WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

МИХАЙЛОВА Валерия Вадимовна

Тепловая денатурация актиновых филаментов и влияние

на нее актин-связывающего белка кофилина

03.00.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д. И.Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук С.Ю. Хайтлина кандидат биологических наук А.В. Воротников

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится декабря года в часов на заседании «11» диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу:

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » ноября 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Актин является одним из самых распространенных белков в природе. Он присутствует во всех эукариотических клетках, а в последнее время актиноподобные белки были обнаружены и у прокариот. Актин – глобулярный белок с молекулярной массой 42 кДа, который может существовать как в виде мономера (G-актин), так и в виде длинных полярных филаментов (F-актин), образующихся в результате полимеризации G-актина. Актиновые филаменты являются одним из главных компонентов цитоскелета эукариотических клеток, а их взаимодействие с миозином лежит в основе мышечного сокращения и множества иных процессов биологической подвижности. Полимеризация актина (образование филаментов F-актина из мономерного G-актина) представляет собой обратимый динамический процесс, который сопровождается гидролизом АТФ и контролируется множеством актин-связывающих белков. Особое место среди них занимает белок кофилин, способный взаимодействовать как с мономерным G-актином, так и с филаментами F-актина, вызывая фрагментацию филаментов и значительно повышая скорость их деполимеризации. В последнее время множество работ было посвящено свойствам этого белка – главным образом, его влиянию на структуру актиновых филаментов и на динамику их сборки-разборки.

Изучение тепловой денатурации белков позволяет получать новую ценную информацию об их структуре и о тех конформационных перестройках, которые происходят в белках при моделировании процессов их функционирования. Для этого применяется метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК), позволяющий подробно изучать процесс тепловой денатурации белка. Этот метод давно уже успешно применяется в нашей лаборатории для структурно-функциональных исследований мышечных белков [Левицкий и др., 1998; Левицкий, 2004]. При этом, однако, до сих пор практически не проводились систематические исследования тепловой денатурации F-актина. Ясно было лишь одно – то, что это очень сложный процесс, не поддающийся описанию с использованием имеющихся моделей тепловой денатурации белка. Несмотря на значительное количество опубликованных к настоящему времени данных, механизм тепловой денатурации актиновых филаментов до сих пор оставался неизвестным и для его выяснения требовалось множество дополнительных экспериментов. Еще меньше было известно о том, как взаимодействие с различными актин-связывающими белками отражается на тепловой денатурации актиновых филаментов. Выяснение этих вопросов и составило главную цель предпринятого нами исследования.

Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы стало изучение тепловой денатурации F-актина и влияния актин-связывающих белков на этот процесс. В соответствии с этой целью были поставлены следующие конкретные задачи:

1). Методом ДСК провести исследования тепловой денатурации актиновых филаментов в широком диапазоне условий, варьируя различными факторами (такими, как концентрация белка и добавленных нуклеотидов, а также скорость прогрева), и попытаться описать механизм этого процесса.

2). Исследовать влияние актин-связывающего белка кофилина на процесс тепловой денатурации мономерного G-актина и филаментов F-актина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основании результатов проведенных исследований предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что необратимой тепловой денатурации F-актина предшествуют по крайней мере две обратимые стадии – высвобождение прочно связанной АДФ из субъединиц актина и отщепление субъединиц с концов актиновых филаментов.

2. Применение метода ДСК впервые позволило выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина, а именно стабилизацию актиновых филаментов при стехиометрических концентрациях кофилина и сильную дестабилизацию филаментов при суб-стехиометрических концентрациях кофилина.

Научная новизна. Впервые предложен механизм тепловой денатурации F-актина, главной особенностью которого является то, что актиновый филамент не денатурирует целиком как единое целое, как зачастую считалось ранее. Напротив, необратимой тепловой денатурации актиновых субъединиц в филаменте предшествуют по крайней мере две обратимые стадии – диссоциация субъединиц с концов актиновых филаментов и высвобождение из них прочно связанной АДФ. Результаты экспериментов, проведенных методом ДСК, впервые позволили выявить два совершенно противоположных эффекта актин-связывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина. Показано, что при стехиометрическом связывании (т.е. при полном насыщении актина кофилином) кофилин заметно увеличивает термостабильность как мономерного G-актина, так и филаментов F-актина. Оказалось, однако, что при низких концентрациях кофилин дестабилизирует актиновые филаменты, заметно смещая максимум теплового перехода F-актина в сторону более низкой температуры. Дестабилизация F-актина кофилином происходила с очень высокой кооперативностью и наблюдалась даже при очень низких концентрациях кофилина (при молярном отношении кофилин/актин, равном 1:100 и даже ниже). На основании этих данных был сделан вывод, что кофилин, связываясь с F-актином, стабилизирует те его субъединицы, с которыми он непосредственно связывается, но с высокой кооперативность дестабилизирует множество соседних субъединиц в актиновом филаменте, свободных от кофилина.

Научно-практическая ценность. Полученные данные расширяют и углубляют представления о механизмах тепловой денатурации сложных олигомерных белков и их комплексов и могут быть использованы при чтении курсов лекций по биохимии и биофизике. Дестабилизация F-актина кофилином, обнаруженная нами впервые методом ДСК, может играть важную роль в динамике актиновых филаментов в живой клетке, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций – ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации.

Калориметрические подходы, разработанные при исследованиях комплексов актина с кофилином, могут в дальнейшем успешно использоваться для изучения взаимодействия мономерного G-актина и филаментов F-актина с другими актин-связывающими белками.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на III Съезде биохимического общества (г. Санкт-Петербург, 2002), на 31-й, 32-й, 33-й, 34-й и 35-й Европейских мышечных конференциях (г. Люнтерен, Нидерланды, 2002; г. Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004; г. Дебрецен, Венгрия, 2005; г. Гейдельберг, Германия, 2006), на Международных симпозиумах «Биологическая подвижность» (г.

Пущино-на-Оке Московской области, 2004; 2006) и на 30-м Международном конгрессе FEBS (г. Будапешт, Венгрия, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ ( статьи в рецензируемых журналах и 10 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения ( главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы ( источников).

Диссертация изложена на страницах, содержит 24 рисунка и 1 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему моменту сведения о структуре и свойствах мономерного G-актина, филаментов F-актина и актинсвязывающего белка кофилина, а также анализируются имеющиеся в литературе данные о взаимодействии между этими белками. Особое внимание уделяется анализу имеющихся в литературе данных о тепловой денатурации G-актина и F-актина, исследованной методом ДСК.

Материалы и методы исследования Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации. За час до использования мономерный G-актин в G-буфере (2 мМ трис-HCl, рН 8,0, 0,2 мМ АТФ, 0,2 мМ CaCl2, 0,5 мМ -меркаптоэтанол) полимеризовали, добавляя MgCl2 до конечной концентрации 2 мМ, и использовали в F-форме. Рекомбинантные малые белки теплового шока человека – Hsp27-wt (малый белок теплового шока дикого типа с кажущейся молекулярной массой 27 кДа) и Hsp27-3D (мутант Hsp27 с имитацией фосфорилирования путем замены остатков серина в положениях 15, 78 и 82 на остатки аспарагиновой кислоты) были любезно предоставлены профессором Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В.

Ломоносова). Рекомбинантный дрожжевой кофилин был любезно предоставлен И.В.

Дедовой (Department of Anatomy and Histology, University of Sydney, Сидней, Австралия).

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино-на-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Для получения кривых теплопоглощения препарат белка с концентрацией 0,5–2 мг/мл в буфере 30 мM Hepes-KOH (рН 7,3), содержащем 2 мM MgCl2, или в G-буфере (pH 8,0), содержащем Hepes-KOH вместо трис-HCl, помещали в ячейку прибора и прогревали с постоянной со скоростью, равной 0,5, 1,0 или 1,8 град/мин, от 5 до 100оС при постоянном давлении 2,2 атм. Базовую линию записывали, помещая в рабочую и контрольную ячейки используемый в опыте буфер. Для проверки обратимости тепловой денатурации исследуемых белков, после первого сканирования и последующего охлаждения ячеек до 5oС пробу подвергали повторному прогреву в тех же условиях. Тепловая денатурация актина была полностью необратимой. Из каждой полученной кривой теплопоглощения белка вычитали или инструментальную базовую линию, или кривую, полученную при повторном прогреве образца.

Для обработки и анализа кривых теплопоглощения актина использовали пакеты программного обеспечения “Origin 1,16” и “Origin 7,0” фирмы “MicroCal” (США).

Калориметрическую энтальпию (Нcal) определяли как площадь под пиком на кривой теплопоглощения, а кооперативность теплового перехода – как ширину пика на его полувысоте.

Процесс тепловой агрегации F-актина контролировали, регистрируя температурные зависимости светорассеяния F-актина. Светорассеяние измеряли на флуоресцентном спектрофотометре Cary Eclipse (Varian), нагревая образец с постоянной скоростью 1°С в минуту от 25°С до 90°С при скрещенных монохроматорах и длине волны 350 нм.

Температуру измеряли датчиком, погруженным непосредственно в раствор белка.

Измерения температурных зависимостей светорассеяния проводили в тех же условиях, при той же концентрации белка и при той же скорости нагрева, что и в соответствующих экспериментах методом ДСК.

При центрифугировании на больших скоростях филаменты актина осаждаются.

Если в растворе есть небольшие молекулы, способные связываться с актиновыми филаментами, то они также будут обнаруживаться в осадках вместе с ними.

Следовательно, анализируя осадки и супернатанты после ультрацентрифугирования, можно делать выводы о способности небольших белков взаимодействовать с F-актином.

Для проведения таких экспериментов по соосаждению использовали ультрацентрифугу Airfuge фирмы «Beckman» с ротором 18о. Подготовленные растворы белков объемом 100– 200 мкл центрифугировали в течение 20 минут при 140000 g. Затем отбирали супернатанты, а осадки суспендировали в буфере того же объема, что и исходный объем образца. Содержание белков в супернатантах и осадках анализировали при помощи SDSэлектрофореза в полиакриламидном геле.

Белковый состав проб анализировали методом вертикального SDS-электрофореза по методу Лэммли. В работе использовали 13% и 15% разделяющие гели. Электрофорез проводили в камере Mini-Protean 3 Сell (Bio-Rad) при постоянном напряжении 200 В. Гель окрашивали раствором Кумасси R-250. Полученные гели сканировали, используя планшетный сканер Umax Astra 6700. Электрофореграммы обрабатывали с помощью программы ImageQuant 5.2.

Для изучения свойств гидрофобных поверхностей нативного и денатурированного актина исследовали спектры флуоресценции зонда ANS. В работе использовали флуоресцентный спектрофотометр Cary Eclipse (Varian). Длины волн возбуждения флуоресценции составляли 292 нм – для триптофана и 400 нм – для ANS.

Влияние нуклеотидов на характер тепловой денатурации F-актина.

В ходе исследования тепловой денатурации актиновых филаментов было замечено, что термостабильность F-актина сильно зависит от концентрации добавленного нуклеотида (АДФ или АТФ). Из рисунка 1А видно, что увеличение концентрации АДФ в растворе приводит к заметному смещению кривой теплопоглощения F-актина в сторону более высоких температур. Аналогичный эффект наблюдается и в случае АТФ (данные не представлены). Температура максимума теплового перехода F-актина (Tмакс) возрастает на 5–6 градусов с увеличением концентрации АДФ вплоть до 1 мМ и выходит на плато при более высоких концентрациях АДФ (рис.1Б). Данный эффект не зависел от скорости нагрева образца и наблюдался при трех использованных скоростях – от 0,5 до 1,8 град/мин.

Рис. 1. Влияние концентрации добавленной АДФ на тепловую денатурацию F-актина.

(А) Слева направо представлены кривые теплопоглощения F-актина, полученные в (Б) Зависимость температуры максимума теплового перехода F-актина (Tмакс) от Концентрация белка 1,5 мг/мл. Скорость Hepes-KOH, pH 7,3, 2 мМ MgCl2.

Стабилизирующий эффект АДФ поскольку он наблюдается лишь в нуклеозид-дифосфатов (IDP, UDP, GDP, CDP). Более того, некоторые из них (UDP, GDP и CDP) даже несколько снижали термостабильность F-актина (рис. 2).

Напротив, сильный эффект стабилизации F-актина в присутствии АТФ значительно менее специфичен, т. к. он наблюдается, хотя и в меньшей степени, для других исследованных нуклеозид-трифосфатов (ITP, UTP, GTP) (рис. 2). Это наводит на мысль о том, что стабилизирующий эффект АТФ существенно отличается по своему механизму от эффекта, вызываемого АДФ. Не исключено, что АТФ и другие нуклеозид-трифосфаты могут взаимодействовать не только с высокоспецифическим участком связывания нуклеотидов, расположенным в нуклеотид-связывающей щели между двумя доменами в молекуле актина, но и с дополнительным нуклеотид-связывающим участком в F-актине. Наличие в актине такого «второго» участка связывания нуклеотидов с низкой специфичностью и низким сродством было ранее отмечено в литературе. Связывание нуклеотидов в этом участке происходит при их миллимолярных концентрациях, причем ИТФ и ЦТФ связываются даже эффективнее, чем АТФ.

По-видимому, стабилизирующий эффект АТФ в значительной степени обусловлен именно ее взаимодействием со «вторым» нуклеотид-связывающим участком в F-актине. В пользу этого предположения говорит тот факт, что повышение концентрации АТФ от 1 до 5 мМ приводит к дальнейшему увеличению термостабильности F-актина, тогда как подобное повышение концентрации АДФ уже не оказывает никакого влияния на термостабильность (рис. 3). Самые значительные изменения в термостабильности F-актина происходят при низких концентрациях добавленного нуклеотида (0,1–0,2 мМ) и в этих условиях эффекты АДФ и АТФ очень сходны между собой. Подобные эффекты очень трудно объяснить каким-либо взаимодействием АДФ или АТФ с дополнительным нуклеотид-связывающим участком в F-актине, для которого требуются значительно более высокие концентрации нуклеотида.

Рис. 2. Сравнение эффектов различных нуклеозид-дифосфатов (ADP, IDP, UDP, GDP и CDP) и нуклеозид-трифосфатов (ATP, ITP, UTP, GTP), а также неорганического пирофосфата (PPi) на температуру максимума теплового перехода F-актина (Tмакс). F-a – F-актин в отсутствие добавленных нуклеотидов. Концентрация актина – 1 мг/мл, концентрация всех нуклеотидов – мМ, пирофосфата – 5 мМ. Скорость нагрева 1,8 град/мин.

Tмакс, C Однако стабилизирующее влияния нуклеотидов на тепловую денатурацию F-актина может быть объяснено иным образом, нежели взаимодействием нуклеотидов с дополнительными сайтами связывания. Мы предполагаем, что необратимой тепловой денатурации F-актина предшествует обратимая стадия диссоциации нуклеотида (АДФ) из специфических нуклеотид-связывающих центров в актиновых субъединицах. Хорошо известно, что актин, лишенный нуклеотидов, крайне нестабилен и легко денатурирует. Он сохраняет стабильность и способность к образованию филаментов F-актина лишь в присутствии высоких концентраций сахарозы. В обычных условиях АДФ, прочно связанная с субъединицами F-актина, неспособна обмениваться со свободными нуклеотидами. Обратимая диссоциация АДФ из нуклеотид-связывающего центра протомера актина происходит, по-видимому, лишь в процессе нагрева, непосредственно перед необратимой денатурацией белка. Присутствие в растворе свободного нуклеотида (АДФ или АТФ) препятствует такой диссоциации, и именно этим можно объяснить вызываемое нуклеотидами увеличение термостабильности F-актина.

Зависимость тепловой денатурации F-актина от концентрации белка.

Известно, что при тепловой денатурации многих олигомерных белков и ферментов температура максимума теплового перехода (Tмакс) заметно повышается с увеличением концентрации белка. Исследование тепловой денатурации F-актина при разных концентрациях белка показало, что в случае актиновых филаментов зависимость положения максимума кривой теплопоглощения от концентрации белка выражена достаточно сильно (рис. 4). Согласно современным представлениям, наличие подобной зависимости температуры максимума теплового перехода от концентрации белка свидетельствует о том, что необратимой тепловой денатурации белковых субъединиц предшествует обратимая стадия их диссоциации из состава олигомера. Следовательно, можно предположить, что перед необратимой денатурацией F-актина происходит обратимая фрагментация актиновых филаментов (или диссоциация коротких олигомеров с одного из концов филамента).

Для проверки этого предположения были исследованы подобные зависимости для актина в разных состояниях: для мономерного G-актина, для филаментов F-актина, а также для F-актина, стабилизированного фаллоидином или фторидом алюминия (AlF4-). На рис. показаны зависимости температуры максимума теплового перехода (Tмакс) от концентрации белка для всех описанных выше состояний актина. Видно, что для F-актина величина Tмакс увеличивается почти на 3 градуса при повышении концентрации белка с 0, до 2,0 мг/мл. Сходная зависимость величины Tмакс от концентрации белка обнаружена также для F-актина, стабилизированного фаллоидином, в то время как в присутствии AlF4такая зависимость выражена значительно слабее. Что касается мономерного G-актина, то в этом случае, как и ожидалось, величина Tмакс вообще не зависела от концентрации белка (рис. 4). Эти данные подтверждают наше предположение о наличии обратимой стадии фрагментации F-актина непосредственно перед необратимой денатурацией белка.

Тмакс, С Предполагаемый механизм тепловой денатурации актинового филамента.

На основании полученных данных был предложен новый «диссоциативный»

механизм тепловой денатурации F-актина. В основу этой модели легли приведенные выше предположения о том, что необратимой тепловой денатурации F-актина предшествуют по крайней мере две обратимые стадии – высвобождение нуклеотида (АДФ) из нуклеотидсвязывающих центров субъединиц актина и фрагментация актиновых филаментов.

Завершается процесс денатурации агрегацией денатурированных молекул белка.

На рис. 5 схематически представлен «диссоциативный» механизм тепловой денатурации филаментов F-актина. Предполагается, что в процессе нагрева актиновые филаменты подвергаются дестабилизации, подвижность их увеличивается, а связи между отдельными актиновыми субъединицами ослабляются. Вследствие этого происходит фрагментация F-актина: короткие олигомеры отрываются с одного из концов полярного актинового филамента (скорее всего, с «минус»-конца, на котором скорость отщепления субъединиц актина значительны выше, чем на растущем «плюс»-конце). В том случае, если отщепившиеся олигомеры утрачивают связанную АДФ из нуклеотид-связывающих центров актиновых субъединиц, то, становясь крайне нестабильными, они достаточно быстро подвергаются денатурации и последующей агрегации. Однако содержащие АДФ олигомеры способны вновь связаться с актиновым филаментом, причем вероятнее всего подобное связывание будет происходить с «плюс»-концом ближайшего соседнего филамента.

D D DD D D D

DD D D D D D D

D D D D D D D D D D D D DD D

DDD DDDDD

DDD D DD

Предложенная модель (рис. 5) позволяет объяснить полученные нами данные о том, что тепловая денатурация F-актина зависит как от концентрации АДФ, так и от концентрации белка. В силу того, что в процессе нагрева нуклеотид (АДФ) в нуклеотидсвязывающем центре молекулы актина может, по-видимому, обмениваться с нуклеотидами в растворе, избыток свободной АДФ затрудняет вызываемое нагревом обратимое высвобождение прочно связанной АДФ из актиновых субъединиц. Увеличение же концентрации белка приводит к увеличению количества актиновых филаментов, а, соответственно, и их растущих «+»-концов, к которым могут присоединяться олигомеры актина.

Следует отметить существенные различия во влиянии фаллоидина и AlF4- на зависимость Tмакс от концентрации белка (рис. 4). Несмотря на то, что оба стабилизирущих агента резко увеличивают термостабильность F-актина, они делают это независимо друг от друга, и механизм стабилизации актинового филамента данными агентами имеет совершенно разную природу. Фаллоидин повышает термостабильность F-актина, усиливая связи между соседними субъединицами в актиновом филаменте, тогда как AlF4- оказывает сходный эффект путем прочного удерживания АДФ в нуклеотид-связывающем центре актина. Таким образом, комплекс АДФ-AlF4--актин, имитирующий промежуточное состояние АДФ-Фн-актин в цикле полимеризации актина, должен препятствовать высвобождению АДФ из субъединиц актина и, с другой стороны, стимулировать присоединение актиновых мономеров или коротких олигомеров к «растущему» «+»-концу филамента. В свете предложенной выше модели это означает, что AlF4- может оказывать влияние на обе обратимые стадии, предшествующие необратимой тепловой денатурации F-актина, делая таким образом зависимость Tмакс от концентрации F-актина менее выраженной и приближая ее к зависимости, характерной для мономерных белков. Это хорошо согласуется с полученными нами данными (рис. 4).

Данные литературы, свидетельствующие в пользу «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.

Для того, чтобы предложенную нами модель тепловой денатурации актиновых филаментов можно было считать достаточно обоснованной, мы в первую очередь обратились к опубликованным к настоящему время данным литературы в поисках необходимых подтверждений наших предположений.

Одним из важнейших положений предлагаемого механизма тепловой денатурации актиновых филаментов (рис. 5) является утверждение о том, что содержащие АДФ короткие олигомеры актина, отщепившиеся с «–»-конца филамента, могут вновь связываться с растущими «+»-концами соседних филаментов. В настоящее время хорошо известно, что содержащий связанную АДФ мономерный G-актин способен полимеризоваться с образованием филаментов F-актина, причем филаменты, полученные из АДФ-G-актина и АТФ-G-актина, достаточно близки по своим свойствам. Кроме того, возможно присоединение АДФ-G-актина к растущим концам уже сформированных актиновых филаментов [Pollard, 1984; 1986]. Помимо этого, опубликован целый ряд работ, свидетельствующих о способности F-актина образовывать длинные нити из коротких филаментов актина. Такое явление обусловлено взаимодействием между «+»- и «–»концами двух филаментов, с сохранением их полярности, и получило название «отжига»

[Murphy et al., 1988; Sept et al., 1999; Andrianantoandro et al., 2001]. Данный процесс происходит спонтанно, не требует наличия содержащих АТФ мономеров G-актина или гидролиза АТФ, не зависит от природы нуклеотида, связанного с протомерами актина на концах нити, а наличие стабилизатора (фаллоидин) не оказывает на этот процесс заметного влияния. Таким образом, приведенные выше данные свидетельствуют о том, что постулируемое в нашей модели присоединение содержащих АДФ коротких олигомеров актина к растущим концам актиновых филаментов (рис. 5) является вполне вероятным.

Кроме того, нами был проведен целый ряд дополнительных экспериментов для проверки основных постулатов предложенной модели тепловой денатурации F-актина.

Здесь стоит отметить тот факт, что при исследовании тепловой денатурации актина нельзя не принимать во внимание сопровождающий ее процесс агрегации белка. Именно стадия агрегации является последней в описанном выше «диссоциативном» механизме денатурации актиновых филаментов (рис. 5). Поэтому для получения полного представления о процессе тепловой денатурации F-актина, необходимо подробно исследовать его тепловую агрегацию.

Тепловая агрегация актина.

Для детального исследования агрегации актина нами был использован метод светорассеяния, позволяющий регистрировать изменения интенсивности светорассеяния раствора белка в процессе его нагрева. Было показано, что в процессе агрегации мономерного G-актина интенсивность светорассеяния увеличивается очень незначительно, в то время как агрегация F-актина сопровождается заметным ростом светорассеяния.

Важно отметить, что исследования температурных зависимостей светорассеяния проводились в тех же условиях и при той же скорости нагрева, что и эксперименты по изучению тепловой денатурации актина методом ДСК. Это позволяло нам сопоставлять температурные зависимости тепловой денатурации актина с температурными зависимостями его агрегации. В результате была обнаружена очень хорошая корреляция между тепловой денатурацией актина (рис. 6, DSC) и увеличением светорассеяния, обусловленного агрегацией белка (рис. 6, LS). Полученный результат указывает на то, что в процессе нагрева денатурированные молекулы актина сразу подвергаются агрегации, и именно эта стадия является заключительной в процессе тепловой денатурации актинового филамента.

Исследование процесса тепловой денатурации актина при помощи гидрофобного флуоресцентного зонда ANS.

Одним из подтверждений высказанного нами предположения о том, что денатурации подвергаются не целые актиновые филаменты, а отдельные короткие олигомеры, отрывающиеся от филамента в процессе нагрева, стали результаты исследований тепловой денатурации актина с использованием гидрофобного флуоресцентного зонда 1анилинонафталин-8-сульфоната (ANS). Этот зонд интересен тем, что при его взаимодействии с гидрофобными кластерами, появляющимися на поверхности белка при его денатурации, наблюдается резкий прирост флуоресценции ANS.

Теплопоглощение, мкВт Светорассеяние, отн. ед.

Интенсивность флуоресценции, отн. ед.

На рис. 7 представлены спектры флуоресценции, полученные в присутствии ANS для G- и F-актина при комнатной температуре (нативные белки) и после их прогрева до 70оС (полностью денатурированные белки). Хорошо видно, что флуоресценция ANS (пик с максимумом при ~470 нм) наблюдается лишь в случае денатурированных белков (спектры 3 и 4 на рис. 7), тогда как для нативных белков подобного эффекта не выявлено. G- и Fактин мало отличаются друг от друга по величине прироста флуоресценции ANS, и спектры флуоресценции зонда, связанного с денатурированным актином, для них очень похожи (рис. 7). Необходимо отметить, что данный эффект наблюдался вне зависимости от длины волны возбуждения (292 нм или 400 нм). Сходство полученных в результате тепловой денатурации G- и F-актина спектров флуоресценции ANS позволяет предположить, что гидрофобные свойства поверхностей обоих денатурированных белков отличаются незначительно.

Исследования температурных зависимостей интенсивности флуоресценции ANS для G-актина и F-актина показали, что прирост флуоресценции ANS непосредственно связан с процессом тепловой денатурации актина, а не с его последующей агрегацией. В силу того, что спектры флуоресценции связанного с денатурированным актином гидрофобного зонда ANS для G- и F-актина демонстрируют столь заметное сходство (рис. 7), представляется вероятным, что и тепловая денатурация этих белков в данных условиях происходит сходным образом. Из литературы известно, что денатурация мономерного G-актина приводит к образованию небольших комплексов, состоящих из ограниченного количества развернутых молекул белка. Следовательно, на основании того, что гидрофобные поверхности денатурированного G- и F-актина имеют схожие свойства, можно предположить, что актиновый филамент денатурирует не целиком, а сначала распадается на отдельные небольшие олигомеры, которые в процессе денатурации образуют комплексы, аналогичные растворимым комплексам денатурированного мономерного Gактина. Это является еще одним свидетельством в пользу предложенного «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина (рис. 5).

Влияние малых белков теплового шока на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации.

Еще одно подтверждение предложенного механизма тепловой денатурации актиновых филаментов (рис. 5) было получено при исследованиях взаимодействия F-актина с малыми белками теплового шока (sHSP). Считается, что в клетке эти белки предотвращают агрегацию различных денатурированных белков, не обладая при этом узкой специфичностью.

Методом ДСК было показано, что sHSP не оказывают никакого влияния на процесс тепловой денатурации F-актина. Однако при измерениях температурных зависимостей светорассеяния, проводимых в тех же условиях, что и эксперименты методом ДСК, было установлено, что sHSP эффективно предотвращают агрегацию денатурированного актина, смещая кривую светорассеяния более чем на 20оС в сторону более высоких температур (рис. 8). Для того, чтобы понять механизм такого защитного действия sHSP на агрегацию F-актина при его тепловой денатурации, были проведены эксперименты по соосаждению F-актина с Hsp27-3D (псевдофосфорилированный мутант малого белка теплового шока Hsp27, существующий в виде небольших димеров или тетрамеров). Смесь белков прогревали с постоянной скоростью (1оС/мин) от 25 до 90оС, контролируя процесс агрегации по приросту светорассеяния (рис. 8, левый плот). По достижению определенных значений температуры (25, 70 или 90оС) отбирали аликвоты белка, которые затем охлаждали, подвергали ультрацентрифугированию и с помощью SDS-гель электрофореза определяли содержание белков в осадках (p) и супернатантах (s) (рис. 8, правый плот).

Светорассеяние, отн. ед.

Рис. 8. Влияние малого белка теплового шока Hsp27-3D на агрегацию F-актина в процессе его тепловой денатурации. F-актин (1 мг/мл) в отсутствие (кривая 1) или в присутствии Hsp27-3D (0,33 мг/мл) (кривая 2) прогревали с постоянной скоростью 1 град/мин и регистрировали агрегацию по приросту светорассеяния (LS). При определенных температурах, отмеченных стрелками (25, 75 и 90оС), отбирали аликвоты, охлаждали их и центрифугировали в течение мин при 140000g, после чего методом SDS-ПААГ-электрофореза определяли содержание актина и Hsp27-3D в осадках и супернатантах. На правом плоте представлены электрофореграммы, показывающие распределение белков (актин и Hsp27-3D) в супернатантах (s) и осадках (p) после прогрева F-актина до указанной температуры в отсутствие (А) или в присутствии Hsp27-3D (В).

Слева отмечены положения полос актина (actin) и Hsp27-3D (Hsp) на электрофореграмме.

Одним из самых важных результатов этого эксперимента явилось то, что после прогрева до 70оС (т.е. после полной необратимой денатурации F-актина) в отсутствие Hsp27-3D весь актин обнаруживался в осадке, тогда как в присутствии Hsp27-3D более 70 % актина и почти весь Hsp27-3D одновременно обнаруживались в супернатанте (рис. 8).

Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе нагрева sHSP образуют с денатурированным актином стабильные хорошо растворимые комплексы, которые не осаждаются в процессе ультрацентрифугирования. Подобные результаты могут быть интерпретированы следующим образом: малые белки теплового шока связываются с денатурированными короткими олигомерами актина, получаемыми в процессе нагревания F-актина, и защищают их от агрегации путем образования небольших и хорошо растворимых комплексов, размеры которых намного меньше, чем у нативных актиновых филаментов, которые полностью осаждаются при ульрацентрифугировании. Очевидно, что эти результаты являются еще одним свидетельством в пользу предложенного «диссоциативного» механизма тепловой денатурации актиновых филаментов (рис. 5).

Влияние кофилина в насыщающей концентрации на процесс тепловой денатурации актина.

Актин-связывающий белок кофилин может связываться как с F-актином, так и с мономерным G-актином. Из литературы известно, что с одной молекулой актина связывается только одна молекула кофилина; следовательно, для получения полностью насыщенного кофилином актина необходимо, чтобы молярная концентрация кофилина была равна или превышала молярную концентрацию актина. В данном разделе приведены результаты экспериментов, в которых молярное соотношение кофилина к актину составляло 1,2. Тепловую денатурацию белков исследовали с помощью метода ДСК.

В первую очередь мы исследовали влияние кофилина на тепловую денатурацию Gактина. На рис.9А представлены кривые теплопоглощения для мономерного G-актина, кофилина и комплекса этих белков. Для изолированных белков температуры максимумов тепловых переходов соответствуют 60,3оС в случае G-актина и 56,5оС в случае кофилина.

В составе комплекса наблюдается заметная стабилизация обоих белков, и их денатурация происходит при более высокой температуре с максимумом теплового перехода при 66,4оС (рис.9А, кривая 3); при этом полностью исчезают пики свободных белков. Это свидетельствует о том, что новый высококооперативный тепловой переход не является результатом суперпозиции переходов изолированных G-актина и кофилина, а происходит образование достаточно прочного комплекса этих двух белков, которые затем денатурируют вместе как единое целое. Следует отметить, что подобное изменение характера тепловой денатурации мономерного G-актина при взаимодействии с кофилином не является результатом полимеризации актина. Об этом свидетельствуют данные о полном отсутствии полимеризованного F-актина в осадках, полученных при ультрацентрифугировании комплексов G-актина с кофилином. Тем не менее, при связывании мономерного G-актина с кофилином происходит значительное увеличение термостабильности обоих белков (рис.9А).

Аналогичная ситуация наблюдается и в случае F-актина в присутствии кофилина в насыщающих концентрациях (рис.9Б). В результате полимеризации актина происходит незначительная стабилизация белка (Tмакс для F-актина соответствует 61,5оС, что всего на 1,2оС выше температуры денатурации мономерного G-актина), но заметно увеличивается кооперативность теплового перехода. При добавлении кофилина в насыщающей концентрации наблюдается заметная стабилизация обоих белков: максимум кривой теплопоглощения комплекса достигается при температуре 68,5оС, а кооперативность теплового перехода значительно возрастает (рис.9Б). Как и в случае мономерного Gактина, образование комплекса F-актина с кофилином сопровождается почти полным исчезновением тепловых переходов свободных белков.

Теплопоглощение, мкВт Таким образом, связывание как G-актина, так F-актина с кофилином в его насыщающих концентрациях приводит к значительному увеличению термостабильности обоих белков в составе образующихся комплексов. Исходя из того, что эффект стабилизации актинового филамента кофилином аналогичен стабилизирующему эффекту, наблюдаемому для комплекса кофилина с мономерным G-актином, можно предположить, что кофилин индуцирует сходные структурные перестройки как в актиновом мономере, так и в субъединицах F-актина, с которыми он связывается непосредственно. Из литературы известно, что связывание актина с кофилином приводит к серьезным структурным перестройкам в молекуле актина (например, оно способствует переходу нуклеотид-связывающей щели между двумя доменами молекулы актина в более «закрытое» состояние). Не исключено, что именно это и является одной из главных причин вызываемого кофилином значительного повышения термостабильности как Gактина, так и F-актина (рис. 9).

Влияние кофилина в малых концентрациях на процесс тепловой денатурации F-актина. Кооперативная дестабилизация актинового филамента..

В противоположность стабилизирующему эффекту насыщающих концентраций кофилина на тепловую денатурацию F-актина (рис. 9Б), в концентрациях ниже ненасыщающих (т.е. в более низких молярных концентрациях, чем у F-актина) кофилин дестабилизирует F-актин. В этих условиях мы наблюдали заметное снижение термостабильности F-актина, которое выражалось в смещении его теплового перехода в сторону более низких температур на 1–6оС, в зависимости от молярного отношения кофилина к актину. Наиболее ярко выраженный эффект наблюдался при концентрациях кофилина от 4 до 16 мкМ (т.е. при молярных соотношениях актин/кофилин от 6,25 до 1,56). В этих условиях на термограмме наблюдалось одновременно два пика: пик стабилизированного кофилином F-актина при 65–67оС и пик при 56-58оС, отражающий тепловую денатурацию F-актина, дестабилизированного кофилином (рис. 10). С уменьшением молярного отношения кофилина к актину происходило уменьшение пика дестабилизированного кофилином. При низких концентрациях кофилина (0,125–1,0 мкМ) наблюдался только пик дестабилизированного F-актина (рис. 10), причем его максимум сдвигался в сторону более низких температур при увеличении концентрации кофилина. Напротив, максимум пика стабилизированного F-актина смещался в сторону более высоких температур при повышении концентрации кофилина (рис. Концентрация 10).

Рис. 10. Кривые теплопоглощения комплексов F-актина с кофилином, полученные при различных молярных соотношениях кофилин/актин. Концентрация F-актина кривой. Вертикальная пунктирная линия актина в отсутствие кофилина (Тмакс ~ 61,5оС).

Прочие условия:. 30 мМ Hepes-KOH, pH 7,3, град/мин. Кривые ДСК сдвинуты друг относительно друга вдоль вертикальной оси вертикальная метка соответствует 25 мкВ.

Следует особо отметить, что дестабилизирующий эффект кофилина является высококооперативным: он наблюдается даже при очень низких молярных отношениях кофилин/актин, когда на 100–200 субъединиц F-актина приходится всего одна молекула кофилина.

В экспериментах по ультрацентрифугированию было показано, что во всех случаях актин обнаруживается только в осадках. Таким образом, дестабилизация F-актина при низких концентрациях кофилина не является следствием деполимеризации актина и этот эффект обусловлен, скорее всего, структурной реорганизацией актинового филамента.

Влияние стабилизаторов F-актина на тепловую денатурацию его комплексов с кофилином.

Последующая серия экспериментов была проведена для выяснения влияния двух стабилизаторов F-актина, фаллоидина и фторида алюминия (AlF4-), на индуцируемую кофилином стабилизацию или дестабилизацию актинового филамента. Как уже указывалось ранее (рис. 4), при связывании F-актина с фаллоидином термостабильность актина значительно увеличивается: максимум кривой теплопоглощения F-актина смещается с 61,5 до 78 оС (рис. 11, кривые 1,3). При добавлении к стабилизированному фаллоидином F-актину кофилина в насыщающей концентрации форма кривой ДСК (рис.11А, кривая 4) становится практически такой же, как и для комплекса F-актина с кофилином в отсутствие фаллоидина (рис.11А, кривая 2). Из литературы известно, что сродство фаллоидина к F-актину намного выше, чем у кофилина, и именно этим объясняется тот факт, что фаллоидин обычно препятствует связыванию кофилина с актином в условиях in vitro. Однако представляется вполне возможным, что в процессе нагрева белков сродство кофилина к F-актину значительно возрастает. В результате кофилин получает возможность связываться с F-актином даже в присутствии фаллоидина, полностью предотвращая при этом его стабилизирующий эффект (рис. 11А).

Напротив, при низких концентрациях, недостаточных для насыщения, кофилин почти не оказывал влияния на тепловую денатурацию F-актина, стабилизированного фаллоидином (рис. 11Б). В этом случае добавление фаллоидина полностью предотвращало дестабилизирующий эффект кофилина.

Аналогичные эффекты наблюдались нами и в случае добавления кофилина к F-актину в присутствии AlF4- (данные не представлены). Известно, что данный анион (аналог неорганического фосфата) связывается с АДФ-F-актином с очень высоким сродством и в значительной степени увеличивает термостабильность F-актина; однако добавление кофилина в насыщающих концентрациях полностью нейтрализует эффект этого стабилизатора. Этот факт позволяет предположить, что структурные перестройки, индуцируемые кофилином в субъединицах F-актина, могут препятствовать структурным перестройкам, индуцируемым AlF4-. При этом дестабилизирующий эффект, оказываемый на F-актин кофилином в низких, ненасыщающих концентрациях полностью предотвращается добавлением фторида алюминия.

Теплопоглощение, мкВт кофилина, но, с другой стороны, они оказываются намного сильнее дестабилизирующего эффекта кофилина в случае его ненасыщающих концентраций и полностью предотвращают этот эффект.

Дестабилизирующий эффект кофилина в свете «диссоциативного» механизма Представленные выше данные свидетельствуют о том, что связывание с кофилином оказывает двойственный эффект на термостабильность F-актина, в зависимости от концентрации кофилина. При стехиометрических (насыщающих) концентрациях кофилин стабилизирует структуру актинового филамента, что выражается в повышении температуры теплового перехода. Однако наиболее интригующим результатом является дестабилизация актинового филамента при суб-стехиометрических (ненасыщающих) концентрациях кофилина (рис. 10). Этот эффект трудно объяснить деполимеризацией F-актина:

ультрацентрифугированию, так и данные ДСК о том, что добавление фаллоидина к F-актину, дестабилизированному кофилином, полностью устраняет эффект дестабилизации (рис. 11Б). Важно отметить, что пики стабилизированного и дестабилизированного Fактина могут сосуществовать на одной и той же термограмме (рис. 10). Эти данные позволяют предположить, что кофилин стабилизирует только те субъединицы в актиновом филаменте, с которыми он связывается непосредственно, но при этом он с высокой степенью кооперативности дестабилизирует соседние субъединицы, свободные от кофилина. Это объяснение подразумевает сосуществование как минимум двух различных конформационных состояний частично декорированного кофилином актинового филамента: термостабильного F-актина, декорированного кофилином, и свободных от кофилина участков того же самого филамента, являющихся менее термостабильными.

Вероятно также, что индуцируемые кофилином структурные изменения в F-актине могут распространяться вдоль филамента от субъединиц, непосредственно связанных с кофилином, к свободным от кофилина протомерам актинового филамента, причем такой дестабилизирующий эффект кофилина отличается очень высокой кооперативностью.

В настоящее время ни одна из существующих моделей, применяемых для описания процесса тепловой денатурации взаимодействующих друг с другом белков, не может объяснить кооперативный эффект дестабилизации актинового филамента кофилином в его ненасыщающей концентрации. Мы считаем, что этот эффект кофилина трудно объяснить иначе, чем фрагментацией актинового филамента, предшествующей его необратимой денатурации. Попробуем представить дестабилизирующее влияние кофилина на актиновый филамент в свете предложенного нами «диссоциативного» механизма тепловой денатурации F-актина.

При концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения актинового филамента, он связывается лишь с некоторыми субъединицами, что приводит к структурной дестабилизации свободных от кофилина областей частично декорированного актинового филамента. Следствием этого является повышение «хрупкости» в местах контактов декорированных и недекорированных участков филамента, в результате чего Fактин обретает склонность ломаться и рваться в подобных «слабых» точках (что подтверждается и некоторыми литературными данными). Однако снижение термостабильности F-актина не может является только следствием разрывов, происходящих в филаменте. Это позволяет предположить, что индуцируемая кофилином дестабилизация актинового филамента включает в себя как серьезные изменения в ориентации актиновых субъединиц, находящихся в дестабилизированных областях филамента, так и значительные структурные перестройки в самих субъединицах. Так как в соответствии с предложенной нами моделью тепловой денатурации F-актина (рис. 5) температурно-зависимая диссоциация олигомеров от филамента происходит при меньших температурах, чем температура денатурации, то дестабилизированные кофилином субъединицы актина будут диссоциировать от филамента. Мы предполагаем, что такие субъединицы в течение некоторого времени могут «помнить» свое измененное конформационное состояние. Вследствие подобной «конформационной памяти» свободные от кофилина субъединицы могут, по-видимому, некоторое время сохранять приобретенную конформацию, которая отличается пониженной термостабильностью, что на термограмме F-актина отражается в виде появления низкотемпературного теплового перехода (рис. 10).

Таким образом, предложенный ранее «диссоциативный» механизм тепловой денатурации актиновых филаментов может, с некоторыми допущениями, объяснить два столь противоположных эффекта, оказываемых кофилином на процесс тепловой денатурации Fактина.

Дестабилизация F-актина кофилином может играть важную роль в динамике цитоскелета, способствуя выполнению кофилином его главных, уже описанных в литературе функций – ускорению деполимеризации актиновых филаментов и их фрагментации. Имеются данные о том, что кофилин локализован главным образом вблизи клеточной мембраны и его гораздо меньше в центре клетки. При этом концентрация кофилина в клетке существенно меньше концентрации актина. Следовательно, вблизи мембраны актиновые филаменты будут практически полностью декорированы кофилином и стабилизированы им, тогда как по мере удаления от мембраны к центру клетки все меньше и меньше молекул кофилина будет связано с F-актином. Исходя из наших данных, можно предположить, что актиновые филаменты в центре клетки будут нестабильны, что приведет к их фрагментации и образованию большого количества небольших олигомеров или даже мономеров, которые вновь смогут полимеризоваться в насыщенных кофилином областях клетки вблизи мембраны. Таким образом, как стабилизирующий, так и дестабилизирующий эффекты кофилина, обнаруженные нами впервые методом ДСК, могут играть важную роль в динамике актинового цитоскелета в живых клетках.

ВЫВОДЫ

При исследованиях тепловой денатурации филаментов актина (F-актина) методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показано, что термостабильность F-актина существенно возрастает с увеличением концентрации белка, а также при увеличении концентрации добавленного нуклеотида (АДФ). Эффект АДФ является высокоспецифичным, поскольку он не проявляется в присутствии других нуклеозиддифосфатов.

На основании полученных данных предложен новый «диссоциативный» механизм тепловой денатурации F-актина, согласно которому необратимой стадии денатурации (и последующей агрегации) белка предшествуют как минимум две обратимые стадии – диссоциация коротких олигомеров с концов актиновых филаментов и высвобождение нуклеотида (АДФ) из нуклеотид-связывающих центров субъединиц актина.

С помощью метода ДСК впервые выявлены два противоположных эффекта актинсвязывающего белка кофилина на тепловую денатурацию F-актина: стабилизация (увеличение термостабильности) актиновых филаментов при насыщающих концентрациях кофилина и дестабилизация (значительное снижение термостабильности) филаментов при низких концентрациях кофилина, недостаточных для полного насыщения всех актиновых субъединиц в филаменте.

Показано, что дестабилизация актиновых филаментов имеет место даже при очень низких концентрациях кофилина, когда на 100–200 актиновых субъединиц приходится одна молекула кофилина. Предполагается, что кофилин, взаимодействуя с F-актином, стабилизирует только те его субъединицы, с которыми он непосредственно связывается, но дестабилизирует множество соседних субъединиц в актиновом филаменте, свободных от кофилина.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в рецензируемых журналах:

1. Dedova I.V., Nikolaeva O.P., Mikhailova V.V., dos Remedios C.G. and Levitsky D.I.

(2004) Two opposite effects of cofilin on the thermal unfolding of F-actin: a differential scanning calorimetric study. Biophys. Chem., 110, 119–128.

2. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I. and Gusev N.B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation and aggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 331, 1548–1553.

Михайлова В.В., Курганов Б.И., Пивоварова А.В., Левицкий Д.И. (2006) Диссоциативный механизм тепловой денатурации F-актина. Биохимия, 71, № 11, 1550–1560.

4. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., Mikhailova V.V. and Nikolaeva O.P. (2008) Thermal unfolding and aggregation of actin. Stabilization and destabilization of actin filaments. FEBS J., 275, № 17, 4280–4295.

Тезисы докладов:

Николаева О.П., Михайлова В.В., Дедова И.В., Левицкий Д.И. (2002) Влияние кофилина на тепловую денатурацию актина. Тезисы научных докладов III Съезда Биохимического Общества (Санкт-Петербург, 26 июня – 1 июля 2002 г.), стр. 97-98.

2. Nikolaeva O.P., Dedova I.V., Mikhailova V.V., and Levitsky D.I. (2002) Effects of cofilin on the thermal unfolding of actin. J. Muscle Res. and Cell Motil., v. 23, № 1, p. 24-25.

(Abstracts of the 31st European Muscle Conference, Lunteren, Netherlands, 14– September 2002).

3. Mikhailova V.V., Kurganov B.I., Levitsky D.I. (2003) Thermal denaturation of F-actin: a proposed mechanism. J. Muscle Res. and Cell Motil., v. 24, № 4-6, p. 329. (Abstracts of the 32nd European Muscle Conference, Montpellier, France, 6–10 September 2003).

4. Mikhailova V.V., Kurganov B.I., and Levitsky D.I. (2004) A proposed mechanism for the thermal denaturation of actin filaments. Abstracts of International Symposium “Biological Motility” (Pushchino, Moscow region, May 23–June 1, 2004), p. 93–94.

5. Chernik I.S., Mikhailova V.V., Pivovarova A.V., Levitsky D.I., and Gusev N.B. (2004) Protective effects of small heat shock proteins (sHSP) on the thermally induced aggregation of actin filaments. Abstracts of International Symposium “Biological Motility” (Pushchino, Moscow region, 23 May–1 June 2004), p. 78.

6. Mikhailova V., Pivovarova A., Chernik I., Gusev N., and Levitsky D. (2004) Small heat shock proteins prevent thermally induced aggregation, but not thermal denaturation of actin filaments. J. Muscle Res. and Cell Motil., 2004, v. 25, № 3, p. 251. (Abstracts of the 33rd European Muscle Conference, Isola d’Elba, Italy, 19-23 September 2004).

7. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Gusev N.B., and Levitsky D.I. (2005) Small heat-shock proteins prevent thermally induced aggregation of actin filaments by formation of soluble complexes with denatured actin. FEBS J., v. 272, Suppl. 1, p. 356.

(Abstracts of the 30th FEBS Congress and 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary, 2– 8. Mikhailova V., Pivovarova A., Chernik I., Chebotareva N., Gusev N., and Levitsky D.

(2005) A new insight into “dissociative” mechanism of the thermal unfolding of F-actin by using small heat shock proteins. J. Muscle Res. and Cell Motil., v. 26, № 1, p. 79.

(Abstracts of the 34th European Muscle Conference, Hortobagy, Hungary, 17– September, 2005).

9. Levitsky D.I., Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chebotareva N.A., and Kurganov B.I.

(2006) Thermal denaturation and aggregation of actin filaments. Abstracts of International Symposium “Biological Motility: Basic Research and Practice” (Pushchino, Moscow Region, May 11-15, 2006), p. 29- 10. Pivovarova А., Mikhailova V., and Levitsky D.I. (2006) Comparative studies on the thermal unfolding of G-actin and F-actin by using ANS fluorescence. J. Muscle Res. Cell Motil,. v. 27, № 5-7, p. 512. (Abstracts of 35th European Muscle Conference, Heidelberg, Germany, 9-12 September 2006).



 
Похожие работы:

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И....»

«Семенова Ольга Владимировна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА НАСЕЛЕНИЯ ЖУЖЕЛИЦ ПАРКОВОЙ ЗОНЫ КРУПНОГО ПРОМЫШЛЕННОГО ГОРОДА НА ПРИМЕРЕ НИЖНЕГО ТАГИЛА 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Екатеринбург - 2008 2 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской Академии Наук Научный руководитель : кандидат биологических наук Ольшванг Владимир Николаевич Официальные оппоненты : доктор...»

«Борисанова Анастасия Олеговна МИКРОСКОПИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ И УЛЬТРАСТРУКТУРА КОЛОНИАЛЬНЫХ KAMPTOZOA НА ПРИМЕРЕ ВИДА BARENTSIA DISCRETA (BUSK, 1886) Специальность 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва, 2013 Работа выполнена на кафедре зоологии беспозвоночных биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : чл.- кор. РАН, профессор Малахов Владимир...»

«Лузянин Сергей Леонидович ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И ЭКОЛОГИЯ ПЧЁЛ ТРИБЫ BOMBINI (HYMENOPTERA, APIDAE) ЕСТЕСТВЕННЫХ И УРБАНИЗИРОВАННЫХ ЭКОСИСТЕМ КУЗНЕЦКО-САЛАИРСКОЙ ГОРНОЙ ОБЛАСТИ 03.00.16 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Барнаул – 2009 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Еремеева Наталья Ивановна...»

«ИНДЖГИЯ ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ФЕРМЕНТНЫМИ СИСТЕМАМИ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS В ПРИСУТСТВИИ МЕДИАТОРОВ ФЕРРОЦЕНОВОГО РЯДА 03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2010 Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета. кандидат химических наук, доцент Научный руководитель :...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«БЛИНОВА Илона Владимировна БИОЛОГИЯ ОРХИДНЫХ НА СЕВЕРО-ВОСТОКЕ ФЕННОСКАНДИИ И СТРАТЕГИИ ИХ ВЫЖИВАНИЯ НА СЕВЕРНОЙ ГРАНИЦЕ РАСПРОСТРАНЕНИЯ Специальность 03. 00. 05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук в Полярноальпийском ботаническом саду-институте им Н. А. Аврорина (ПАБСИ КНЦ РАН) Официальные оппоненты : доктор биологических наук Коломейцева Галина...»

«Феоктистов Александр Сергеевич Распределение лектинов в талломе листоватых лишайников в связи с особенностями их морфоструктурной организации Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Диссертационная работа выполнена на Биологическом факультете Московского Государственного Университета имени М.В.Ломоносова...»

«САВИНОВ Иван Алексеевич Система и эволюция порядка Celastrales на основе данных сравнительной морфологии 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург - 2011 2 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН и в ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор,...»

«Нефедова Наталия Сергеевна МИНОРНЫЕ КОМПОНЕНТЫ МЕТАБОЛИЗМА В ИССЛЕДОВАНИИ МЕЖМОЛЕКУЛЯРНОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ 03.01.04 – Биохимия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Челябинск 2013 2 Работа выполнена на кафедре фундаментальной и клинической биохимии с лабораторной диагностикой Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Самарский государственный медицинский университет Министерства...»

«Заводовский Петр Геннадьевич АФИЛЛОФОРОИДНЫЕ ГРИБЫ В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ВОДЛОЗЕРЬЯ 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университета Научный руководитель : член-корр. РАН, доктор биологических наук,...»

«ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«Китаев Константин Альбертович ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОАДАПТАЦИИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА (LEPTINOTARSA DECEMLINEATA SAY) И ЕГО ЭНТОМОФАГОВ 03.02.07 – генетика 03.02.08– экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2013 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) является инвазивным видом, появившимся в агроэкосистемах вслед за картофелем, и наиболее массовым фитофагом...»

«САИДОВ АБДУСАТТОР САМАДОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРЫЗУНОВ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 03.02.04 - зоология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Душанбе – 2011 Работа выполнена в Отделе экологии наземных позвоночных животных Института зоологии и паразитологии им. Е.Н.Павловского Академии наук Республики Таджикистан Научный консультант : академик АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук,...»

«МИХАЙЛЕНКО Дмитрий Сергеевич АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С РАЗВИТИЕМ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ ПОЧКИ 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва 2008 год Работа выполнена в лаборатории эпигенетики Государственного учреждения Медико-генетический научный центр РАМН Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Залетаев Дмитрий Владимирович Официальные оппоненты :...»

«Сибгатуллина Гузель Валерьевна РЕДОКС-МЕТАБОЛИЗМ КАЛЛУСОВ ГРЕЧИХИ, ОТЛИЧАЮЩИХСЯ ПО МОРФОГЕННОЙ СПОСОБНОСТИ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена в лаборатории физиологии и генетики культивируемых клеток Учреждения Российской академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук...»

«ЖИГАДЛОВА Галина Геннадьевна МОРСКИЕ ВОДОРОСЛИ - МАКРОФИТЫ ОСОБО ОХРАНЯЕМЫХ ПРИРОДНЫХ ТЕРРИТОРИЙ ВОСТОЧНОЙ КАМЧАТКИ (биоразнообразие, систематика, биология, рациональное использование) 03.00.18 - гидробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петропавловск-Камчатский 2007 2 Работа выполнена в Лаборатории гидробиологии Камчатского филиала Тихоокеанского института географии ДВО РАН Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«Розломий Наталья Геннадьевна Зелёная зона г. Уссурийска Приморского края (состояние естественных и искусственных насаждений, оптимизация рекреационного лесопользования) 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Владивосток 2010 2 Работа выполнена в Институте лесного и лесопаркового хозяйства Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Приморская...»

«ШАДРИНА МАРИЯ ИГОРЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ БОЛЕЗНИ ПАРКИНСОНА 03.01.07 – Молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук МОСКВА – 2011 Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН доктор биологических наук, профессор Научный консультант : Петр Андреевич Сломинский Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной...»








 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.