WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

Pages:   || 2 |

«Функционирование, механизм регуляции активности и возможное практическое использование голубых медьсодержащих оксидаз ...»

-- [ Страница 1 ] --

На правах рукописи

Шлеев Сергей Валерьевич

Функционирование, механизм регуляции активности

и возможное практическое использование

голубых медьсодержащих оксидаз

Специальность 03.01.04 – «биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва 2010

Работа выполнена в лаборатории химической энзимологии Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Ярополов Александр Иванович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор химических наук, профессор Карякин Аркадий Аркадьевич доктор химических наук, профессор Решетилов Анатолий Николаевич

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН

Защита состоится «14» октября 2010 г. в 15 час. на заседании диссертационного совета Д 002.247.01 при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 2, конференц-зал

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу:

119071 Москва, Ленинский пр. 33, корп. 1.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Голубые медьсодержащие оксидазы (МСО), к которым относятся лакказа (Lc), билирубиноксидаза (BOx) и аскорбатоксидаза (AOx), а также церулоплазмин (Cp), занимают особое место среди окислительно-восстановительных ферментов. Они обладают высокой удельной активностью и способностью к прямому восстановлению О2 до Н2О без образования промежуточных высоко реакционно-способных токсичных интермедиатов кислорода. Большой интерес, как в фундаментальном, так и прикладном плане, представляет субстратная специфичность этих ферментов, способных окислять широкий круг органических и неорганических соединений.




Окисление органических соединений протекает по свободнорадикальному механизму, который в настоящее время до конца не изучен. Таким образом, МСО представляют большой интерес с точки зрения фундаментальных исследований их структуры и механизма катализа. Это обусловлено строением активного центра медьсодержащих оксидаз, в который входят ионы меди трех различных типов, координированное взаимодействие которых в процессе каталитического акта одноэлектронного окисления субстратов доноров электронов или атома водорода, позволяет осуществлять восстановление О2 непосредственно до Н2О. Помимо этого, каталитические свойства MCO делают возможным их широкое использование в целлюлозно-бумажной, текстильной, пищевой и косметической промышленностях, а таже медицине. MCO используются для детоксикации и обесцвечивания сточных вод, биодеградации ксенобиотиков, создания антимикробных композиций, получения древесноволокнистых плит, древесных блоков и картона без применения токсичных связующих, при производстве моющих средств и в клиническом анализе.

Интерес к практическому использованию MCO еще более возрос в середине 90-х годов ХХ века, после открытия возможности усиления действия этих ферментов с использованием различных редокс-медиаторов, что позволило существенно расширить область их практического применения. Медиаторы MCO представляют собой субстраты этих ферментов, в процессе окисления которых образуются высоко редокс-потенциальные и химически активные продукты.

Последние могут вступать в реакцию с соединениями, которые не подвергаются окислению одними лишь оксидазами, или участвовать в переносе электронов в электрохимических реакциях, ускоряя электрохимические процессы с участием данных ферментов. Кроме того, в процессе окисления органических субстратов образуются свободные радикалы, которые могут модифицировать другие соединения. Значительный интерес представляет собой использование MCO в органическом синтезе. Показана возможность использования MCO для окисления первичных гидроксильных групп производных сахаров, для синтеза винбластина и бензальдегидов.

Важным направлением практического использования данных ферментов является их применение в биоэлектронике – новой области биотехнологии, сформировавшейся на стыке биологии и электроники и имеющей большое прикладное значение для медицины, высокотехнологичных производств и биокомпьютерных технологий. Основой для создания биосенсоров и биотопливных элементов может быть субстратная специфичность MCO, их высокая активность и стабильность, а также возможность протекания реакции прямого биоэлектрокатализа.

Однако, до сих пор остается неясным детальный механизм функционирования и принципы регуляции активности данного класса ферментов.

Цель работы – установление механизма функционирования и регуляции активности MCO в гомогенных и гетерогенных биокаталитических системах с целью их обоснованного и рационального использования в биокаталитическом синтезе и системах биодеградации ксенобиотиков, для разработки устройств трансформации химической энергии в электрическую, а также для оптимизации электроаналитических сенсоров.





Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие основные задачи:

1. Детально изучить биохимические и каталитические характеристики грибных, древесной и бактериальной Lc с целью выбора наиболее перспективных ферментов для использования в различных биотехнологических процессах и биоэлектронных устройствах.

2. Разработать метод экологически чистого синтеза электропроводящего полианилина с участием высоко редокс-потенциальных Lc.

3. Предложить стратегию отбора и исследования потенциальных редокс-медиаторов Lc и провести апробацию лакказа-медиаторных систем (LMS) на практически значимых объектах.

4. Провести комплексное сравнительное спектральное и электрохимическое изучение MCO, включающее, в том числе, и разработку методов и подходов редокс-титрования микроколичеств белков с целью определения редокс-потенциалов их активных центров.

5. Предложить подходы для практического использования MCO в биосенсорах и биотопливных элементах.

6. Выяснить закономерности регуляции активности МСО на молекулярном уровне с использованием электрохимических методов. Экспериментально показать “диод-“ и “триодподобные” свойства биоэлектрохимических устройств.

Научная новизна работы. На основании комплексного исследования основных биохимических и физико-химических свойств, субстратной специфичности и каталитических параметров грибных, бактериальной и древесной Lc выявлены основные критерии отбора Lc из различных таксономических групп для использования в биотехнологии. Детально изучены и систематизированы биоэлектрохимические свойства Lc, BOx и Cp. Предложены новые экспериментальные подходы для исследования активных центров MCO, в том числе разработаны уникальные макро и микро спектроэлектрохимические ячейки. С их использованием были определены значения редокс-потенциалов Т1 центров MCO, а также впервые установлены возможные значения потенциалов некоторых интермедиатов трехъядерного медного кластера ферментов. Сформулированы и экспериментально исследованы пути сопряжения ферментативных реакций MCO и электрохимических процессов с их участием. Комплексные физико-химические и биохимические исследования показали, что механизм и эффективность электронного переноса (ЭП) зависит от ориентации молекул фермента на поверхности электрода. Результаты исследования биохимических, физико-химических, спектральных и электрохимических свойств MCO, субстратной специфичности и механизма действия этих ферментов вносят свой вклад в понимание механизма гомогенного и гетерогенного катализа многоядерными медьсодержащими оксидазами. Теоретически обоснованы и экспериментально доказаны “диод-“ и “триод-подобные” свойства высоко редокс-потенциальной грибной Trametes hirsuta Lc. Высказано предположение о регуляторном значении открытых и исследованых “полупроводниковых” свойств MCO при функционировании данных ферментов в природе.

Обнаружен новый класс редокс-медиаторов Lc (усилителей действия фермента) с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 (PP). Подобраны и экпериментально подтверждены научно-обоснованные критерии отбора редокс-медиаторов Lc для создания эффективных систем для обесчвечивания лигноцеллюлозы.

Впервые с участием высоко редокс-потенциальной грибной Lc осуществлен синтез электропроводящего полианилина и изучены его физико-химические свойства.

Практическая значимость. Решение поставленных задач позволило выяснить возможности, ограничения и перспективы использования голубых MCO в различных областях биотехнологии.

На основе различных Lc разработаны амперометрические биосенсоры для определения соединений фенольной структуры и водорастворимого лигнина. Сконструированы и охарактеризованы модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих в качестве топлива глюкозу, а в качестве окислителя – растворенный кислород.

Предложена схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и экспериментальные методы их тестирования, что значительно облегчает поиск новых медиаторов фермента. Ряд соединений класса PP отвечают многим требованиям, предъявляемым к усилителям действия ферментов, а именно высокая эффективность, низкая стоимость и экологическая чистота. Показана возможность использования этих соединений для отбеливания лигноцеллюлозы. В частности, проведены лабораторные испытания LMS для делигнификации бумажной пульпы. Разработаны методы ферментативного синтеза электропроводного полианилина с различными свойствами, отвечающие требованиям «зеленой» химии.

Положения, выдвигаемые на защиту:

• особенности механизмов гомогенного и гетерогенного катализа с участием высоко и низко редокс-потенциальных голубых MCO;

• биоэлектрохимические свойства голубых MCO, адсорбированных на электродах из различных материалов;

• обоснование “диод-“ и “триод-подобных” свойств Lc;

• амперометрические биосенсоры на основе голубых MCO для определения соединений фенольной структуры и лигнина;

• модели безмедиаторных, безмембранных биотопливных элементов, использующих углеводы в качестве топлива и растворенный кислород в качестве окислителя;

• схема отбора потенциальных редокс-медиаторов Lc и методы их тестирования;

• разработка методов синтеза электропроводящего псевдоводорастворимого, а также оптически активного полианилина.

Публикации. По материалам диссертации опубликована 41 научная статья, получено российских патента. Данные диссертации суммированы в 4 обзорных статьях, а также включены в книгу “Электрохимия белков и нуклеиновых кислот”, выпущенную издательством «Elsevier».

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования доложены и обсуждены на российских и международных конференциях, конгрессах, симпозиумах, в том числе: на Международной конференции “Биокатализ-2002” (Москва, Россия, 2002), на Международной конференции “Биотехнология – состояние и перспективы развития” (Москва, Россия, 2002), на XVII и XVIII Международных симпозиумах “Биоэлектрохимия и биоэнергетика” (Флоренция, Италия, 2003 и Коимбра, Португалия, 2005), на 8-ой Международной Пущинской ШколеКонференции “Биология - наука XXI века” (Пущино, Россия, 2004), на VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа (Уфа, Россия, 2004), на Международных конгрессах электрохимического общества (Квебек, Канада, 2005, Бусан, Корея, 2005, Денвер, США, 2006), на IV Балтийской электрохимической конференции (Грейфсвальд, Германия, 2005), на II Международном Симпозиуме ”Модификация поверхности для химического и биохимического распознавания” (Казимеш Долны, Польша, 2005), на Международной конференции “Электроанализ” (Бордо, Франция, 2006).

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения результатов, заключения, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 334 страницах. Список цитируемой литературы включает 478 наименований. Иллюстративный материал содержит рисунков и 23 таблицы.

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, в развитии и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов. Экспериментальная работа выполнена самим автором, а также сотрудниками, аспирантами и студентами под руководством автора. В исследованиях, проведенных в соавторстве с зарубежными коллегами, личный вклад автора заключался в постановке задачи, непосредственном участии в экспериментальной работе, в обсуждении полученных результатов и в оформлении их в виде публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложена актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования.

Первая глава содержит обзор литературы, состоящий из шести частей. В первой части описываются строение, свойства и каталитический механизм действия ферментов, относящихся к MCO. Во второй части – основные факторы, определяющие окислительно-восстановительный потенциал этих ферментов. Третья, четвертая и пятая части обзора литературы посвящены описанию AOx, BOx и Cp, соответственно. В шестой части рассматривается строение, свойства и каталитический механизм действия Lc, а также представлено описание основных усилителей действия фермента и LMS. Помимо этого, рассмотрены возможности использования Lc и LMS в биотехнологии.

Во второй главе представлены материалы и методы исследования, включая некоторые оригинальные методики автора с соавторами [Шлеев с соавт., 2000; Горшина с соавт., 2006а, 2006б].

В работе использовали Lc, выделенные из культуральных жидкостей грибов Trametes hirsuta, Trametes ochracea, Trametes pubescens, Coriolopsis fulvocinerea и Cerrena maxima, а также частично очищенную M. termophila Lc - коммерческий препарат фермента фирмы «Novozymes A/S» (Дания). В рамках совместных исследований были любезно предоставлены гомогенный препарат рекомбинантной Lc Myceliophthora thermophila (LT2), мутантные формы фермента 2B10, 7H9, 3D1, 2E9, и R2 (Др. Мигуэлем Алкаде, Испания), а также гомогенный препарат Cerrena unicolor Lc (Проф. Дж. Рогальски, Польша). В работе были использованы частично очищенные препараты BOx Myrothecium verrucaria (Amano 2) и Trachyderma tsunnodae (Amano 3), фирмы Amano Enzyme Ltd. (Япония). Дополнительная очистка препаратов до гомогенного состояния проводилась Др. Николасом Мано (Франция) в рамках совместных исследований. Частично очищенный препарат Rhus vernicifera Lc, который был любезно предоставлен проф. Бенгтом Рейнхаммером (Швеция), был дополнительно очищен до гомогенного по данным SDS-электрофореза состояния методом HPLC. Рекомбинантный бактериальный фермент Bacillus halodurans, а также Lc аскомицета Lamprospora wrigthii были любезно предоставлены проф. Диетмаром Халтрихом и Др. Роландом Людвигом (Австрия) в рамках выполнения совместных исследований. Помимо этого, в работе использовали Cp, выделенный из крови человека, – высокоочищенный препарат компании Sigma-Aldrich (США). Определение молекулярной массы Lc проводили методом градиентного электрофореза в денатурирующих условиях. Содержание ионов меди определяли бихинолиновым методом [Broman et. al., 1962], а также методом лазерной масс-спектрометрии [Maganadze & Shutyaev, 1993]. Спектральные исследования Lc проводили с использованием спектрофотометра Coulter DU-650 («Beckman», Германия), спектрофлуофотометра RF-5301 PC («Shimadzu», Япония), ЭПР-спектрометра ESCBruker», Германия). Определение редокс-потенциала Т1 центра Lc осуществляли методом окислительно-восстановительного титрования, используя в качестве медиаторной пары октоцианомолибдат (IV) и (V) калия [Dutton, 1978; Xu et al., 1996b]. Определение редокспотенциала Т1 центра BOx осуществляли методом спектроэлектрохимического титрования в присутствии комплексов переходных металлов в качестве медиаторов [Christenson et al., 2006].

Определение рН-оптимума и каталитических констант ферментативных реакций, катализируемых Lc, проводили на кислородном электроде типа Кларка. Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей (медиаторов) Lc, проводили на спектрофотометре «Hitachi-557» (Япония). Спектры кругового дихроизма были записаны с использованием КД дихрографа FKD-2 (Россия). Круговой дихроизм Lc и образцов полианилина измеряли в единицах A, как разность в поглощении лучей с левой и правой круговой поляризацией.

Для анализа продуктов окисления вератрового спирта (VA) LMS использовали метод гидрофобной обратнофазовой жидкостной хроматографии высокого давления. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени удерживания на колонке, их количество в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия).

Электрохимические исследования осуществляли с использованием анализаторов CV 50W или CV 100W (BAS, США) работающих в трехэлектродном режиме (рабочий электроды – модифицированные и немодифицированные электроды на основе стеклоуглерода, спектрального графита или золота; электроды сравнения – хлорсеребряный или каломельный электроды; вспомогательные электроды – платиновая проволока или золотая пластина).

Спектроэлектрохимические исследования MCO проводили с использованием макро [Шлеев с соавт., 2000] и микро [Larsson et al., 2001] ячеек объемом 1000 мкл и 1 мкл, соответственно.

Масс-спектроскопические исследования проводили с использованием лазер десорбционноионизирующей (MALDI) масс-спектрометрии на масс-спектрометрическом анализаторе “Applied Biosystems 4700 Proteomics Analyzer” MALDI time-of-flight (TOF) (США). Гидролизаты белков также анализировали с использованием четырехполюсной ионной ловушки Bruker Esquire (Германия) в сочетании с нанораспылителем для их ионизации (ESI-QIT-MS анализ).

В третьей главе представлены результаты диссертационного исследования.

Выделение и основные физико-химические свойства лакказ из различных источников [Королева с соавт., 2001; Шлеев с соавт., 2003; Shleev et al., 2004b; Shleev et al., 2005b;

Никитина с соавт., 2005; Shleev et al., 2006c; Shleev et al., 2007a; Горбачева с соавт., 2008;

Морозова с соавт., 2007а; Горишна соавт., 2009а, 2009b] Были выделены в гомогенном состоянии Lc из культуральной жидкости базидиальных грибов T. hirsuta, T. ochracea, T. pubescens, C. fulvocinerea и C. maxima, основные биохимические характеристики которых представлены в Таблице 1. Как видно из таблицы, все изученные Lc являются гликопротеинами, характеризуются оптимумом рН в интервале 3,5-5,2 (при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина), значения их изоэлектрических точек (pI) находятся в кислой области рН. Как и большинство описаных в литературе Lc, эти ферменты содержат 4 иона меди на 1 молекулу белка. Необходимо отметить, что все ферменты обладают высокой стабильностью (сохраняют до 50% первоначальной активности через 52-65 часов инкубации при 50°С), что является важным условием для их использования в биотехнологических процессах, биосенсорах и биотопливных элементах.

Таблица 1. Некоторые биохимические характеристики лакказ * При использовании в качестве субстрата-восстановителя пирокатехина ** Время полуинактивации при 50оС В таблице 2 представлены кинетические параметры реакций, катализируемых четырьмя Lc для некоторых органических субстратов и ферроцианида калия. Как видно из таблицы, T. hirsuta Lc обладала наиболее высокими значениями каталитических констант по отношению к органическим субстратам. В то же время, Lc C. maxima показала наибольшее значение k cat при окислении K4Fe(CN)6.

Сравнение кинетических параметров реакций, катализируемых грибной T. hirsuta и древесной Rhus vernicifera Lc (Табл. 3) выявило высокое сродство и эффективность катализа для обеих Lc по отношению к кислороду – природному акцептору электронов данных ферментов. Более того, показана линейная зависимость эффективности катализа, выраженная величиной lg(kкат/KM), от разности между редокс-потенциалами ионов меди Т1 центров ферментов и потенциалами субстратов. Последняя величина – разность потенциалов является движущей силой реакции переноса электронов от субстратов-доноров на фермент. Линейная зависимость эффективности ферментативного катализа от E(фермент-субстрат) указывает на внешнесферный механизм переноса электронов от субстратов на ион меди Т1 центра Lc.

Оптимум рН для всех изученных грибных Lc был приблизительно одинаков и находился в интервале рН 3,5–5,0 при использовании в качестве субстрата-донора пирокатехина (Табл. 1;

Рис. 1А), а кривая зависимости активности ферментов от рН раствора имела колоколообразную форму. При использовании K4Fe(CN)6 активность ферментов монотонно падала при изменении рН раствора от 2,5 до 5,5 (Рис. 1Б). рН-профили активности всех изученных Lc при использовании в качестве субстратов как органического, так и неорганического соединений не отличались от таковых для других Lc, описанных в литературе.

Таблица 2. Кинетические параметры реакций, катализируемых лакказами Субстрат kcat, Kм, kcat/Kм, kcat, Kм, kcat/Kм, kcat, Kм, kcat/Kм, kcat, Kм, kcat/Kм, c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c-1 c-1 мкM мкM-1·c- * кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам Таблица 3. Сравнение кинетических и термодинамических параметров реакций, катализируемых грибной и растительной лакказами * литературные значения (Andreasson et. al., 1979; Cole et al., 1991; Matijosyte et al., 2008);

кинетические константы были рассчитаны как средние значения по пяти экспериментам С точки зрения фундаментальных исследований большой интерес представляют структура MCO и механизм катализа. Активный центр Lc содержит 4 иона меди, которые подразделяют на три типа по их спектральным характеристикам: Т1 центр, характеризующийся полосой оптического поглощения в области 600 нм и слабым сверхтонким расщеплениям в спектрах ЭПР;

Т2 центр, невидимый на спектрах поглощения, но характеризующийся на спектрах ЭПР сверхтонким расщеплением; Т3 центр – биядерный диамагнитный медный центр, который может быть идентифицирован на спектрах оптического поглощения по плечу в области 330 нм.

Cпектры поглощения всех изученных в настоящей работе ферментов были типичными для MCO. В них присутствовали сигналы меди Т1 центра – пик поглощения на 610 нм и биядерного комплекса меди Т3 – плечо в области 330 нм (например, Рис. 2).

Спектры ЭПР, характеризующие ионы меди Т1 и Т2 центров изученных грибных Lc имели сходные характеристики (Рис. 3). На Рис. 4 представлены спектры возбуждения (I) и излучения (II) флуоресценции некоторых исследованных Lc, записанные при комнатной температуре.

Возбуждение в области биядерного медного центра (330 нм) приводит к эмиссии при 432, 438, 436 и 443 нм для T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima Lc, соответственно.

Необходимо отметить, что эти спектры не сильно различаются между собой и хорошо согласуются с литературными данными [Wynn et al., 1983; Shin et al., 2000].

Изучение вторичной структуры ферментов проводили с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Показано, что грибные Lc имели незначительные отличия во вторичной структуре белка. На Рис. 5 представлены типичные КД-спекры двух форм T. pubescens Lc (Lc1 и Lc2).

Поглощение, о.е.

Интенсивность флуоресценции КД-спектры Lc были математически обработаны в области длин волн от 190 до 250 нм.

Параметры вторичной структуры белков были рассчитаны с использованием компьютерной программы «Protein-CD», версия 1,5. Программа сравнивает КД-спектры интересующих нас ферментов с КД-спектрами имеющихся в базе данных белков. Результаты расчетов показали, что молекулы грибных Lc (T. hirsuta, T. ochracea, C. maxima, and C. fulvocinerea) содержат около 5% -спиральных участков, 45% -структуры, 20% изгибов и 35% представлено нерегулярной структурой.

Были проведены сравнительные исследования двух форм Lc базидиомицета T. pubescens и сделан вывод о значительном сходстве биохимических, физико-химических и кинетических свойств обеих форм Lc. Для выяснения вопроса о том, являются ли выделенные ферменты продуктами одного гена, были проведены масс-спектроскопические исследования Lc1 и Lc2.

Анализ гидролизатов Lc1 и Lc2 методом MALDI в области масса/заряд (m/z) 500– показал практически полное сходство аминокислотных последовательностей данных белков (Рис. 6). Исходя из этого, можно предположить, что выделенные ферменты Lс1 и Lс2 являются, скорее всего, продуктами одного гена, т.е. множественными формами одного и того же фермента. Следует отметить, что пять полученных пептидов Lc1 и Lc2 совпадали с описанными в литературе основными пептидами Trametes versicolor Lc. При этом аминокислотная последовательность Lc1 и Lc2 отличалась от данных, имеющихся в литературе по первичной структуре двух изоформ T. pubescens Lc (база данных NCBI, AAM18408 и AAM18407). Таким образом, выделенные нами ферменты являются новыми, ранее не описанными множественными формами Lc T. pubescens. Для сравнения был проведен аналогичный анализ Lc T. hirsuta. Продукты гидролиза этого фермента сильно отличались от таковых для Lс1 и Lс базидиомицета T. pubescens Lc.

Рисунок 6. Суммарный масс-спектрометрический анализ продуктов В результате проведенных исследований были определены основные физико-химические характеристики ферментов и спектральные характеристики ионов меди, входящих в состав активного центра Lc, выделенных из различных источников. Показано сходство биохимических и спектральных параметров исследованных ферментов.

Поиск новых медиаторов лакказ и возможности их использования [Shleev et al., 2003; Шлеев с соавт., 2004a; Shleev et al., 2006b; Shumakovich et al., 2006;

Первоначально медиаторами называли соединения – субстраты фермента, в результате окисления которых образовывались устойчивые высокопотенциальные продукты, способные вступать в химические неферментативные реакции с другими соединениями. При этом окисленный медиатор восстанавливался до первоначальной формы и таким образом формировался замкнутый цикл. Простейшая схема функционирования LMS представлена на Рис. 7.

Оптимальный редокс-медиатор должен быть хорошим субстратом Lc, его окисленная и восстановленная формы должны быть стабильны и не должны ингибировать ферментативную реакцию или инактивировать фермент, процесс его редокс-превращения должен быть циклическим. Соединения, которые в литературе называют медиаторами, на самом деле ими вообще не являются или их можно отнести к медиаторам с большой натяжкой. В первую очередь это связано с низкой стабильностью образующихся интермедиатов и, как следствие, низким числом редокс-циклов. В связи с этим в литературе появился термин «enhancer», т.е. усилитель действия фермента.

Принимая во внимание требования к редокс-медиаторам, была предложена схема отбора органических соединений – потенциальных медиаторов Lc и экспериментальные методы их тестирования, включающая 4 стадии:

1. Отбор соединений на основе анализа структурной формулы с учетом необходимости наличия сопряженных связей и гетероциклических атомов, а также –OH и –NH2 групп.

2. Определение каталитических характеристик отобранных соединений в гомогенных ферментативных реакциях, катализируемых Lc.

3. Анализ циклических вольтамперограмм растворов отобранных соединений в отсутствие и в присутствии модельных соединений лигнина.

4. Прямой эксперимент по анализу продуктов окисления модельного соединения лигнина LMS.

Реакционная способность ароматических и гетероциклических соединений часто зависит от природы и положения заместителей. Влияние заместителей на окисление этих соединений определяется как электронными эффектами, так и стерическими факторами. Наша задача состояла в том, чтобы выбрать соединения для использования в LMS с наилучшими каталитическими параметрами в гомогенной ферментативной реакции и оптимальными характеристиками электрохимической реакции на электроде (значение редокс-потенциала, обратимость реакции). При первичном отборе усилителей необходимо учитывать, что введение в структуру соединения тех или иных заместителей должно приводить к увеличению стабильности образующихся в результате реакции радикалов. Окисление соединений, в структуре которых присутствует гидроксильная группа, приводит к образованию нестабильных фенокси-радикалов, димеризацию/полимеризацию промежуточных форм соединения. Электрон-донорные заместители (алкильная, фенильная и аминогруппы), увеличивая скорость окисления соединения и обеспечивая при этом стабильность образующихся радикалов, уменьшают его окислительно-восстановительный потенциал соединения. Электрон-акцепторные группы (например, карбоксильная или сульфо- группы), увеличивают окислительно-восстановительный потенциал соединения [Xu et al., 2001] и улучшают его растворимость в водных растворах. При отборе соединений в качестве усилителей действия Lc необходимо принимать во внимание, что их редокс-потенциал должен быть выше 450 мВ [Bourbonnais et al., 2000], в противном случае они не могут принимать участие в окислении нефенольных подструктур лигнина.

В силу возможного масштабного коммерческого использования медиаторов, эти соединения должны быть доступны и иметь при этом низкую стоимость. Поиск нетоксичных гетероциклических соединений показал, что одним из наиболее перспективных классов органических соединений, которые могли бы использоваться в качестве медиаторов Lc, являются соединения с общим названием 1-фенил-3-метил-пиразолоны-5, которые производятся в промышленных масштабах и имеют низкую себестоимость (Рис. 8). Одним из наиболее известных соединений данного класса является метамизол натрия или анальгин (PPA-Na), который используется в медицинской практике в качестве обезболивающего средства.

1-фенил-3-метил-пиразолоны-5 относятся к гетероциклическим соединениям, содержащим в своем составе два заместителя электрон-донорной природы – метильную и фенильную группы и присутствуют в растворе в виде двух таутомерных форм (Рис. 8).

Были исследованы около двадцати соединений различной структуры, в том числе гетероциклических, N-OH соединений и производных бензойной кислоты. Исследования гомогенных реакций с участием T. hirsuta Lc позволили отобрать соединения, которые могут являться усилителями фермента. Среди этих соединений выраженные субстратные свойства по отношению к Lc обнаружены у 1-фенил-3-метилпиразолона-5 (РР), его сульфо- (mSPP и pSPP) и аминопроизводных (PPA и PPA-Na), а также у N-гидроксифталеимида (HPI) и 3-амино-(6гидрокси)-бензойной кислоты (HABA). Структурные формулы этих соединений представлены на Рис. 9.

1-(4’-сульфофенил)- 1-(3’-сульфофенил)фенил-3метилпиразолон-5 3-метил-пиразолон-5 3-метил-пиразолон- 1-фенил-3-метил-4-метиламинофенил-2,3-диметиламинопиразолон-5 пиразолон-5-N(4)-метансульфонат натрия

HPI HABA

N-гидроксифталеимид 3-амино-(6-гидрокси)-бензойная кислота Исследование зависимости начальной скорости гомогенных ферментативных реакций от концентрации исследуемых соединений показало, что кинетика реакций описывается уравнением Михаэлиса-Ментен. Для оценки эффективности взаимодействия Lc с этими соединениями было проведено их сравнение с одним из лучших субстратов Lc – гидрохиноном (HQ). Результаты представлены в Таблице 4. Как видно из Таблицы, производные PP с сульфогруппой в фенильном кольце (pSPP и mSPP), либо аминогруппой в гетероцикле (PPA), являются субстратами, сравнимыми по своим каталитическим константам с HQ. Эффективность процесса ферментативного окисления РР намного ниже, что, возможно, связано с его гидрофобностью.

Введение в гетероцикл фенилметилпиразолона электрон-донорных групп (аминогруппы в положение 4 и метильной группы в положение 2) увеличивает значение kкат/Kм в случае PPA более чем в 18 раз по сравнению с PP. Однако, это значение в несколько раз меньше, чем для сульфо-производных фенилметилпиразолона. В случае PPA-Na, введение заместителей (метильной и метан-сульфоновой групп) в аминогруппу мало отражается на скорости ферментативной реакции, но значение Км увеличивается более чем в 10 раз. Возможно, более слабое взаимодействие Lc с PPA-Na объясняется проявлением стерического фактора.

Взаимодействие Lc с HPI характеризуется низким сродством этого субстрата к ферменту и низкой скоростью реакции, а HABA является субстратом Lc, сравнимым по своим кинетическим параметрам с HQ.

В отличие от производных фенилметилпиразолона, при высоких скоростях развертки потенциала система с HPI квазиобратима, что подтверждается наличием катодного пика на вольтамперограммах. Потенциал средней точки между катодным и анодным пиками равен мВ, и его условно можно принять за редокс-потенциал этой пары. По-видимому, при низких скоростях развертки потенциала продукт, образующийся при окислении, недостаточно стабилен и не успевает восстановиться на электроде. Таким промежуточным продуктом может быть NO• радикал, как это было показано для таких медиаторов, как HBT и TEMPO [Bourbonnais et al., 1998; Xu et al., 2000; Fabbrini et al., 2002].

Описанные выше интермедиаты субстратов Lc образуются за счет их неферментативного окисления на электродах. Зависимость максимального анодного тока от квадратного корня из скорости развертки потенциала имеет линейный характер, что свидетельствует о том, что для всех исследованных соединений электродный процесс протекает в диффузионноконтролируемом режиме.

Таблица 4. Кинетические и электрохимические параметры субстратов лакказ E1/2 – потенциал полуволны окисления субстрата (скорость развертки потенциала 5 мВ/с);

Iдиф – анодный ток окисления медиатора;

I – прирост анодного тока при окислении медиатора (0,2 мМ) в присутствии VA (2 мМ).

Примечания:

Рабочие растворы содержали 2% этилового спирта ** Определение I и I Потенциалы полувысоты анодного пика для всех изученных производных фенилметилпиразолона, а также для HPI и HABA, представлены в Таблице 4. Как и следовало ожидать, потенциал полувысоты анодного пика зависел от природы заместителя в структуре фенилметилпиразолонов.

Ток, мкА Он увеличивался при введении электрон-акцепторной сульфогруппы в фенильное кольцо (mSPP и pSPP) и уменьшался при введении в гетероцикл электрон-донорной аминогруппы (РРА).

Спектральные исследования интермедиатов, образующихся при окислении усилителей, в Были проведены дополнительные спектральные исследования продуктов гомогенного окисления двух соединений класса фенилметилпиразолонов – PPA-Na и mSPP в присутствии T.

hirsuta Lc.

В случае PPA-Na спектры поглощения интермедиатов, образующихся в результате ферментативного окисления, зависели от соотношения концентраций медиатора и фермента в растворе (Рис. 11), что указывало на возможное образование нескольких промежуточных продуктов окисления медиатора.

Основываясь на электрохимических данных по гетерогенному окислению PPA-Na, можно предположить существование как минимум трех основных промежуточных продуктов ферментативного окисления данного субстрата (с потенциалами максимумов анодных пиков 290, 570, и 770 мВ).

При ферментативном окислении mSPP, по-видимому, образуются два интермедиата (Рис. 12). При этом продукт с максимумом поглощения при 340 нм является более высоко редокс-потенциальным, т.к. его формирование протекает на более поздней стадии ферментативной реакции. Можно предположить образование двух основных интермедиатов mSPP со значениями потенциалов 660 и 850 мВ, соответствующими максимумам поглощения при 270 и 340 нм, соответственно. При этом образование первого продукта при ферментативном окислении является быстрым процессом, в то время как образование второго продукта процесс более медленный. Похожее двухступенчатое поведение при ферментативном окислении было показано для ABTS, что позволяет предположить сходство механизмов ферментативного окисления обоих субстратов Lc [Bourbonnais & Paice, 1990; Sols-Oba et al., 2005].

Электрохимическое окисление вератрового спирта в присутствии медиаторов Методом циклической вольтамперометрии было изучено взаимодействие отобранных соединений с модельным соединением лигнина – вератровым спиртом (VA). Этот метод позволяет исследовать не только электродные процессы, но и сопряженные с ними химические реакции.

В качестве примера на Рис. 13 представлены циклические вольтамперограммы, записанные в растворах VA, медиаторов (mSPP, PPA-Na, HPI), а также смеси VA-медиатор. Необходимо отметить, что VA электрохимически не активен до потенциала 1000 мВ.

В присутствии mSPP (Рис. 13), а также pSPP и РРА, окисление VA происходит с меньшим перенапряжением, чем при прямой электродной реакции. На анодной ветви кривой наблюдается увеличение тока окисления в области потенциала 1000 мВ. В то же время, добавление VA к раствору PPA-Na не приводило к увеличению токов окисления (Рис. 13).

В присутствии VA в растворах HPI наблюдалось значительное увеличение анодного тока в области потенциалов окисления HPI и полное исчезновение тока восстановления на катодной ветви кривой (Рис. 13). Отсутствие катодного тока можно объяснить включением интермедиата электродного окисления HPI в процесс химического окисления VA вблизи поверхности электрода.

Химически восстановленный интермедиат вновь окислялся на электроде, давая увеличение анодного тока. При потенциале 910 мВ и скорости развертки потенциала 5 мВ/с анодный ток в присутствии VA увеличивался в 2,5 раза по сравнению с током в отсутствие VA (Рис. 13), что указывает на регенерацию восстановленной формы медиатора в результате каталитического окисления VA, и на повторное окисление HPI на электроде.

Оптическая плотность Оптическая плотность До потенциала 1000 мВ не наблюдалось ускорения электроокисления VA в присутствии низкопотенциального продукта электродного окисления HABA, редокс-потенциал которого составляет 390 мВ.

В Таблице 4 представлены соотношения прироста анодного тока в растворе, содержащем VA и медиатор, к диффузионному току окисления самого медиатора при потенциале 1000 мВ. Как видно из таблицы, эффективность электрокаталитического окисления VA возрастала с увеличением потенциала полуволны окисления усилителя. При взаимодействии с VA эффективными являлись соединения, имеющие потенциал полувысоты волны окисления выше 500 мВ.

Рисунок 13. Циклические вольтамперные кривые, зарегистрированные в растворах (1) медиатора (0.2 мМ); (2) вератрового спирта (2 мМ) и (3) смеси Условия: 0.1 М цитратно-фосфатный буфер, рН 5.0; скорость развертки потенциала 5 мВ/с Окисление вератрового спирта в системе лакказа/редокс усилитель фермента Для выяснения эффективности исследуемых медиаторов при деградации модельного соединения лигнина – VA, были проведены прямые эксперименты по окислению VA LMS в гомогенном растворе. Продукты окисления разделяли методом HPLC. Идентификацию продуктов окисления VA проводили по времени их удерживания на колонке. В качестве маркеров использовали VA, вератровый альдегид и вератровую кислоту, количество которых в элюате рассчитывали интегрированием пика элюции с использованием программы “Мультихром” (Россия). Для оценки эффективности аналогичный эксперимент проводили с использованием ABTS в качестве медиатора.

При использовании системы Lc/HPI была достигнута высокая степень превращения VA, сравнимая со степенью окисления спирта в присутствии ABTS. Взаимодействие Lc с гидроксифталеимидом характеризуется низкой скоростью реакции. Однако, как показали электрохимические исследования, образующийся при окислении катион-радикал, способен с довольно высокой скоростью окислять VA. Благодаря этому общая эффективность процесса деградации спирта системой Lc/HPI высока и составляет 70% превращения VA за 48 часов реакции. Иначе обстоит дело с системами Lc/PP. Как показали кинетические исследования (Табл.

4), Lc с высокой скоростью катализирует окисление сульфопроизводных данного класса.

Электрохимическими экспериментами было показано, что продукты окисления этих соединений нестабильны. Однако потенциал и время жизни продуктов окисления оказываются достаточными для того, чтобы окислить VA. Благодаря высокой скорости ферментативного окисления этих производных общая эффективность окисления VA системами Lc/mSPP или Lc/pSPP достаточно высока, в результате чего процент превращения спирта достигает, соответственно, 35% и 30% за 48 часов реакции. Более низкий по сравнению с ABTS процент деградации VA объясняется, повидимому, слабой обратимостью процесса окисления этих производных фенилметилпиразолона.

Как и следовало ожидать на основании электрохимических исследований, в системе Lc/PPANa скорость окисления VA оказалась значительно ниже, чем при использовании сульфопроизводных PP. В то же время, при использовании PPA-Na окисление VA идет до соответствующей кислоты, в то время как большинство известных к настоящему времени медиаторов окисляют VA до вератрового альдегида [Bourbonnais, Paice, 1990]. По-видимому, несмотря на низкую скорость реакции окисления VA, высокопотенциальные интермедиаты PPANa, образующиеся в присутствии Lc, способны к дальнейшему окислению вератрового альдегида до вератровой кислоты. Это хорошо согласуется с электрохимическими и спектральными результатами, полученными для PPA-Na.

Контрольные эксперименты показали, что в отсутствие Lc исследуемые нами медиаторы практически не способны к окислению VA, также как и Lc в отсутствие медиаторов окисляет менее 2% VA. Таким образом, производные PP могут использоваться в качестве усилителей действия Lc.

[Ярополов c соавт., 2007, 2008; Karamyshev et al., 2003; Vasil'eva et al., 2007] Полианилин является одним из наиболее важных электропроводящих полимеров в силу своей высокой химической стабильности, относительно высокой электропроводности, простоты получения и возможности изменять свои физико-химические характеристики при изменении температуры, рН раствора, электрического потенциала. Это обуславливает возможность использования электропроводящего полианилина в различных областях, таких как создание хемо- и биосенсоров, антистатических и антикоррозионных покрытий, в микроэлектронике и светоизлучающих устройствах, для разделения изомеров оптически активных соединений. В настоящей работе описываются ферментативный способ получения водной дисперсии наночастиц электропроводящего полианилина и полисульфокислоты, а также безматричный способ получения оптически активного полианилина.

В качестве катализатора реакции окислительной полимеризации мономера использовали высокоочищенные препараты Lc из культурального фильтрата базидиального гриба T. hirsuta.

Использованная в работе Lc является кислотостабильным ферментом, что важно при проведении ферментативного синтеза, осуществляемого при кислых значенях рН.

Матричный синтез интерполимерного комплекса наночастиц электропроводящего Полимеризацию анилина проводили при комнатной температуре в присутствии сульфонированного полистирола как матрицы для синтеза полимера. Формирование продуктов реакции контролировали спектрофотометрически (Рис. 14). Варьировали следующие параметры синтеза: рН раствора, начальные концентрации фермента, анилина и сульфополистирола.

Исследовались следующие параметры полученных образцов: строение полианилинов с использованием различных видов спектроскопии (Рис. 14), электрохимическая активность с использованием циклической вольтамперометрии, а также электропроводность синтезированных образцов. Показана возможность ферментативного получения водорастворимого электропроводящего полианилина, различающегося по основным свойствам в зависимости от условий синтеза.

Безматричный синтез оптически активного электропроводящего полианилина Использование оптически активного полианилина для создания HPLC сорбентов с целью разделения энантиомеров физиологически активных соединений представляет большой интерес. Поскольку дедопированный полианилин не имеет ассиметричных атомов углерода, оптическая активность полимера (спиралевидная конформация) индуцируется хиральными допантами, среди которых наиболее часто используют энантиомеры сульфокамфорной кислоты (CKK).

Одной из практических задач настоящей работы являлась разработка простого, экологически чистого способа получения оптически активного полианилина. Поставленная задача была решена следующим способом: окислительную полимеризацию анилина проводили в присутствии хирального допанта (R- или S-сульфокамфорной кислот (CKK)) с использованием T. hirsuta Lc.

Ферментативный способ получения хирального полианилина протекает в одну стадию, является экологически чистым и позволяет получать полианилин не загрязненный продуктами восстановления окислителя. При значении рН около 2,8, которое было выбрано оптимальным для получения допированного полианилина, Lc сохраняет ~38% своей первоначальной активности после инкубации в течение 4 суток при температуре 20°С.

Были оптимизированы условия ферментативного синтеза путем варьирования концентраций реагентов (CKK и анилина от 0,025 М до 0,4 М) и их соотношений (от 1:5 до 5:1); концентрации дикислорода (0,025 mM и 1 mM), рН раствора (2,66,0); температуры (4°С и 20°С) и концентрации фермента (6•10-8 М и 1,6•10-7 М). Наилучшие результаты были получены при соотношении реагентов анилин:сульфокамфорная кислота=1:1 и их концентраций в интервале 0,10,2 М.

При увеличении концентрации О2 в реакционной смеси по сравнению с раствором насыщенным воздухом, скорость полимеризации возрастает, но при этом несколько усложняется методика эксперимента. Поэтому все эксперименты, приведенные в настоящей работе, проводили на воздухе.

Поглощение Поглощение На рисунке 15 приведены УФ-видимые спектры полианилина, допированного S-CKK, синтезированного in situ, при различных температурах. Видны четко выраженные полосы поглощения в области 750-800 нм, относящиеся к допированной форме полианилина и указывающие на наличие локализованного полярона в структуре полимера.

Методом спектроскопии кругового дихроизма показана оптическая активность ферментативно синтезированного полимера (Рис. 16). Установлено, что спиралевидная конформация основной цепи полианилина является достаточно лабильной и знак оптической активности полимера можно изменить передопированием полученного образца другим энантиомером СКК.

Комплексное сравнительное изучение медьсодержащих оксидаз [Шлеев с соавт., 2003; Shleev et al., 2004a, 2005b, 2005c, 2006d, 2007a, 2007b, 2008a, 2008b;

Ferapontova et al., 2005; Pita et al., 2006; Christenson et al., 2004, 2006; Yaropolov et al., 2007;

Nazaruk et al., 2007; Haghighi et al., 2007; Zumarraga et al., 2007, 2008a, 2008b; Горбачева с соавт., 2008; Vaz-Dominguez et al., 2008; Ramrez et al., 2008; Haberska et al., 2009;

Определение окислительно-восстановительных потенциалов Т1 центров MCO Одной из основных характеристик MCO является стандартный окислительновосстановительный потенциал Т1 центров ферментов. Значения этого потенциала варьируются у различных MCO от 430 до 1000 мВ отн. NHE [Solomon et al., 1996; Shleev et al., 2005b]. T1 центр фермента является первичным акцептором электронов, поступающих от субстратоввосстановителей. Непосредственно MCO окисляют только те соединения, окислительновосстановительный потенциал которых незначительно превышает редокс-потенциал иона меди Т1 центра фермента [Xu, 1997]. Кроме того, от редокс-потенциала Т1 центра зависит эффективность катализа для большинства субстратов Lc, что делает MCO с высокими потенциалами Т1 центра весьма перспективными объектами для биотехнологических целей, например, для обесцвечивания бумажной пульпы, биоремедиации и деградации различных ксенобиотиков. Определение редокс-потенциалов ионов меди первого типа было необходимо для выявления наиболее высокопотенциальных ферментов, которые, участвуя в реакциях окисления субстратов, приводят к образованию высокопотенциальных интермедиатов, что весьма важно при проведении биотехнологических процессов. Более того, именно применение высоко редокс-потенциальных MCO перспективно с точки зрения создания высокоэффективного биокатода топливных элементов.

Определение редокс-потенциалов Т1 центров MCO осуществляли методом потенциометрическoго титрования в присутствии редокс-медиатора(ов) с использованием разработанных микро и макро спектроэлектрохимических ячеек (Рис. 17).

На рисунке 18 представлены спектры поглощения растворов T. hirsuta Lc, записанных в процессе окислительно-восстановительного титрования с использованием редокс-пары [Mo(CN)8]3-/[Mo(CN)8]4-. Аналогичные данные были получены при окислительновосстановительном титровании T. ochracea, C. fulvocinerea и C. maxima Lc. Восстановление Т медного центра сопровождалось уменьшением пика поглощения в области 610 нм. Следует отметить, что редокс-потенциал системы в данном случае определялся соотношением окисленной и восстановленной форм медиатора.

Другим вариантом потенциометрического титрования в присутствии одного или нескольких редокс-медиаторов является метод электролиза смеси фермента и редокс-медиаторов. Для этой цели использовалась микро спектроэлектрохимическая ячейка с рабочим объемом около 7 мкл (Рис. 17А). Редокс-потенциал системы в данном случае определяется потенциалом, накладываемым на рабочий электрод, а медиатор служит лишь для ускорения достижения редокс-равновесия в системе. Данный метод позволяет значительно уменьшить количество медиатора, а также расширить возможную область потенциалов в процессе редокс-титрования.

Микро (рабочий объем 7 микролитров) Макро (рабочий объем 2000 микролитров) Т1 и Т3 центры (УФ-видимая спектроскопия) Т1 и Т2 центры (УФ-видимая и ЭПР спектроскопия) (А: 1 - вывод рабочего раствора; 2 и 3 - вспомогательные электроды; 4 - керамическая втулка; 5 пластмассовая завинчивающаяся крышка; 6 - коническая муфта; 7 - пластиковое крестообразное основание;

8 - золотой рабочий электрод (капилляр); 9 - электрод сравнения; 10 – оптическое волокно.

Б: 1 - кварцевая кювета; 2 - плоский шлиф; 3 - зажим; 4 - ячейка для проведения электрохимических измерений; 5 - трубка ввода газа; 6 - кран; 7 - мешалка; 8 - платиновые электроды; 9 - трубка вывода газа и ввода веществ; 10 - простой шлиф; 11 - водяной затвор; 12 - капилляр;

13 - трубка для соединения рабочего раствора с электродом сравнения; 14 - трубка для шланга) На рисунке 19 представлен пример использования данной методики при редокс-титровании двух множественных форм T. pubescens Lc с использованием редокс-пары [Mo(CN)8]3Mo(CN)8]4-. С помощью данной методики были определены окислительно-восстановительные потенциалы Т1 центров Cerrena unicolor Lc, рекомбинантной M. thermophila Lc (LT2), мутантов фермента 2B10, 7H9, 3D1, 2E9, и R2, M. verrucaria и T. tsunodae BOx, а также Bacillus halodurans MCO.

Поглощение, отн. ед.

Поглощение, отн. ед. (614 нм) Полученные данные о значении окислительно-восстановительных потенциалов Т1 центров MCO представлены в Таблице 5. Все изученные MCO относятся к высоко редокс-потенциальным ферментам и являются высокоактивными в гомогенных реакциях окисления субстратов-доноров.

Дальнейшие электрохимические исследования Lc, проведенные в настоящей работе, представляют интерес для понимания механизма катализа и возможности использования этих ферментов в гетерогенных биоэлектрокаталитических системах.

Таблица 5. Редокс-потенциалы Т1 центра голубых медьсодержащих оксидаз Trametes ochracea Lc Trametes hirsuta Lc Trametes pubescens LAC Trametes pubescens LAC Coriolopsis fulvocinerea Lc Cerrena maxima Lc Cerrena unicolor Lc Myceliophthora thermophila LT Myceliophthora thermophila 2B Myceliophthora thermophila 7H Myceliophthora thermophila 3D Myceliophthora thermophila 2E Myceliophthora thermophila R Myrothecium verrucaria BOx Trachyderma tsunodae BOx Bacillus halodurans бактериальная MCO Редокс-титрование T. hirsuta Lc c одновременной детекцией сигнала Т1 центра посредством видимой и ЭПР спектроскопии, а также специфического сигнала Т2 центра в ЭПР спектре Lc (Рис. 20) показало, что одно из возможных значений редокс-потенциала Т2/T3 кластера значительно ниже окислительно-восстановительного потенциала Т1 центра Lc равного 780 мВ отн. NHE. При проведении данных экспериментов использовалась разработанная автором биоэлектрохимическая ячейка с параллельным спектрометрическим контролем исследуемого вещества (Рис. 17Б).

Уникальная конструкция микро-спектроэлектрохимической ячейки с общим объемом около 7 мкл (Рис. 17А) позволила провести окислительно-восстановительные титрования MCO, таких как T. hirsuta Lc, M. verrucaria BOx, и T. tsunodae BOx, в отсутствие редокс-медиаторов. В данных экспериментах кривые титрования значительно отличались от кривых, представленных выше.

Наличие четко выраженного гистерезиса в электрохимическом процессе показано для всех изученных MCO. Как видно из рисунков 21 и 22, ход окислительного титрования ферментов отличается от восстановительной ветви кривой титрования.

Используя модельный редокс-белок, азурин, который содержит в своей структуре лишь один ион меди типа 1, было показано, что данное явление связано не столько с отсутствием полного окислительно-восстановительного равновесия в системе, сколько с особыми свойствами MCO, имеющих в своем составе многоядерный медьсодержащий активный центр. Высказано предположение, что электронное поведение MCO, сходное с поведением диодов, а именно значительно различающаяся скорость электронного переноса в ходе окислительного и восстановительного процессов, является внутренним свойством, присущим многим высоко редокс-потенциальным MCO. По-видимому, данное явление связано со специфической ориентацией белка на поверхности золотого рабочего электрода, а именно возможностью электронного контакта Т2/T3 центра ферментов и электрода (Рис. 22Б). Был сделан вывод о том, что одним из возможных редокс-потенциалов Т2/T3 центра высоко редокс-потенциальных MCO является значение близкое к 400 мВ отн. NHE. Анализ литературных данных, а также собственные результаты по электрохимическому поведению MCO на золотых и угольных электродах (см. ниже), подтвердили данное предположение.

Поглощение, опт. ед.

Поглощение, опт. ед.

Поглощение, опт. ед.

Поглощение, опт. ед.

Электрохимическое поведение MCO на золотых электродах Исследовано электрохимическое поведение T. hirsuta, T. ochracea и C. maxima Lc, а также T. tsunodae BOx и человеческого Cp, адсорбированных на модифицированных и немодифицированных золотых электродах. Cp, адсорбированный на немодифицированных золотых электродах, также как электродах, модифицированных отрицательно и положительно заряженными тиолами, не обладал электрохимической активностью. Циклические вольтамперограммы золотых электродов, модифицированных 4-аминотиофенолом, с иммобилизованным Cp в отсутствие редокс-медиаторов представлены на Рис. 23.

Иммобилизация Cp на нейтральном слое аминофенола приводила к появлению электрохимической активности фермента, а именно неярко выраженного анодного пика со значением потенциала около 750 мВ отн. NHE. Рассчитанная для одноэлектронного переноса концентрация белка составляла около 8 пмоль/см2 с учетом реальной поверхности золота, имеющей фактор шероховатости около 2. Высота анодного пика слабо зависела от концентрации растворенного О2. Важно отметить полное отсутствие ускорения электрокаталитического процесса восстановления О2 церулоплазмином, иммобилизованным на модифицированных и немодифицированных золотых электродах.

Рисунок 23. Циклические вольтамперограммы золотого электрода, Дополнительные элипсометрические исследования адсорбции белка на тиол-модифицированной поверхности позволили расчитать реальную концентрацию Cp при его иммобилизации на 4аминотиольном монослое (Рис. 24). С учетом молекулярного веса целовеческого Cp, 132 кДа, эта концентрация не превышала 2 пмоль/см2. Сходная ситуация, а именно проявление электрохимической активности без ускорения электровосстановления О2 в отсутствие редоксмедиаторов, наблюдалась и при электрохимическом изучении другой MCO – T. tsunodae BOx, иммобилизованной на золотых электродах, модифицированных отрицательно заряженным монослоем тиола (Рис. 25А). При этом фермент, адсорбированный на немодифицированных золотых электродах, также как и на электродах, модифицированных положительно заряженным и нейтральным тиолами, не обладал электрохимической активностью. Широкие катодный и анодный пики (Рис. 25А) отражают электрохимическое восстановление и окисление BOx, ковалентно связанной с поверхностью электрода. Потенциал средней точки фарадеевского процесса равен 360 мВ (отн. NHE), интервал между катодным и анодным пиком соответствует квазиобратимому электрохимическому процессу (56 мВ), рассчитанная поверхностная концентрация фермента – около 10 пмоль/см2. Рассчитанная с использованием Marcus-DOS теории вольтамперометрическая кривая достаточно хорошо описывает Фарадеевский процесс при значениях энергии реогранизации Т1 центра ( Т 1 ) 0,4-0,8 эВ и стандартной константы скорости гетерогенного ЭП ( k 0 ) 0,3 с-1.

количество (mg/m2) Введение в буферный раствор кислорода, также как и ингибирование фторид-ионами адсорбированного фермента, не приводило к появлению значительной разницы в плотностях тока по сравнению с анаэробными условиями для электрода, поляризованного при потенциале +500 мВ (Рис. 25А, вставка). При этом, добавление K3[Fe(CN)6], эффективного медиатора, осуществляющего ЭП независимо от ориентации фермента на поверхности электрода, приводило к появлению ярко выраженного процесса ускорения электрокаталитического восстановления О2 (Рис. 25Б). Аналогичные результаты были получены и для золотых электродов, модифицированных T. hirsuta Lc.

На рис. 26 представлена циклическая вольтамперограмма фермента, адсорбированного на немодифицированном золотом электроде. Потенциал средней точки фарадеевского процесса равен 480 мВ (отн. NHE), интервал между катодным и анодным пиком соответствует квазиобратимому электрохимическому процессу (100 мВ), поверхностная концентрация фермента, рассчитанная с учетом одноэлектронного переноса, – около 4 пмоль/см2. Данная концентрация фермента незначительно превышает количество Lc на единицу поверхности, рассчитанную с учетом элипсометрических исследований (Рис. 27). Следует отметить практически полное отсутствие ускорения электровосстановления О2 Lc, адсорбированной на немодифицированных золотых электродах в отсутствие редокс-медиаторов.

Введение в раствор ABTS приводило к ярко выраженному биоэлектрокаталитическому восстановлению О2 Lc, адсорбированной на золотых электродах. Процесс контролировался как электрохимически (Рис. 28), так и спектрофотометрически с использованием микро спектроэлектрохимической ячейки (Рис. 29).

Следует отметить, что активность адсорбированного фермента зависела от потенциала, приложенного к золотому электроду. Данное поведение фермента напоминает поведение полупроводниковых транзисторов, в которых скорость ЭП (плотность тока) между вводом и выводом устройства зависит от потенциала, приложенного к контрольному электроду (Рис. 30).

По-видимому, низко редокс-потенциальный процесс, наблюдаемый при использовании золотых материалов, соответствует редокс-трансформации Т2/Т3 кластера MCO за счет специфической ориентации белка на поверхности электрода. Важно также отметить, что активность Lc составляла около 50% при отсутствии потенциала (Рис. 30).

Ток, мкA/см количество (мг/м2) Ток, нА Ток, нА А (419 нм) Рисунок 29. Спектроэлектрохимичесике исследования окисления ABTS с адсорбированной на поверхности золотого капилярного электрода.

А) Зависимость скорости ферментативного окисления ABTS (выраженная в Для иммобилизации MCO также использовали свежесинтезированные золотые наночастицы различного размера, от 40 до 110 нм. В этом случае, в отличие от золотых макроэлектродов, удалось добиться ПЭП между золотой поверхностью и Т1 центром некоторых ферментов, в частности T. hirsuta Lc, что выражалось в биоэлектрокаталитической активности адсорбированных MCO, проявляющейся уже при высоких потенциалах близких к редокспотенциалу Т1 центра. Рассчитанная k 0 в случае использования T. hirsuta Lc составляла около 0.5 с-1. Плотность тока биоэлектрокаталитического восстановления О2 варьировали (в зависимости от размера наночастиц, рН буферного раствора, и т.д.) в диапазоне от 5 до мкА/см2.

Электрохимическое поведение MCO на электродах из углеродных материалов Методом циклической вольтамперометрии исследованы прямые (безмедиаторные) электрохимические реакции восстановления O2 с участием T. hirsuta, T. ochracea, T. pubescens, C. fulvocinerea и C. maxima Lc, нативной L. wrigthii Lc, рекомбинантной M. thermophila (LT2) Lc и мутантов фермента 2B10, 7H9, 3D1, 2E9, и R2, а также M. verrucaria BOx, T. tsunodae Box, человеческого Cp и бактериальной MCO Bacillus halodurans, адсорбированных на электродах из спектрального графита. В аэробных условиях на электродах из спектрального графита для всех исследованных ферментов показана возможность ПЭП с электрода на фермент. Для T. hirsuta, T. ochracea, C. fulvocinerea, T. pubescens, C. maxima Lc, а также бактериальной MCO B.

halodurans, ПЭП сопровождался ускорением электрокаталитического восстановления О2. На Рис.

31 представлены типичные циклические вольтамперограммы немодифицированных и модифицированных Lc электродов из спектрального графита в насыщенных кислородом буферных растворах. При адсорбции на электродах, все Lc сильно уменьшали перенапряжение реакции электровосстановления молекулярного О2 до Н2О.

Ток, мкА Ток, мкА Необходимо отметить, что для C. fulvocinerea Lc наблюдалась более низкая электрокаталитическая активность по сравнению с другими изученными ферментами базидиомицетов, в то время как ее активность в гомогенном растворе сравнима с активностью других Lc. Возможно, это объясняется высоким (32%) содержанием углеводов в C. fulvocinerea Lc (Таблица 1), что может оказывать влияние на ориентацию молекул фермента на поверхности электрода, а также затруднять ЭП с электрода на Т1 центр фермента.

Как видно из рисунка 31, начало электровосстановления O2 на электродах, модифицированных Lc, находится в области 800 мВ, т.е. существует корреляция между потенциалом Т1 центра ферментов и началом реакции электровосстановления O2 на электроде.

Такая же корреляция получена и для низко редокс-потенциальных растительной Lc и бактериальной MCO. При этом оптимум рН биокаталитической реакции восстановления O находится в сильно кислой области для Lc базидиомицетов и слабощелочной области для растительного и бактериального ферментов, что совпадает с оптимумами рН гомогенных реакций данных биокатализаторов.

Lc аскомицетов, например, дикого типа L. wrigthii и рекомбинантная M. thermophila, не катализировали ускорение реакции электровосстановления О2. При этом, на циклических вольтамперограммах ферментов регистрировались достаточно ярко выраженные редокспроцессы в области потенциалов 400 мВ отн. NHE.

немодифицированных электродах из спектрального графита. В качестве примера, на Рис. представлены циклические вольтамперограммы электродов из спектрального графита с иммобилизованной смесью многостенных углеродных нанотрубок с Cp. На электродах из спектрального графита, модифицированных и немодифицированных многостенными и одностенными нанотрубками, всегда присутствовал фарадеевский процесс со значением потенциала средней точки около 380 мВ отн. NHE. Поверхностная концентрация фермента, рассчитанная с учетом одноэлектронного переноса, достигала 8 и 14 пмоль/см2 для катодного и анодного пика, соответственно, с учетом факторов шероховатости элетродов.

Наряду с квазиобратимым процессом, наблюдался катодный пик со значением потенциала около 580 мВ и рассчитанной поверхностной концентрацией Cp около 3 пмоль/см2.

Использование многостенных карбоновых нанотрубок в качестве матрицы для иммобилизации фермента приводило к обнаружению высоко редокс-потенциального квазиобратимого процесса со значением потенциала средней точки около 690 мВ отн. NHE. Показана чувствительность обоих редокс-процессов к О2, а именно исчезновение редокс-активности Cp в анаэробных условиях (Рис. 32). Однако, как и при использовании золотых электродов, ускорения реакции электровосстановления О2 адсорбированным Cp не наблюдалось.

Ток, мкА I (A) Рисунок 32. Циклические вольтамперограммы электродов из спектрального графита, модифицированных многостеночными карбоновыми нанотрубками (скорость развертки потенциала – 100 мВ/сек; стартовый потенциал – 1000 мВ) На циклических вольтамперограммах T. tsunodae Box, адсорбированной на электроде из спектрального графита, в анаэробных условиях наблюдались низко и высоко редокспотенциальные симметричные пики с потенциалами средней точки фарадеевских процессов равными 390 мВ и 690 мВ отн. NHE, соотвественно (Рис. 33А). Интервалы значений потенциалов между катодными и анодными пиками соответствовали квазиобратимым электрохимическим процессам, 73 мВ и 155 мВ. Рассчитанная поверхностная концентрация фермента – около 5 и пмоль/см2 для низко и высоко редокс-потенциальных процессов, соотвественно.

Смоделированная с использованием Marcus-DOS теории вольтамперометрическая кривая достаточно хорошо описывает оба фарадеевских процесса при значениях энергии реорганизации 0,4 – 0,8 эВ и стандартной константы скорости гетерогенного процесса 1,3 с-1 и 0, с-1, соответственно.

Ток, мкА Ток, мкА Введение в буферный раствор кислорода приводило к появлению ярко выраженного каталитического процесса, ингибирующегося фторид-ионами. Добавление K3[Fe(CN)6], эффективного медиатора, осуществляющего МЭП независимо от ориентации фермента на поверхности электрода, не приводило к значительному изменению плотностей тока. При относительно высоких скоростях развертки потенциала проявлялась вторая полуволна электровосстановления О2 (Рис. 33Б). Начало первой и второй полуволн электровосстановления О2 находилось в четкой корреляции с редокс-потенциалами фарадеевских процессов, зарегистрированных в анаэробных условиях (Рис. 32А).

Разработка амперометрических биосенсоров первого и второго рода для определения (Шлеев с соавт., 2004б; Ярополов с соавт., 2005; Shleev et al., 2006a; Haghighi et al., 2007) А) Биосенсор первого рода для определения полифенольного комплекса вин Проведено определение общего содержания фенольных соединений по значению максимального тока кислородного электрода методом хроноамперометрии с использованием T. hirsutа Lc и тирозиназы. Показано, что в случае применения отдельных препаратов тирозиназы и Lc наблюдалась прямая зависимость между предельным током электрода Кларка (величина, прямо пропорциональная содержанию кислорода) и содержанием фенолов, определенных методом Фолина-Чокальтеу. Однако максимальная разница ответов ячейки на количество окисляемых соединений составляла лишь около 8 нА (6,5% шкалы прибора). При этом разница в количестве фенольных соединений в образцах достаточно значительна.

Совместное использование двух ферментов приводило к получению максимальной разницы тока до 20 нА (18,5% шкалы прибора), а также к значительно более четкой корреляции между значениями токов окисления и общего содержания полифенолов в образце. Это объясняется расширением субстратной специфичности окисляемых фенольных соединений при использовании двух ферментов что, соответственно, приводит к увеличению точности анализа.

Построена калибровочная кривая зависимости концентрации кислорода в ячейке Кларка (при совместном использовании тирозиназы и Lc) от общего содержания фенолов в красных винах.

На основании полученных данных сделан вывод о принципиальной возможности использования биосенсора первого рода для определения полифенольного комплекса вин.

Б) Биосенсоры первого и второго родов для определения лигнинов В отличие от биосенсора первого рода для определения полифенольного комплекса вин, в котором производилось прямое введение ферментов в исследуемые растворы, для определения концентрации лигнинов в структуру биосенсора был добавлен реактор с иммобилизованной Lc (Рис. 34).

Показано, что иммобилизация фермента с использованием глутарового альдегида приводила к сохранению 90% от первоначальной активности фермента. На Рис. представлены калибровочные кривые биосенсора при определении Крафт и хвойного лигнинов.

Зависимость ответа электрода Кларка имела линейный характер в диапазоне концентраций лигнина 0,01-0,15 мг/мл. Чувствительность биосенсора составляла 0,49 и 0,21 нА/мкг по отношению к Крафт и хвойному лигнинам, соответственно. Была исследована операционная и долговременная стабильности биосенсора с иммобилизованной Lc. Показана стабильность сигнала устройства при проведении 20 анализов за день. Необходимо отметить, что биосенсор сохранял до 85% активности при проведении 70 анализов в течение 7 дней.

Основу биосенсора второго рода составлял электрод из спектрального графита с иммобилизованной путем физической адсорбции T. hirsute Lc. Было исследовано поведение биосенсора в двух режимах: в замкнутой системе с перемешиванием и проточно-инжекционной системе. рН-оптимум обоих биосенсоров – около 5, оптимальный потенциал – около +150 мВ. В проточно-инжекционном режиме оптимум потока буфера составлял 0,6 мл/мин. При этом наблюдалось плавное увеличение отклика биосенсора при увеличении скорости потока от 0 до 0,6 мл/мин, что указывало на быструю кинетику реакций на поверхности электрода. В диапазоне 0,6 – 1,5 мл/мин отклик биосенсора оставался постоянным. В качестве рабочего режима была выбрана скорость потока буфера 1,4 мл/мин для предотвращения возможного засорения системы нерастворимыми частицами препаратов лигнина. На Рис. 35Б представлены калибровочные кривые биосенсоров в замкнутой системе с перемешиванием и проточноинжекционной системе при определении Крафт и хвойного лигнинов. Зависимость ответа электрода Кларка имела линейный характер в диапазоне концентраций 0,01-0,50 мг/мл для Крафт и 0,01-0,25 мг/мл для хвойного лигнинов. Чувствительность биосенсора составляла 3,31 и 0,75 нА/мкг для Крафт и хвойного лигнинов, соответственно. Была исследована операционная и долговременная стабильности биосенсора c иммобилизованной Lc. В обоих режимах показано сохранение ответа устройства при проведении 100 анализов в день. Биосенсор сохранял до 70% активности при проведении 30 анализов в течение 7 дней.

Ответ биосенсора (мкА) Рисунок 35. Калибровочные кривые определения Крафт и хвойного лигнинов.

А) на основе электрода Кларка с использованием реактора с иммобилизованной В) Биосенсор второго рода для определения фенольных соединений Был разработан амперометрический ферментный электрод на основе лакказы T. hirsuta для определения фенольных соединений. Для иммобилизации фермента на поверхности стеклоуглеродного электрода использованы три вида полимерных материалов: положительно заряженный цетилэтилполиэтиленимин и отрицательно заряженные коммерческие препараты Nafion и Eastman AQ 29D. Нижний предел обнаружения модельных фенольных соединений, гидрохинона и пирокатехина, при соотношении сигнал/шум равном 3 в буферном растворе при иммобилизации Lc в мембране Nafion составлял 3,5х10-8 М и 5,0х10-8 М, соответственно.

Наименьшим временем отклика обладали электроды с Lc, иммобилизованной в мембранах Nafion и Eastman AQ 29. Было показано, что операционную стабильность и стабильность при хранении (долговременную стабильность) можно значительно увеличить дополнительным включением в матрицы полимеров желатина, предотвращающего инактивацию фермента в результате модификации последнего свободно-радикальными продуктами окисления фенольных соединений. Разработанный биосенсор позволяет детектировать фенольные соединения в водных растворах при концентрациях ниже 1 мкМ.

Г) Биосенсор второго рода для определения фенольных соединений на основе частично очищенного ферментного препарата базидиомицета T. pubescens При создании биосенсора использовали частично очищенный ферментный препарат T.

pubescens Lc. Оптимизацию амперометрического биосенсора для определения фенольных соединений на основе ферментного препарата проводили с использованием пирокатехина в качестве модельного субстрата. В качестве рабочего электрода использовали спектральный графит с нанесенным на его поверхность ферментным препаратом. Детекцию осуществляли при потенциале рабочего электрода, соответствующем электровосстановлению продукта ферментативной реакции. Показано, что оптимальная концентрация ферментного препарата для адсорбции составляла около 100 мкг/мл. Воспроизводимость результатов для шести изготовленных ферментных электродов составляла приблизительно 88%, что хорошо согласуется с литературными данными для биосенсоров на основе Lc-модифицированных электродов.

Исследована зависимость отклика биосенсора от приложенного потенциала. Показано, что для потенциалов ниже +385 мВ величина тока не зависит от приложенного потенциала. В дальнейших экспериментах электровосстановление окисленных фенольных соединений проводили при потенциале +160 мВ, т.к. этот потенциал удобен для практического использования и оказывает наименьшее влияние на превращение различных соединений в комплексных системах. Наиболее интенсивный ответ биосенсора наблюдался при скорости потока 0,5 мл/мин. Изучение влияния рН буферного раствора на отклик биосенсора показало, что оптимальное значение рН для детекции пирокатехина составляло 5,0.

В оптимизированных условиях были определены амперометрические отклики биосенсоров на основе ферментного препарата из гриба T. pubescens с использованием проточноинжекционной системы для ряда фенольных соединений. Чувствительность, предел детекции, линейный динамический диапазон, а также коэффициент корреляции рассчитывали, используя уравнение Михаэлиса-Ментен для электрохимических систем. Результаты расчетов для некоторых соединений представлены в Таблице 6. Сравнивая полученные нами данные для электродов, модифицированных ферментными препаратами из базидиомицета T. pubescens, с данными для электродов, модифицированных гомогенными препаратами T. versicolor и T. hirsuta Lc, можно сделать вывод, что разработанный биосенсор обладал более широким линейным диапазоном детекции для большинства использованных фенольных соединений.

Таблица 6. Характеристики амперометрического биосенсора на основе ферментного препарата базидиомицета Trametes pubescens по отношению к фенольным соединениям Разработка безмедиаторных биокатодов и биотопливных элементов Принципиальная возможность создания достаточно стабильных и эффективных биокатодов на основе ПЭП показана выше. Прямая физическая адсорбция Lc базидиомицетов, а также грибных BOx на графитовых электродах, приводит к созданию простейших биокатодов с плотностью тока до 100 мкА/см2, работающих в диапазоне рН 3,0-8,0. Дальнейшее увеличение плотности тока, наряду со значительным улучшением долговременной и операционной стабильностей биокатода, было достигнуто ковалентной иммобилизацией T. hirsuta Lc на модифицированных поверхностях электродов для специфической ориентации молекул фермента. Для этой цели графитовые электроды модифицировались фенольными производными различной структуры, например 2-аминофенолом и аминофенилом (Рис. 36), с последующей ковалентной пришивкой Lc за счет карбоксильных групп фермента. Данные биокатоды отличались повышенной операционной стабильностью (до 1 месяца работы при сохранении практически первоначальных параметров), отсутствием ингибирования фермента хлорид-ионами, а также плотностями тока до 650 мкА/см2.

Была разработана модель простого биотопливного элемента, основанного на явлении ПЭП в катодной и анодной реакциях (Рис. 37). Как описано выше, в нашем распоряжении имелись несколько биокатодов, активных в широком диапазоне рН. Принципиальной задачей настоящей работы была разработка простой, безмембранной, безмедиаторной модели глюкоза/O утилизирующей биотопливной ячейки. Глюкозооксидаза – фермент, широко использующийся в биотопливных элементах в настоящее время. Однако, из-за отсутствия ярко выраженного ПЭП для фермента на немодифицированных поверхностях, большинство разработанных биоанодов включали в себя растворимые редокс-медиаторы или редокс-полимеры. Лишь в последнее время появились работы, описывающие эффективный ПЭП между глюкозооксидазой и модифицированными электродами с использованием достижений нанотехнологии. В связи с этим был использован другой биокатализатор – целлобиозодегидрогеназа (CDH), фермент, обладающий ферментативной активностью по отношению к широкому кругу углеводов, включая глюкозу. В состав фермента входят две простетические группы – флавинадениндинуклеотид и гем-группа. Последняя обеспечивает наличие ПЭП между активным центром фермента и анодом биотопливного элемента (Рис. 37).

Рисунок 36. Схема модификации электрода лакказой с использованием карбоновых электродов, модифицированных (А) аминофенилом и (Б) 2-аминофенолом.

Рисунок 37. Схема безмембранной глюкоза/O2 биотопливной ячейки на основе голубой медьсодержащей оксидазы и целлобиозодегидрогеназы, Использование CDH и MCO из различных источников позволило создать модели биотопливных ячеек, работающих как в кислых, так и нейтральных растворах, использующих различные углеводы, включая глюкозу, в качестве биотоплива. Основные параметры разработанных устройств представлены в Таблице 7.

Таблица 7. Основные характеристики моделей безмедиаторных безмембранных углевод/О биотопливных ячеек работающих в слабощелочных и кислых растворах Строение биотопливного элемента C. thermophila CDH/T. tsunodae BOx (pH 7,4) В четвертой главе представлено обсуждение результатов автора, а также анализ последних литературных данных по теме диссертации.

Широкое использование окислительно-восстановительных белков, редокс-ферментов и клеток, для создания чувствительных и селективных биосенсоров, высокоэффективных биотопливных элементов, а также открытие “полупроводниковых” свойств сложных оксилительно-восстановительных ферментов, привело к возникновению нового термина в биоэлектрохимии, “биоэлектроника” (Katz, 2006) - раздела, охватывающего фундаментальные и прикладные исследования различных биоэлектронных устройств. По принципу действия биоэлектронные устройства можно разделить на три типа, а именно устройства первого, второго, и третьего родов или, другими словами, поколений (Рис. 38).



Pages:   || 2 |
 
Похожие работы:

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«СУДНИК Светлана Александровна ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РЕПРОДУКТИВНЫХ СТРАТЕГИЙ КРЕВЕТОК 03.00.16 - Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград - 2008 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Буруковский Рудольф Николаевич Официальные...»

«МОРОЛДОЕВ ИГОРЬ ВИКТОРОВИЧ СТРУКТУРА СООБЩЕСТВ ЖУКОВ-ЖУЖЕЛИЦ (COLEOPTERA, CARABIDAE) КРИОАРИДНОЙ ЛЕСОСТЕПИ ЮГА ВИТИМСКОГО ПЛОСКОГОРЬЯ 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2009 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Амшеев Роман Маньярович, Научный руководитель : доктор биологических наук Хобракова Лариса Цыренжаповна, Научный консультант : кандидат биологических наук...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенском государственном педагогическом университете имени В.Г. Белинского...»

«СОРОКИНА Светлана Юрьевна Видоспецифичность полиморфизма митохондриальной ДНК у близкородственных видов дрозофил группы virilis (Diptera: Drosophilidae) 03.00.15 – генетика 03.00.26 – молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2009 Работа выполнена в лаборатории генетики Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (ИБР РАН) и лаборатории сравнительной генетики животных...»

«ФИРСОВ Сергей Александрович ОПТИМИЗАЦИЯ АГРОЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ ТВЕРСКОЙ ОБЛАСТИ НА ОСНОВЕ РЕГИОНАЛЬНОГО МОНИТОРИНГА Специальность 03.02.08. - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2011 год Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте агрохимии Российской академии сельскохозяйственных наук и ФГУ Центре агрохимической службы Тверской Научный консультант академик...»

«Шелковникова Татьяна Александровна Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории нейрохимии физиологически активных веществ и в лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Учреждения Российской академии наук Института...»

«Миронова Виктория Владимировна КОМПЬЮТЕРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ РОЛИ АУКСИНА В МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ РАЗВИТИЯ КОРНЯ РАСТЕНИЙ 03.01.09 – математическая биология, биоинформатика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 1 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики СО РАН в лаборатории теоретической генетики, г. Новосибирск Научный руководитель : Доктор биологических наук,...»

«МЯЗИН Владимир Александрович РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ КОЛЬСКОГО СЕВЕРА ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ НЕФТЕПРОДУКТАМИ (В УСЛОВИЯХ МОДЕЛЬНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА) 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра Российской академии наук Научный...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«Степанова Нина Юрьевна ФЛОРА КУМО-МАНЫЧСКОЙ ВПАДИНЫ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в лаборатории Гербарий Федерального государственного бюджетного учреждения науки Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН Научный руководитель : ИГНАТОВ МИХАИЛ...»

«СОМОВА РЕГИНА ШАМИЛЕВНА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ДОЛГОЛЕТИЯ И СТАРЕНИЯ НА МОДЕЛЬНЫХ ЛИНИЯХ Musca domestica L. И В ПОПУЛЯЦИИ ЧЕЛОВЕКА 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2013 Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и генетики Уфимского научного центра Российской академии наук Научный руководитель :...»

«БАКАЕВА Светлана Сергеевна СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ КРАПЧАТОГО СУСЛИКА (Spermophilus suslicus Gld.) В ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ АРЕАЛА: МЕТАПОПУЛЯЦИОННАЯ СТРУКТУРА, БИОТОПИЧЕСКАЯ ПРИУРОЧЕННОСТЬ, ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАЗНООБРАЗИЕ Специальность 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пенза – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования...»

«Синицына Марина Вячеславовна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ФЛОРЫ МАЛЫХ ИСКУССТВЕННЫХ ВОДОЕМОВ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – ботаника 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского на кафедре ботаники и экологии...»

«Пархоменко Василий Михайлович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И СТРУКТУРА ЦЕНОПОПУЛЯЦИЙ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (HYPERICUM PERFORATUM L.) В УСЛОВИЯХ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского на кафедре...»

«Слугинова Ирина Сергеевна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ФЛОРЫ МЕЛОВЫХ ОБНАЖЕНИЙ БАССЕЙНА Р. ПОЛНОЙ (РОСТОВСКАЯ ОБЛАСТЬ) И ВОПРОСЫ ЕЕ ОХРАНЫ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Федяева Валентина Васильевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук,...»

«ПОХИЛЬКО Лидия Олеговна Экологические принципы формирования ассортимента древесных растений в озеленении г. Ростова-на-Дону 03.00.16 – экология АФТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Паршин Витольд Георгиевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Дзыбов...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»

«Гиляров Дмитрий Алексеевич СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИНГИБИТОРА ДНК-ГИРАЗЫ МИКРОЦИНА Б Специальность 03.01.07 - молекулярная генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института биологии гена РАН. Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Северинов Константин Викторович Официальные...»

«Горобцова Ольга Николаевна Экологическая оценка уровня загрязнения почв и растительности 3,4-бенз(а)пиреном в зоне влияния Новочеркасской ГРЭС 03.00. 27 – почвоведение 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2007 2 Работа выполнена на кафедре агроэкологии и физиологии растений Донского государственного аграрного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Назаренко Ольга...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.