WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 


На правах рукописи

ПЕТРОВА НАДЕЖДА ЭДУАРДОВНА

ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ЛЕГОГЛОБИНА В

КЛУБЕНЬКАХ БОБОВЫХ РАСТЕНИЙ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2002

Работа выполнена в лаборатории метаболизма азота и синтеза белка у растений Института биохимии им. А.Н.Баха РАН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук А.Ф.Топунов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор А.С.Капрельянц доктор биологических наук, профессор В.К.Шильникова

Ведущая организация:

Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (г. Саратов)

Защита диссертации состоится «11» июня 2002 г. в «14» часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии им. А.Н.Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологической литературы ОБН РАН (119071, Москва, Ленинский проспект, 33, корп. 1.)

Автореферат разослан « » 2002г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф.Орловский

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Одной из центральных проблем биологии растительной клетки является проблема усвоения азота. Растения постоянно находятся в условиях недостатка азота и применяют стратегию его экономного использования. Большинство представителей семейства бобовых способно в симбиозе с клубеньковыми бактериями усваивать азот непосредственно из атмосферы. Известно, что внешние условия оказывают большое влияние на процесс симбиотической фиксации атмосферного азота в клубеньках бобовых растений. Некоторые из этих воздействий могут быть достаточно сильными, чтобы их можно было считать стрессовыми. Одним из процессов, необходимых для нормального протекания азотфиксации и который подвергается серьезному воздействию внешних условий, является регуляция кислородного режима в клубеньках и связанное с этим функционирование легоглобина - содержащегося в них кислородсвязывающего гемопротеида и метлегоглобинредуктазы – фермента, восстанавливающего легоглобин. Изучение адаптивных изменений, происходящих при стрессе, может позволить найти регуляторные механизмы, управляющие интенсивностью азотфиксации в норме.

Цель и задачи работы. Настоящая работа была направлена на изучение воздействия различных внешних факторов на азотфиксирующие клубеньки бобовых растений и на легоглобин, как один из важнейших компонентов поддержания оптимальных условий для процесса азотфиксации. В связи с этим в работе были поставлены следующие задачи:

1.Изучить влияние нитратов на растения гороха различных генетических линий, как дикого типа, так и мутантных по симбиотическим генам, в том числе на состояние легоглобина и метлегоглобинредуктазы.

2. Изучить действие активных форм кислорода на легоглобин в модельной системе, которой являлись клетки E. coli с встроенным геном легоглобина.

3. Изучить взаимодействие легоглобина с нитратами и активными формами кислорода и азота в опытах in vitro.

4. Рассмотреть общие механизмы ответа клубеньков и систем регуляции кислородного режима в них при воздействии различных стрессовых факторов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Изучено состояние легоглобина и метлегоглобинредуктазы в клубеньках бобовых растений различных генетических линий. Показано, что содержание легоглобина сильно различается в линиях дикого типа гороха посевного и линиях, мутантных по симбиотическим генам, отвечающим за различные стадии формирования клубенька.

Легоглобин в клубеньках всех исследованных генетических линий гороха находился в физиологически активном состоянии, а активность метлегоглобинредуктазы у них было практически одинакова. Показано также, что состояние легоглобина должно быть дополнительным параметром при анализе генетических линий бобовых растений.

Идентифицирован первый известный симбиотический ген гороха (Sym31), одновременно контролирующий дифференцировку симбиотических компартментов и нитрат-зависимую регуляцию клубенькообразования.

Впервые было исследовано влияние окислительного стресса на легоглобин в модельной системе, которой являлась культура E. coli, синтезирующая легоглобин. Показано, что окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода и азота, сильнее влияет на рост этой культуры, чем на рост исходного штамма. Показано также, что легоглобин является эффективным катализатором реакций свободно-радикального окисления липидов, в том числе природных антиоксидантов (например, -каротина), а индуцированные легоглобином реакции свободнорадикального окисления модулируются NO-содержащими комплексами.

Полученные в работе данные позволяют предложить новые подходы для более точной оценки результатов мутаций в симбиотических генах бобовых растений, что может быть важно для генетического анализа бобовых растений. Данные исследований по воздействию внешних факторов на клубеньки и легоглобин могут помочь выяснению механизмов ответа симбиотической азотфиксирующей системы на стрессовые воздействия, что важно для селекции бобовых растений на устойчивость к неблагоприятным внешним воздействиям, а также при выращивании их в экстремальных условиях.

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы.

Диссертация изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков, таблиц. Список цитированной литературы включает 348 наименований, из них 292 работы зарубежных авторов.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на:

2nd European Nitrogen Fixation Conference Poznan, Poland 1996; Intern. Symp. on Stress and Inorganic Nitrogen Assimilation. Moscow. 1996; Второй Съезд Биохимического Общеста, 1997 г., Москва; NATO Advanced Study Institute Co-sponsored by FEBS. Free Radicals, Oxidative Stress and Antioxidants. Pathological and Physiological Significance, 1997, Turkey; XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Санкт-Петербург. 1998; IV Съезд общества физиологов растений России. Москва. 1999; International Conference Biocatalysis-2000: Fundamentals & Applications.

Moscow, Russia. 2000.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 31 печатной работе, в том числе в 8 статьях.

«Быстрорастущий ранний - 4», инокулированные клубеньковыми бактериями Rhizobium lupini (эффективный штамм 359а из коллекции ВНИИ биотехнологии) и выращенные в полевых условиях Московской области; в) растения гороха посевного (Pisum sativum L.): исходные линии «дикого типа»

SGE, Sprint-2, Sparkle и Finfle, а также симбиотические мутанты SGEFix-1 (sym40), SGEFix-2 (sym33), Sprint-2Fix- (sym31), E135f (sym13), Ris FixV(sym 42), двойные мутантные линии RBT (sym13, sym31), RBT1(sym13,sym40), RBT3 (sym33, sym40), RBT4 (sym33, sym42), инокулированные клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae, (производственный штамм CIAM 1026 из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН).

Клубеньки собирали на стадии бутонизации - начала цветения, так как ранее было показано (Баширова с соавт., 1979), что содержание легоглобина (Lb), как и активность метлегоглобинредуктазы (MLbR), являются максимальными в данной фазе развития растений.

Условия выращивания растений. Растения гороха посевного выращивались во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН (Санкт-Петербург). Растения гороха выращивали в контейнерах, содержащих 500 см3 стерильного вермикулита, в фитотроне. В субстрат добавляли минеральную питательную среду (Borisov et al., 1997) по 200 мл среды на контейнер. Нитратный стресс создавали добавлением в среду KNO3 до концентрации 5 мM. В контроле ионную силу поддерживали добавлением в среду KCl до концентрации 5 мM. Подсчет числа клубеньков и определение массы побегов для каждой линии проводили на 10 растениях. Данные в таблицах представляют собой средние арифметические из полученных значений и их стандартные отклонения.

Выращивание бактерий. В работе использовали штамм E. coli BL21(DE3)pLysS с встроенным в плазмиду pET-3a геном легоглобина люпина lbII (аналогичный штамму полученному ранее (Sikorski et al., 1995)). Культивирование бактерий осуществляли в колбах Эрленмейера объемом мл. на качалке при 37 0С. Экспрессию lbII гена индуцировали добавлением IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ через 2 часа роста.

Обработка клеток редокс-медиаторами. В середине log-фазы роста (3 часа роста) при оптической плотности 0,120-0,160 как в культуру экспрессирующую, так и не экспрессирующую Lb добавляли GS-NO и/или этанольный раствор редокс-медиаторов (менадион, феназинметасульфат (ФМС), бензилвиологен). Концентрации прооксидантов указаны в разделе «Результаты и обсуждение».

Получение белков из цитозоля клубеньков проводили по методу С.С. Мелик-Саркисян с соавторами (1972) с модификациями.

Концентрацию Lb определяли спектрофотометрически, используя оптическое поглощение при 525 нм. Для расчета концентрации Lb использовали коэффициент миллимолярной экстинкции EмМ525 = 9, 52 (Quast, Vesterberg, 1969). Окисленную и оксигенированную формы Lb определяли, исходя из стандартных спектров поглощения белка.

Метлегоглобинредуктазную активность определяли по методу (Баширова с соавт. 1979) с модификациями.

Получение восстановленного, окисленного и оксигенированного легоглобина. Окисленный Lb получали окислением феррицианидом калия по методу Шаронова (Шаронов с соавт., 1973).

Восстановленный Lb получали добавлением дитионита натрия до конечной концентрации 2мМ.

Оксигенированный Lb получали добавлением к гемопротеиду в окисленной форме NADH+H+ до конечной концентрации 2мМ и метиленовую синь до концентрации 2,5 мкМ.

Проведение опытов по взаимодействию легоглобина с нитритом в системе in vitro. С целью проверки окисляющего действия нитрита на восстановленный Lb в анаэробных условиях нами была проведена инкубация раствора Lb с нитритом натрия в следующих молярных соотношениях: а.) 1 Lb / 1 NO2- ; б ) 5 Lb / 1 NO2- ; в ) 1 Lb / 5 NO2Конечная концентрация Lb составляла 0,02-0,05 мМ. Концентрацию окисленного и оксигенированного Lb определяли по формуле, выведенной из стандартных спектров поглощения форм Lb (Appleby, Bergersen, 1980).

Определение сырой и сухой массы растений и эндогенного нитрата. Сырую массу определяли немедленным взвешиванием 5-и растений на аналитических весах. Для определения сухой массы растения фиксировали 30 мин при 105 0С в сушильном шкафу, а затем доводили до постоянной массы при 60 0С. Эндогенный нитрат определяли потенциометрическим методом с помощью нитратселективного электрода (Большой практикум по физиологии растений, 1978).

Проведение жидкостной колоночной хроматографии. Все виды колоночной хроматографии низкого давления проводили с помощью комплекта стандартного оборудования для жидкостной хроматографии низкого давления фирмы “LKB” (Швеция) при температуре +4 0С. Ионообменную хроматографию высокого давления проводили с использованием HPLC-System, “ Akvilon ” (Россия).

Во все буферы при очистке вводили PMSF (10 мкМ) в качестве ингибитора протеаз.

Исследования с использованием электронного парамагнитного резонанса (ЭПР). Для генерации супероксид-анион радикала использовали комбинацию ксантина (1 мМ) с ксантиноксидазой (0,2 ед/мл). Количество возникающего в присутствии и отсутствие Lb супероксиданиона оценивали по образованию его радикального аддукта со спиновой ловушкой 5диэтоксифосфорил-5-метил-1-пирролин-N-оксид (ДЕПМПО). Синтез динитрозильных комплексов железа с глутатионом (ДНКЖ) проводили, добавляя к смеси ксантина и ксантиноксидазы, ферритин (0,25 мкг/мл), нитрозоглутатион (3 мМ) и восстановленный глутатион (20 мМ). Концентрацию ДНКЖ оценивали по интенсивности характерного сигнала ЭПР парамагнитной формы ДНКЖ (g фактор равен 2,034). Регистрацию спектров ЭПР проводили на спекторометре Х-диапазона («Varian», США). Сигналы ЭПР радикального аддукта ДЕПМПО с супероксидом и парамагнитной формы ДНКЖ регистрировали при комнатной температуре (250С), амплитуде модуляции магнитного поля мТл, развертке поля 100 мТл и мощности СВЧ 10 мВт.

Для определения прооксидантных свойств легоглобина использовали систему окисления -каротина в условиях генерации различных свободных радикалов, инициированных Lb в сочетании с перекисью водорода, гидроперекисями полиненасыщенных жирных кислот и пероксидом трет-бутила. Скорость гомолиза 15-гидроперокси-арахидоната и окислительной деструкции -каротина определяли при 250C на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония) по падению оптической плотности при 234 и 450 нм соответственно. Для подавления свободнорадикального окисления -каротина использовали такие генерирующие NO соединения как GS-NO и ДНКЖ. Sнитрозоглютатион синтезировали как описано ранее (Hart, 1985). Препарат ДНКЖ был предоставлен д.б.н. профессором А.Ф. Ваниным (Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН). В препарате ДНКЖ находились в равновесии димерные и мономерные формы.

Целью данного раздела работы являлось изучение влияния симбиотических генов (генов, отвечающих за различные стадии формирования симбиотическиой системы) на синтез и состояние легоглобина в клубеньках. Для планирования экспериментов и объяснения результатов нами совместно с ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН параллельно были проведены исследования внешней морфологии клубеньков, их ультраструктурного анализа и базирующейся на них классификации мутантов в соответствии с гипотетическим порядком функционирования идентифицированных генов.

Начиная со стадии эндоцитоза у линий Sparkle и Sprint-2 (изученные нами линии дикого типа) различается последующее развитие симбиотических структур. У обеих линий симбиосомы всегда содержат один бактероид за счет того, что делящиеся бактероиды в зоне инфекции довольно быстро разобщаются перетяжкой перибактероидной мембраны (ПМ) и бактероиды оказываются в разных симбиосомах.

Гипотетическая последовательность функционирования симбиотических генов гороха, контролирующих стадии развития клубенька (основанная на морфологических характеристиках мутантных фенотипов) может иметь следующий вид (Tsyganov et al., 1998):

Sym33 Sym40 Sym31, Sym 32 Sym13 ген, идентифицированный в линии FN1, и ген Sym Для недавно выявленных симбиотических генов гороха Sym33 и Sym40 (мутантные линии SGEFix -2 и SGEFix--1 соответственно) была показана необходимость их функционирования на нескольких стадиях развития симбиоза от поздних этапов формирования инфекционных нитей до дифференцировки бактероидов и поддержания морфо-функциональной стабильности симбиотических структур клубенька (Tsyganov et al., 1998).

На наиболее ранней стадии функционирует ген Sym33 (мутант SGEFix--2). У этого мутанта бактерии активно делятся внутри инфекционной нити, но не способны из нее выходить. При этом азотфиксирующая эндосимбиотическая система не формируется. Мутация в гене Sym33 (SGEFix--2) детерминирует формирование на корнях двух типов клубеньков: белых с темной ямкой на дистальном конце и розоватых.

Позже начинает функционировать ген Sym40 (мутант SGEFix--1). Фенотип мутанта также проявляется в запрете на выход бактерий из инфекционной нити, однако их деление приводит к гипертрофии и коллапсу инфекционных нитей и к образованию симбиосом. Мутация в гене Sym (мутант SGEFix--1) детерминирует образование на корнях неэффективных мелких белых клубеньков.

Однако иногда на корнях мутанта могут образовываться розовые клубеньки с нормальной организацией. Как в белых клубеньках мутанта SGEFix--1 (sym40), так и в розоватых клубеньках мутанта SGEFix--2 (sym33) наблюдается преждевременная деградация симбиотических структур.

На еще более поздних стадиях функционируют, соответственно, ген Sym31 (мутантная линия Sprint-2Fix-) и ген Sym13 (мутантная линия Е135f). Для мутанта Sprint-2Fix- (sym 31) описан совершенно другой характер развития симбиосом. У этого мутанта происходит нормальный выход бактерий из инфекционных нитей. Как и у дикого типа, можно наблюдать молодые симбиосомы с активно делящимися бактероидами, однако бактероиды не так активно разобщаются ПМ, в результате чего оказываются заключенными в группы по 6 - 8 в симбиосоме. В отличие от исходных линий Sparkle и Sprint-2, бактероиды симбиотической зоны мутанта Sprint-2Fix- (sym31) не отличались заметно от бактерий в инфекционных нитях ни по форме и размеру, ни по плотности внутриклеточного содержимого.

У мутанта Е135f (sym13) происходит образование нормальных симбиосом (по одному бактероиду в симбиосоме). Несмотря на нормальные признаки дифференцировки бактероидов, дальнейшее развитие симбиоза заблокировано и клубеньки преждевременно стареют (Kneen et al., 1990), симбиосомы атакуются литической системой растения и инфекционная зона быстро деградирует.

У мутанта FN1 (мутация воздействует на клубенек на той же стадии, что и у мутанта Е135f) нитрогеназа детектируется в молодых клубеньках, а затем содержание ее падает параллельно с деградацией симбиотических структур клубенька.

Мутант RisFixV (sym42) (Novak et al., 1995; Tsyganov et al., 2001) формирует два типа клубеньков. Первый тип представляет собой азотфиксирующие розовые клубеньки и второй тип мелкие зеленоватые клубеньки. Последние подобны по структуре клубенькам родительской линии Finale, но характеризуются преждевременной деградацией симбиотических структур.

Наконец, морфология симбиосом двойного мутанта RBT (sym13, sym31) cходна с таковой у Sprint-2Fix- (sym31), а не E135f (sym13). В центральной зоне клубеньков этого мутанта бактероиды также находятся в симбиосомах в группах по 6 - 8. Он также обнаруживает лишь следы морфологической дифференцировки бактероидов. Морфология клубеньков двойных мутантов RBT1(sym13, sym40) и RBT3 (sym33, sym40) сходна с морфологией родительских мутантных линий SGEFix--1 и SGEFix--2 соответственно.

1.2. Легоглобин в клубеньках различных генетических линий гороха В ряде линий гороха, мутантных по симбиотическим генам, ранее исследовалось содержание Lb в клубеньках. Однако данные были достаточно противоречивыми. Поэтому одной из задач наших исследований было систематическое изучение по данному параметру генетических линий, мутантных по известным к настоящему времени симбиотическим генам. В клубеньках растений с одиночными мутациями в генах Sym13, Sym31 и Sym42 легоглобин не детектировался (Таблица 1.).

У двойного мутанта RBT (sym 13, sym 33) легоглобин детектировался, хотя и на крайне низком уровне (Таблица 1). Его концентрация оказалась на 3 порядка ниже, чем у дикого типа, однако наличие Lb в таких клубеньках достоверно подтверждалось характером спектра поглощения во всем оптическом диапазоне. Это свидетельствует о новообразовании фенотипа в результате комбинирования мутаций в генах Sym13 и Sym31 в одном генотипе. Ранее было показано, что мутации в гене Sym31 подавляют фенотипическое проявление мутаций в гене Sym13 в отношении дифференцировки симбиотических компартментов клубенька; отсюда был сделан вывод о том, что функция гена Sym31 необходима на более раннем этапе развития симбиоза, чем функция гена Sym (Borisov et al., 1997). Это заключение было подтверждено при анализе различных биохимических параметров клубеньков двойного мутанта (Tikhonovich et al., 1995; Borisov et al., 1996). Однако данные, полученные в настоящей работе, свидетельствуют о комплементарном действии изученных генов, что указывает на необходимость определять группу используемых признаков при анализе последовательности действия идентифицированных симбиотических генов. Таким образом, можно заключить, что последовательность действия генов Sym13 и Sym31 в отношении регуляции синтеза легоглобина пока остается неопределенной.

В другой серии опытов мы изучали влияние мутаций в генах Sym33 и Sym40 как на содержание Lb, так и на активность MLbR - фермента, поддерживающего Lb в физиологически активном состоянии. Из таблицы 2 видно, что содержание Lb в клубеньках мутантных растений было ниже, чем в эффективных клубеньках гороха исходной линии SGE. При этом, если клубеньки мутанта SGEFix--2 содержали в 5-6 раз меньше Lb, чем у исходной линии, то в клубеньках мутанта SGEFix--1 его содержание было меньше, чем у SGE, на два порядка. Было также показано, что во всех случаях Lb был в физиологически активном восстановленном состоянии. Более того, при выделении MLbR из различных линий, ее активность также была практически одинаковой.

Таблица 2. Содержание легоглобина и активность метлегоглобинредуктазы в клубеньках Результаты данного исследования подтвердили предположение, сделанное на основании анализа морфологии мутантов, о пониженном содержании или отсутствии Lb в клубеньках мутантов SGEFix--1 (sym40) и SGEFix--2 (sym33), так как у обоих из них активность нитрогеназы не детектировалась (Tsyganov et al., 1998) и оба мутантных гена должны начинать функционировать на стадиях, предшествующих стадии, контролируемой геном Sym31, при блокировании которой экспрессии Lb не наблюдается.

В то же время, по результатам предыдущей серии опытов у мутанта SGEFix--2 (мутантный ген Sym33), Lb не детектировался, в отличие от мутанта SGEFix--1 (мутантный ген Sym40), так как у первого мутанта развитие симбиоза заблокировано на более ранней стадии, принимая во внимание вышеизложенную классификацию. Однако результаты настоящих исследований показали обратное:

содержание Lb у мутанта SGEFix--1 (sym40) было ниже, чем у мутанта SGEFix--2 (sym33). Это может объясняться различиями как в использовании штамма микросимбионта, так и в условиях выращивания растений и методах выделения и очистки легоглобина. Этим же могут объясняться и различия в абсолютных значениях величин содержания Lb.

Из всех приведенных данных видно, что по влиянию мутаций в них на содержание Lb симбиотические гены можно разделить на несколько групп: 1) линии, постоянно содержащие Lb (Sym 40); 2) линии, Lb в которых не всегда детектируется или детектируется на разном уровне (Sym 33, Sym 13); и 3) линии, вообще не содержащие Lb (Sym 31). Противоречивые данные по некоторым мутантным линиям могут быть связаны как с наличием разных типов клубеньков (линии SGEFix- - (sym40) и SGEFix- - 2 (sym33)), так и с разным влиянием внешних факторов на такие клубеньки. Есть данные, что температура может по-разному влиять на морфогенез клубеньков разного типа у одной генетической линии.

Кроме того, проведенные исследования выявили факты, которые могут рассматриваться как противоречащие сложившимся представлениям о последовательности функционирования симбиотических генов гороха Sym13 и Sym31, так как было показано комплементарное действие этих генов в отношении регуляции синтеза Lb. Это подтверждает высказанное нами ранее (Топунов с соав., 2000) предположение, что классификация мутантов в соответствии с первой наблюдаемой морфологической аномалией может не совпадать с возможной классификацией, использующей уровень экспрессии легоглобина в качестве основного критерия.

2.1. Влияние нитрата на физиологические параметры различных генетических линий гороха.

Большую роль в физиологических исследованиях играет анализ растений, дефектных по симбиотическим признакам, то есть мутантов по симбиотическим генам. Нами были отобраны два симбиотических мутанта гороха - E135f (sym 13) и Sprint-2Fix- (sym 31), которые мы сравнивали с их исходными линиями (Sparkle и Sprint). Также в работе использовался двойной мутант RBT (sym 13, sym 31). Мутанты интересны тем, что развитие симбиоза у них заблокировано на разных этапах.

Отметим, что исследованные нами мутанты ранее не были охарактеризованы по устойчивости клубенькообразования к ингибирующему действию нитратов.

Данные по накоплению сырой, сухой массы, а также по числу клубеньков на растении гороха в зависимости от наличия или отсутствия нитрата в среде, представлены в таблице 3.

Влияние концентрации нитрата на сырую, сухую массу побегов и на число клубеньков симбиотических мутантов гороха (концентрация нитрата 5 мМ).

Помимо воздействия на синтез Lb, экзогенные нитраты отрицательно влияют на образование и развитие клубеньков. Как видно из таблицы 3, нитраты вызывали почти 50%-ное снижение числа клубеньков на корневой системе растений дикого типа - Sparkle и Sprint-2, что свидетельствует о том, что концентрация нитрата 5 мМ была достаточной для ингибирования этого процесса в норме. В то же время накопление биомассы растений увеличивалось, что свидетельствовало о переключении на усвоение нитратного азота. Аналогично вел себя мутант E135f (sym13). Что касается мутанта Sprint- Fix- (sym31) и двойного мутанта RBT (sym13, sym31), имеющих мутации по гену Sym31, то они в данных условиях показывали устойчивость к нитратам в отношении регуляции количества формируемых на корнях клубеньков.

Это говорит о том, что ген sym 31, в отличие от sym 13, контролирует не только процесс дифференцировки бактерий в бактероиды, но и нитрат-зависимую регуляцию количества образующихся клубеньков.

Поскольку показано, что двойной мутант RBT (sym 13, sym 31) так же реагирует на нитрат, как и Sprint-2Fix-, тем самым подтверждено, что мутации в гене sym 31 супрессируют фенотипическое проявление мутации в гене sym 13.

На основании фенотипических признаков (характер инфицирования, строение симбиосом и бактероидов, а также скорости старения) создатели линии RBT (см. Borisov et al., 1997) делают вывод о сходстве мутантов Sprint-2Fix- (sym 31) и RBT (sym 13, sym 31) и заключают, что ген Sym функционирует в процессе развития клубенька раньше, чем Sym 13.

Более того, из полученных результатов видно, что у всех линий, несущих мутантную аллель sym 31, нарушена регуляция клубенькообразования, зависимая от связанного азота. Следовательно, можно предположить, что двойной мутант RBT (sym 13, sym 31) похож на Sprint-2Fix- (sym 31) не только по ультраструктуре клубеньков, но и по системе авторегуляции. Ценность этого наблюдения возрастает, если учитывать возможность существования более чем одной системы авторегуляции (Novak et al., 1997).

Таким образом, ген Sym31, мутации в котором также приводят к фенотипу Fix-, был нами идентифицирован как единственный известный к настоящему моменту симбиотический ген гороха, одновременно контролирующий дифференцировку симбиотических компартментов и нитратзависимую регуляцию клубенькообразования.

2.2. Влияние нитратного стресса на легоглобин в клубеньках.

Нами были проведены опыты по влиянию высоких доз нитрата в субстрате (5 мМ) на количество легоглобина в клубеньках гороха посевного дикого типа и мутантных линий E135f (мутантный ген sym13) и Sprint-2Fix- (мутантный ген sym31). Отметим, что двойной мутант RBT (sym13, sym31) в наших опытах впервые был охарактеризован по содержанию легоглобина в клубеньках. Результаты экспериментов отражены в таблице 4.

Как видно из таблицы, добавление к питательному раствору 5 мМ нитрата калия приводило к значительному уменьшению концентрации Lb в клубеньках растений гороха обоих исходных генотипов, Sparkle и Sprint-2. Это подтверждает ранее полученные данные о наличии адаптивных механизмов, регулирующих содержание легоглобина в клубеньках в условиях нитратного стресса (Bisseling et al., 1978; Nelson, 1987).

Влияние нитрата на концентрацию легоглобина в клубеньках гороха.

фотосинтетической активности растения, а также при старении клубенька легоглобин бобовых растений претерпевает ряд изменений, связанных как с деградацией гема, так и с денатурацией и протеолизом глобиновой части молекулы, тем самым теряя свою функциональную активность (Becana, Klucas, 1992; Кретович, 1994, с. 60-83).

В наших опытах продуктов деградации Lb в клубеньках исследованных линий обнаружено не было. Доля физиологически неактивного окисленного Lb в клубеньках линий дикого типа находилась в пределах значений, обычно объясняемых его окислением при выделении (Becana, Klucas, 1992;). Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что концентрация Lb в условиях нитратного стресса регулируется именно через биосинтез, а не через деградацию.

Целью данного раздела работы была проверка гипотезы Kanayama c соавторами (Kanayama et al., 1990) о том, что нитрат в цитозоле клубенька способен, превращаясь в нитрит, образовывать нитрозокомплексы с легоглобином, лимитируя при этом нитрогеназу по кислороду.

Была проведена аэробная и анаэробная инкубация Lb с нитритом натрия в разных молярных соотношениях. Как в аэробных, так и анаэробных условиях было обнаружено окисляющее действие нитрита на Lb (рис. 1), причем скорость окисления выражалась тем сильнее, чем больше была концентрация нитрита. Спектрофотометрически не удалось выявить нитрозокомплексов, по крайней мере в течение 50 часов инкубации при +4 0С.

Анализ полученных результатов показывает, что проблема нитратного ингибирования должна решаться с использованием комплексного подхода. Реакция бобового растения на экзогенный нитрат происходит как на уровне отдельных молекул, так и целых органов и тканей. Разработка хорошо воспроизводимой методики для оценки действия экзогенных факторов имеет первостепенное значение при работе с азотфиксирующим симбиозом. Использование разработанной методики в дальнейшем позволит установить действие нитрата на экспрессию компонентов легоглобина и изоформ метлегоглобинредуктазы, а также на изменение активности метлегоглобинредуктазы в ходе становления симбиоза в стрессовых условиях.

2.4. Модификация метода очистки метлегоглобинредуктазы для проведения опытов с легоглобином Поскольку для проведения опытов с легоглобином in vitro использовался восстановленный Lb, было необходимо получить MLbR для его восстановления. Ранее в группе А.Ф. Топунова был разработан метод, позволяющий получать в гомогенном состоянии обе формы MLbR (Шлеев с соавт., 2001). Однако этот метод включал в качестве заключительной стадии изоэлектрическую фокусировку (а иногда и повторное ее проведение). Поскольку ИЭФ является достаточно жестким методом, нами была проведена модификация процедуры очистки MLbR. Метод включал стадию жидкостной хроматографии высокого давления, которая давала хорошие результаты разделения (рис 2). В результате очистки были получены две формы MLbR - димерная с мол. массой 120 кДа и мономерная с мол. массой 62 кДа., что подтвердило результаты предыдущих исследований. Гомогенные препараты мономерной MLbR с мол. массой 62 кДа. были нами использованы в экспериментах с легоглобином.

3.1. Влияние легоглобина на выживаемость клеток E. coli в условиях окислительного стресса.

Одним из стрессовых воздействий на симбиотическую азотфиксирующую систему бобового растения может являться также действие активных форм кислорода (АФК) и азота и вызванный ими окислительный стресс. Для изучения такого воздействия нами была использована модельная система, представляющая собой клеткии E. coli с перенесеным в них геном легоглобина люпина.

Известно, что бактериальные гемоглобинподобные белки могут участвовать в детоксикации АФК и азота (Couture et al, 1999). В связи с этим представляло интересс изучение функционирования Lb, экспрессированного в E. coli, в условиях окислительного стресса. Данная модель позволяла сравнить устойчивость к действию АФК клеток E. coli, различающихся по содержанию Lb.

Окислительный стресс инициировали такими редокс-медиаторами, как ФМС, менадион, бензилвиологен. Эти соединения способны осуществлять перенос электрона с компонентов дыхательной цепи на O2 с образованием супероксид-анион радикала (О2•-). Отметим, что в условиях обычного (без инициаторов окислительного стресса) роста E. coli выход биомассы у Lbсинтезирующей культуры был на 10-15% больше, чем в контрольной культуре. В присутствии ФМС Рис. 1 Окисление легоглобина нитритом в анаэробных условиях Рис. 2. Профиль элюции с колонки DEAE TSK Gel-2SW активных фракций MLbR (высокоэффективная жидкостная ионообменная хроматография) MLbR 1 - мономерная форма метлегоглобинредуктазы (62кДа) MLbR 2 - димерная форма метлегоглобинредуктазы (120кДа) рост бактериальной культуры интенсифицировался с увеличением концентрации этого редоксмедиатора (рис. 3). Индуцированная ФМС стимуляция роста Lb-синтезирующей культуры E. coli наблюдалась только в первые часы, в дальнейшем рост замедлялся (рис. 3). При использовании менадиона в концентрациях 10-20 мкг/мл наблюдалось незначительное (на 17-20%) ингибирование роста как в контрольной, так и в Lb-синтезирующей культурах (рис. 4, п. 3). В присутствии бензилвиологена происходило резкое подавление роста E. coli на 60 % в контроле и на 80 % в Lb синтезирующей культуре (рис. 4, п. 1).

Таким образом, как ФМС, так и бензилвиологен подавляют рост Lb-синтезирующих культур E. coli. В то же время ФМС может усиливать рост бактериальных культур, возможно в результате стимуляции окислительно-восстановительного метаболизма. Усиление токсического действия ФМС в стационарной фазе роста Lb-синтезирующей культуры может быть связано с образованием продуктов распада этого редокс-медиатора.

Для проверки действия активных форм азота на клетки E. coli к бактериальной культуре вместе с редокс-медиаторами добавляли GS-NO. В этих условиях, благодаря взаимодействию О2•- и окиси азота, генерируемой при распаде GS-NO, должен был образовываться пероксинитрит. Однако в наших экспериментах не наблюдалось усиления токсического действия на культуру E. coli при сочетании GS-NO с менадионом, ФМС или бензилвиологеном (рис. 4, п. 2,4,5). В связи с этим можно предположить существование в клетках E. coli собственной эффективной системы защиты от АФК и азота. И в последние годы было показано существование у бактерий ферментных систем, детоксицирующих активные формы азота (Liu et al., 2001; Bryk et al., 2002).

Отметим, что, по литературным данным, три основные активные формы кислорода (О2•-, H2O2, НО• ) могут генерироваться легоглобином (Puppo et al., 1981; Puppo, Halliwell, 1988). Следует отметить, что феррил-форма Lb сама является сильным окислителем и может участвовать в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ).

В связи с вышесказанным, мы полагаем, что данные, полученные нами при исследовании действия редокс-медиаторов на Lb-синтезирующие клетки E. coli, могут позволить понять роль Lb в условиях окислительного стресса in vivo, например, при старении и деградации клубеньков.

3.2. Участие легоглобина в перекисном окислении в опытах in vitro.

Хотя в описанных выше экспериментах показано прооксидантное действие Lb в бактериальных клетках, нельзя исключить, что этот гемопротеид может нейтрализовывать О2•-. При этом ферри-форма (Fe3+) Lb восстанавливается супероксидом по следующей схеме:

LbO2 + О2- + 2H+ Lb3+ + О2 + H2O Lb3+ + О2- LbO Рис. 3. Влияние различных концентрации ФМС на рост культур E. coli синтезирующих (2, 4) и несинтезирующих Lb (1, 3). Бактерии культивировались в течении 9 (1,2) и 24 часов (3,4). В культуры E. coli ФМС добавлялся через 4 часа роста Рис. 4. Влияние редокс-медиаторов и GSNO на рост культур E. coli.

1 -1 мМ бензилвиологена; 2 - 1 мМ бензилвиологена + 0,5 мМ GSNO;

3 - 0,3 мМ менадииона; 4 - 0,3 мМ менадииона + 0,5 мМ GSNO; 5 - 0,5 мМ GSNO. За 100% принята оптическая плотность культур E. coli после 18 часов роста Однако до сих пор участие в подобных реакциях было строго доказано только для цитохрома с. В некоторых работах была показана возможность восстановления различных гемопротеидов в присутствии ионов переходных металлов за счет генерации в растворе супероксид-иона (Lb (Becana, Klucas, 1992), Mb (Koizumi, Brown, 1972)). Известно, что в цитозоле клубеньков содержание переходных металлов, особенно ионов Fe, достаточно велико. Свободные ионы железа могут участвовать как в образовании О2•- и НО• радикалов и стимулировать ПОЛ, так и в метаболизме активных форм азота. Действительно, при взаимодействии GS-NO со свободными ионами Fe2+ образуется ДНКЖ (Lo Bello et al., 2001).

В тоже время можно предположить, что Lb способствует распаду GS-NO и последующему окислению NO до нитрита и нитрата, блокируя физиологически активное действие данного соединения. С другой стороны, нейтрализуя О2•-, легоглобин может предотвращать образование пероксинитрита.

В экспериментах с использованием спиновой ловушки ДЕПМПО показано, что в условиях генерации супероксида в системе ксантин-ксантиноксидаза, Lb существенно снижает концентрацию этого радикала (рис. 5, кривые 1,2.). Эти результаты подтверждают взаимодействие ферри-формы Lb с О2•- без образования других радикальных продуктов.

Весьма интересным фактом является также то, что Lb стимулирует образование ДНКЖ в условиях генерации О2•- в присутствии GS-NO и ферритина как источника ионов железа (рис. 5, кривые 3,4). Можно предположить, что этот эффект также связан с нейтрализацией О2•- и соответственно уменьшением образования ONOO-.

Представляется вероятным, что ДНКЖ могут взаимодействовать с белковой частью Lb, либо в их образовании участвует связанный с гемом NО. В любом случае Lb играет определенную роль в образовании физиологически важных метаболитов NO.

Известно, что NO участвует в регуляции многих процессов в организме животных. Причем основной формой его существования являются низкомолекулярные и связанные с белками нитрозильные комплексы железа и нитрозотиолы. В последние время появляются данные о важной роли NO и у растений, в том числе в регуляции апоптоза у бобовых (Lum et al., 2001). Первоначально внимание исследователей было привлечено к прооксидантному действию таких метаболитов NO, как пероксинитрит, NO2. и N2O3. Однако появляется все больше данных об антиоксидантном действии метаболитов NO. Так в последнее время было обнаружено, что GS-NO и 5-нитрозо-D,L-ацетилпенициламин предотвращают окисление полиненасыщенных жирных кислот (Chamulirat et al., 1998). Как было показано в работе (Kanner et al., 1980), нитрозильный комплекс Mb ингибировал миоглобин-индуцированное соокисление -каротина и полиненасыщенных жирных кислот, однако использованная авторами статьи система окисления не позволила им сделать определенных выводов о механизме такого антиоксидантного эффекта.

В связи с этим представляло несомненный интерес изучение взаимодействия комплексов NO (GS-NO и ДНКЖ) с Lb в условиях, моделирующих окислительный стресс. В нашей работе была использована система, позволяющая моделировать взаимодействие Lb с этими метаболитами NO и исследовать в этих условиях возможную модификацию прооксидантных свойств Lb. Прооксидантное действие оценивалось по окислительной деструкции -каротина, которая вызывалась различными свободными радикалами, генерируемыми с участием Lb. В условиях взаимодействия Lb с мицеллами гидроперекиси арахидоновой кислоты моделировалась стадия продолжения и разветвления цепей ПОЛ в биомембранах (рис. 7, кривые А, Б). Следует отметить, что это позволяло исследовать взаимодействие GS-NO и ДНКЖ непосредственно со свободнорадикальными продуктами распада липопероксидов (алкоксильные либо пероксильные радикалы).

Взаимодействие ДНКЖ и GS-NO только с алкоксильными радикалами исследовалось в системе содержащей пероксид трет-бутила и Lb (рис. 7, кривые В, Г). В этих условиях окисление -каротина обусловлено алкоксильными радикалами, возникающими в соответствии со следующими реакциями:

Lb-FeII + ROOR Lb-FeIII + RО.

Lb-FeIII + ROOR Lb-FeIV + RO.

Мы показали, что и GS-NO и ДНКЖ существенно подавляют инициированное свободными радикалами окисление -каротина, однако ДНКЖ был более эффективным ингибитором, чем GS-NO.

инициированного этим гемопротеином свободнорадикального окисления эритроцитарных мембран и липопротеинов низкой плотности (Dee et al., 1991). По аналогии с Mb можно предположить, что что в присутствии GS-NO и ДНКЖ происходит нитрозилирование легоглобина или взаимодействие NO c его гемом, причем модифицированный легоглобин не так эффективно катализирует образование алкоксильных и перекисных радикалов при декомпозиции липопероксидов, как немодиифиицированный.

Однако GS-NO и ДНКЖ в концентрациях, вызывающих 35-40% подавление окисления каротина (200 и 20 мкМ соответственно), практически не влияют на скорость зависимой от Lb декомпозиции 15-гидроперокси-арахидоната и пероксида трет-бутила. Следует также отметить, что инкубация Lb c нитрозоглутатионом до ввдения в реакционную среду пероксида трет-бутила или 15гидроперокси-арахидоната снижала антиоксидантное действие GS-NO. В то же время инкубация Lb c ДНКЖ существенно не влияла на степень ингибирования окислительной деструкции -каротина.

Таким образом, исходя из обнаруженных фактов, можно предположить, что большая эффективность антиоксидантного действия ДНКЖ в используемой системе связана с его высокой стабильностью.

С другой стороны, нельзя исключить возможность непосредственного взаимодействия GS-NО и ДНКЖ с липопероксидами, что может приводить к уменьшению скорости генерирования липидных радикалов в процессе их декомпозиции и, как следствие, к наблюдаемому в наших опытах снижению скорости окисления -каротина. Для проверки этого предположения в отдельной серии экспериментов в инкубационную смесь, содержащую -каротин и 15-гидроперокси-арахидонат, GSNО и ДНКЖ вносили за 12 мин до добавления Lb, катализирующего гомолиз липогидропероксидов.

Существенно, что в данной модельной системе липогидропероксиды не реагируют с -каротином в Рис. 5. Влияние легоглобина на образование супероксид-анион радикала (1,2) и динитрозильных комплексов железа с глутатионом (3, 4) Рис. 6. Влияние прединкубации с GSNO (A) и ДНКЖ (Б) на индуцированное легоглобином свободнорадикальное окисление -каротина:

1 - 100 мМ фосфатного буфера (рН 7,4) + 50 мкМ гидропероксида арахидоновой кислоты + 5 мкг/мл Lb;

2 - то же, что и 1, + 300 мкМ GSNO;

3 - то же, что и 2, но Lb был добавлен через 12 мин после GSNO;

4 - то же, что и 1, + 45 мкМ ДНКЖ;

5 - то же, что и 4, но Lb был добавлен через 12 мин после ДНКЖ.

Рис. 7. Ингибирование индуцированного легоглобином (Lb) свободнорадикального окисления каротина в зависимости от концентрации GS-NO (А,В) и ДНКЖ (Б,Г). Инкубационная среда содержала 100 мМ К-фосфатный буфер (рН 7,4), 7,5 мкМ -каротина, 50 мкМ 15гидропероксиарахидоната (А, Б) или 200 мкМ пероксида трет-бутила (В,Г) и 5 мкг/мл Lb для инициации окисления. Снижение концентрации -каротина через 20 мин после инициации окисления комплексов NO принято за 100%.

отсутствии компонентов, инициирующих их гомолиз (Гомбоева с соавт. 2001). Как видно из результатов экспериментов (рис. 6, кривая 5), введение ДНКЖ в реакционную смесь, содержащую только 15-гидроперокси-арахидонат, вызывало незначительную окислительную деструкцию каротина. При этом последующее добавление Lb практически не влияло на скорость окисления каротина в системе, в отличие от экспериментов с одновременным внесением липогидропероксидов и легоглобина (рис. 6, кривые 1, 2 и 4). Напротив, предварительная инкубация GS-NО с 15гидроперокси-арахидонатом приводила к снижению ингибирующего действия этого нитрозотиола на окислительную деструкцию -каротина, инициированную добавлением Lb (рис. 6, кривые 2, 3). Это могло быть связано с быстрым окислением NO до нитритов и нитратов при его перераспределении в гидрофобную фазу (Liu et al., 1998).

На основании полученных данных можно предположить, что NO, генерируемый GS-NO и ДНКЖ, действует в исследовавшейся системе в качестве классического антиоксиданта - ловушки липидных радикалов. В результате образовывался органический нитрозопероксикомплекс, схожий по структуре с пероксинитритом (Padmaja, Huie, 1993). Этот комплекс не участвовал в цепных реакциях перекисного окисления:

LOО. + NO. LOONO [LО. + NO2.] LONO При этом нитрозильные комплексы железа, в отличие от GS-NO, по-видимому, способны давать промежуточные соединения с гидропероксидами или радикалами липидов, распадающиеся в дальнейшем с образованием продуктов, не способных инициировать окисление -каротина.

Предложенный механизм позволяет объяснить большую по сравнению с GS-NO эффективность антиоксидантного действия ДНКЖ и усиление этого действия при предварительной инкубации нитрозильных комплексов железа с гидропероксидом арахидоновой кислоты.

Известно, что GS-NO и ДНКЖ являются ингибиторами глутатионпероксидазы и глутатион-Sтрансферазы – ферментов, участвующих в детоксикации как гидропероксидов липидов, так и пероксинитрита (Sies et al., 1997; Hoog 2000). Поэтому способность нитрозильных комплексов взаимодействовать с пероксинитритом и возникающими при участии гемопротеидов липидными радикалами может играть особую роль для поддержания антиоксидантного баланса. Действительно, из наших данных следует, что Lb может выполнять роль пероксидазы в условиях генерации NO и его метаболитов. Не исключено также, что Lb может принимать участие в образовании ДНКЖ в клубеньках в присутствии GS-NO и ионов Fe2+. Антиоксидантное действие Lb может быть обусловлено взаимодействием с супероксидом. Образование ДНКЖ в клубеньках возможно в присутствии нитрозоглютатиона и ионов свободного железа, накопление последних и инициация ими перекисного окисления в ПМ показано в работе Пуппо с соавторами (Puppo et al., 1991). В связи с этим необходимо отметить, что антиоксидантные свойства ДНКЖ могут быть связаны не только с их собственным действием, но и со связыванием ионов железа и стабилизацией NO в виде ионов нитрозония. Таким образом Lb может участвовать как в проксидантных процессах (перикисное окисление), так и при определенных условиях проявлять антиоксидантные свойства (а именно нейтрализация О2•-), а также участвовать в метаболизме NO.

Влияние стресса на кислородные условия в клубеньке и легоглобин Многими авторами было отмечено, что ответ клубенька на внешние воздействия практически одинаков независимо от характера воздействий. Нами была проанализирована ситуация в клубеньках при действии различных внешних факторов как на основании собственных экспериментальных, так и литературных данных. Оказалось, что исследуемая ситуация по многим параметрам чрезвычайно похожа на стандартную концепция стресса по Селье, причем изменения в клубеньке напоминают общий адаптационный синдром (ОАС) и по характеру этапов этого процесса.

В реакции клубенька на стрессовые воздействия можно отметить три этапа, которые мы можем сравнить с тремя стадиями ОАС.

1) Барьер резко понижает свою проницаемость, внутренняя концентрация кислорода падает, доля оксигенированного легоглобина (FOL) уменьшается, нитрогеназа лимитирована по кислороду.

Как правило, длится не очень долго. Соответствует реакции тревоги в ОАС.

2) Барьер начинает пропускать обычное количество кислорода, ситуация стабилизируется, FOL соответствует норме, нитрогеназа слегка лимитирована (как в обычных условиях), либо находится в оптимуме своей активности. Соответствует стадии резистентности.

3) Барьер перестает выполнять свою защитную функцию, количество проникающего кислорода увеличивается, возрастает и FOL. Параллельно понижается как общее количество Lb, так и доля его активной формы. Нитрогеназа ингибируется кислородом, может происходить и полное прекращение азотфиксации. Соответствует стадии истощения. Возможно и повторение реакции, характерной для первого этапа.

Внешние факторы могут влиять и на окислительно-восстановительный статус Lb, воздействуя на MLbR. Ранее в группе А.Ф. Топунова было показано (Сварадж с соавт., 1986), что при высушивании уменьшается MLbR активность, и увеличивается доля физиологически неактивного Lb.

Эта активность может понижаться и при действии некоторых веществ.

Знание характера внешних воздействий на клубенек и механизмов его ответа может иметь и практическое значение при выращивании бобовых растений в экстремальных условиях или в сложной экологической обстановке.

5. Четыре типа регуляции поступления кислорода в клубенек.

Мы также рассмотрели имеющиеся к настоящему времени модели регуляции поступления кислорода в клубенек и попытались представить их в более систематизированном виде. Критериями для классификации типов регуляции барьера являлись как реальное различие во времени протекания тех или иных механизмов его функционирования, так и некоторые другие факторы, например, время ингибирования нитрогеназы. Мы считаем, что для наиболее полного описания системы контроля поступления кислорода в клубенек следует говорить о четырех типах регуляции работы барьера, различающихся как по времени ответа на внешние воздействия, так и по механизму регуляции.

«Кратковременной» следует считать реакцию, действующую в течение нескольких минут (5мин., иногда до получаса), что сравнимо со временем обратимого ингибирования нитрогеназы. В течение этого времени действуют преимущественно физико-химические механизмы. При некоторых видах воздействий барьер не успевает среагировать и концентрация кислорода в инфицированной клетке может увеличиться до величины, приводящей к ингибированию нитрогеназы. Эта концентрация приходит в норму как раз через 5-10 мин., а через 30 мин. барьер начинает нормально выполнять свою защитную функцию (Hunt, Layzell, 1993).

«Средневременной» можно считать реакцию, проходящую, как правило, от нескольких часов до суток. Здесь уже начинают действовать физиологические и биохимические реакции, однако еще не происходит заметного включения биосинтетических механизмов.

«Долговременной» мы называем реакцию, длящуюся сутки и более, когда необходим уже дополнительный синтез веществ, которые будут участвовать в регуляции пропускания кислорода через барьер. Напомним, что для синтеза нитрогеназы de novo после ее необратимого ингибирования требуется 24 ч.

И, наконец, «особо долговременной» будет реакция, длящаяся несколько суток, а иногда и недель. В этом случае происходят уже изменения на уровне перестройки структуры клубеньков.

Разумеется, указанное время той или иной реакции является приблизительным. Оно зависит от многих факторов и может меняться в достаточно широких пределах.

осуществляющих регуляцию кислородного режима в клубеньке на разных уровнях организации: от внутриклеточного до тканевого. Многокомпонентность барьера дает возможность точной настройки кислородного режима в соответствии с интенсивностью метаболизма клеток и обеспечивать ответ растения в стрессовых условиях. Зоной, где задерживается подавляющая часть кислорода, остается внутренняя кора.

Во внешней зоне инфицированной клетки, примыкающей к межклеточным газовым пространствам, концентрация кислорода становится равной ~ 10 мкМ (Thumfort et al., 1994;

Bergersen, 1994). Дальнейшее понижение концентрации кислорода происходит уже в самой инфицированной клетке, и в центральной, бактероидной ее зоне она понижается до ~10 нМ. Здесь кислород связывается с Lb и поступает к бактероидам (точнее, к симбиосомам - образованиям, бактероиды, и окружающее их перибактероидное пространство и ПМ).

Благодаря согласованному протеканию всех упомянутых процессов в клубеньках поддерживаются кислородные условия, оптимальные для симбиотической фиксации азота. Как мы отмечали выше, во многих случаях одновременно могут действовать несколько механизмов. Одной из задач, стоящих перед исследователями, является оценка вклада того или иного механизма в разных условиях, в том числе и при разных видах воздействия на клубенек.

1. Идентифицирован первый известный симбиотический ген гороха (Sym31), одновременно контролирующий дифференцировку симбиотических компартментов и нитрат-зависимую регуляцию клубенькообразования.

2. Содержание Lb сильно различается в линиях дикого типа гороха посевного и линиях, мутантных по симбиотическим генам, отвечающим за различные стадии формирования клубенька.

Показано, что состояние Lb должно быть дополнительным параметром при анализе таких линий.

3. Легоглобин в клубеньках всех исследованных генетических линий гороха находится в физиологически активном состоянии. Активность метлегоглобинредуктазы у всех этих линий практически одинакова.

4. Показано, что окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода и азота, сильнее влияет на рост культуры E. coli, синтезирующей легоглобин, чем на рост исходного штамма.

5. Легоглобин является эффективным катализатором реакций свободно-радикального окисления липидов, в том числе природных антиоксидантов (-каротина).

6. Индуцированные легоглобином реакции свободно-радикального окисления модулируются NO-содержащими комплексами.

7. Показано, что для описания характера внешних воздействий и ответа клубенька на них может быть применена классическая концепция стресса и общего адаптационного синдрома.

8. Выделено четыре типа регуляции работы барьера газовой диффузии в клубеньке, различающихся по времени и механизмам действия.

Список основных работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Petrova N.E., Bashirova N.F., Talyzin V.V., Topunov A.F. Properties and role of lupin leghemoglobin components. // 2nd European Nitrogen Fixation Conference Abstracts. Poznan, Poland:

Scientific Publishers OWN. 1996. P. 221.

2. Topunov A.F., Petrova N.E. Influence of superoxide on leghemoglobin functioning in nitrogenfixing legume nodules. // NATO Advanced Study Institute Co-sponsored by FEBS. Free Radicals, Oxidative Stress and Antioxidants. Pathological and Physiological Significance, May 24 - June 4, 1997, Antalya, Turkey, P. 134.

3. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Регуляция кислородного режима в клубеньках бобовых и классическая концепция стресса. // Физиология растений. 1997. Т. 44. № 5. С. 671-675.

4. Петрова Н.Э., Розов Ф.Н., Шлеев С. В., Топунов А.Ф. Влияние ксенобиотиков на регуляцию кислородных условий в азотфиксирующих клубеньках бобовых растений. // XVI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Химия живого. Рефераты докладов и сообщений № 4. 25-29 мая 1998, Санкт-Петербург. 1998. С. 5. Топунов А.Ф., Розов Ф.Н., Петрова Н.Э. Как регулируется поступление кислорода в корневые клубеньки бобовых? Четыре типа регуляции. // Физиология растений. 1998. Т. 45. № 6. С.

935-941.

6. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э., Цыганов В.Е., Борисов А.Ю., Тихонович И.А. Влияние мутаций в симбиотических генах гороха Sym 33 и Sym 40 на содержание легоглобина и активность метлегоглобинредуктазы в клубеньках. // Физиология растений. 2000. Т. 47. № 1. С. 95-99.

7. Topunov A.F., Shleev S.V., Petrova N.E., Rozov F.N., Zhabaeva M.U. Reductases reducing plant hemoglobins and possible mechanism of their action. // Moscow University Chemistry Bulletin. 2000.

Special Issue. P. 9-11.

8. Розов Ф.Н., Шлеев С. В., Петрова Н.Э., Цыганов В.Е., Борисов А.Ю., Топунов А.Ф., Тихонович И.А. Ген гороха Sym31, контролирующий дифференцировку бактерий в бактероиды в клубеньках, участвует в нитрат-зависимой регуляции клубенькообразования. // Физиология растений.

2001. Т. 48. № 4. С. 536-541.

9. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э., Шлеев С. В., Розов Ф.Н., Жабаева М.У. Участие легоглобина в регуляции кислородных условий в клубеньках бобовых. // Физиология и биохимия культурных растений. 2001. Т. 33. № 4. С. 363-368.

10. Топунов А.Ф., Петрова Н.Э. Гемоглобины: эволюция, распространение и гетерогенность.

// Успехи биологической химии. Т. 41. 2001. С. 199-228.



 


Похожие работы:

«Вагун Илья Владимирович Продукционный процесс и фиторемедиационный потенциал сортов рапса на загрязненных тяжелыми металлами почвах Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре физиологии растений Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Кошкин...»

«КАШТАНОВА Наталья Николаевна ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ РЕГУЛЯТОРАМИ РОСТА НА УСТОЙЧИВОСТЬ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ К ГИПО- И ГИПЕРТЕРМИИ Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 Работа выполнена на кафедре ботаники и физиологии растений Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Мордовский государственный университет...»

«Воронкова Валерия Николаевна ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ ЛОШАДЕЙ САЯНО-АЛТАЙСКОГО РЕГИОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЯДЕРНЫХ И МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК МАРКЕРОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2012г. Работа выполнена в лаборатории сравнительной генетики животных Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, г. Москва Научный...»

«АШИБОКОВА ЛИАНА РАШИДОВНА ЭКОЛОГО-ЦЕНОТИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДГОРНЫХ СТЕПЕЙ КАРАЧАЕВО-ЧЕРКЕСИИ И ИХ ХОЗЯЙСТВЕННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена в ГНУ Ставропольский НИИСХ Россельхозакадемии Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Дзыбов Джантемир Сосренович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Акатов...»

«Бытотова Светлана Васильевна ЭНДЕМИКИ ФЛОРЫ РЕСПУБЛИКИ ХАКАСИЯ: СИСТЕМАТИКА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, БИОЛОГИЯ 03. 00. 05. – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Томский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Гуреева Ирина Ивановна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Тимошок Елена Евгеньевна лаборатория динамики и...»

«Феоктистов Александр Сергеевич Распределение лектинов в талломе листоватых лишайников в связи с особенностями их морфоструктурной организации Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Диссертационная работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова...»

«ЧЕРЕПКОВА Оксана Анатольевна ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ Специальность 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2006 Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин...»

«КЛЕВЦОВА Ирина Николаевна ЭКОЛОГИЯ И ФИЗИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ПОЧВ ОРЕНБУРГСКОГО ПРЕДУРАЛЬЯ 03.00.16 - Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Оренбург-2008 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Оренбургский государственный университет Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Русанов Александр Михайлович Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ГАЛУШКО МАКСИМ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА ТОЛЕРАНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К ТРОМБИНУ ПО КОАГУЛОАКТИВНОСТИ ТРОМБОЦИТОВ И УРОВНЮ МАРКЕРОВ НЕПРЕРЫВНОГО ВНУТРИСОСУДИСТОГО СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Тюмень – 2012 Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Тюменская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и...»

«Чирков Сергей Николаевич Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений 03.00.06 – Вирусология 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН. Научный консультант : доктор...»

«КУЗНЕЦОВА ЛЮБОВЬ ЛЕОНИДОВНА НАСЛЕДОВАНИЕ ПРИЗНАКА РОЗОВАЯ ОКРАСКА ВЕНЧИКА У КРУПНОПЛОДНОЙ ЗЕМЛЯНИКИ FRAGARIA ANANASSA DUCH. 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : кандидат биологических наук Батурин...»

«АРЛЯПОВ ВЯЧЕСЛАВ АЛЕКСЕЕВИЧ ПРИМЕНЕНИЕ НИЗКОСЕЛЕКТИВНЫХ БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОХИМИЧЕСКОГО ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА И АНАЛИЗА МНОГОКОМПОНЕНТНЫХ СМЕСЕЙ 03.00.23 – биотехнология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2009 Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. кандидат химических наук, доцент Научный руководитель : Алферов Валерий Анатольевич доктор...»

«ПЛОТНИКОВА ОЛЬГА МИХАЙЛОВНА ВЛИЯНИЕ МЕТИЛФОСФОНОВОЙ КИСЛОТЫ НА ОСНОВНЫЕ ЗВЕНЬЯ ГОМЕОСТАЗА БЕЛЫХ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Казань - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении Российский научный центр Восстановительная травматология и ортопедия имени академика Г.А. Илизарова (РНЦ ВТО) Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Научный...»

«Ребриков Денис Владимирович ПОЛИМОРФНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ АЛЛЕЛЬНОГО СТАТУСА В СЛОЖНЫХ СМЕСЯХ МОЛЕКУЛ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Специальности 03.00.15 – генетика 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН и ЗАО НПФ ДНК-Технология (г....»

«Лысак Людмила Вячеславовна Бактериальные сообщества городских почв Специальность 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Звягинцев Дмитрий Григорьевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук Карпачевский Лев Оскарович...»

«ШЕВЦОВ Александр Станиславович АНТРОПОГЕННАЯ ЭЛИМИНАЦИЯ НАЗЕМНЫХ ПОЗВОНОЧНЫХ ЦЕНТРАЛЬНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре ботаники, зоологии и общей биологии ФГАОУ ВПО Северо-Кавказский федеральный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, доцент Ильюх Михаил Павлович Официальные оппоненты : Бабенко...»

«ГАВРИЛО Мария Владиславовна БЕЛАЯ ЧАЙКА PAGOPHILA EBURNEA (PHIPPS, 1774) В РОССИЙСКОЙ АРКТИКЕ: особенности гнездования вида в современном оптимуме ареала 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2011 Работа выполнена в Государственном научном центре Российской Федерации Арктическом и Антарктическом научно-исследовательском институте Росгидромета (ГНЦ...»

«КОЗЛОВА Юлия Алексеевна ДИНАМИКА ЧИСЛЕННОСТИ КРОВОСОСУЩИХ ЧЛЕНИСТОНОГИХ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ МЕРОПРИЯТИЙ В АНТРОПОБИОЦЕНОЗАХ ПРЕДБАЙКАЛЬЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 2 Работа выполнена в ГОУ ВПО Иркутский государственный университет Федерального агентства по образованию (г. Иркутск) и ФГУЗ Иркутский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный...»

«Зотов Александр Александрович ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДОЛГОНОСИКОВ ПОДСЕМЕЙСТВА LIXINAE (COLEOPTERA, CURCULIONIDAE): ЭКОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в отделе аридной экологии ФГБУН Институт аридных зон Южного научного Центра РАН доктор биологических наук, Научный руководитель : Арзанов Юрий Генрихович Замотайлов Александр...»

«Горобцова Ольга Николаевна Экологическая оценка уровня загрязнения почв и растительности 3,4-бенз(а)пиреном в зоне влияния Новочеркасской ГРЭС 03.00. 27 – почвоведение 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2007 2 Работа выполнена на кафедре агроэкологии и физиологии растений Донского государственного аграрного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Назаренко Ольга...»







 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.