WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ИВАЩЕНКО ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА К F1 И V АНТИГЕНАМ YERSINIA

PESTIS ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ

03.02.03 – микробиология

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Оболенск – 2013 2

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич кандидат биологических наук Белова Елена Валентиновна

Официальные оппоненты:

Афанасьев Станислав Степанович, заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор, Федеральное бюджетное учреждение науки «Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им Г.Н. Габричевского» Роспотребнадзора, заместитель директора по биотехнологии Ерусланов Борис Васильевич, доктор медицинских наук, Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник отдела молекулярной микробиологии

Ведущая организация:

Федеральное казенное учреждение здравоохранения «Ставропольский научноисследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится 20 декабря 2013 г. в 15 ч на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при Федеральном бюджетном учреждении науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора по адресу: 142279, Московская обл., Серпуховский р-н, п. Оболенск, ФБУН ГНЦ ПМБ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан _ ноября 2013 г.





Учный секретарь диссертационного совета Фурсова Надежда Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности Возбудитель чумы (Yersinia pestis) - один из наиболее вирулентных для человека микроорганизмов и единственный представитель бактерий, относящийся к возбудителям первой группы патогенности (Weekly epidemiological record, 2010).

В настоящее время возбудитель чумы обнаружен более чем в 200 видах диких грызунов, обитающих в очагах чумы на всех континентах, кроме Австралии и Антарктиды (Cui et al., 2008). Люди подвергаются инфицированию, вступая в контакт с зараженным животным. Чума может передаваться человеку при употреблении в пищу мяса инфицированных животных или при обращении с мясом инфицированных животных (Eppinger et al., 2010).

Патогенез чумы начинается с прикрепления бактерий к поверхности клеток-хозяев. После адгезии возбудитель очень быстро размножается.

Бактерии в большом количестве вырабатывают факторы проницаемости, подавляющие фагоцитоз, такие как F1, V, рН6-Аг. Массивная антигенемия, выброс медиаторов воспаления, в том числе и шокогенных цитокинов, ведт к развитию микроциркуляторных нарушений, ДВС-синдрома с последующим исходом в инфекционно-токсический шок (Bartra et al., 2008).

В связи с вышесказанным, быстрая индикация возбудителя способствует оперативной организации и своевременному проведению противоэпидемических мероприятий, а при необходимости - выбору правильной стратегии лечения.

Лабораторная диагностика чумы построена на детекции возбудителя и его дифференциации от других представителей рода Yersinia. Для этого в основном используются микробиологические, серологические и биохимические методы исследования. Однако нередко возникают проблемы детекции возбудителя чумы и его дифференциации от близкородственного возбудителя Yersinia pseudotuberculosis (Лебедева и др., 2010; Попов и др., 2009).

В связи с этим возникает необходимость в разработке новых экспрессных методов диагностики, направленных на сокращение времени проведения анализа, его упрощение при одновременном увеличении наджности и лгкости интерпретации полученных результатов при высокой чувствительности и специфичности.

Видоспецифическим антигеном чумного микроба, на выявлении которого базируется диагностика чумы, является капсульный антиген F1. Однако хорошо известно, что в природе существуют штаммы Y. pestis не продуцирущие F антиген, но при этом сохраняющие вирулентность (Winter et al., 1960; Schofield et al., 2012). Данный признак указывает на то, что F1 антиген не всегда является идеальной мишенью для определения возбудителя. Другой антиген чумного микроба - V антиген (LcrV), представляющий собой полипептид с молекулярной массой 37 кДа, кодируемый геном lcrV в составе оперона lcrGVH, присутствующей у всех патогенных для человека иерсиний (Anisimov et. al., 2010). У возбудителя чумы и псевдотуберкулеза эта генетическая структура имеет высокую степень гомологии (Roggenkamp et al., 1997; Bergman et al., 1991), но при этом выявлены как небольшие видовые, так и внутривидовые различия в ее структурной организации и фенотипическом проявлении (Сухоносов И.Ю.





Автореф. дис. … канд. мед. наук, 2008). V антиген является высококонсервативным белком в эпидемически значимых штаммах Y. pestis (Светоч Т.Э. Автореф. дис. … канд. биол. наук, 2012) и может служить хорошей мишенью для индикации патогена.

Иммунологические методы широко применяют в лабораторной диагностике инфекционных болезней. Иммуноанализы на основе антител наиболее часто используемый тип диагностических тестов и остающийся одной из быстро развивающихся технологий при анализе биомолекул.

Одним из ведущих направлений в области совершенствования диагностических иммунотестов является введение в их состав моноклональных антител (МКА), обеспечивающих наиболее высокую чувствительность, специфичность и необходимый уровень стандартизации препаратов (Andreotti et al., 2003). Использование МКА в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МКА является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах (Абелев, 1998).

иммунодиагностических тест-систем для выявления возбудителя чумы на основе специфичных МКА.

Задачи исследования высокоспецифичные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. Изучить специфическую и перекрестную активность полученных МКА и оценить их диагностическую значимость в различных форматах иммуноанализа: непрямого ИФА, «сэндвич-ИФА», дот-блот анализа.

3. Разработать систему специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени при идентификации Y. pestis.

4. Сконструировать диагностические тест-системы в формате латексагглютинации, иммуноферментного анализа и хМАР-технологии.

Научная новизна Получена и охарактеризована панель МКА к V и F1 антигенам чумного микроба. Подобраны диагностически значимые пары антител и показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем чумы.

Впервые с помощью метода атомно-силовой микроскопии разработана система специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях при идентификации Y. pestis.

Впервые в России получены и охарактеризованы системы на основе МКА в формате латекс-агглютинации и xMAP технологии для идентификации F антигена Y. pestis и ИФА для обнаружения V антигена Y. pestis.

Теоретическая и практическая значимость работы 1. Получены и депонированы в Государственную коллекцию патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ – ОБОЛЕНСК») штаммы гибридных клеток - продуценты МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. На основе МКА сконструированы высокоспецифичные лабораторные образцы диагностических тест-систем в формате латекс-агглютинации и хМАРтехнологии.

3. Изготовлены экспериментальные образцы иммуноферментной и латексагглютинационной тест-систем. Тест-системы успешно прошли комиссионные испытания.

4. Получены 4 Патента на изобретение – № 2460787 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 10G4 – продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № 2460788 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 13F8 – продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis»; № «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2B8 – продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis»;

№ 2478703 «Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 – продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis».

Методология и методы исследования В работе использовались различные методы исследования:

микробиологические (культивирование штаммов микроорганизмов), гибридомная технология, методы иммунохимии (ИФА, латекс-агглютинация, иммуно-блот), микроскопические.

Положения, выносимые на защиту 1. Полученные МКА к V и F1 антигенам Y. pestis являются перспективными иммунореагентами и могут быть использованы в различных иммунологических тестах детекции возбудителя чумы.

2. Использование метода атомно-силовой микроскопии позволяет визуализировать специфическое взаимодействие антиген-антитело на молекулярном уровне при выявлении Y. pestis.

3. Латекс-агглютинационная тест-система способна выявлять F1 антиген Y.

pestis в чистых культурах чумного микроба в концентрации от 1105 м.к./мл до 2106 м.к./мл и выше и 4 нг/мл водорастворимого F1 антигена Y. pestis, что подтверждает диагностическую эффективность набора.

4. Разработанная тест-система иммуноферментная моноклональная для выявления V антигена Y. pestis характеризуется высокой чувствительностью детекции V антигена 2 нг/мл и не выявляет клетки гомологичных микроорганизмов в концентрации 108 м.к./мл и ниже.

5. Разработанная тест-система в формате хМАР технологии детектирует капсульный F1 антиген как в буферном растворе (до 6 пг/мл), так и в сыворотке крови (до 32 пг/мл), а также клетки возбудителя чумы в концентрации до 1102 м.к./мл.

Степень достоверности и апробация результатов Материалы диссертации изложены и представлены на научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов научноисследовательских учреждений Роспотребнадзора «Биологическая безопасность в современном мире» ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2010); III Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2011г) (3-место в конкурсе молодых ученых); III научно-практической школеконференции молодых ученых и специалистов НИО Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», ФБУН ГНЦ ПМБ, (Оболенск, 2011); IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2012г); 7-м Европейском конгрессе по тропической медицине и международному здравоохранению (Барселона, Испания, 2012г); V Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, (Москва, 2013г).

План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ГНЦ ПМБ 25 марта 2010 г., протокол №3, с изменениями, утвержденными Ученым советом от 11 сентября 2013 г., протокол №7.

Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ГНЦ ПМБ 4 июля 2013 г., протокол № 31.

Публикации Результатом научной работы являются 11 публикаций по теме диссертации, включающие одну статью, опубликованную в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК, четыре Патента РФ на изобретение:

№ 2460787 С1 РФ и № 2460788 С1 РФ от 28.07.2011; № 2478703 С1 РФ и № 2478704 С1 РФ от 20.12.2011) и 7 тезисов.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 217 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования с их обсуждением, заключение, выводы, список сокращений и список литературы, приложения Работа иллюстрирована 15 рисунками и 18 таблицами. Приложения состоят из одной статьи, опубликованной по теме диссертации, четырех Патентов и протокола технических испытаний.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Штаммы микроорганизмов В работе были использованы 32 штамма возбудителя чумы и 46 штаммов близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур («ГКПМ-Оболенск») ФБУН ГНЦ ПМБ, из коллекции музея живых культур ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора (г. Саратов).

Для повышения продукции капсульного антигена F1 культуры Y. pestis выращивали на агаре Хоттингера (рН 7,2) с добавлением 3 % дефибринированной крови при температуре 37 °С в течение 72 часов. Для секреции LcrV культуры Y. pestis и близкородственных иерсиний индуцировали в условиях низкой концентрации кальция ( 2 мM) на питательной среде для определения потребностей чумного микроба в ионах кальция (пр-во ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, регистрационное удостоверение ФСР 2011/11609), рН 7,2, содержащей MgCl2 в количестве 4 г/л, - аналоге среды Хигучи-Смита - в течение 48 ч при температуре 37 °C.

Получение гибридом Мышей линии BALB/c иммунизировали рекомбинантными антигенными препаратами V и F1, любезно предоставленными д.м.н. Дентовской С.В.

(ФБУН ГНЦ ПМБ). Иммунизацию проводили по следующей схеме: 0 день - мкг антигена в ФСБ, эмульгированного в ПАФ подкожно; 21 день - 50 мкг антигена в ФСБ, эмульгированного в НАФ подкожно; 51 день - 100 мкг антигена в ФСБ внутривенно; 58 день - 100 мкг антигена в ФСБ внутривенно.

Проверку титра специфичности антител у иммунизированных мышей проводили твердофазным ИФА по методу Егорова А.М. (Егоров и др., 1991).

Гибридизацию проводили по стандартной методике (Catty et al., 1991).

Первичный скрининг полученных гибридом, продуцирующих специфические антитела, проводили в ИФА. Мышей линии BALB/c обрабатывали пристаном («Sigma», США) и вводили интраперитонеально по 1010 гибридных клеток.

Выделение МКА из асцитной жидкости проводили на колонке Protein G Sepharose согласно рекомендации производителя («Pharmacia Biotech», Швеция). Чистоту препаратов антител оценивали в SDS-PAGE электорофорезе в 10% геле в денатурирующих условиях по методу Laemly (Laemly, 1970).

Количество белка оценивали спектрофотометрически при длине волны 278 нм (спектрофотометр SmartSpecPlus, «Bio-Rad», США).

Определение специфической и перекрестной активности МКА в отношении клеток Y. pestis, а также близкородственных и других видов микроорганизмов проводили методом дот-блот анализа.

Определение подклассовой принадлежности проводили с помощью набора для определения изотипов мышиных моноклональных антител («Envirologix», США).

Подбор пар МКА проводили в двухсайтовом дот-блот анализе.

Биотинилирование антител проводили по методу Duk M. (Duk, 1994) при помощи биотин-N-гидросукцинимидного эфира («Sigma», США).

Визуализацию взаимодействия антиген-антитело проводили на атомносиловом микроскопе Nanoscope IIIa (Digital Instruments, США) в режимах постоянного и прерывистого контакта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жсткостью 0,06, 0,32, 0,58 и 0,12 Н/м. Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканирования лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц.

Приготовление чумных иммунопероксидазных конъюгатов Коньюгаты получали методом перйодатного окисления по Nakane (Nakane & Kawaoi, 1974). Рабочий титр и чувствительность иммунопероксидазных конъюгатов определяли по методике M.Clark, A. Adams (Clark & Adams, 1977) в «сэндвич»-варианте ИФА, используя микропланшеты для иммунологических реакций.

Для конструирования латекс-агглютинационной тест-системы в качестве твердого носителя МКА использовали полиакролеиновые частицы марки А-63-22, синтезированные в Институте биоорганической химии им. акад.

М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Иммобилизацию МКА на латексных частицах осуществляли согласно инструкции производителя.

Реакцию латекс-агглютинации проводили в 96-луночных планшетах с Vобразным профилем лунок (Greiner Bio-one, Германия).

При разработке тест-системы в формате иммуноферментного анализа для выявления V антигена Yersinia pestis использовали полученную ранее пару МКА 5G6 и 2B8 к V антигену Y. pestis, проявивших наибольшую активность в отношении V антигена в дот-блот анализе. Чувствительность и специфичность тест-системы исследовали путем постановки ИФА с использованием штаммов чумного микроба и близкородственных микроорганизмов в восьмилуночных стрипованных планшетах с сорбированными на их поверхности МКА к V антигену Y. pestis.

Образующийся комплекс антитело-антиген выявлялся с помощью пероксидазного коньюгата на основе МКА 5G6 по появлению голубого окрашивания на этапе ферментативного превращения субстратного раствора.

При помощи микропланшетного спектрофотометра измеряли ОП каждой лунки планшета при длине волны 450 нм через 5 минут после добавления стопреагента. Положительным считали образец со значением ОП в 2 и более раз превышающим значение ОП отрицательного контроля.

При конструировании тест-системы в формате хМАР-технологии в качестве твердого носителя МКА использовали флуоресцентно окрашенные полистироловые микросферы №50, содержащие на своей поверхности карбоксильные группы (Bio-Rad, США). В качестве связывающих антител использовались МКА 13F8 к F1 антигену Y. pestis. В качестве детектирующих биотинилированные МКА 10G4.

Иммобилизацию МКА осуществляли с помощью кита «Bio-Plex Amine coupling Kit» согласно прилагаемой инструкции. Анализ проводили в 96-ти луночных планшетах с фильтрующим дном. Предел обнаружения тест-системы оценивали, используя в качестве исследуемых образцов суспензию инактивированных микробных клеток Y. pestis и препарат рекомбинантного F антигена Y. pestis в заданных концентрациях в двух модельных системах (в ФСБ и в сыворотке крови мышей). Учет результатов производили с помощью системы Био-Плекс 200 (Bio-Rad, США).

Получение и отбор перспективных МКА Наиболее важным этапом работы являлся отбор гибридных клеток с перспективой дальнейшего использования полученных МКА в качестве компонентов иммунодиагностических тест-систем.

В результате гибридизации с использованием миеломной клеточной линии Х63-Ag8.653 и спленоцитов мышей было получено около 250 гибридов к F антигену Y. pestis и около 200 гибридов к V антигену Y. pestis.

По результатам первичного скрининга для дальнейшей работы были отобраны 6 наиболее продуктивных, генетически стабильных гибридом F8, 11G11, 9E8, 11F5, 10G4 и 9С6 к F1 антигену Y. pestis и 3 гибридомы Е8, 2В8 и 5G6, продуцирующие МКА к V антигену Y. pestis.

С целью отбора клонов гибридом, перспективных в качестве источников МКА для разработки иммунодиагностических тест-систем, была проведена проверка специфической активности МКА методом дот-блота с использованием штаммов возбудителя чумного микроба и близкородственных микроорганизмов.

Исследование специфической активности МКА к F1 антигену Y. pestis видоспеспецифичными свойствами и давали положительную реакцию только с культурами Y. pestis, связывая капсульный F1 антиген, секретируемый только штаммами чумного микроба, и не вступали в реакцию с другими антигенами тестируемых микроорганизмов. Но наиболее активными оказались МКА гибридом 13F8 и 10G4, которые выявляли все 17 использованных в анализе штаммов Y. pestis в концентрации 107 - 106 м.к./мл (табл. 1).

Таблица 1 - Исследование специфической и перекрестной активности МКА к F1 антигену Y. pestis методом дот-блот анализа Штаммы микроорганизмов минимальная выявляемая концентрация Y. pestis И- Y. pestis Y. pestis Y. pestis 262- Y. pestis Y. pestis И- Y. pestis И- Y. pestis И- Y. pseudotuberculosis S. oranienburg S. typhimurium Примечание: (–) – отсутствие реакции Таким образом, реакционная способность и активность МКА 13F8 и 10G позволяет считать их потенциально пригодными для использования в качестве средства контроля за F1 антигеном чумного микроба.

Поскольку получение высокоспецифических МКА к липополисахариду Y. pestis – чрезвычайно сложная задача ввиду его низкой иммуногенности (Priop Titball, 2002), то в наших исследованиях в качестве дополнительной мишени при получении МКА мы использовали V антиген.

Как уже было отмечено выше, все три вида патогенных для человека иерсиний (Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, и Y. enterocolitica) содержат 70 kb плазмиду вирулентности (pYV) с гомологичной нуклеотидной последовательностью от 55 до 90 % (Roggenkamp et al., 1997; Portnoy & Martinez, 1985). Поэтому дифференциация двух близкородственных и высокогомологичных видов рода иерсиний - чумного микроба (I группа патогенности) и значительно менее опасного возбудителя псевдотуберкулеза (III группа патогенности) важна при мониторинге природных очагов чумы.

В связи с этим для подтверждения диагностической ценности МКА к V антигену тестировали на расширенной панели штаммов близкородственных микроорганизмов, подготовленных сотрудниками лаборатории микробиологии чумы ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора.

взаимодействовали с 24 индуцированными штаммами Y. pestis в концентрациях 106 и 107 м.к./мл, что указывает на их достаточную активность по отношению к искомому возбудителю. Положительный сигнал с бесплазмидной культурой Y. pestis И-2377 (LcrV) в дот-ИФА не регистрировался.

По результатам дот-блот анализа МКА 5G6 и 2В8 не взаимодействовали с клетками гомологичных микроорганизмов в концентрации 108 – 106 м.к./мл (табл. 2), а при увеличении концентрации микробных взвесей близкородственных микроорганизмов до 109 м.к./мл и выше наблюдался слабый положительный сигнал. Из полученных результатов можно предположить, что уровень выработки V антигена гомологичными микроорганизмами во много раз ниже, чем у возбудителя чумы.

Определение подклассовой принадлежности показало, что все полученные в ходе работ гибридомы продуцируют иммуноглобулины подклассов G.

Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивали в SDS-PAGEэлектрофорезе в денатурирующих условиях. Молекулярные массы тяжелых цепей МКА 2B8 и 10G4 составляют 53 кДа, МКА 13F8 и 5G6 - 52 кДа.

Молекулярные массы легких цепей МКА 2B8 и 10G4 составляют 26 кДа, МКА 13F8 и 5G6 - 23 кДа (рис. 1).

Таблица 2 – Исследование специфической и перекрестной активности МКА к V антигену Y. pestis Примечание: (–) – отсутствие реакции Рисунок 1 – Характеристика моноклональных антител.

А – Определение молекулярной массы легких и тяжелых цепей, (М – маркер молекулярного веса); В – Определение подклассов МКА с помощью иммунохроматографических стрипов Основной задачей при разработке тест-систем являлось получение и селекция специфичных пар антител, пригодных для применения в том или ином формате иммуноанализа. Подбор диагностически значимых пар МКА осуществляли методом двусайтового дот-блот анализа. В результате было установлено, что пары МКА гибридных клонов 2B8, 5G6 и 10G4, 13F являются оптимальными при совместном использовании и могут быть использованы в качестве компонентов для создания тест-систем.

Для визуализации специфического взаимодействия антиген-антитело использовали метод атомно-силовой микроскопии (АСМ), основанный на принципе механического сканирования образцов без применения предварительного напыления металлов и облучения фотонами и электронами.

Для специфической визуализации взаимодействия антиген-антитело МКА 10G4 к F1 антигену Y. pestis были иммобилизованы непосредственно на твердой подложке через связывание антител белком G. Белок G специфически узнает и связывает Fc-фрагменты антител.

Для исследования использовали клетки Y. pestis штамма И-2422 с концентрациями 109 м.к./мл, 107 м.к./мл и 105 м.к./мл.

На рисунке 2 представлены АСМ изображение клеток Y. pestis после их предварительной инактивации и профиль клетки.

Причем единичные клетки визуализировались вплоть до концентрации исходного препарата 105 м.к./мл.

Рисунок 2 - АСМ изображение клеток Y. pestis и их размеры (профиль).

А - Активированная в тлеющем разряде слюда (0,2 мА, 1 мин.) - белок G ( мкл 0.1 г/л, 10 мин, затем промывка в 100 мкл воды) – МКА 10G4 к F1 антигену Y. pestis (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин) – клетки Y. pestis 109 м.к./мл (затем промывка погружением в трис-HCl буфер, высушивание и промывка каплей воды); В – График расчета физического размера объектов взаимодействия Для изучения специфического связывания фрагментов бактерий с аффинной поверхностью нами была предложена следующая структура этой поверхности: активированная слюда – белок G – антитело 10G4.

Активированная в тлеющем разряде слюда улучшает адсорбцию на нее белка G, который в свою очередь увеличивает степень адгезии на него антител (в силу их специфического взаимодействия). На рисунке 3 показана специфическая визуализация F1 антигена Y. pestis.

Рисунок 3 – Специфическая визуализация F1 антигена Y. pestis.

А – Активированная в тлеющем разряде слюда (0,2 мА, 1 мин.) – белок G (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин, затем промывка в 100 мкл воды) - МКА 10G4 к F антигену Y. pestis (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин) – F1 антиген (белок) (10 мкл 0.05 г/л, 10 мин) (затем промывка погружением в трис-HCl буфер, высушивание и промывка каплей воды); В – График расчета физического размера объектов взаимодействия Нам также удалось показать наличие специфического связывание антигена с антителами в системе, где сначала на подложке фиксировали антиген, а затем добавляли антитело (рис. 4).

Рисунок 4 – Специфическая АСМ визуализация взаимодействия антиген - антитело.

Активированная в тлеющем разряде слюда (0,2 мА, 1 мин.) - антиген (белок) (10 мкл 0.1 г/л, 10 мин, затем промывка в 100 мкл воды) – МКА 10G4 к F1 антигену Y. pestis (10 мкл 0.01 г/л, 10 мин, затем промывка в капле воды) Белые точки на рисунке 4 – это антитела, специфически связавшиеся с подложкой из антигена. Их размер составляет около 10 нм, что соответствует их истинной величине.

Таким образом, в ходе проведенных работ было показано, что полученные МКА к F1 и V антигенам Y. pestis обладают характеристиками, позволяющими использовать их с высокой эффективностью в качестве компонентов современных иммунодиагностических тест-систем для выявления микробных клеток данного возбудителя.

Конструирование диагностических тест-систем Разработка новых универсальных, высокоэффективных и чувствительных способов ранней диагностики чумной инфекции является актуальной проблемой здравоохранения.

Таким образом, важность представленной диссертационной работы обусловлена необходимостью повышения достоверности, чувствительности и скорости выявления возбудителя. В данной работе внимание было сосредоточено на разработке тест-систем на основе МКА в формате латексагглютинации, иммуноферментного анализа и хМАР технологии.

Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для выявления капсульного F1 антигена Yersinia pestis По результатам дот-блот анализа для конструирования латексной тестсистемы были выбраны МКА 10G4, которые специфически взаимодействовали с F1 антигеном Y. рestis и не давали перекрестных реакций с другими микроорганизмами. Оптимальная нагрузка МКА 10G4 на латексных частицах составила 20 мкг на 50 мкл исходной латексной суспензии. Полученный диагностикум апробировали в реакции латекс-агглютинации (РЛА), использовав обеззараженные взвеси микроорганизмов. В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный F1 антиген и клетки штамма Y. рestis ЕV линии НИИЭГ, выращенные при температуре 37 °С. Таким образом, были выявлены чувствительность и специфичность латексного диагностикума. В результате проведенной РЛА установлено, что латексные частицы с иммобилизованными МКА 10G4 выявляют F1 антиген в концентрации 0,004 мкг/мл. Активность диагностикума с типичными штаммами возбудителя чумы, выращенными при 37 °С, составила 7, м.к./мл. Полученный латексный препарат не выявлял культуры близкородственных и гетерологичных микроорганизмов в концентрации м.к./мл и ниже (рис. 5).

Рисунок 5 – Определение чувствительности и специфичности полученного диагностикума в реакции латекс-агглютинации.

1 – капсульный F1 антиген Y. pestis, 2 - Y. enterocolitica 287, 3 - Y. рestis ЕV НИИЭГ (37°С), 4 - Y. pseudotuberculosis III, 5 - E. coli АТСС 25922, 6 - S.

enteritidis Grtneri 30, 7 – S. paratyphi «B» 61951, 8 - Sh. flexneri 8516, 9 – Sh.

dysenteriae Для увеличения срока хранения полученного диагностикума латексная суспензия с иммобилизованными МКА 10G4 была лиофильно высушена.

Установлено, что по чувствительности и специфичности лиофильно высушенный латексный препарат не уступает исходной жидкой латексной суспензии с иммобилизованными МКА 10G4, и может быть использован в качестве компонента набора реагентов для определения F1 антигена Yersinia pestis в реакции латекс-агглютинации.

На основании выполненной работы был разработан и утвержден комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388-136-78095326-2011) на диагностикум «Набор реагентов для определения капсульного F1 антигена Yersinia pestis в реакции латекс агглютинации».

сконструированного латексного диагностикума были проведены на базе ФКУЗ Иркутского и Ставропольского научно-исследовательских противочумных институтов Роспотребнадзора. Чувствительность и специфичность латексного чумного диагностикума определяли в РЛА, используя 11 штаммов Y. pestis, штаммов близкородственных микроорганизмов рода Yersinia и 2 штамма микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae. В качестве положительного контроля использовали препарат капсульного F1 антигена Y. pestis, входящий в комплект латексного чумного диагностикума. Результаты исследования чувствительности и специфичности полученного чумного латексного диагностикума представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Результаты определения чувствительности и специфичности латексного чумного диагностикума в реакции латексагглютинации Y. pestis И- 18 S. typhimuirium В результате проведенного анализа установлено, что лиофильно высушенная латексная суспензия с адсорбированными МКА выявляет исследованные штаммы возбудителя чумы в концентрациях от 10 5 м.к./мл до 2106 м.к./мл и выше и не имеет перекрестной активности с близкородственными и гетерологичными микроорганизмами. Предел обнаружения капсульного F1 антигена составил 0,004 мкг/мл (4 нг/мл).

Конструирование тест-системы в формате хМАР технологии С целью обнаружения антигена чумного микроба, представленного в сыворотке крови в более низких концентрациях, чем это возможно определить другими иммунологическими методами, нами был проведен анализ с применением технологии xMAP. Разрабатываемая тест-система на основе хМАР технологии является разновидностью «сэндвич»-варианта ИФА метода, в котором связывающие антитела иммобилизованы на твердом носителе – полистирольных гранулах (микросферах) диаметром 5,6 мкм. При разработке тест-системы использовали карбоксилированные микросферы, имеющие спектральный адрес 50. Оптимальная нагрузка МКА 13F8 к F1 антигену Y. pestis на полистироловых микросферах составила 50 мкг. Эффективность иммобилизации МКА на микросферах проверяли с помощью антивидовых (антимышиных) антител, меченых фикоэритрином (Sigma, США) по сигналу флуоресценции.

В качестве тестируемого материала использовали сыворотку крови мыши с экспериментально внесенным F1 антигеном Y. pestis. В качестве отрицательного контроля использовали сыворотку без добавления F1 антигена.

Параллельно проводили анализ с использованием в качестве образцов растворы рекомбинантного F1 антигена Y. pestis в ФСБ для сравнения чувствительности тест-системы в буферном растворе и биологическом материале.

Учет результатов проводили с помощью проточного флуориметра БиоПлекс 200. Результаты анализа представлены в таблице 4.

Таблица 4 – Результаты определения F1 антигена Y. pestis в буферном растворе и в биологическом материале Концентрация F антигена (на мл) Условия проведения иммунофлуоресцентного анализа позволили достичь предела обнаружения F1 антигена возбудителя чумы при использовании в качестве исследуемых образцов биологического материала (сыворотки крови животных) 32 пг/мл. Чувствительность данной тест-системы в отношении F антигена в буферном растворе составила 6,4 пг/мл.

Значения сигналов флуоресценции, соответствующих данной концентрации F1 антигена, не менее чем на 5 ед. инт. превышают значение отрицательного контроля.

Эти показатели значительно ниже уровня, требуемого в клинических испытаниях, в которых концентрация F1 антигена в положительном образце сыворотки часто достигала нескольких микрограммов на миллилитр [Cao et al., 1995].

Для определения чувствительности тест-системы в отношении микробных клеток Y. pestis, использовали в качестве исследуемого материала суспензию инактивированных клеток штамма Y. pestis И-1988, получая суспензии с концентрацией 1107, 1106, 1105, 1104, 1103, 1102, (м.к./мл), (табл. 5).

Таблица 5 – Результаты определение предела обнаружения тестсистемы в отношении суспензии инактивированных микробных клеток Y. pestis Концентрация Y. pestis, (м.к./мл) Значение MFI В результате анализа установлено, что предел обнаружения клеток возбудителя чумы методом иммунофлуоресцентного анализа достоверно составляет 1102 м.к./мл. Значения сигналов флуоресценции, соответствующих данной концентрации микробных клеток Y. pestis не менее чем на 5 ед. инт.

превышают значение отрицательного контроля.

Для изучения перекрестной активности тест-системы использовались рекомбинантные поверхностные антигены возбудителей особо опасных инфекций, полученные в ходе предыдущих работ, а также инактивированные культуры штаммов гомологичных и гетерологичных микроорганизмов (табл.6).

Таблица 6 – Результаты определения перекрестной активности тестсистемы с поверхностными антигенами возбудителей особо опасных инфекций, близкородственными непатогенными бациллами и гетерологичными микроорганизмами В результате анализа установлено, что тест-система не обладает перекрестной активностью в отношении поверхностных антигенов возбудителей особо опасных инфекций, близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, так как сигнал флуоресценции, ассоциированный с капсульным F1 антигеном не превышает более чем на 5 ед. инт. значение отрицательного контроля (К- равен 14).

По данным зарубежных исследователей средний уровень F1 антигена в крови пациентов, переболевших бубонной формой чумы, составлял 275 нг/мл, а количество клеток Y. pestis во время бактериемии достигало уровня от до 108 м.к./мл (Tomaso et al., 2007). Полученные в данном исследовании показатели чувствительности xMAP тест-системы дают исследователю возможность ее использования для ранней диагностики чумной инфекции.

Разработка тест-системы иммуноферментной моноклональной для выявления V антигена Yersinia pestis иммуноферментной тест-системы был разработан и утвержден комплект нормативной документации, включающий в себя инструкцию по применению и технические условия (ТУ 9388-171-78095326-2012, ОКП 938890).

Были проведены межлабораторные медицинские испытания тест-системы иммуноферментной моноклональной для определения V антигена Y. pestis на базе ФКУЗ Иркутского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора в сооответствии с разработанной программой и инструкцией по применению тест-системы иммуноферментной для выявления V антигена Yersinia pestis и проектом ТУ 9388-171-78095326-2012.

Чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы определяли с использованием 9 штаммов Y. pestis, 7 штаммов близкородственных микроорганизмов рода Yersinia и 4 штаммов микроорганизмов, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae (табл. 7). В качестве положительного контроля использовали рекомбинантный препарат V антигена Y. pestis.

Таблица 7 – Определение чувствительности и специфичности тестсистемы иммуноферментной для определения V антигена Y. pestis № Наименование концентрация микроорганизмов 10 Y. pseudotuberculosis Y. pseudotuberculosis И- 12 Y. pseudotuberculosis Y. pseudotuberculosis И- 16 Y. enterocolitica В результате проведенной работы было установлено, что тест-система иммуноферментная для определения V антигена Y. pestis чувствительна и выявляет V антиген в концентрации до 2 нг/мл, а также микробные клетки девяти опытных культур Y. pestis в концентрации от 2106 м.к./мл до 1,25108 м.к./мл. Тест-система не выявляет клетки близкородственных микроорганизмов в концентрации 108 м.к./мл и ниже, и не обладает перекрестным взаимодействием с гетерологичными микроорганизмами.

Известно, что подавление провоспалительного ответа критично для патогенеза инфекции, вызванной Y. pestis. Для прогрессирования инфекции и супрессии TNF- – ключевого фактора в патогенезе чумы, концентрация V антигена в биологических жидкостях должна достигать 50 нг/мл (Gomes-Solecki et al., 2005).

Проведенные исследования позволили составить диагностические наборы реагентов лабораторного образца тест-системы иммуноферментной моноклональной для определения V антигена Yersinia pestis.

Разработанная тест-система может быть использована для выявления клеток возбудителя чумы в дополнение к другим диагностическим методам.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, в рамках настоящей работы были получены МКА к F антигену чумного микроба, специфичные в отношении клеток Y. pestis.

Учитывая факт, что у трех видов патогенных иерсиний наблюдается большая степень родства между отдельными детерминантами патогенности ( 90 %) (Ценева и др., 2002), то в данном случае, говоря об отсутствии у МКА к V антигену Y. pestis перекрестных реакций с гомологичными микроорганизмами в концентрации 108 м.к./мл и ниже, можно предположить, что речь идет о меньшей удельной продукции белка LcrV клетками Y.

pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

На основе полученных результатов с целью выявления возбудителя чумы разработаны и испытаны с использованием МКА латекс-агглютинациионная, иммуноферментная тест-системы, а также тест-система нового поколения – в формате хМАР технологии, позволяющая обнаруживать антиген чумного микроба, как в чистых культурах, так и в биологических пробах.

Полученные диагностические препараты могут применяться в лабораторной и клинической практике для осуществления эффективного эпиднадзора и предупреждения заболеваемости людей чумой.

ВЫВОДЫ

1. Получены и депонированы в государственную коллекцию ФБУН ГНЦ ПМБ штаммы гибридных клеток-продуценты МКА к V и F1 антигенам Y. pestis.

2. Получены и охарактеризованы МКА к возбудителю чумного микроба, характерные отсутствием перекрестных реакций с близкородственными микроорганизмами. Определены подклассы и подобраны диагностически значимые пары антител, показана специфичность взаимодействия антител с возбудителем чумы.

3. Методом АСМ показаны взаимодействия инактивированных клеток Y. pestis и рекомбинантного F1 антигена с моноклональными антителами 10G на молекулярном уровне в реальном времени и при физиологических условиях.

4. На основе отобранных МКА сконструированы диагностические тестсистемы в формате иммуноферментного анализа, латекс-агглютинации и хМАР технологии. Проведены исследования их чувствительности и специфической активности. Иммуноферментная и латекс-агглютинационная тест-системы успешно прошли комиссионные испытания и могут быть использованы для выявления клеток возбудителя чумы в качестве альтернативы или в дополнение к другим диагностическим методам.

5. Наибольшей чувствительностью определения чумного микроба обладает тест-система в формате хМАР технологии, детектирующая капсульный F1 антиген Y. pestis как в чистых культурах (до 32 пг/мл), так и в биологических жидкостях (до 6 пг/мл), а также клетки возбудителя чумы в концентрации 102 м.к./мл и выше. Данный факт является основанием для рассмотрения вопроса о внедрении тест-системы в практику здравоохранения и использования в научных исследованиях.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

а) статьи в журналах, рекомендованных ВАК 1. Иващенко, Т.А. Разработка латекс-агглютинационной тест-системы для выявления капсульного антигена F1 Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, Е.В.

Белова, С.В. Дентовская, С.А. Белькова, С.В. Балахонов, И.Г. Шемякин // Биотехнология. – 2012. – №6. – С. 76-85.

2. Пат. 2460787 Российская Федерация, МПК С12N 5/16, С07K 16/28, С12P 21/08, А61К 39/00. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 10G4 – продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А., Игнашина Е.Н., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. – № 2011131563/10; заявл. 28.07.11; опубл.

10.09.12, Бюл. № 25. – 14 с.

3. Пат. 2460788 Российская Федерация, МПК С12N 5/18, С12P 21/08, С07K 16/21, G01N 33/569. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 13F8 – продуцент моноклональных антител, специфичных к капсульному F1 антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А., Игнашина Е.Н., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. – № 2011131566/10; заявл. 28.07.11; опубл.

10.09.12, Бюл. №25. – 15 с.

4. Пат. 2478704 Российская Федерация, МПК С12N 5/16, С12P 21/08, С07K 16/28. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 2B8 – продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А., Куценко А.К., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. – № 2011151804/10; заявл. 20.12.11; опубл. 10.04.13, Бюл.

№10. – 15 с.

5. Пат. 2478703 Российская Федерация, МПК С12N 5/16, С12P 21/08, С07K 16/28. Штамм гибридных клеток животных Mus musculus 5G6 – продуцент моноклональных антител, специфичных к V антигену Yersinia pestis / Белова Е.В., Иващенко Т.А., Куценко А.К., Дятлов И.А., Шемякин И.Г.; заявитель и патентообладатель Федеральное бюджетное учреждение науки Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии. – № 2011151803/10; заявл. 20.12.11; опубл. 10.04.13, Бюл.

№10. – 15 с.

в) тезисы научных конференций 6. Иващенко Т.А. Получение моноклональных антител для обнаружения капсульного F1 антигена Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, С.В. Дентовская, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы научно-практической школы– конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора (25–27 мая 2010 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. – Протвино: А–ПРИНТ ЗАО, 2010. С. 322-323.

7. Иващенко Т.А. Получение моноклональных антител к V- и F антигенам Yersinia pestis и перспектива их применения в качестве компонентов диагностических тест-систем / Т.А. Иващенко, С.В.

Дентовская, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Инфекционные болезни:

Материалы III Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (28-30 марта 2011 г., Москва) / Под ред. В.И. Покровского.

2011.– С. 147.

8. Иващенко Т.А. Выявление капсульного F1 антигена Yersinia pestis методом иммуноферментного анализа / Т.А. Иващенко, С.В. Дентовская, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Современные технологии обеспечения биологической безопасности: Материалы III научно–практической школы– конференции молодых ученых и специалистов научно–исследовательских организаций Роспотребнадзора (31 мая –2 июня 2011 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. – Протвино: А– Принт ЗАО, 2011.- С. 187-188.

9. Иващенко Т.А. Конструирование латексного диагностикума на основе моноклональных антител для определения капсульного F1 антигена Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Инфекционные болезни: Материалы IV Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (26-28 марта 2012 г., Москва) / Под ред. В.И.

Покровского. – Москва, 2012. – С. 161.

10. Shemyakin I.G., Development of diagnostics for determination of V- and F1 antigens of Yersinia pestis / Shemyakin I.G., Belova E.V., Ivasсhenko T.A., Luneva N.M. // Abstracts of the 7th European Congress on Tropical Medicine and International Health (3-6 October 2011, Barcelona, Spain). Barcelona 2011.

№16. – P.248.

11. Иващенко Т.А., Конструирование тест-системы иммуноферментной моноклональной для выявления V антигена Yersinia pestis / Т.А. Иващенко, Е.В. Белова, И.Г. Шемякин // Инфекционные болезни: Материалы V Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (25- марта 2013 г., Москва) / Под ред. В.И. Покровского. - Москва, 2013. – С. 170.

Список сокращений, используемых в тексте АСМ – атомно-силовая микроскопия ГКПМ – Государственная коллекция патогенных микроорганизмов ДВС – диссеминированное внутрисосудистое свртывание ИФА – иммунофементный анализ кДа – килодальтон м.к. – микробные клетки МКА – моноклональные антитела НАФ – неполный адъювант Фрейнда ОП – оптическая плотность ПАФ – полный адъювант Фрейнда РЛА – реакция латекс-агглютинации ФКУЗ РосНИПЧИ – Федеральное казенное учреждение здравоохранения Российский научно-исследовательский противочумный институт ФСБ – фосфатно-солевой буфер BALB/c – популяция лабораторных мышей – альбиносов lcrV – структурный ген V антигена MFI – mean fluorescence intensity (средняя интенсивность флуоресценции) pCad – 45-47 MDa плазмида, определяющая температурную зависимость роста иерсиний от ионов кальция, синтез V антигена и белков внешней мембраны TNF- – tumor necrosis factor alfa (фактор некроза опухоли-альфа) кb – kilobase (тысяча пар нуклеотидов) Приношу искреннюю благодарность своим научным руководителям д.б.н., профессору Шемякину И.Г. и к.б.н. Беловой Е.В. за оказание методической помощи при выполнении данной работы, а также за общую организацию и координацию работы.

Глубоко признательна заведующей лабораторией микробиологии чумы ФБУН ГНЦ ПМБ д.м.н. Дентовской С.В., с.н.с. отдела особо опасных инфекций, к.б.н. Шайхутдиновой Р.З. за консультации по проведению исследований и предоставленные материалы.

Выражаю искреннюю благодарность директору ФКУЗ Иркутский научноисследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, д.м.н., профессору Балахонову С.В., а также с.н.с. лаборатории микробиологи чумы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, к.б.н. Бельковой С.А. за предоставленные штаммы микроорганизмов и помощь в поведении испытаний разработанных тестсистем.

Приношу искреннюю признательность заведующему лабораторией нанобиотехнологии ФБУН ГНЦ ПМБ, д.б.н. Игнатову С.Г. за помощь при проведении экспериментов на разных этапах работы.

Благодарю всех сотрудников лаборатории молекулярной биологии, оказывавших помощь в проведении экспериментов.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.–корр. РАМН, д.м.н., профессора Дятлова И.А. за предоставленную возможность защищать диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФБУН ГНЦ ПМБ.

Глубоко признательна ведущей организации, официальным оппонентам и всем рецензентам настоящей работы за высказанные замечания, вопросы и рекомендации.



 
Похожие работы:

«ШАДРИНА МАРИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 03.01.07 – Молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН доктор биологических наук, профессор Научный консультант : Петр Андреевич Сломинский Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной...»

«БОНДАРЕНКО Александр Сергеевич АУТЭКОЛОГИЯ И МИГРАЦИОННАЯ АКТИВНОСТЬ МАССОВЫХ ВИДОВ ЖУЖЕЛИЦ (COLEOPTERA, CARABIDAE) НАГОРНОЙ ЧАСТИ СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО КАВКАЗА 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Краснодар – 2013 Работа выполнена на кафедре фитопатологии, энтомологии и защиты растений факультета защиты растений ФГБОУ ВПО Кубанский государственный аграрный университет Научный руководитель :...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«СОМОВА РЕГИНА ШАМИЛЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДОЛГОЛЕТИЯ И СТАРЕНИЯ НА МОДЕЛЬНЫХ ЛИНИЯХ Musca domestica L. И В ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛОВЕКА 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2013 Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Научный руководитель :...»

«ЕФИМОВ ПЕТР ГЕННАДЬЕВИЧ РОД PLATANTHERA Rich. (ORCHIDACEAE Juss.) И БЛИЗКИЕ РОДЫ ВО ФЛОРЕ РОССИИ 03.00.05. – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007 Работа выполнена в Отделе Гербарий высших растений Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук Аверьянов Леонид Владимирович Официальные оппоненты : доктор биологических наук Шамров Иван Иванович, кандидат...»

«Мошарова Ирина Викторовна ЭКОЛОГИЯ БАКТЕРИЙ, ТРАНСФОРМИРУЮЩИХ ПОЛИХЛОРИРОВАННЫЕ БИФЕНИЛЫ, И ИХ МЕСТО В СОСТАВЕ МОРСКОГО ГЕТЕРОТРОФНОГО БАКТЕРИОПЛАНКТОНА Специальность 03.00.16 - Экология Специальность 03.00.18 – Гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2 Работа выполнена в Институте Глобального Климата и Экологии Росгидромета и...»

«Абрамов Сергей Маркович Микробная конверсия целлюлозосодержащих отходов в электроэнергию с помощью гидрогеназного электрода, интегрированного в среду ферментации 03.02.03 - Микробиология 03.01.06 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Московского...»

«КАНЦЕРОВА Надежда Павловна Са2+-ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ НЕКОТОРЫХ ВОДНЫХ БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И РЫБ Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск 2011 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии Карельского научного центра РАН Научный руководитель : член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор НЕМОВА Нина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«БАЛАНОВСКИЙ Олег Павлович ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОФОНДА В ПРОСТРАНСТВЕ И ВРЕМЕНИ: СИНТЕЗ ДАННЫХ О ГЕНОГЕОГРАФИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И Y-ХРОМОСОМЫ 03.02.07 – генетика 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научные консультанты: доктор биологических наук,...»

«Пархоменко Василий Михайлович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И СТРУКТУРА ЦЕНОПОПУЛЯЦИЙ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (HYPERICUM PERFORATUM L.) В УСЛОВИЯХ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского на кафедре...»

«Рущук Александр Дмитриевич РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОКРОВ СТЕПЕЙ ЛЕВОБЕРЕЖЬЯ ДНЕСТРА: АНАЛИЗ ФЛОРЫ И КЛАССИФИКАЦИЯ РАСТИТЕЛЬНОСТИ Специальность 03.00.05 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Тирасполь 2007 Работа выполнена на кафедре ботаники и экологии естественно-географического факультета ПГУ имени Т.Г. Шевченко Научные доктор сельскохозяйственных наук, руководители...»

«ЮРЦЕВА АНАСТАСИЯ ОЛЕГОВНА МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ АТЛАНТИЧЕСКОГО ЛОСОСЯ (SALMO SALAR L.) В ЕСТЕСТВЕННЫХ УСЛОВИЯХ И АКВАКУЛЬТУРЕ Специальность: 03.02.06 – ихтиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2011 1 Работа выполнена на кафедре ихтиологии и гидробиологии Биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор...»

«Бедарева Ольга Михайловна ЭКОСИСТЕМЫ СРЕДНИХ ПУСТЫНЬ КАЗАХСТАНА И ИХ ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ МЕТОДАМИ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Калининград 2009 2 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научные консультанты: академик Национальной Академии Наук Республики...»

«ЧЕПИНОГА Виктор Владимирович ФЛОРА БАССЕЙНОВ РЕК ИЯ И ОКА (В ПРЕДЕЛАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.00.05. - ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Иркутск, 2000 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики Иркутского государственного университета. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент А. М. Зарубин Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор, Л.И. Малышев кандидат биологических наук, М.Г....»

«ЧУДИНОВА Екатерина Сергеевна Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO и редуктаза в модельных NO-генерирующих системах in vitro 03.00.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2007 Работа выполнена в лаборатории химической физики ферментов отдела кинетики химических и биологических процессов Института проблем химической физики РАН, г.Черноголовка, Московская обл. Научный руководитель : доктор...»

«ЛАВРЕНЧЕНКО Леонид Александрович МЛЕКОПИТАЮЩИЕ ЭФИОПСКОГО НАГОРЬЯ: ПУТИ И ОСОБЕННОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ ФАУНЫ ГОРНЫХ ТРОПИКОВ 03.00.08 – зоология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН доктор биологических наук, профессор, Официальные оппоненты : Никольский Александр Александрович доктор биологических наук, Холодова...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«Слугинова Ирина Сергеевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЛОРЫ МЕЛОВЫХ ОБНАЖЕНИЙ БАССЕЙНА Р. ПОЛНОЙ (РОСТОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) И ВОПРОСЫ ЕЕ ОХРАНЫ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Федяева Валентина Васильевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенском государственном педагогическом университете имени В.Г. Белинского...»

«Левицкая Наталья Николаевна Критерии и индикаторы для оценки состояния лесов Московской области Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН Научный руководитель : Черненькова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.