WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

МАРКОВ Денис Игоревич

Тепловая денатурация и агрегация субфрагмента 1

миозина и влияние малых белков теплового шока на

процесс агрегации

Специальность 03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д. И. Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В. П. Ширинский доктор физико-математических наук А. К. Цатурян

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится « 16 » декабря 2010 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «15» ноября 2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Малые белки теплового шока (sHsp) – это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высококонсервативного участка, который получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. Практически все sHsp формируют крупные олигомерные комплексы, различающиеся по своей структуре и количеству мономеров [Haslbeck, 2002]. Показано наличие зависимости шапероноподобной активности sHsp от их четвертичной структуры [Shashidharamurthy et al., 2005; Lelj-Garolla and Mauk, 2006]. Кроме того, эти белки могут подвегаться фосфорилированию под действием различных протеинкиназ, что также отражается как на их олигомерной структуре, так и на шапероноподобной активности [Haslbeck, 2002; Gusev et al., 2002; Rogalla et al., 1999].





В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них наиболее подробно изучены А- и В-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspB1). Как Hsp27, так и В-кристаллин экспрессируются в большом количестве в мышечной ткани, и их содержание увеличивается в ответ на различные повреждающие воздействия. Весьма вероятно, что одна из функций этих белков – это взаимодействие с актином и миозином (главными белками сократительного аппарата мышц) при неблагоприятных условиях. Изучению взаимодействия sHsp с актином было посвящено довольно много работ; в частности, было показано, что эти белки не взаимодействуют с нативными актиновыми филаментами и не влияют на процесс тепловой денатурации актина, но при этом эффективно предотвращают его тепловую агрегацию, образуя небольшие растворимые комплексы с денатурированным актином [Pivovarova et al., 2005; Pivovarova et al., 2007]. Значительно меньше было известно о взаимодействии sHsp с миозином. К моменту начала наших исследований этому вопросу была посвящена всего одна работа [Melkani et al., 2006], в которой было показано, что в условиях, имитирующих тепловой шок (инкубация при 43oC), В-кристаллин не только предотвращает агрегацию скелетномышечного миозина, но также частично подавляет инактивацию его ATPазы. Исходя из полученных результатов, авторы указанной работы заключили, что в условиях теплового шока sHsp могут взаимодействовать с головками миозина и предотвращать их тепловую денатурацию (приводящую к агрегации и инактивации ATPазы) [Melkani et al., 2006]. Подобные заключения, однако, представлялись нам весьма странными, особенно в свете результатов исследований взаимодействия sHsp с актином. Вследствие этого, одной из целей данной работы стало подробное исследование влияния sHsp на процессы тепловой денатурации и агрегации миозиновой головки. Важно отметить, что сам процесс тепловой агрегации миозиновой головки ранее почти не исследовался (особенно в условиях физиологической ионной силы), поэтому другой не менее важной целью настоящей работы было детальное исследование этого процесса.

Головки миозина могут быть изолированы путем ограниченного протеолиза молекул скелетномышечного миозина. Изолированная головка (называемая субфрагментом миозина (S1)) состоит из двух главных структурных доменов – моторного (или каталитического, содержащего активный центр ATPазы и участки связывания с актином) и регуляторного. Последний (в случае S1, полученного путем химотрипсинолиза в отсутствие двухвалентных катионов) представляет собой длинную -спираль, с которой нековалентно ассоциирована «существенная» (или «щелочная») легкая цепь. Эта легкая цепь существует в виде двух изоформ: A1 и A2. Основное отличие A1 от A2 – это наличие у нее дополнительной N-концевой последовательности из 41 остатка. Поэтому препарат S1, получаемый из миозина скелетных мышц, представляет собой смесь двух изоформ, содержащих только одну из этих легких цепей: S1(A1) или S1(A2).





Исследованию тепловой денатурации S1 посвящено довольно много работ. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) было установлено, что она полностью необратима; применение подхода «последовательного отжига» позволило выявить три тепловых перехода [Шныров и др., 1989; Levitsky et al., 1990; 1991; 1992].

Были также сделаны попытки идентификации этих калориметрических переходов, т. е.

выявления их соответствия определенным структурным доменам S1 [Levitsky, 1994].

Стоит, однако, отметить, что метод «последовательного отжига» недостаточно строг и дает лишь приблизительную информацию о механизме тепловой денатурации белка. Кроме того, большинство работ было выполнено на смешанном препарате S1 (без его разделения на изоформы). В то же время детальное понимание процесса тепловой агрегации белка невозможно без знания детального механизма его денатурации. Стоит отметить, что относительно недавно в нашей лаборатории был предложен новый, физически более строгий метод анализа данных ДСК для необратимо денатурирующих белков. В результате еще одной целью данной работы было подробное исследование механизма тепловой денатурации изолированных изоформ S1 и возможный пересмотр полученных ранее результатов.

Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы стало подробное изучение тепловой денатурации и агрегации S1 и влияния sHsp на эти процессы в условиях, приближенных к условиям теплового шока. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Методом ДСК провести подробные исследования тепловой денатурации препаратов S1(A1) и S1(A2) при двух значениях ионной силы: 20 мМ и 120 мМ.

Провести математический анализ полученных данных с целью нахождения калориметрических доменов (т. е. участков молекулы, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга).

2). Исследовать тепловые изменения собственной триптофановой флуоресценциии S и тепловую инактивацию его ATPазы. Сопоставляя полученные результаты с данными ДСК, попытаться провести идентификацию калориметрических доменов S1, т. е. выявить их соответствие определенным структурным доменам S1.

3). Методами турбидометрии и динамического лазерного светорассеяния (DLS) исследовать механизм тепловой агрегации изоформ S1 при двух значениях ионной силы:

20 мМ и 120 мМ.

4). Изучить влияние малого белка теплового шока Hsp27-3D (Hsp27 с тремя имитирующими фосфорилирование заменами: S15D, S78D, S82D) на тепловую денатурацию S1, инактивацию его АТРазы, а также на агрегацию S1 в условиях, имитирующих тепловой шок физиологическим (120 мМ).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании результатов проведенных исследований пересмотрен механизм тепловой денатурации S1. Показано наличие двух калориметрических доменов в его молекуле, причем менее термостабильный калориметрический домен идентифицирован как регуляторный домен миозиновой головки, а более термостабильный – как моторный домен.

2. Показано, что при значениях ионной силы, близких к физиологическим, изоформы S1 не различаются по характеру тепловой агрегации. Процесс агрегации при этом лимитируется денатурацией моторного домена. При инкубации в условиях низкой ионной силы (20 мМ) S1(A1) агрегирует значительно быстрее, чем S1(A2). Предполагается, что в этих условиях агрегация S1(A1) по крайней мере частично обусловлена межмолекулярными взаимодействиями N-концевого сегмента легкой цепи А1.

3. Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния ни на тепловую денатурацию S1, ни на инактивацию его АТРазы. При этом sHsp способны эффективно подавлять тепловую агрегацию S1 за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами S1.

Научная новизна. Впервые детально исследован механизм тепловой денатурации и агрегации изоформ S1 с применением методов химической кинетики. Установлено наличие в молекуле S1 двух калориметрических доменов, причем более термостабильный домен денатурирует в две стадии. Существенные различия между изоформами S1 в кинетических параметрах денатурации выявлены только для первого калориметрического домена независимо от условий ионной силы. Проведена идентификация калориметрических доменов и установлено, что менее термостабильный домен соответствует регуляторному домену миозиновой головки, а более термостабильный – моторному домену.

Показано, что в условиях высокой ионной силы (120–130 мМ) тепловая агрегация протекает одинаково у обеих изоформ S1, не зависит от концентрации белка и лимитируется необратимой денатурацией моторного домена. Более того, в этих условиях механизм тепловой агрегации S1 коренным образом отличается от такового для всех ранее исследованных белков: рост агрегатов осуществляется не за счет слипания стартовых агрегатов, а за счет последовательного налипания на эти агрегаты отдельных молекул S1, моторный домен которых частично денатурирован. Напротив, в условиях низкой ионной силы (20 мМ Hepes) обнаружена существенная разница в агрегации между двумя изоформами S1. Необратимая агрегация S1(A2) является следствием тепловой денатурации этой изоформы S1 и мало зависит от концентрации белка, а в случае S1(A1) отсутствуют какие-либо корреляции между тепловой денатурацией и агрегацией этой изоформы S1 и наблюдается выраженная концентрационная зависимость агрегации. Кроме того, показано, что в условиях низкой ионной силы спонтанная агрегация S1(A1) происходит даже при +4oC. В последнем случае агрегация является полностью обратимой:

образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора. На основании этих данных сделан вывод, что при низкой ионной силе агрегация S1(A1) не является прямым следствием тепловой денатурации белка и по крайней мере отчасти обусловлена взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи А1 с другими молекулами S1.

Показано, что в условиях ионной силы, близких к физиологическим, sHsp не влияют ни на тепловую денатурацию S1, ни на инактивацию его АТРазы, однако эффективно защищают его от тепловой агрегации, образуя устойчивые комплексы с частично или полностью денатурированным молекулами S1. В зависимости от весового соотношения sHsp/ S1 рост агрегатов либо замедляется, либо подавляется вовсе.

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации и агрегации сложных мультидоменных белков и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике.

Отсутствие концентрационной зависимости и разницы между изоформами в кинетике роста агрегатов в условиях высокой ионной силы делают S1 особенно удобным объектом для исследования шапероноподобной активности малых белков теплового шока и других агентов, подавляющих тепловую агрегацию белков. Во-первых, отпадает необходимость разделения препарата S1 на изоформы, а во-вторых, эффект шаперона будет зависеть только от молярного (или весового) соотношения шаперон/S1.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XVII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2010» (г. Москва, 2010), на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность»

(г. Пущино-на-Оке Московской области, 2008; 2010) и на 35-м Международном конгрессе FEBS (г. Гетеборг, Швеция, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения ( главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы (_ источников).

Диссертация изложена на _ страницах, содержит: 29 рисунков и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах S1 миозина и малых белков теплового шока (sHsp). Особое внимание уделено работам по исследованию тепловой денатурации S1 методом ДСК.

Детально рассмотрен разработанный ранее в нашей лаборатории подход к анализу термограмм мультидоменных белков с необратимой тепловой денатурацией. Рассмотрены современные представления об аморфной тепловой агрегации белков и влиянии sHsp на этот процесс.

Материалы и методы исследования S1 получали, переваривая филаменты миозина из скелетных мышц кролика -химотрипсином, обработанным TLCK для подавления активности примесей трипсина, в буфере 20 мМ NaH2PO4, 0,12 M NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,5 мМ ДТТ (pH 7,0) при 25oC в течение 10 минут при весовом соотношении -химотрипсин/миозин, равном 1/250. Реакцию останавливали добавлением PMSF. Миозин был получен ранее сотрудниками лаборатории и хранился при –20оС в 50% глицерине. S1 разделяли на изоформы S1(A1) и S1(A2) методом ионообменной хроматографии на колонке с SP-трисакрилом [Trayer et al., 1988].

Рекомбинантный малый белок теплового шока человека Hsp27-3D (мутант Hsp27 с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) был любезно предоставлен профессором Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова).

Исследования денатурации и агрегации белков проводили в буфере 20 мМ HepesKOH (рН 7,3), содержащем 1 мM MgCl2 (низкая ионная сила) или в том же буфере, содержащем 100 мМ KCl (высокая ионная сила). Все исследования влияния sHsp на тепловую денатурацию и агрегацию S1 проводили на смешанном (не разделенном на изоформы) препарате S1 в буфере с высокой ионной силой.

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино-на-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Для получения кривых теплопоглощения препарат белка с концентрацией 1,5–1,9 мг/мл помещали в ячейку прибора и прогревали с постоянной со скоростью, равной 1 град/мин, от 10 до 80оС при постоянном давлении 2,2 атм. В эксперименте по исследованию влияния Hsp27-3D на тепловую денатурацию S1 конечная концентрация S1 была 1,5 мг/мл, а sHsp – 1,2 мг/мл. Калориметрические измерения проводили двумя способами: стандартным, когда исследуемый белок помещен в опытную ячейку, а контрольный буфер – в ячейку сравнения, и модифицированным, когда тот же белок помещен в ячейку сравнения, а буфер – в опытную ячейку. В результате во втором случае белковый пик на термограмме оказывался перевернутым, а все артефакты инструментальной базовой линии располагались в тех же местах, что и при стандартных измерениях. Далее из кривой, полученной стандартным образом, вычитали кривую, полученную модифицированным способом. Это позволяло избежать артефактов, вызываемых вычитанием инструментальной базовой линии, и удвоить белковый сигнал. Затем результирующую кривую делили на два для получения реального значения этого сигнала. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до 10oС пробу подвергали повторному прогреву в тех же условиях. Тепловая денатурация S1 была полностью необратимой. Для обработки и анализа кривых теплопоглощения использовались написанные нами скрипты, исполняемые в среде MatLab (The MathWorks, Inc., США).

Исследования температурных зависимостей параметров триптофановой флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Cary Eclipse (Varian Inc.), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком. Исследования проводили при концентрации белка 0,05 мг/мл. Длина волны возбуждения была равна 297 нм (ширина щели 5 нм); записывали либо спектры флуоресценции в диапазоне от 310 до 395 нм (ширина щели 2.5 нм), либо изменения интенсивности флуоресценции при разных длинах волн (320 и 365 нм). Для характеристики формы спектра применяли т. н. параметр А (отношение интенсивности флуоресценции при 320 нм к интенсивности флуоресценции при 365 нм) [Turoverov et al., 1976].

Эксперименты по тепловой инактивации ATPазы S1 проводили, инкубируя раствор S1 с концентрацией 0,5 мг/мл при определенной постоянной температуре в течение различных промежутков времени, после чего пробы охлаждали до 25oC и измеряли К+-ЭДТА-ATPазную активность по высвобождению Pi [Panusz et al., 1970]. Эксперименты по инактивации ATPазы проводили при различных температурах в диапазоне 39–47oC.

Исследования влияния sHsp на инактивацию ATPазы проводились при 43oC при различных весовых соотношениях sHsp/S1.

Процесс тепловой агрегации S1 регистрировали по приросту кажущейся оптической плотности при 350 нм и по приросту среднего гидродинамического радиуса образующихся агрегатов (Rh). Измерения кажущейся оптической плотности проводили на спектрофотометре Cary-100 (Varian Inc.), снабженном температурной приставкой Biomelt.

Прирост Rh регистрировали на DLS-спектрометре Photocor Complex (Photocor instruments, США) c гелий-неоновым лазером 632,8 нм и контролируемым нагревом ячейки;

полученные результаты обрабатывали с помощью программы DynaLS v2.5.2 (Alango, Израиль). Агрегационные эксперименты проводили либо с постоянной скоростью прогрева 1оС/мин, либо путем инкубации при определенной постоянной температуре (от 39oC до 47oC). В исследованиях влияния Hsp27-3D на агрегацию S1 конечная концентрация S1 составляла 0,5 мг/мл, а весовые соотношения sHsp/S1 составляли 1:4, 1:2, 1:1 и 2:1.

При центрифугировании на высоких скоростях крупные агрегаты S1 осаждаются.

Если sHsp способны связываться с такими агрегатами, они будут переходить в осадок вместе с S1. Hsp27-3D очень удобен для таких экспериментов по соосаждению, поскольку он неспособен (в отличие от белка дикого типа) образовывать крупные олигомеры и потому не осаждается сам при высокоскоростном центрифугировании. Эти эксперименты проводили, используя ультрацентрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18о.

Растворы S1 с концентрацией 0,5 мг/мл в 30 мМ Hepes-NaOH (pH 7,3), содержащем 1 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl, инкубировали в течение различных промежутков времени при 43oC в отсутствие sHsp и в присутствии Hsp27-3D (0,5 мг/мл), после чего охлаждали до 25oC.

Затем образцы центрифугировали в течение 15 минут при 140000 g. Содержание белков в осадках и супернатантах анализировали методом вертикального SDS-электрофореза в ПААГ [Laemmli, 1970].

Гели окрашивали раствором Кумасси R-250 и сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью написанных нами скриптов, исполняемых в среде MatLab (The MathWorks, Inc., США) и использующих функции из набора Image Processing Toolbox.

Тепловая денатурация изоформ S Ранее в нашей лаборатории был разработан новый методический подход для анализа термограмм необратимо денатурирующих мультидоменных белков, суть которого сводится к следующему. На первом шаге анализируется полная термограмма такого белка и при помощи специальных математических процедур раскладывается на гипотетические одностадийные необратимые переходы (предполагается, что константа скорости для каждого из таких переходов подчиняется уравнению Аррениуса). Для каждого из найденных переходов производится оценка двух параметров уравнения Аррениуса и калориметрической энтальпии (площади под пиком избыточного теплопоглощения). После этого проводится калориметрическая съемка препаратов этого же белка, подвергнутых предварительной инкубации в течение определенных промежутков времени при определенной температуре. Времена и температуры этих инкубаций (отжигов) подбираются таким образом, чтобы полностью элиминировать все калориметрические домены, кроме самого термостабильного, затем – всех, кроме двух самых термостабильных, и т. д. После проведения всех необходимых инкубаций и получения всех термограмм определяются окончательные значения всех параметров каждого из калориметрических переходов данного белка методом многомерной нелинейной оптимизации в пространстве параметров. В качестве входных данных используются все полученные термограммы и условия всех инкубаций одновременно. Вычислительная мощность современных компьютеров это позволяет. Для подтверждения полученных результатов проводится контрольный отжиг, и полученная экспериментально термограмма сравнивается с термограммой, смоделированной на основе рассчитанных значений параметров калориметрических переходов и условий отжига.

Предварительный анализ данных ДСК для S1(A1) и S1(A2), полученных как в условиях низкой, так и высокой ионной силы (см. Материалы и Методы), в соответствии с описанным выше алгоритмом позволил предположить наличие трех необратимых тепловых переходов. Мы обозначили их как калориметрические переходы 1, 2 и 3 в порядке роста температуры максимума пика избыточного теплопоглощения. Однако последующий анализ термограмм препаратов, подвергнутых предварительной инкубации, заставил нас прийти к заключению, что переходы 2 и 3 не являются независимыми и должны соответствовать двум последовательным стадиям денатурации одного калориметрического домена. В результате мы предложили модель тепловой денатурации S1, включающую два калориметрических домена, причем более термостабильный домен (обозначенный как домен II) денатурирует в две стадии. Каждая из стадий денатурации (единственная для первого домена и две последовательные для второго домена) является полностью необратимой, и температурные зависимости соответствующих констант скорости описывается уравнением Аррениуса. В таблице 1 приведены окончательные оптимальные значения параметров калориметрических переходов для обеих изоформ S1, рассчитанные при двух разных значениях ионной силы: по два параметра уравнения Аррениуса и калориметрическая энтальпия. На Рис. 1А приведены результаты разложения термограммы препарата S1(A1), полученной в условиях высокой ионной силы, на тепловые переходы, рассчитанные исходя из предложенной модели тепловой денатурации и найденных параметров. Аналогично выглядят результаты разложения термограмм других препаратов S1: как S1(A1) в условиях низкой ионной силы, так и препаратов S1(A2) в условиях низкой или высокой ионной силы.

Из таблицы 1 хорошо видно, что независимо от ионной силы заметные различия между двумя изоформами S1 наблюдаются только в значении параметра T* для калориметрического домена I, которое для S1(A1) на 1,5–2,0 K ниже такового для S1(A2).

Чтобы подтвердить указанную разницу, мы провели дополнительную оптимизационную процедуру. Значение параметра T* для домена I было установлено равным среднему арифметическому его значений для S1(A1) и S1(A2) и «заморожено»; все остальные параметры могли изменяться произвольно. Используя полученные в результате такой процедуры значения параметров, мы смоделировали термограммы для препаратов, подвергнутых контрольному отжигу. Смоделированные термограммы значительно отличались от полученных экспериментально, в то время как при использовании значений параметров, приведенных в таблице 1, модельные термограммы почти не отличаются от экспериментальных. В результате мы заключили, что указанное различие между изоформами S1 является достоверным. Учитывая, что структурно изоформы S различаются лишь своими легкими цепями, ассоциированными с регуляторным доменом, можно предположить, что калориметрический домен I соответствует регуляторному домену миозиновой головки, а калориметрический домен II – моторному домену.

Таблица. 1. Значения параметров калориметрических доменов S1. Калориметрическому домену I, денатурирующему в одну стадию, соответствует переход 1. Переходы 2 и 3 соответствуют 1-й и 2-й стадиям денатурации калориметрического домена II. Каждый переход характеризуется тремя независимыми параметрами: калориметрической энтальпией H и двумя параметрами уравнения Аррениуса ( k T = exp [ E a / R1/T 1 /T ], где T – абсолютная температура, R – универсальная газовая постоянная) – энергией активации Ea и T * (абсолютной температурой, при которой константа скорости k равна 1 мин-1).

*, K 317.5±0.4 319.0±0.4 321.2±0.4 321.6±0.4 324.5±0.4 324.7±0. H, кДж/моль 200±20 200±20 1030±100 970±100 500±50 300± *, K 319.2±0.4 321.4±0.4 323.0±0.4 323.0±0.4 325.5±0.4 325.6±0. Для подтверждения этого предположения независимым методом мы провели исследование температурной зависимости собственной триптофановой флуоресценции изоформ S1. Хорошо известно, что все остатки Trp сосредоточены в моторном домене, поэтому следует ожидать, что изменения флуоресцентных свойств S1 будут происходить в области температур, соответствующих денатурации моторного домена. Необратимая тепловая денатурация S1 (обеих его изоформ как при низкой, так и при высокой ионной силе), происходящая в результате прогрева препарата до 70oC с постоянной скоростью 1 К/мин, сопровождается сдвигом максимума спектра собственной флуоресценции в более коротковолновую область примерно на 3 нм. Во всех случаях такое изменение спектра соответствовало изменению параметра A = I320/I365 (отношения интенсивностей флуоресценции на соответствующих длинах волн) от 1,05-1,07 до 1,30-1,35. Этот так называемый «синий сдвиг» спектра флуоресценции S1 был описан ранее [Шныров и др., 1989; Levitsky et al., 1991] и до сих пор так и не получил однозначного объяснения.

Единственная и очевидная интерпретация этого феномена заключается в том, что в результате необратимой денатурации S1 остатки Trp (по крайней мере некоторые из них) оказываются в более гидрофобном окружении, чем они находились в молекуле с нативной структурой. Иначе говоря, необратимая тепловая денатурация S1 не сводится к тривиальному разворачиванию. Следует, однако, отметить, что детальное исследование феномена «синего сдвига» выходило за рамки нашей работы.

Используя данные, приведенные в таблице 1, мы рассчитали температурные зависимости степеней завершенности трех калориметрических переходов S1 и сопоставили их с температурной зависимостью нормализованного параметра А (степени завершенности перехода по параметру А). На Рис. 1Б приведены результаты такого сопоставления для препарата S1(A1) в условиях высокой ионной силы. Хорошо видно, что температурные изменения параметра А происходят в области калориметрических переходов 2 и 3, т. е. в области денатурации калориметрического домена II. При этом в области денатурации калориметрического домена I никаких изменений параметра А не наблюдается. Аналогичные результаты были получены и для всех других исследованных препаратов S1 (как для S1(A1) при низкой ионной силе, так и для S1(A2) независимо от ионной силы). Таким образом, полученные данные позволяют идентифицировать калориметрический домен II как моторный домен S1, а калориметрический домен I – как регуляторный домен.

В наших исследования мы установили, что в диапазоне 39–45 oC инактивация ATPазы S1 является реакцией (псевдо-)первого порядка. Это позволяет определить соответствующие константы скорости. Мы рассчитали (используя данные из таблицы 1) константы скорости денатурации калориметрического домена I и первой стадии денатурации калориметрического домена II для температур в указанном диапазоне и сравнили их с рассчитанными по экспериментальным данным константами скоростей инактивации ATPазы. Для всех препаратов S1 при всех исследованных температурах константы скоростей инактивации ATPазы были, во-первых, в пределах погрешности одинаковы для двух изоформ S1 (при условии одинакового значения ионной силы), а во-вторых, очень близки к таковым для первой стадии денатурации калориметрического домена II. Поскольку ATPазный центр локализован в моторном домене S1, полученные результаты еще раз свидетельствуют в пользу соответствия калориметрического домена II моторному домену S1.

Тепловая агрегация изоформ S1 в условиях высокой ионной силы Необратимая тепловая денатурация S1 сопровождается его агрегацией. Для исследования тепловой агрегации S1 мы применили метод DLS, позволяющий регистрировать средний размер частиц, образующихся в процессе агрегации.

В отличие от денатурации, агрегация белков всегда является реакцией взаимодействия между 2 и более молекулами белка. Следовательно, хотя бы одна из ее стадий должна быть реакцией второго или более высокого порядка. Иными словами, в общем случае агрегация белков должна зависеть от их концентрации в растворе. На Рис. 2А в полулогарифмических координатах представлены зависимости среднего гидродинамического радиуса агрегатов (Rh), образующихся в процессе инкубации препаратов S1(A1) с различной концентрацией (0,25–1,0 мг/мл) при 44oC в буфере с высоким значением ионной силы (100 мМ KCl). Хорошо видно, что в этих условиях агрегация S1(A1), регистрируемая по приросту среднего гидродинамического радиуса агрегатов, не зависит от его начальной концентрации в растворе. Абсолютно аналогичное поведение в этих условиях (100 мМ KCl) демонстрировала изоформа S1(A2), а также смешанный (не разделенный на изоформы) препарат S1 (последний – даже в более широком диапазоне концентраций: 0,125–2,0 мг/мл). Кроме того, из Рис. 2А хорошо видно, что зависимости Rh от времени инкубации очень хорошо описываются возрастающими экспонентами (в полулогарифмических координатах экспонента выглядит как прямая).

Такие экспоненты могут быть охарактеризованы параметром t2R, имеющим физический смысл времени удвоения Rh. Оптимальные значения этого параметра были рассчитаны и составили 4,50,4 мин (95%-й доверительный интервал, инкубация при 44oC) для обеих изоформ S1 при всех исследованных концентрациях белка. Отсутствие концентрационной зависимости, а также экспоненциальный характер процесса роста Rh свидетельствуют о том, что агрегация S1 в этих условиях (100 мМ KCl) лимитируется какой-то реакцией первого порядка.

Чтобы лучше понять механизм тепловой агрегации S1, мы исследовали влияние температуры на величину параметра t2R. Важно отметить, что при всех исследованных температурах кривые прироста гидродинамического радиуса хорошо описываются экспонентами, что позволяет рассчитать значения этого параметра. На Рис. 2Б представлена зависимость значений t2R от температуры инкубации (серая пунктирная линия) для S1(A1) в условиях высокой ионной силы в сопоставлении с периодами полураспада калориметрических доменов этого же препарата, рассчитанными по данным таблицы 1. Хорошо видно, что значения времени удвоения гидродинамического радиуса агрегатов в пределах погрешности совпадают с временами полураспада первой стадии денатурации калориметрического домена II (черная сплошная линия). Абсолютно аналогичные результаты были получены и для препарата S1(A2). Поскольку калориметрический домен II идентифицирован нами как моторный домен S1, мы можем заключить, что в этих условиях (100 мМ KCl) именно первая стадия денатурации моторного домена S1 лимитирует процесс его тепловой агрегации. Также необходимо подчеркнуть, что в этих условиях как времена полураспада первой стадии денатурации моторного домена, так и времена удвоения Rh одинаковы (при одной и той же температуре) у обеих изоформ S1, т. е. в смысле кинетики тепловой агрегации смешанный препарат S ведет себя как гомогенный.

Известно, что агрегация белков характеризуется наличием некоторой лаг-фазы – фазы нуклеации, необходимой для образования зародышей агрегации, т. н. «стартовых агрегатов». Чтобы установить наличие этой стадии в процессе агрегации S1 в условиях высокой ионной силы (100 мМ KCl), мы исследовали температурные зависимости прироста Rh в процессе нагрева с постоянной скоростью 1 К/мин. Эти зависимости были одинаковы для обеих изоформ S1 и не зависели от концентрации белка в диапазоне 0,25– 1,0 мг/мл вплоть до значений Rh 3000 нм. На Рис. 2В приведено сопоставление температурной зависимости Rh (пунктирная линия и окружности) с температурными зависимостями степеней завершенности трех калориметрических переходов S1 (сплошные линии, цифры соответствуют номеру перехода) для S1(A1). Хорошо видно, что между первой стадией денатурации калориметрического домена II (переход 2), лимитирующей процесс агрегации S1 в этих условиях, и процессом быстрого роста Rh имеется задержка в несколько градусов. Для S1(A2) наблюдалась абсолютно аналогичная картина. Исходя из этого, мы можем заключить, что в процессе тепловой агрегации S1 присутствует стадия нуклеации. Формирование «стартовых агрегатов» требует некоторого времени, что и обуславливает наблюдаемую задержку.

Исходя из полученных данных, можно предложить следующий механизм тепловой агрегации S1. Первая стадия этого процесса – это нуклеация, когда несколько частично или полностью денатурированных молекул S1 слипаются, образуя «стартовый агрегат» – зародыш для дальнейшей агрегации. Дальнейший рост этого зародыша осуществляется за счет налипания отдельных молекул S1, моторный домен которых находится на стадии кинетического интермедиата. Причем скорость реакции налипания таких молекул на агрегат значительно превышает скорость первой стадии денатурации моторного домена, которая и лимитирует в итоге весь процесс роста агрегатов. Дальнейшая денатурация моторного домена (вторая стадия, калориметрический переход 3) происходит, повидимому, после того, как молекула оказывается включенной в состав агрегата. Такой механизм агрегации S1 не укладывается в предложенную ранее схему [Markossian et al., 2009], в соответствии с которой рост радиуса агрегатов происходит в результате слипания «стартовых агрегатов», а не налипания денатурированных молекул белка на некий зародыш агрегации. Однако полученные нами данные позволяют однозначно отдать предпочтение именно предлагаемой нами схеме. Следует, однако, отметить, что схема, описанная в работе [Markossian et al., 2009], очень хорошо описывает тепловую агрегацию всех исследованных ранее белков. Тот факт, что агрегация S1 в условиях высокой ионной силы в нее не укладывается, свидетельствует о том, что нами впервые обнаружен альтернативный механизм тепловой агрегации, который не встречался у исследованных ранее белков.

Тепловая агрегация изоформ S1 в условиях низкой ионной силы В ранних исследованиях [Levitsky et al., 1991] было показано, что в условиях низкой ионной силы (20 мМ Hepes) изоформы S1 существенно различаются по характеру своей тепловой агрегации: в процессе нагрева с постоянной скоростью S1(A1) агрегирует при значительно более низкой температуре, чем S1(A2). В нашей работе мы воспроизвели эти результаты, а заодно проанализировали зависимость агрегации от начальной концентрации белка. На Рис. 3 приведены температурные зависимости агрегации (зарегистрированные по приросту кажущейся оптической плотности при 350 нм и затем нормализованные) S1(A1) (А) и S1(A2) (Б), полученные при двух концентрациях белка: 0,25 мг/мл (окружности и сплошные линии) и 2,0 мг/мл (перевернутые треугольники и сплошные линии). Хорошо видно, что в этих условиях (при низкой ионной силе) снижение концентрации белка оказывает сильное влияние на характер тепловой агрегации S1(A1), смещая кривую агрегации в сторону более высокой температуры, при этом влияние концентрации на тепловую агрегацию S1(A2) выражено намного слабее.

Для сравнения на этом же рисунке представлены температурные зависимости степеней завершенности трех калориметрических переходов S1 (пунктирные линии, цифры соответствуют номеру перехода), рассчитанные с использованием данных таблицы 1. Сопоставляя эти кривые с температурными зависимостями агрегации изоформ S1, можно сделать следующие выводы. Агрегация S1(A2) в этих условиях (Рис. 3Б), как и при высокой ионной силе, является следствием тепловой денатурации этой изоформы S1, скорее всего – ее моторного домена (переходы 2 и 3), денатурация которого, по-видимому, в значительной степени лимитирует процесс агрегации этой изоформы и в условиях низкой ионной силы. Ничего подобного нельзя, однако, сказать о тепловой агрегации S1(A1) в этих условиях (Рис. 3А).

В этом случае отсутствует однозначная связь между тепловой денатурацией и агрегацией S1(A1). Более того, хорошо видно, что при относительно высокой концентрации белка (2 мг/мл) агрегация S1(A1) начинается при довольно низких температурах (ниже 35оС) и даже слегка опережает денатурацию самого термолабильного домена I (Рис. 3А). Это позволяет предположить, что при низкой ионной силе агрегация S1(A1) не является прямым следствием тепловой денатурации белка, будучи по крайней мере отчасти обусловленной взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи А с другими молекулами S1. Представляется совершенно очевидным, что вероятность таких межмолекулярных взаимодействий должна существенно возрастать при повышении концентрации белка. Более того, можно ожидать, что при низкой ионной силе агрегация S1(A1), обусловленная межмолекулярными взаимодействиями N-концевого сегмента легкой цепи А1, может медленно происходить и при низкой температуре.

Это предположение подтверждается экспериментально. На Рис. 4 представлен спектр поглощения препарата S1(A1), хранившегося в условиях низкой ионной силы в течение ночи при 4оС (кривая 1, сплошная черная линия). Видно, что такой препарат демонстрирует высокий уровень светорассеяния, проявляющегося в аномально высокой кажущейся оптической плотности в области 320–360 нм, где отсутствует поглощение белка (кривая 1). Такое светорассеяние полностью исчезает после добавления к препарату KCl до конечной концентрации 100 мМ (кривая 2, сплошная толстая серая линия). Путем экстраполяции длинноволнового отрезка спектра поглощения S1(A1), хранившегося при низкой ионной силе, в коротковолновую область мы рассчитали величину светорассеяния образца по всему волновому диапазону (255–360 нм) и вычли полученную кривую (кривая 3, короткий пунктир) из спектра поглощения S1(A1) при низкой ионной силе (кривая 1).

Полученная кривая 4 (длинный пунктир), представляющая собой чистый спектр поглощения S1(A1) без вклада светорассеяния, ничем не отличалась от спектра поглощения S1(A1), полученного в присутствии 100 мМ KCl. Важно отметить, что при хранении препаратов S1(A2) в таких же условиях ничего подобного не наблюдается.

Поскольку единственное отличие S1(A1) от S1(A2) – это наличие дополнительного N-концевого сегмента в легкой цепи A1, то представляется вполне очевидным, что агрегация S1(A1) в условиях низкой ионной силы, происходящая при низкой температуре, обусловлена взаимодействиями N-концевого сегмента легкой цепи А1 либо с аналогичным сегментом легкой цепи, либо с моторным доменом другой молекулы S1. Такая агрегация является полностью обратимой, поскольку образующиеся агрегаты легко разрушаются при повышении ионной силы раствора; в этом отношении она коренным образом отличается от необратимой агрегации, вызываемой тепловой денатурацией белка, которая сопровождается слипанием денатурированных молекул.

Напоследок хотелось бы высказать несколько соображений о возможных механизмах влияния такого межмолекулярного взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи А1 на процесс тепловой агрегации изоформы S1, содержащей эту легкую цепь. С одной стороны, мы можем ожидать усиления таких взаимодействий с ростом температуры, и тогда наблюдаемая тепловая агрегация (как, например, на Рис. 3А) является комбинацией двух различных процессов: обратимой агрегации, обусловленной межмолекулярными взаимодействиями нативных молекул, и необратимой – вызванной слипанием денатурированных молекул. Нельзя также исключить влияния этого межмолекулярного взаимодействия непосредственно на процесс необратимой денатурационной агрегации – например, за счет облегчения нуклеации, которая в этом случае может происходить еще до денатурации. Межмолекулярные взаимодействия Nконцевого сегмента А1, по-видимому, в значительной степени подавляются при повышении ионной силы. Этим и объясняется тот факт, что в условиях высокой ионной силы(100 мМ KCl) тепловая агрегация изоформ S1 протекает одинаково.

Влияние малых белков теплового шока (sHsp) на тепловую денатурацию S1 и инактивацию его ATPазы Перейдем теперь к рассмотрению вопросов о взаимодействии sHsp с S1. Наши исследования в этой области мы начали с того, что попытались воспроизвести результаты американских авторов [Melkani et al., 2006] о влиянии sHsp на тепловую инактивацию ATPазного центра миозина, который, как известно, располагается в моторном домене миозиновой головки (S1). Поскольку инактивация ATPазы S1 обусловлена денатурацией его моторного домена и протекает одинаково у обеих изоформ S1, то такие исследования можно проводить на смешанном (не разделенном на изоформы) препарате S1. Мы исследовали влияние Hsp27 (как дикого типа, так и Hsp27-3D) на тепловую инактивацию K+-ЭДТА- и Ca2+-ATPазы S1 при различных весовых соотношениях S1/sHsp (2:1, 4:1 и 8:1).

Во всех случаях мы не обнаружили никакого влияния sHsp на инактивацию АТРазы S1 в процессе инкубации при 43оС. Характерный ход кривых инактивации представлен на Рис. 5. Мы также исследовали влияние Hsp27-3D на инактивацию Ca2+-ATPазы целого миозина при тех же концентрациях белков (0,04 мг/мл) и при том же весовом соотношении sHsp/миозин (1:1), что и в работе [Melkani et al., 2006] и опять не обнаружили никакого защитного эффекта sHsp на ATPазную активность миозина. Исходя из этого, можно было бы предположить, что защита миозиновой ATPазы от тепловой инактивации является уникальным свойством B-кристаллина, который использовался в работе американских авторов. Чтобы проверить это предположение, мы исследовали влияние смешанного препарата A- и B-кристаллина (3:1 w/w) (коммерческий препарат -кристаллина (Sigma)) на инактивацию АТРазы миозина при концентрации последнего 0,04 мг/мл. Но даже в этом случае (при весовых соотношениях миозин/кристаллин, равных 1:1, 1:2 и даже 1:4) мы не обнаружили никакого защитного эффекта. Наконец, мы не обнаружили никакого влияния очищенного рекомбинантного B-кристаллина на инактивацию Ca2+-ATPазы S1 при весовых соотношениях S1/sHsp, равных 1:1 и 1:2. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что sHsp не влияют на тепловую инактивацию ATPазы как целого миозина, так и его субфрагмента 1, которая является следствием тепловой денатурации моторного домена головки миозина. Что касается данных, полученных американскими авторами [Melkani et al., 2006], то они, по-видимому, являются экспериментальным артефактом.

Если малые белки теплового шока не влияют на тепловую инактивацию ATPазы S1, то, скорее всего, они не должны влиять и на тепловую денатурацию головки миозина, по крайней мере его моторного домена. Для проверки этого предположения мы провели калориметрический эксперимент, результаты которого представлены на Рис. 6. Поскольку в первую очередь нас интересовал вопрос о возможном влиянии sHsp на тепловую денатурацию S1, а не детальный механизм этого влияния, в этом эксперименте использовался смешанный препарат S1. Из Рис. 6 хорошо видно, что кривые теплопоглощения препаратов S1, полученные в отсутствие и в присутствии Hsp27-3D, практически идентичны (различие в энтальпии пиков S1 находится в пределах погрешности метода), из чего следует вывод, что Hsp27-3D не оказывает влияния на тепловую денатурацию S1. Однако присутствие денатурированного S1 оказывает заметное влияние на тепловую денатурацию Hsp27-3D. Это выражается в смещении максимума теплового перехода Hsp27-3D на 2,6oC в область более низких температур и уменьшении энтальпии перехода примерно на 30%. Такое изменение свойств Hsp27-3D свидетельствует в пользу того, что он образует комплексы с денатурированным S1.

Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию S Для изучения влияния sHsp на агрегацию S1 мы применили метод DLS, позволяющий регистрировать кинетику прироста среднего гидродинамического радиуса агрегатов (Rh) в процессе инкубации при 43oC. Все эксперименты были выполнены только в условиях высокой ионной силы (100 мМ KCl), близкой к ее физиологическому значению. Работать при таком значении ионной силы особенно удобно, т. к. в этих условиях тепловая агрегация обеих изоформ S1 протекает одинаково, не зависит от начальной концентрации S1 в широком диапазоне его концентраций и лимитируется первой стадией денатурации моторного домена головки миозина. Поэтому в этой серии экспериментов мы использовали смешанный (не разделенный на изоформы) препарат S1. Результаты экспериментов приведены на Рис. 7. Кривая 1 соответствует препарату S1 без sHsp.

Хорошо видно, что присутствие Hsp27-3D частично или полностью подавляет рост Rh (кривые 2–5). Защитный эффект Hsp27-3D на процесс агрегации S1 зависит от весового соотношения sHsp/S1: по мере его увеличения он усиливается (кривые 2 и 3), а при достижении им величины 1:1 рост агрегатов подавляется почти полностью (кривая 4).

Дальнейшее увеличение этого соотношения уже не оказывает влияния на процесс тепловой агрегации S1 (см. кривые 4 и 5), поэтому мы можем заключить, что при весовом соотношении, равном 1:1, достигается некое насыщение. По-видимому, при этом весовом соотношении образуются комплексы S1 с Hsp27-3D, в которых все «липкие участки» на молекуле частично или полностью денатурированного S1 полностью экранированы за счет взаимодействия с малым белком теплового шока.

Рассмотрим теперь вопрос о стехиометрии взаимодействия S1 с Hsp27-3D. Допустим, что она постоянная и не зависит от весового соотношения Hsp27/S1. Если это так, то при ненасыщающих весовых соотношениях Hsp27/S1 (меньше 1:1) мы должны наблюдать расщепление распределения гидродинамических радиусов образующихся агрегатов на две субпопуляции, одна из которых соответствовала бы S1, полностью насыщенному малым белком тепловго шока, а другая – избыточному S1, лишенному sHsp. Rh частиц первой субпопуляции оставался бы почти неизменным во время инкубации, в то время как во второй субпопуляции наблюдался бы быстрый рост Rh. Однако при всех весовых соотношениях распределение гидродинамических радиусов образующихся агрегатов оставалось строго унимодальным (по крайней мере в течение тех промежутков времени наблюдения, для которых на Рис. 7 приводятся временные зависимости Rh). Таким образом, мы можем заключить, что стехиометрия взаимодействия S1 с sHsp варьирует в зависимости от весового соотношения sHsp/S1. Следует подчеркнуть, что этот вывод о стехиометрии взаимодействия хорошо согласуется с представлением о том, что в клетке sHsp не обладают высокой специфичностью к своим мишеням.

Нами установлено, что в условиях высокой ионной силы агрегация чистого S1 (в отсутствие sHsp) полностью лимитируется первой стадией денатурации его моторного домена, иными словами – каждое столкновение уже существующего агрегата с другими молекулами S1, у которых моторный домен частично денатурирован, приводит к слипанию. Отметим, что кривые 1–3 на Рис. 7 являются экспонентами, т. е. в тех случаях, когда рост агрегатов не подавлен полностью, агрегация S1 в присутствии Hsp27-3D (как и в его отсутствие) лимитируется какой-то реакцией первого порядка, которая, однако, как это хорошо видно из Рис. 7, протекает медленнее, чем агрегация S1 в отсутствие sHsp.

Следовательно, присутствие в системе sHsp привносит новую лимитирующую скорость стадию в процесс тепловой агрегации S1. Кроме того, скорость этой новой лимитирующей стадии тем меньше, чем выше весовое соотношение sHsp/S1 (оптимальное значение t2R (95% доверительный интервал) составляет 5.3±0.1 мин для чистого S1 (кривая 1 на Рис. 7) и увеличивается до 9.1±0.7 мин и 14.8±0.5 мин при весовом соотношении Hsp27-3D/S1, равном 1:4 (кривая 2) и 1:2 (кривая 3) соответственно). Почти полное подавление роста Rh при весовом соотношении 1:1 и выше можно формально интерпретировать как приближение скорости этой стадии к нулю. Исходя из этого, можно предположить, что в присутствии sHsp имеет место образование комплексов частично или полностью денатурированного S1 с шапероном. Это сопровождается частичным или полным (в зависимости от весового соотношения sHsp/S1) экранированием «липких участков» на поверхности S1, что приводит к уменьшению вероятности слипания при столкновении (которая зависит от суммарной площади доступных для взаимодействия «липких участков»). При низких весовых соотношениях sHsp/S1 (ниже 1:1) образуются комплексы S1 с Hsp27-3D, в которых не все липкие участки на поверхности частично или полностью денатурированного S1 экранированы от растворителя. По мере увеличения весового соотношения изменяется стехиометрия образующихся комплексов таким образом, что на одну молекулу S1 приходится больше молекул Hsp27-3D, и в результате суммарная площадь не экранированных «липких участков» уменьшается, приближаясь к нулю при весовом соотношении 1:1.

Аналитическое соосаждение Hsp27-3D с S Интерпретируя результаты экспериментов по изучению влияния sHsp на тепловую агрегацию S1, мы предположили образование комплексов S1 с Hsp27-3D. Чтобы проверить это предположение, была поставлена серия экспериментов по аналитическому соосаждению S1 с Hsp27-3D. Мы использовали смешанный (не разделенный на изоформы) препарат S1, т. к. эти эксперименты проводились в условиях высокой ионной силы (100 мМ NaCl). В качестве шаперона был выбран Hsp27-3D, неспособный образовывать крупные олигомеры. Нами было экспериментально показано, что даже после инкубации его раствора при 43oC в течение часа Hsp27-3D не осаждается при высокоскоростном центрифугировании и весь остается в супернатанте. Это значит, что свободный (т. е. не вовлеченный в комплексы с S1) Hsp27-3D всегда будет оставаться в супернатанте при ультрацентрифугировании. Смесь белков или чистый S1 прогревали при 43oC в течение различных промежутков времени, после чего препараты охлаждали, подвергали ультрацентрифугированию (20 мин при 140000 g) и исследовали содержание S1 и Hsp27-3D в супернатантах. Типичные электрофореграммы супернатантов представлены на Рис. 8А (S1 без sHsp) и Рис. 8Б (S1 в присутствии Hsp27-3D, весовое соотношение 1:1). На Рис. 8В приведены результаты количественной обработки этих электрофореграмм.

Исчезновение S1 из супернатантов регистрировалось по исчезновению его тяжелой цепи (обозначена как HC на Рис. 8А,Б). Можно видеть, что Hsp27-3D замедляет, но не предотвращает переход S1 в осадок. Кроме того, количество этого шаперона в супернатанте тоже уменьшается по мере инкубации его смеси с S1 при 43оС. Исчезновение Hsp27-3D из супернатантов хорошо коррелирует с исчезновением S1 (коэффициент корреляции между количествами HC-S1 и Hsp27-3D в супернатанте равен 0,9094). Таким образом, мы можем сделать вывод о том, что в этих условиях Hsp27-3D образует прочные комплексы с частично или полностью денатурированным S1 и включается в состав образующихся агрегатов.

1. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) проведен детальный сравнительный анализ тепловой денатурации двух изоформ изолированной головки миозина (субфрагмент 1 миозина, S1), содержащих разные «щелочные» легкие цепи: А1 и А2. Показано наличие в молекуле S1 двух калориметрических доменов (т. е.

участков, денатурирующих кооперативно и независимо друг от друга), причем более термостабильный домен денатурирует в 2 стадии.

2. На основании сопоставления данных ДСК, собственной триптофановой флуоресценции и инактивации ATPазы проведена идентификация калориметрических доменов S1. Установлено, что более термостабильный из них отражает тепловую денатурацию моторного домена миозиновой головки, а менее термостабильный соответствует регуляторнному домену головки. Показано, что две изоформы S различаются лишь по параметрам тепловой денатурации регуляторного домена.

3. Установлено, что в условиях высокой ионной силы (в присутствии 100 мМ KCl) тепловая агрегация двух изоформ S1 протекает с одинаковой скоростью, которая лимитируется первой стадией денатурации моторного домена.

4. Показано, что в условиях низкой ионной силы S1(A1) существенно отличается от S1(A2) по механизму тепловой агрегации. Это обусловлено взаимодействиями дополнительного N-концевого сегмента легкой цепи А1, отсутствующего у A2, с другими молекулами S1. Такие взаимодействия, сопровождаемые обратимой агрегацией S1(A1), имеют место даже при неденатурирующих условиях.

5. Показано, что малые белки теплового шока не оказывают влияния на тепловую денатурацию S1 и инактивацию миозиновой ATPазы, однако эффективно подавляют тепловую агрегацию S1 за счет образования устойчивых комплексов с частично или полностью денатурированными молекулами S1.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН и гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых-кандидатов наук.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

1. Markov D.I., Pivovarova A.V., Chernik I.S., Gusev N.B., Levitsky D.I. (2008) Small heat shock protein Hsp27 protects myosin S1 from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPase inactivation. FEBS Lett., 582, 1407–1412.

2. Марков Д.И., Николаева О.П., Левицкий Д.И. (2010) Влияние «существенной»

легкой цепи А1 миозина на агрегационные свойства миозиновой головки. Acta Naturae, 2, № 2(5), 81–85.

3. Markov D.I., Zubov E.O., Nikolaeva O.P., Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2010) Thermal denaturation and aggregation of myosin subfragment 1 isoforms with different essential light chains. International Journal of Molecular Sciences, 11, 4194–4226.

Тезисы докладов:

1. Markov D.I., Gusev N.B., Levitsky D.I. (2008) Interaction of myosin subfragment 1 with small heat shock proteins. Abstracts of the International Symposium “Biological Motility:

Achievements and Perspectives” (Pushchino, Moscow Region, May 11–15, 2008), p. 40– 2. Markov D.I., Pivovarova A.V., Levitsky D.I., Gusev N.B (2008) Analysis of effect of human small heat shock protein Hsp27 on thermal denaturation of skeletal muscle myosin and actin. Abstracts of XXXVII European Muscle Conference (Keble College, Oxford, UK, September 13–16, 2008), p. 101.

3. Левицкий Д.И., Пивоварова А.В., Марков Д.И., Гусев Н.Б. (2009) Как малые белки теплового шока защищают актин и миозин от агрегации в условиях стресса. Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды» (г. Казань, 23–27 июня 4. Марков Д.И. (2010) Механизм тепловой денатурации и агрегации субфрагмента миозина. Тезисы докладов XVII международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010» (Москва 12–15 апреля 2010 г.), с.

5. Markov D.I., Zubov E.O., Nikolaeva O.P., Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2010) Thermally induced denaturation and aggregation of myosin subfragment 1: new insight and proposed mechanism. Abstracts of International Symposium “Biological motility:

from fundamental achievements to nanotechnologies” (Pushchino, Moscow region, Russia, May 11–15, 2010), p. 164–165.

6. Markov D.I., Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2010) New insight into the mechanism of thermal denaturation and aggregation of the myosin head. FEBS J., v. 277, Suppl. 1, p.

290. (Abstracts of the 35th FEBS Congress and YSF 2010, Gothenburg, Sweden, June 23 – Данный автореферат разрешается перепечатывать и копировать частично или полностью при выполнении следующих условий:

1. материал воспроизводится в неизменном виде;

2. указывается ссылка на источник;

3. перепечатывание или копирование производится в некоммерческих целях.



 
Похожие работы:

«ПАНОВ Алексей Валерьевич ОБОСНОВАНИЕ, ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И ОПТИМИЗАЦИЯ ЗАЩИТНЫХ И РЕАБИЛИТАЦИОННЫХ МЕРОПРИЯТИЙ НА ТЕРРИТОРИЯХ, ПОДВЕРГШИХСЯ ЗАГРЯЗНЕНИЮ ПОСЛЕ АВАРИИ НА ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АЭС Специальность: 03.00.01 – радиобиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Обнинск - 2009 2 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научноисследовательской институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии...»

«ГУЧАСОВ ЗАУРБЕК МУАЕДОВИЧ Флора Скалистого хребта и Юрской депрессии Кабардино-Балкарии (Центральный Кавказ) и ее анализ. Специальность 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ставрополь 2003 Работа выполнена на кафедре ботаники биологического факультета Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х. М. Бербекова. Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Шхагапсоев С. Х. Официальные...»

«ИВОНИН АЛЕКСЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ ОЦЕНКА АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ ШТАММА YERSINIA PESTIS EV НИИЭГ НА МОДЕЛИ ЭРИТРОЦИТОВ 03.02.03 микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань 2010 2 Работа выполнена на кафедре морфологии и микробиологии ФГОУ ВПО Вятская государственная сельскохозяйственная академия Научный руководитель доктор биологических наук, профессор Романов Владимир Евдокимович Официальные оппоненты : доктор медицинских наук,...»

«Емельянов Алексей Валерьевич ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ МОНИТОРИНГА И УПРАВЛЕНИЯ РЕСУРСАМИ ОБЫКНОВЕННОГО БОБРА (CASTOR FIBER LINNAEUS, 1758) В БАССЕЙНАХ СРЕДНИХ РЕК 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Саратов – 2013 1 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского на кафедре морфологии и экологии животных и в ФГБОУ ВПО Тамбовский государственный...»

«Салеем Кайд Мохаммед Абдулла ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГУМИНОВЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДЕТОКСИКАЦИИ И БИОДЕГРАДАЦИИ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.00.16 –экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук 2 МОСКВА 2003 г. Работа выполнена в Российском государственеом университете нефти и газа им. И. М. Губкина на кафедре промышленной экологии. Научный...»

«ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Цыганов Андрей Николаевич Морфологическая изменчивость, видовой состав и структура сообществ сфагнобионтных раковинных амёб Специальность 03.00.18 – Гидробиология 03.00.08 – Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2007 Работа выполнена на кафедре гидробиологии Биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова. Научные руководители:...»

«ЖИГАДЛОВА Галина Геннадьевна МОРСКИЕ ВОДОРОСЛИ - МАКРОФИТЫ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ КАМЧАТКИ (биоразнообразие, систематика, биология, рациональное использование) 03.00.18 - гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2007 2 Работа выполнена в Лаборатории гидробиологии Камчатского филиала Тихоокеанского института географии ДВО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Горюнова Юлия Дмитриевна ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА СОДЕРЖАНИЕ В РАСТЕНИЯХ НЕКОТОРЫХ АНТИОКСИДАНТОВ Специальность 03.00.16 – Экология 03.00.12 – Физиология и биохимия растений Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград – 2009 Работа выполнена в Российском государственном университете имени Иммануила Канта. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Чупахина Галина Николаевна Официальные оппоненты :...»

«САДЕКОВА ОЛЬГА НИКОЛАЕВНА Генетические маркеры привычного невынашивания беременности I триместра 14.01.01 - Акушерство и гинекология 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2012 Работа выполнена на кафедре биохимии и молекулярной медицины Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова Научные руководители: ООО Клиника на Петровке доктор медицинских...»

«СУСЛОВА Мария Юрьевна РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РАЗНООБРАЗИЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ 03.00.16 – экология 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2007 Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск Научный кандидат биологических наук руководитель: ст.н.с. Парфенова Валентина Владимировна Официальные Доктор биологических наук...»

«3 МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. Ломоносова _ ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Куликова Наталья Александровна СВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ ПО ОТНОШЕНИЮ К АТРАЗИНУ 03.00.27 –ПОЧВОВЕДЕНИЕ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва- Работа выполнена на кафедре общего земледелия факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова. Научные...»

«Ребриков Денис Владимирович ПОЛИМОРФНЫЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ И ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИХ АЛЛЕЛЬНОГО СТАТУСА В СЛОЖНЫХ СМЕСЯХ МОЛЕКУЛ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ Специальности 03.00.15 – генетика 03.00.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2008 Работа выполнена в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Институте общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН и ЗАО НПФ ДНК-Технология (г....»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«ОВЧИННИКОВА АННА БОРИСОВНА ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ КУЛЬТУРНЫХ ВИДОВ КАРТОФЕЛЯ НА ОСНОВЕ ПОЛИМОРФИЗМА ЯДЕРНЫХ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ И ИЗМЕНЧИВОСТИ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ 03.02.07. – Генетика 03.02.01. – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт – Петербург - 2011 -2 Работа выполнена в отделе биотехнологии и в отделе агроботаники и сохранения in situ генетических ресурсов растений Государственного научного учреждения...»

«Лобуничева Екатерина Валентиновна ЗООПЛАНКТОН МАЛЫХ ВОДОЕМОВ РАЗНЫХ ЛАНДШАФТОВ ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.00.16 – экология 03.00.18 – гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук БОРОК – 2009 Работа выполнена в ГОУ ВПО Вологодский государственный педагогический университет и Вологодской лаборатории ФГНУ ГосНИОРХ Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Болотова Наталья Львовна кандидат биологических наук, доцент...»

«СОЛОВЬЕВА ИРИНА ВЛАДЛЕНОВНА МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗНОЙ МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА 03.02.08 – экология (биология) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Нижний Новгород 2013 2 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«БУХАРОВА Надежда Владимировна АФИЛЛОФОРОВЫЕ ГРИБЫ ГОСУДАРСТВЕННОГО ПРИРОДНОГО ЗАПОВЕДНИКА БАСТАК 03.02.01 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владивосток – 2013 Работа выполнена в лаборатории низших растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Биолого-почвенного института ДВО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук Булах Евгения Мироновна Научный консультант : кандидат биологических...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«Чудаев Дмитрий Алексеевич ДИАТОМОВЫЕ ВОДОРОСЛИ ОЗЕРА ГЛУБОКОГО (МОСКОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2014 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Благодаря более чем столетней истории существования одноименной гидробиологической станции, оз. Глубокое считается модельным водоемом для...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.