной цепи. Определены параметры структуры макромолекул и их физико-химические свойства. Выделены и охарактеризованы галактоглюкоманнаны из эндосперма и кожуры семян Cerсis сanadensis L. Впервые обнаружено, что замещенные -маннаны аналогичного строения и близкого состава могут иметь различную локализацию в семени (эндосперм и кожура) и, соответственно, выполнять две разные функции – запасную и структурную. Проведено сульфатирование 4-х галактоманнанов с разным соотношением Ман:Гал (1.1-5.2) и примерно равной молекулярной массой (ок. 100 кДа). Полученная высокая степень замещения не зависит от структурных параметров полисахаридов. В двух тестах in vitro – определение тромбинового времени и ингибирование агрегации тромбоцитов – установлено, что полученные производные обладают антикоагуляционной активностью. Найдено, что величина галактоманнане.

Практическая ценность работы. Получены новые сведения о строении и свойствах замещенных -маннанов – полисахаридов с широкими возможностями применения.

Разработаны условия и осуществлен синтез сульфатированных производных галактоманнанов.

Положительный результат тестирования биологической активности синтезированных сульфатов галактоманнанов дает основание для расширения работ по созданию активных гепариноидов.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на V Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, Россия, 2003) и на III Всероссийской школеконференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, Россия, 2004).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 5 статей.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экпериментальной части, включающей в себя описание материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (118 наименований, в том числе 98 на иностранных языках). Работа изложена на 105 страницах, включает рисунков и 13 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Семена Cercis canadensis L., Gleditsia triacanthos f. inermis L. и Gleditsia ferox Desf. были предоставлены для исследования из коллекции бобовых Ботанического сада Ростовского государственного университета, Lotus corniculatus L. – из коллекции семян Центрального Сибирского ботанического сада СО РАН. Видовая аутентичность исследованных семян подтверждена ведущими специалистами вышеуказанных организаций. Для сульфатирования были выделены и очищены растительных галактоманнана из коллекции семян нашей лаборатории.

Выделение и очистку замещенных -маннанов из семян проводили по схеме, которая включала измельчение и фиксацию семян кипящим 80 %-ным этанолом, водную экстракцию полисахаридов, избирательное осаждение замещенных маннанов из раствора в виде комплекса с ионами Cu2+. При выделении галактоманнанов из конкретных объектов вводились дополнительные стадии:

обработка растительного материала бензолом; депротеинизация полученного полисахарида с помощью проназы (из Streptomyces grisens, КФ 3.4.244, удельная активность – 8 ед/мг ) и/или по методу Севага. В некоторых случаях выделение полисахаридов осуществляли из изолированных частей семени. При экстракции галактоглюкоманнанов дополнительно использовали растворы NaOH различной концентрации.

Для установления состава, структуры и свойств полисахаридов в работе использовались следующие методы: полный и частичный кислотный гидролиз, частичная деполимеризация, анализ состава олигосахаридов, ферментативный гидролиз, бумажная, тонкослойная, газо-жидкостная, ионообменная и гельпроникающая хроматография, ИК- и С-ЯМР-спектроскопия, поляриметрия, вискозиметрия и другие.

Для определения содержания введенных в полисахарид SО31--групп, использовали известный турбидиметрический метод (Dodgson, Price, 1962).

Калибровочный график строили для растворов K2SO4 различной концентрации.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Изучение галактоманнанов семян Lotus corniculatus L., Gleditsia triacanthos f.

inermis L., Gleditsia ferox Desf.

Выход очищенных препаратов галактоманнанов из семян L. corniculatus., G.

triacanthos f. inermis составил 1.65 и 15.4 % соответственно. Полисахарид семян G.

ferox выделяли из изолированного эндосперма; выход в пересчете на целые семена составил 18.9 %. Полученные препараты представляли собой негигроскопичные, белые или кремовые порошки без запаха.

Моносахаридный состав. На ранних этапах выделения препараты содержали от 4 до 6 сахаров – рамнозу, арабинозу, ксилозу, глюкозу, маннозу и галактозу, причем последние два значительно преобладали. В процессе очистки содержание сопутствующих сахаров снижалось до следовых количеств, тогда как соотношение маннозы и галактозы практически не изменялось. Поскольку постоянство соотношения мономеров является общепринятым критерием гомогенности для гетерополисахаридов, был сделан вывод о том, что полученные препараты представляли собой галактоманнаны.

Анализ олигосахаридов галактоманнанов L. corniculatus и G. triacanthos f.

inermis позволил установить, что остатки галактозы во всех фрагментах не занимают редуцирующих позиций в макромолекуле, не связаны между собой, а присоединены к звеньям маннозы. Последние занимают как концевые, так и нередуцирующие позиции.

С помощью ферментативного гидролиза эндо-1,4--маннаназой (из Bacillus subtilis, КФ 3.2.1.78, удельная активность 12.8 ед/мг) галактоманнанов L. corniculatus и G triacanthos f. inermis было показано наличие 1,4--маннозидной связи в основной цепи полимеров. За процессом следили по изменению приведенной вязкости растворов полисахаридов. Приведенная вязкость раствора галактоманнана L. corniculatus за 5 ч снизилась на 23 %, а для раствора G triacanthos f. inermis – на 83 %. Результаты позволили предположить, что скорость и глубина гидролиза значительно отличались для этих двух замещенных маннанов.

Как известно (McCleary et al., 1983), эффект энзиматического расщепления галактоманнанов зависит от количества и расположения вдоль основной цепи боковых -D-галактопиранозных остатков, поскольку заместители создают стерические затруднения для действия фермента. Таким образом, результаты гидролиза объясняются различным содержанием галактозы в полисахаридах (45.1 % и 29.2 % соответственно).

ИК-спектроскопия. Для всех исследуемых галактоманнанов были записаны ИК-спектры. Кривые поглощения всех трех полисахаридов оказались подобны. В области 700-1200 см-1 были обнаружены характеристичные для маннопиранозных остатков полосы поглощения 900-920 см-1, 870-875 см-1 и 812-820 см-1. В целом, такой тип кривой поглощения в низкочастотной области ИК-спектров характерен для полисахаридов, у которых главная цепь полностью или на довольно протяженных участках образована -маннопиранозными остатками со связью (Kato et al., 1973).

Одним из свидетельств в пользу -конфигурации гликозидного центра галактозы в галактоманнанах является положительный знак оптического вращения их растворов. Как известно, -маннаны обладают отрицательными величинами оптической активности, тогда как растворы исследованных полисахаридов имели положительный угол вращения (табл. 2). Это могло быть только в том случае, если остаток D-галактозы находился в -конфигурации, так вращением.

Для окончательного установления структуры макромолекул галактоманнанов была использована С-ЯМР спектроскопия. Большая молекулярная масса галактоманнанов препятствовала получению хорошо разрешенных ЯМР-спектров, поэтому полисахариды подвергали частичной деполимеризации по методу Божика соответствовали исходным макромолекулам, отличаясь кратно уменьшенной молекулярной массой. ЯМР-спектры исследованных галактоманнанов по набору сигналов резонанса атомов углерода были идентичны, поэтому подробно остановимся на анализе только одного спектра – галактоманнана G. ferox.

На рис. 1 представлен С-ЯМР-спектр галактоманнана G ferox; в табл. приведены величины химических сдвигов сигналов резонанса и их интерпретация.

Сравнение химических сдвигов сигналов С-атомов галактозных остатков с химическими сдвигами сигналов свободной галактозы (табл. 1) показывает, что только С-1 атом этого моносахаридного остатка испытывает сдвиг в слабое поле (+ 6.7 м.д.), так называемый «-эффект». Это свидетельствовало о его участии в образовании ковалентной (галактозидной) связи. Величина химического сдвига характерна для -конфигурации аномерного центра галактозы. Химические сдвиги сигналов остальных атомов галактозных остатков практически не отличались от аналогичных сигналов атомов свободной -галактопиранозы, что свидетельствовало об отсутствии у них заместителей. Положение сигнала С-6 однозначно указывало на пиранозный размер цикла галактозных остатков полисахарида.

Рис 1. С-ЯМР-спектр галактоманнана G. ferox. М – монозамещенный остаток D-маннопиранозы; М+ - дизамещенный остаток; D-маннопиранозы;

G - остаток D-галактопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках.

Положение и интерпретация сигналов 13С-ЯМР спектра деполимеризованного галактоманнана семян G. ferox 4-О--D-маннопиранозил 4,6-ди-О--D-маннопиранозил * - даны для сравнения (Липкинд и др., 1987) Таким образом, -галактозные остатки полимера являются нередуцирующими и незамещенными, т.е. единичными звеньями.

Рассмотрим серию сигналов маннозных остатков в спектре. С-2 и С-3 имели по одному сигналу, С-1, С-5 и С-6 – по два, а С-4 – три сигнала. Конфигурация аномерного центра маннозных остатков была определена как по величине химического сдвига С-5 (76.5 м.д.). Сравнивая положение сигналов атомов углерода маннозных остатков с положением сигналов свободной -маннпиранозы (табл 1), можно видеть, что смещение в сторону слабого поля испытывали сигналы С-1 (+ 6.7), С-4 (+ 10.5) и второй сигнал С-6 (+ 6.0 м.д.). Это доказывает участие этих атомов в образовании ковалентных связей.

Положение пика С-6 свидетельствовало о существовании маннозных остатков полимера в пиранозной форме. Химический сдвиг второго сигнала С- указывал на его замещение -аномером (т.е. галактозой). Этот факт в совокупности с участием С-1 галактозных остатков в образовании ковалентной связи является доказательством гетерополисахаридной природы изучаемого галактоманнана.

Химический сдвиг сигнала С-4 говорит о наличии в положении заместителя, которым также является -маннопираноза, так как галактоза присоединена по С-6. Расщепление сигнала С-4 на 3 линии (77.9, 78.2 и 78.4 м.д.) связано с наличием (или отсутствием) галактозилирования по С-6 у двух соседних остатков (Grasdalen, Painter,1980). Первый сигнал принадлежит незамещенному галактозой «маннобиозному блоку» Ман-Ман, средний – сумме двух разных однозамещенных блоков (Гал)Ман-Ман и Ман-Ман(Гал) и третий – слабопольный сигнал – блоку с двумя галактозными заместителями – (Гал)-Ман-Ман(Гал).

Соотношение интенсивностей этих сигналов, найдено как 0.37 : 0.47 : 0.16 соответственно (вся цепь принята за 1). Указанное соотношение характеризует вероятность встречаемости различных блоков в маннопиранозной цепи.

Из соотношения интегральных интенсивностей сигналов С-1 маннозы и галактозы получаем соотношение мономеров 2.55. Отношение интенсивности сигнала С-6 замещенного остатка маннозы к сумме обоих сигналов С- характеризует долю замещенных остатков маннозы в цепи – 0.38. Обе величины находились в хорошем соответствии с данными ГЖХ (2.54 и 0.39 соответственно).

Таким образом, данные 13С-ЯМР спектроскопии свидетельствуют о том, что в галактоманнане G. ferox оба мономера находятся в пиранозной форме, соотношение Man:Gal равно 2.55, маннопиранозные остатки имеют -конфигурацию и соединены между собой связью 1 4, причем 47 % из них являются 4,6-ди-О-замещёнными. По С-6 они замещены -галактопиранозными остатками, которые сами не имеют замещения, т.е. являются единичными концевыми остатками.

Применяя аналогичные рассуждения, было показано, что галактоманнаны G. triacanthos f. inermis и L. corniculatus имеют подобную структуру. Из их ЯМРспектров следовало, что галактозные и маннозные остатки в обоих полисахаридах связаны ковалентно и существуют в пиранозной форме. В обоих полисахаридах D-маннопиранозные звенья посредством 1,4--связи образуют полимерную цепь, в которой часть маннозных остатков замещена по С-6 единичными остатками -галактопиранозы. Определенное по интегральным интенсивностям сигналов С-1, соотношение мономеров для G. triacanthos f. inermis составило 2.4:1, для L. corniculatus – 1.2:1, что хорошо согласуется с данными ГЖХ (табл. 2). Интенсивность трех линий сигнала С-4 в спектре галактоманнана G. triacanthos f. inermis свидетельствовала, что встречаемость блоков Ман-Ман составила 34 %, (Гал)Ман-Ман и Ман-Ман(Гал) – 50 %, (Гал)Ман-Ман(Гал) – 16 %. В спектре галактоманнана L. corniculatus не удалось получить разрешение сигнала С-4.

Физико-химических свойства растворов галактоманнанов.

Вязкость. Измерение относительной вязкости проводили при низких концентрациях растворов галактоманнанов (менее 1%) в вискозиметре Оствальда.

Все галактоманнаны обладали высоким инкрементом приведенной вязкости с резко выраженной зависимостью от концентрации и имели высокое значение характеристической вязкости (табл. 2), что характерно для жестких фибриллярных макромолекул.

Характеристика исследованных галактоманнанов Галактоманнан G. triacanthos f.

inermis молекулярной массы (табл. 2) по уравнению, предложенному Дублие и Лонэ для галактоманнанов (Doublier, Launay, 1977).

Растворы галактоманнанов обладали оптической активностью. Величины их удельного вращения приведены в табл. 2.

спектроскопических методов установлено, что макромолекулы изученных галактоманнанов состоят из маннопиранозы и галактопиранозы с количественным преобладанием первого компонента. Остатки галактопиранозы имеют -конфигурацию гликозидного центра, а маннопиранозы – -конфигурацию. Последние связаны между собой связью 14, образуя главную цепь полимера. Часть маннопиранозных остатков имеет замещение в положении С-6 единичными остатками -галактопиранозы, которые являются боковыми цепями минимальной длины. То есть, все изученные нами полисахариды имеют «гребенчатый» тип строения макромолекул.

2. Изучение галактоглюкоманнанов из семян Cercis canadensis L.

Для определения моносахаридного состава частей семени C. canadensis был проведен хроматографический анализ гидролизатов эндосперма, кожуры и зародыша. Наибольшее количество маннозы (72 %) содержалось в эндосперме.

Значительное количество маннозы было найдено и в кожуре (45 %), поэтому было принято решение о выделении полисахаридов, как из эндосперма, так и из кожуры.

Галактоглюкоманнан, выделенный из эндосперма. В водном экстракте эндосперма количество маннозосодержащих полисахаридов (после селективного осаждения) оказалось крайне низким и составило всего 0.06 %. Затем продолжали экстракцию 15 %-ным NaOH. Выход полисахаридов в этом случае составил 18.0 %, из них маннозосодержащих – 9.6 %.

Моносахаридный состав галактоглюкоманнанов, выделенных из эндосперма, приведен в табл. 3. В обоих полисахаридах (водная и щелочная экстракция) мажорный сахар – манноза (83.4 % и 82.9 %), в обоих случаях содержится небольшая примесь арабинозы. Различия заключаются в соотношениях галактозы и глюкозы. В галактоглюкоманнане, полученном водной экстракцией, содержание галактозы превалирует над содержанием глюкозы. В полисахариде из щелочного экстракта это соотношение обратное.

использована 13C-ЯМР-спектроскопия. Спектр (рис. 2) был снят в D2O при рН ~ для полисахарида, полученного щелочной экстракцией и затем подвергнутого Соотношение (весовое) моносахаридов в галактоглюкоманнанах, выделенных из эндосперма и кожуры Моносахариды Арабиноза Манноза Галактоза частичной деполимеризации. Анализируя полученный спектр, мы можем сделать вывод о том, что в составе полимера нет фураноз, поскольку величины химических сдвигов сигналов С-1, С-4 и С-6 (табл. 4) каждого мономера характерны для пиранозных форм (Bock, Pedersen, 1983).

Рассмотрим сигналы атомов углерода галактопиранозных остатков. На их -конфигурацию указывает химический сдвиг С-1 (99.5 м.д.). Положение всех сигналов галактозных остатков за исключением С-1 практически совпадает с аналогичными сигналами свободной галактопиранозы (табл. 1). Следовательно, остатки галактозы не имеют замещений, а значительный сдвиг сигнала С-1 в слабое поле (+ 6.0 м.д.) объясняется участием этого атома в образовании гликозидной связи.

Судя по величине химического сдвига сигнала С-1 остатков глюкозы в полимере, последние имеют -конфигурацию глюкозидного центра. Сравнивая Рис. 2. 13С-ЯМР-спектр галактоглюкоманнана из эндосперма C. canadensis. М – монозамещенный остаток D-маннопиранозы; М+ – дизамещенный остаток Dманнопиранозы; Gal – остаток D-галактопиранозы; Glc – остаток глюкопиранозы. Цифры обозначают номера углеродных атомов в моносахаридных остатках.

галактоглюкоманнана C. сanadensis остаток цепи • - Дано для сравнения (Lipkind et al., 1988) положение сигналов свободной -D-глюкопиранозы и глюкозных звеньев полимера (табл. 4) приходим к выводу, что у последних атомы С-1 и С- участвуют в образовании гликозидных связей, о чем свидетельствуют сдвиги в слабое поле (+ 7.1 и + 9.1 м.д.). Остальные сигналы практически совпадают, указывая на отсутствие замещения в соответствующих позициях.

Анализ сигналов маннозных остатков полимера позволяет заключить, что они имеют -конфигурацию аномерного центра, о чем можно судить по химическому сдвигу С-5. В сильном поле маннозным остаткам принадлежали два сигнала С- (62.05 и 67.2 м.д.). Второй, менее интенсивный сигнал С-6 в более слабом поле (+ 5.15 м.д.) появился благодаря наличию замещения в этой позиции у части маннопиранозных звеньев. Химический сдвиг второго сигнала свидетельствовал о замещении -аномером, т.е. в данном случае об -галактозилировании по С- определенной доли остатков маннопиранозы. Сравнивая химические сдвиги сигналов свободной -D-маннопиранозы и остатков -D-маннопиранозы полимера (табл. 1 и 4), мы видим, что сигналы С-1 и С-4 последних значительно смещены в слабое поле (+ 7.5 и + 9.4 м.д.), указывая на участие этих атомов в образовании гликозидной связи 1,4.

Суммируя изложенное выше, можно сделать вывод, что макромолекула изученного полисахарида сочетает в себе элементы строения глюко- и галактоманнана. Имеется линейная цепь из 1,4--связанных D-глюко- и D-маннопиранозных остатков (структура глюкоманнана), причем к части последних по С- присоединены единичные остатки -D-галактопиранозы, образуя «гребень»

(структура галактоманнана). Схематически это можно изобразить следующим образом:

-Manp (1-4)--Manp (1-4) - -Manp (1-4)- -Glcp (1-4)- -Manp (1-4) Галактоглюкоманнан, выделенный из кожуры. Для выделения полисахаридов использовали схему, описанную для получения полимеров из эндосперма. Выход их из водного экстракта составил 3.3 %, из щелочного (с последующим выделением маннозосодержащих полисахаридов) – 16.9 %.

Моносахаридный состав полисахаридов устанавливали с помощью хроматографического анализа. В препарате, экстрагированном водой, были найдены рамноза, арабиноза, манноза, галактоза и глюкоза в приблизительно равных количествах. Можно было предположить, что данный препарат содержит набор гемицеллюлоз.

маннозосодержащий полисахарид – препарат 1 (табл. 3), в котором были обнаружены мажорные моносахариды – манноза, глюкоза и галактоза, небольшая примесь арабинозы, в следовых количествах идентифицировались рамноза и галактоглюкоманнаном. Для подтверждения этого предположения, повторили осаждение ионами Cu2+ – препарат 2. Потери при повторной очистке составили лишь 8.5 %. При сравнении состава препаратов 1 и 2 (табл. 3) оказалось, что содержание арабинозы уменьшилось, исчезли рамноза и ксилоза, а соотношение основных моносахаридов практически не изменилось. Этот факт свидетельствовал в пользу того, что препарат, выделенный из кожуры, также представлял собой гетерополисахарид – галактоглюкоманнан.

Для сравнения полисахаридов, выделенных из эндосперма и кожуры, были сняты их ИК-спектры. В характеристической для углеводов области (700- см-1) кривые поглощения были идентичны друг другу, а также спектрам исследованных нами ранее замещенных -маннанов.

Если состав галактоглюкоманнана, выделенного из кожуры (выход 16.9 %), сопоставить с таковым для полисахарида, полученного при щелочной экстракции из эндосперма (выход 9.6 %), то становится очевидным, что в этих галактоглюкоманнанах молярные соотношения Глю : Гал совпадают, при этом резко различаются соотношения Ман : Гал (табл. 3). В два раза меньшее Ман : Гал в экстрагированном из кожуры полисахариде означает увеличение вдвое боковых ответвлений основной цепи, представленных единичными остатками галактопиранозы. При этом, как известно, повышается растворимость 1,4--маннанов и, как следствие, облегчается их экстракция. Это подтвердилось более высоким выходом препарата 1.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что из разных частей семени C. сanadensis мы извлекли аналогичные по составу галактоглюкоманнаны. Этот факт представляет большой интерес. Известно, что в кожуре семян подсемейства цезальпиниевых мажорными полисахаридами являются арабинаны различного состава и структуры, в то время как в эндосперме в качестве мажорных полисахаридов содержатся галактоманнаны. Арабинанам в составе гемицеллюлоз придается опорная функция, а галактоманнаны представляют собой резервные полисахариды. Т.к. и в кожуре и в эндосперме семян C. сanadensis, галактоглюкоманнаны, можно предположить, что в данных семенах галактоглюкоманнаны могут иметь разные функции.

3. Сульфатированные галактоманнаны – потенциальные гепариноиды.

На основе известных принципов получения сульфатов полисахаридов (Pires et al., 2001; Huynh et al., 2001; Geresh et al., 2002) нами была разработана методика сульфатирования галактоманнанов. Она содержит три этапа: 1 – подготовка полисахарида; 2 – реакция сульфатирования и 3 – очистка производного и получение натриевой соли сульфата галактоманнана.

1 этап. Сульфатирование чаще всего проводится в среде безводного диметилформамида (ДМФА), в котором галактоманнаны не растворяются. Для минимизации сложностей, возникающих вследствие проведения химического синтеза в гетерогенной фазе, галактоманнан был переосажден спиртом из водного раствора, а затем осадок полисахарида был последовательно промыт спиртом и ДМФА в 3-кратной повторности для каждого растворителя. Такая подготовка образца была необходима для лучшей сольватации ОН-групп полисахарида.

2 этап. Реакцию сульфатирования проводили в строго безводной среде в присутствии триэтиламина (ТЭА). Сульфатирование осуществлялось с помощью пиридин-SO3 комплекса, который всегда применяется в избытке по отношению к количеству свободных ОН-групп гексозных остатков в полисахариде. В наших экспериментах использовался трехкратный молярный избыток. Реакция проводилась в течение 4 ч при постоянном перемешивании и заданной температуре.

3 этап. Для остановки реакции сульфатирования добавляли ледяную воду и ТЭА. Полученную смесь диализовали. Затем раствор пропускали через галактоманнана, его раствор нейтрализовали 1M CH3COONa и полисахарид осаждали.

Эксперименты по синтезу сульфатов галактоманнанов и испытанию их антикоагуляционной активности проводились на четырех галактоманнанах с различным соотношением Ман:Гал (табл. 5).

1 - Galega orienthalis; 2 – Cyamopsis tetragonoloba; 3 – Ceratonia siliqua; 4 – Sophora japonica. Эти полисахариды далее для краткости в тексте, таблицах и рисунках будут названы 1 – Галега; 2 – Гуар; 3 – Локуст бин; 4 – Софора.

Для всех галактоманнанов с помощью деполимеризации были получены фрагменты макромолекул с молекулярными массами в интервале 80 – 100 кДа, с неизмененной структурой, которая была подтверждена сохранением соотношения мономеров и идентичностью ИК-спектров исходных и деполимеризованных полисахаридов.

Сульфатированные производные галактоманнанов были синтезированы в одинаковых условиях при t = 60 С. Для доказательства присутствия сульфогрупп в продуктах синтеза были записаны ИК-спектры. Для всех сульфатов галактоманнанов наблюдали интенсивную полосу поглощения при 1250 ± 3 см-1, которая принадлежит валентным колебаниям S=O. Этот факт свидетельствует о замещении части свободных гидроксилов SО31-группами. В качестве примера приведены ИК-спектры Гуара до и после сульфатирования (рис. 3).

Результаты количественного определения сульфогрупп в полученных производных представлены в табл. 5. Из приведенных данных следует, что достигнутая нами степень замещения (DS) не зависит от величины соотношения мономеров в данных галактоманнанах.

Рис 3. ИК-спектры исходного (А) и сульфатированного (В) Гуара. Стрелкой отмечено положение полосы поглощения группы S=O.

Содержание сульфогрупп в синтезированных производных галактоманнанов Более высокая DS с крайними значениями Ман : Гал по сравнению с двумя промежуточными, возможно, объясняется тем, что сульфатирование в первую очередь проходит по первичным ОН-группам, т.е. группам находящимся при шестом атоме углерода (Mhner et al., 2001). В часто- (Галега) и редкозамещенных (Софора) галактоманнанах большинство таких свободных групп, принадлежащих галактопиранозному остатку в первом случае и маннопиранозному во втором, оказываются одинаково доступными для реакции сульфатирования. Для 2-х других галактоманнанов с промежуточными величинами соотношения мономеров, видимо, возникают стерические затруднения для синтеза.

Чтобы убедиться в отсутствии деградации полисахаридов в процессе сульфатирования, для всех полученных производных определяли мономерный состав. Как видно из табл. 5, соотношение мономеров сохранилось для всех сульфатов галактоманнанов. Для полисахарида Гуара до и после сульфатирования была проведена гельпроникающая хроматография. Максимум пика сульфопроизводного имел меньшее время удерживания по сравнению с исходным полисахаридом, что свидетельствовало об увеличении молекулярной массы за счет сульфатирования. На хроматограмме сульфатированного полисахарида была выявлена низкомолекулярная фракция в количестве 3.1 %, которая, вероятно, могла принадлежать продуктам деградации. Поэтому можно полагать, что в процессе синтеза деградация галактоманнанов не происходит или наблюдается в очень слабой степени.

Рис. 4. Зависимость степени сульфа- зависимость DS – температура оказатирования от температуры для га- лась линейной с хорошим коэффилактоманнана Гуар циентом корреляции (r = 0.9995), что позволяет контролировать глубину сульфатирования.

Биологическая активность сульфатированных галактоманнанов. Из литературы известно (Alban, Franz, 2001), что многие сульфополисахариды проявляют антикоагуляционную активность. С целью выяснения, обладают ли полученные нами производные галактоманнанов этими свойствами, в их присутствии было проведено 2 анализа: определение тромбинового времени и степень агрегации тромбоцитов. Исследования были проведены в клиникобиологической лаборатории института хирургии им. А.В. Вишневского РАМН.

Первый тест – определение тромбинового времени – позволил установить зависимость времени коагуляции плазмы от концентрации сульфатов галактоманнанов. Как видно из рис. 5, в пределах использованных концентраций зависимости линейны, кроме того, угол наклона зависит от соотношения моносахаридов в галактоманнане. Наибольший угол, а, следовательно, наивысшая активность наблюдалась для галактоманнана Галеги, соотношение Ман:Гал в котором составляет 1.13. Наименьшая активность была отмечена для галактоманнана Софоры, которая имеет наибольшее соотношение Ман:Гал 5.21.

Таким образом, антикоагулянтные свойства сульфатированных производных зависят от содержания галактозы в исходном полисахариде. Для подтверждения этого положения была построена зависимость увеличения времени образования Рис. 5. Зависимость времени коагу- Рис. 6. Зависимость увеличения тромляции плазмы от концентрации бинового времени в присутствии сульфатов галактоманнанов:

1 – Галега, 2 – Гуар, 3 – Локуст бин, от содержания в них галактозы:

тромбоцитарного сгустка в присутствии сульфатов галактоманнанов (по сравнению с чистой плазмой) от содержания галактозы в полисахаридах. Из рис. видно, что зависимость является линейной. Поэтому очевидно, что существует прямая корреляция между антикоагуляционной активностью сульфатов галактоманнанов и степенью замещения -маннанов в интервале соотношений Ман:Гал 1.1 – 5.2.

Второй тест – измерение агрегационной активности тромбоцитов – проводили на агрегометре в присутствии индуктора АДФ. Результат, т.е. величина активности выражается отношением предельного процента оптического пропускания в эксперименте по сравнению с таковым в донорской плазме, принимаемым за 100 %. Иначе говоря, чем меньше пропускание, тем больше ингибирование процесса агрегации тромбоцитов. Результаты представлены на рис. 7. Как видно, наименьшее пропускание наблюдается в присутствии галактоманнана Галеги, наибольшее – галактоманнана Софоры. Таким образом, мы наблюдаем ту же тенденцию – прямую зависимость проявляемого эффекта от содержания галактозы в полисахариде.

сульфатированные галактоманнаны обладают антитромботической активностью, что проявилось в прямом антикоагуляционном эффекте при определении тромбинового времени и снижении функциональной активности тромбоцитов.

Дальнейшее развитие работы предполагает определение активности полученных производных в других общепринятых тестах, а также установление величины эффектов в зависимости от физико-химических параметров макромолекул полисахаридов. Это необходимо для выяснения механизма взаимодействия сульфатов галактоманнанов с компонентами системы свертывания крови и направленного синтеза активных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Из семян Gleditsia ferox Desf., Gleditsia triacanthos f. inermis L., Lotus corniculatus L. выделены галактоманнаны с различным молярным соотношением мономеров (Ман:Гал) 2.54, 2.42 и 1.22 соответственно. С помощью химических, физико-химических методов и спектроскопии (ИК- и представляют собой основную цепь из 1,4--D-маннопиранозных звеньев, определенная часть которых в положении C-6 замещена единичными остатками -галактопиранозы. Для двух первых галактоманнанов установлена тонкая структура, т.е. распределение галактозы вдоль основной цепи.

2. Галактоманнаны обладали оптической активностью: положительное удельное вращение []D находилось в интервале 30.5 – 84.1°. Водные растворы полисахаридов отличались высокой вязкостью ([] = 559 – 1430 мл/г), свойственной фибриллярным макромолекулам. На основе значений характеристической вязкости рассчитаны величины их молекулярной массы:

600 – 1660кДа.

3. Из эндосперма и кожуры семян Cercis canadensis L. впервые выделены галактоглюкоманнаны, определен их мономерный состав. Для одного из них с помощью С-ЯМР-спектроскопии установлена первичная структура: его главная цепь представлена 1,4--D-глюко- и маннопиранозными остатками, последние замещены по С-6 единичными остатками -галактопиранозы.

Впервые обнаружено, что аналогичные по составу и строению полисахариды локализованы в разных частях семени (эндосперм и кожура) и имеют, повидимому, разные функции – запасную и структурную.

4. Найдены условия синтеза, контролирующие степень сульфатирования галактоманнанов и установлено, что существует прямая корреляция между количеством инкорпорированных сульфогрупп и температурой проведения реакции.

5. Получены сульфатированные производные 4-х галактоманнанов с разным соотношением Ман:Гал (1.1 – 5.2). Установлено, что степень замещения в разработанных условиях реакции не зависит от содержания галактозы в полисахаридах.

6. В двух анализах in vitro показано, что полученные сульфаты галактоманнанов обладают антикоагуляционной активностью. Они увеличивают тромбиновое время и снижают функциональную активность тромбоцитов. При этом установлено, что величины обоих эффектов зависят от содержания галактозы в галактоманнанах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Анулов О.В., Пономаренко С.Ф., Егоров А.В. Галактоманнаны семян некоторых видов сем. Fabaceae // Растительные ресурсы. 2003. Т. 39. № 1.

С. 80-83.

2. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Установление первичной и тонкой структуры галактоманнана семян Gleditsia triacanthos f. inermis L. // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 4. С. 452-456.

Водорастворимый галактоманнан семян Lotus corniculatus L.: строение и свойства // Прикладная биохимия и микробиология. 2003. Т. 39. № 5.

С. 577-580.

Международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». Москва. 2003. Т. 3. С 333-335.

5. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Состав и структура макромолекулы галактоманнана семян Gleditsia ferox // Прикладная биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. № 3. С. 370-375.

6. Егоров А.В., Местечкина Н.М., Щербухин В.Д. Сульфатированные галактоманнаны бобовых – как потенциальные гепариноиды // Материалы III Саратов. 2004. С. 30.

7. Местечкина Н.М., Егоров А.В., Анулов О.В., Щербухин В.Д. Изучение галактоглюкоманнанов из семян Сercis canadensis L. // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. (в печати).



 


Похожие работы:

«КАШТАНОВА Наталья Николаевна ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Мордовский государственный университет...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенском государственном педагогическом университете имени В.Г. Белинского...»

«МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2008 год Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Государственного учреждения Медико-генетический научный центр РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович Официальные оппоненты :...»

«АНДРЕЕВА Алевтина Сергеевна ЖУКИ-ЛИСТОЕДЫ (COLEOPTERA: CHRYSOMELIDAE) БЕЛГОРОДСКОЙ ОБЛАСТИ: ФАУНА, ЭКОЛОГИЯ, ХОЗЯЙСТВЕННОЕ ЗНАЧЕНИЕ 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Белгород – 2014 Работа выполнена на кафедре биоценологии и экологической генетики ФГАОУ ВПО Белгородский государственный национальный исследовательский университет Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент Присный Александр...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«ЕФРЕМЕНКО ЕЛЕНА НИКОЛАЕВНА ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 03.00.02 – биофизика 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный консультант : Варфоломеев Сергей Дмитриевич, доктор...»

«1 НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Анисимова Марина Анатольевна Детоксицирующая способность почв и выделенных из них гуминовых кислот по отношению к гербицидам 03.00.27-почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА 1997 2 Актуальность темы. Применение средств химической защиты растений, ставшее неотъемлемым элементом практики современного земледелия, привело к возникновению проблемы загрязнения почвенного покрова остаточными количествами гербицидов и их...»

«Воробьев Алексей Викторович ФЕНОТИПИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ ПОТЕНЦИАЛ МЕТАНО- И МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА BEIJERINCKIACEAE Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель : доктор биологических наук С.Н. Дедыш Официальные оппоненты : доктор...»

«Новосадова Александра Викторовна МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ В РАННЕМ ОНТОГЕНЕЗЕ ОСЕТРОВЫХ РЫБ У ПОТОМСТВА КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ 03.02.06 ихтиология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП ВНИРО), г. Москва Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«БАИШЕВА ЭЛЬВИРА ЗАКИРЬЯНОВНА ЭКОЛОГО-ФИТОЦЕНОТИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА БРИОКОМПОНЕНТА ЛЕСНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ РЕСПУБЛИКИ БАШКОРТОСТАН Специальность 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук УФА – 2010 Работа выполнена в Лаборатории геоботаники и охраны растительности Учреждения РАН Института биологии Уфимского научного центра РАН Научный консультант Миркин Борис Михайлович доктор биологических наук, профессор Официальные...»

«Абрамов Сергей Маркович Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации 03.02.03 - Микробиология 03.01.06 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского...»

«АВТУХ АЛЕКСАНДР НИКОЛАЕВИЧ СИСТЕМАТИКА АКТИНОМИЦЕТОВ РОДА KRIBBELLA 03.02.03 Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пущино – 2012 Работа выполнена в отделе Всероссийская коллекция микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Евтушенко Людмила Ивановна Научный консультант :...»

«Волкович Марк Габриэлевич ЖУКИ-ЗЛАТКИ ПОДСЕМЕЙСТВА POLYCESTINAE (COLEOPTERA, BUPRESTIDAE): МОРФОЛОГИЯ, ФИЛОГЕНИЯ, КЛАССИФИКАЦИЯ 03.02.05 – энтомология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург – 2012 2 Работа выполнена в лаборатории систематики насекомых Федерального государственного бюджетного учреждения науки Зоологический институт Российской академии наук Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор,...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«КОНДАКОВА МАРИЯ ЮРЬЕВНА ПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА ПСАММОФИТНЫХ ОДНОЛЕТНИКОВ НИЖНЕДОНСКОЙ ФЛОРЫ 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2010 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Федяева Валентина Васильевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Сиротюк Эмилия Айсовна доктор биологических...»

«Миронова Виктория Владимировна КОМПЬЮТЕРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ АУКСИНА В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ КОРНЯ РАСТЕНИЙ 03.01.09 – математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории теоретической генетики, г. Новосибирск Научный руководитель : Доктор биологических наук,...»

«Работа выполнена в Зоологическом институте РАН и Мурманском морском биологическом институте КНЦ РАН ДЕНИСЕНКО Официальные оппоненты : доктор биологических наук, Станислав Григорьевич профессор Бергер В.Я. доктор биологических наук, профессор МАКРОЗООБЕНТОС БАРЕНЦЕВА МОРЯ Брязгин В.Ф. В УСЛОВИЯХ МЕНЯЮЩЕГОСЯ КЛИМАТА И АНТРОПОГЕННОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ доктор биологических наук Гебрук А.В. Специальность 03.00.18 – гидробиология Ведущая организация : Всероссийский...»

«Смирнов Иван Алексеевич Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов Специальность 03.00.24 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный...»

«ФОМИН АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ ВЗАИМОСВЯЗЬ СПЕКТРОВ КОЛЕБАНИЙ ТЕМПЕРАТУРЫ И КРОВОТОКА ПАЛЬЦЕВ РУК 03.01.02 Биофизика АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Саратов 2013 Работа выполнена на кафедре медицинской физики ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского Научный руководитель : Заслуженный деятель науки РФ, доктор физико-математических наук, профессор Усанов Дмитрий Александрович Официальные...»

«САИДОВ АБДУСАТТОР САМАДОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРЫЗУНОВ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 03.02.04 - зоология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Душанбе – 2011 Работа выполнена в Отделе экологии наземных позвоночных животных Института зоологии и паразитологии им. Е.Н.Павловского Академии наук Республики Таджикистан Научный консультант : академик АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук,...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.