WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

АФАНАСЬЕВА Евгения Георгиевна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ МЕЖВИДОВЫХ БАРЬЕРОВ

В ПЕРЕДАЧЕ ПРИОННОГО СОСТОЯНИЯ У ДРОЖЖЕЙ

Специальность 03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Москва 2011

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики Института экспериментальной кардиологии ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Кушниров Виталий Владимирович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Колб Вячеслав Адамович кандидат биологических наук Каменский Пётр Андреевич

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «24» июня 2011 г. в часов на заседании Совета Д 501.001. по защите докторских и кандидатских диссертаций при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского, ауд. 536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан « » мая 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Крашенинников И.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Некоторые белки человека и животных, растворимые в норме, могут иногда полимеризоваться и накапливаться в виде внутри- или внеклеточных агрегатов или бляшек, что приводит к болезни. У человека известно более 30 белков, образующих такие агрегаты, называемые амилоидами. Амилоидные болезни, или амилоидозы, не поддаются лечению. Они широко распространены, и их встречаемость возрастает с увеличением возраста. К их числу относятся, в частности, болезни Альцгеймера и Паркинсона. Амилоидозы в большинстве случаев неинфекционны, за исключением прионных болезней, связанных с белком PrP.

Прионные агрегаты PrP представляют уникальный пример инфекционного агента без генетической программы в виде ДНК или РНК. Прионные болезни редки, однако недавняя эпизоотия губчатой энцефалопатии коров в Великобритании нанесла многомиллиардный урон экономике, и поставила под угрозу жизни людей в связи с возможностью передачи этого заболевания человеку при употреблении в пищу говядины. Следует отметить, что межвидовая передача прионов обычно затруднена или невозможна, что удивительно ввиду небольших видовых отличий в последовательности прионного белка. Поэтому изучение барьеров в межвидовой передаче прионной инфекции важно и для медицины, и для понимания общих свойств прионов.





Имеющиеся в литературе данные по изучению передачи прионного состояния между разными видами млекопитающих ограничиваются в основном фактами существования прионных барьеров, однако об их молекулярных механизмах почти ничего не известно. Прионы дрожжей Saccharomyces являются удобной моделью для изучения молекулярных процессов, лежащих в основе межвидовых прионных барьеров. При этом наиболее информативным является использование прионогенных белков из близкородственных видов дрожжей, степень гомологии которых сопоставима с таковой для белков PrP млекопитающих. Использование близкородственных прионогенных белков Ure2 позволило воспроизвести все основные закономерности прионной передачи у млекопитающих, хотя молекулярные основы событий, происходящих при межвидовой прионной передаче, выявлены не были (Edskes et al., 2009).

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение механизмов межвидовых барьеров в передаче прионного состояния между близкородственными белками Sup35 в дрожжах S. cerevisiae. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность передачи различных вариантов прионного состояния Sup35 S. cerevisiae гибридным белкам Sup35 с прионными доменами из близкородственных видов дрожжей.

2. Охарактеризовать физическое взаимодействие (кополимеризацию) этих белков с прионной формой белка Sup35 S. cerevisiae.

3. Выявить области гетерологичных прионных доменов Sup35, ответственные за барьер в передаче приона [PSI+].

Научная новизна и практическая ценность работы. В работе были изучены и определены количественно (1) возможность передачи прионного состояния между близкородственными белками Sup35, (2) способность гетерологичных белков Sup нарушать поддержание исходного приона, и (3) способность гетерологичных белков Sup35 кополимеризоваться с прионными фибриллами Sup35 S. cerevisiae.

Способность гетерологичных Sup35 препятствовать поддержанию приона была обнаружена в данной работе, и является важным проявлением взаимодействия белков.

Впервые было показано, что передача амилоидной полимеризации между родственными прионогенными белками может происходить без передачи прионных свойств. Анализ полученных данных позволил восстановить подробную картину молекулярных событий, приводящих к барьеру в передаче прионов и к дестабилизации исходного приона, причем сценарии взаимодействия белков в существенной мере зависели от белка Sup35 и от варианта [PSI+]. Это позволило заключить, что: (1) причиной барьера является в одних случаях неспособность гетерологичных белков Sup35 кополимеризоваться, а в других - кополимеризация без передачи прионных свойств, то есть способности к наследованию. Причиной дестабилизации приона было образование неприонных амилоидов и/или блокирование прионной полимеризации гетерологичными белками Sup35. В работе были также определены области гетерологичных прионных доменов Sup35, ответственные за барьер в передаче прионного состояния.





Апробация работы. Результаты работы были апробированы на межлабораторном семинаре Института экспериментальной кардиологии ФГУ РНКПК МЗ и СР РФ (15.04.2011), а также представлены на международной конференции Жака Моно CNRS (2010, Роскофф, Франция), международном конгрессе “Yeast, an evergreen model”, (2010, Рим, Италия), II междисциплинарном микологическом форуме (2010, Москва), международном симпозиуме по структуре амилоидных фибрилл и механизме образования амилоидов, (2009, Галле, Германия), 24-й международной конференции по генетике и молекулярной биологии дрожжей (2009, Манчестер, Англия), V съезде ВОГИС (2009, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи и 6 тезисных сообщений.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы».

Работа изложена на страницах и включает 21 рисунок, 8 таблиц и список литературы, содержащий 102 ссылки.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы S. cerevisiae и E. coli. В работе были использованы штаммы дрожжей: 22VH63S (MATa ura3–52 leu2–3,112his3-200 ade2–1 SUQ5 sup35::TRP1 [PSI+] или [psi-]) (Shkundina et al., 2006), 74-D694S (MATa ura3–52 leu2–3,112 his3-200 ade1– 14 sup35::TRP1 [psi-] [PIN+] pRS313-3ATG) (Alexandrov, et al. 2008). Для молекулярного клонирования использовали штамм E. coli DH5 [supE44 lac U (80 lacZM15) hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1] (Sambrook et al. 1989).

Генетические методы. Трансформация микроорганизмов. В работе применяли стандартные методики генетики дрожжей (Sherman et al., 1986). Трансформацию дрожжей S. cerevisiae проводили согласно Gietz et al. (2002) с небольшими изменениями. Трансформацию E. coli DH5 (Sambrook et al., 1989) осуществляли в соответствие с методом Inoue et al. (1990). Для выявления детерминанта [PSI+] использовали генетические системы, основанные на супрессии мутаций ade2-1 и ade1-14, позволяющие определить наличие детерминанта [PSI+] визуально по цвету колоний. Клетки [psi-], т.е. не содержащие [PSI+], не растут на среде, не содержащей аденин, и имеют красный цвет колоний на полной среде. Колонии клеток [PSI+] имеют розовый или белый цвет в зависимости от варианта [PSI+] и растут при отсутствии аденина в среде.

Конструирование плазмид и другие генно-инженерные манипуляции. Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli и конструирование плазмид проводили в соответствии со стандартным протоколом Sambrook et al. (1989). Нуклеотидные последовательности, кодирующие N-концевые прионные домены белков Sup четырёх видов дрожжей рода Saccharomyces: S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus и S.

kudriavzevii, амплифицировали методом ПЦР из геномной ДНК соответствующих видов дрожжей. Эти виды дрожжей были получены от проф. Г.И. Наумова из коллекции РосНИИ Генетика. Первичная структура белков Sup35 S. bayanus, S.

mikatae и S. paradoxus была получена из белковой базы данных, нуклеотидная последовательность участка гена SUP35 S. kudriavzevii, кодирующая прионный домен, была определена в настоящей работе (номер в базе данных NCBI - JF715427). Вставку последовательности AACTACCAG, кодирующей аминокислотную последовательность NYQ, в ген SUP35-kud осуществляли путём ПЦР.

Белковый гель-электрофорез, иммуноблоттинг. Электрофорез денатурированных белков в полиакриламидном геле проводили согласно Laemmli (1970). Для оценки наличия и размера прионных полимеров был использован электрофоретический подход SDD-AGE (Kryndushkin et al., 2003). Для разделения полимерной и мономерной форм белка Sup35 в одном геле метод электрофореза по Laemmli (1970) был модифицирован согласно Shkundina et al. (2006). Для анализа белков методом иммуноблоттинга после проведения электрофореза белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали либо с поликлональными кроличьими антителами против N и M доменов Sup35, либо с моноклональными мышиными антителами против 3HA тэга, а затем с видоспецифичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, активность которой проявляли с помощью хемилюминесцентного субстрата.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Структура гибридных белков Sup35. Чтобы исследовать механизмы межвидовых барьеров в передаче прионного состояния в дрожжевой модели, мы сконструировали набор генов SUP35, кодирующих гибридные белки Sup35 с N-концевыми прионными доменами из белков Sup35 следующих видов дрожжей рода Saccharomyces: S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus. В этих белках М участок и С-концевой домен, участвующий в терминации трансляции, были общими и происходили из белка Sup35 S. сerevisiae (рис. 1). Тем самым мы исключили влияние неприонных участков белка Sup35 на его прионные свойства. Это влияние невелико, и его исключение позволило существенно уменьшить изучаемую область. Для изучения взаимодействия гибридных Sup35 с прионными полимерами был создан дополнительный набор гибридных генов SUP35 с последовательностью, кодирующей 3HA тэг в С-концевой части неприонного М домена Sup35, что позволило отличать гибридные Sup35 от Sup35 S. cerevisiae по электрофоретической подвижности и по 3НА антигену.

Рис. 1. А. Сравнение аминокислотных последовательностей прионных доменов белков Sup S. cerevisiae, S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus. Точками показаны аминокислотные остатки, идентичные последовательности Sup35 S. cerevisiae. Различия в последовательности обозначены в однобуквенном аминокислотном коде. Делеции обозначены знаком «-».

Б. Схематическое изображение гибридных белков Sup35. Дополнительный набор белков содержал 3НА тэг, после 251 аминокислотного остатка. Напротив каждого гетерологичного прионного домена показан уровень его гомологии с соответствующим доменом Sup35-cer (для простоты подсчёта вставки, делеции и замены аминокислотных остатков считали равными).

В дальнейшем, гибридные гены SUP35 и кодируемые ими белки называются с добавлением суффикса из первых трех букв вида дрожжей, из которого произошел прионный домен. Например, ген SUP35-cer или белок Sup35-mik.

Гибридные белки Sup35 способны переходить в прионное состояние в клетках S.

cerevisiae. Понятие межвидовых барьеров на пути передачи прионного состояния имеет нетривиальный смысл лишь в том случае, если гибридные белки Sup способны самостоятельно поддерживать прионное состояние в клетках S. cerevisiae.

Для определения такой способности в клетках [psi- ] штамма 22V-H63S плазмида с геном SUP35 S. cerevisiae была заменена на плазмиды с соответствующими гибридными генами SUP35, после чего индуцировали возникновение прионного состояния гибридных белков Sup35 путём их сверхпродукции. Все гибридные белки были способны принимать прионное состояние. Надо отметить, что [PSI+] на основе гибридных белков Sup35 различались по своей стабильности (табл. 1).

Таблица 1. Сравнение стабильности [PSI+] на основе различных гибридных Sup35. [PSI+] на основе белков Sup35-mik и Sup35-bay были преимущественно слабого типа.

Разнообразие вариантов является одним из фундаментальных свойств прионов.

Оно связано со способностью прионного белка приобретать различные стабильно наследуемые прионные конформации. Для сильных вариантов [PSI+] характерна эффективная супрессия нонсенс мутации ade2-1 и белый цвет колоний из-за следующих взаимосвязанных свойств: низкой концентрации свободного белка Sup35, большого количества прионных фибрилл, имеющих малый размер вследствие их эффективной фрагментации шапероном Hsp104. Слабые варианты [PSI+] определяют розовый цвет колоний и малоэффективную супрессию нонсенс мутации ade2-1, большее количество свободного Sup35 и большой размер прионных фибрилл в результате их малоэффективной фрагментации.

Между близкородственными белками Sup35 существуют барьеры передачи [PSI+]. Клетки дрожжей штамма 22V-H63S с четырьмя разными вариантами [PSI+], сильным (S) и тремя слабыми (W1, W2, W3), были трансформированы центромерными плазмидами с гибридными генами SUP35, а также, в качестве контроля, плазмидой с геном SUP35-cer.

В этих клетках, коэкспрессирующих два гена SUP35, индуцировали спонтанную потерю исходной плазмиды с геном SUP35-cer, после чего оценивали уровень передачи четырёх вариантов [PSI+] гибридным белкам Sup35. Результаты данного эксперимента представлены в таблице 2.

Из таблицы 2 следует отсутствие передачи всех вариантов [PSI+] белкам Sup35mik, Sup35-bay и Sup35-kud. Уровень прионной передачи белку Sup35-par зависел от варианта прионного состояния, составляя от 5% (W3 [PSI+]) до 68% (S [PSI+]).

Таблица 2. Эффективность передачи четырёх вариантов [PSI+] гибридным белкам, определенная методом спонтанной потери плазмиды.

Экспрессия гибридных SUP35 в клетках с [PSI+] приводит к антисупрессорному фенотипу. Трансформация клеток дрожжей с четырьмя разными вариантами [PSI+] (S, W1, W2 и W3) центромерными плазмидами с гибридными генами SUP35 приводила к антисупрессорному фенотипу клеток. Этот фенотип свидетельствовал о затруднённой кополимеризации гибридных белков Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer, в результате чего значительное количество гибридного белка Sup35 было в растворимой форме, активной в терминации трансляции.

Рис. 2. Фенотипы клеток дрожжей штамма 22V-H63S с разными вариантами [PSI+] (S, W1, W2 и W3) при экспрессии в них гибридных генов SUP35. Экспрессия всех гибридных генов SUP35 без последовательности, кодирующей 3HA тэг, приводит к антисупрессорному фенотипу клеток дрожжей.

Гибридные белки Sup35 способны дестабилизировать [PSI+]. В настоящей работе было обнаружено негативное влияние гетерологичных белков на поддержание исходного приона: экспрессия гибридных генов SUP35 приводила к потере [PSI+].

Частота потери зависела как от варианта приона, так и от аминокислотной последовательности продуцируемого гибридного Sup35 (таблица 3).

Плазмида с Таблица 3. Частоты потери четырёх вариантов [PSI+] разными гибридными белками Sup35 с 3HA тэгом и без него. Значения выражены в процентах. В качестве контроля была измерена митотическая стабильность четырёх представленных вариантов [PSI+] (клетки были трансформированы пустым вектором).

Кроме того, поскольку кополимеризацию гибридных белков Sup35 с прионными полимерами изучали при помощи белков Sup35 с 3HA тэгом, то было необходимо показать, что белки с 3HA тэгом и без него ведут себя сходным образом. Результаты, приведенные в таблице 3, показывают, что частота потери [PSI+] не зависела от наличия 3НА тэга у гибридных белков Sup35.

Передача одного варианта [PSI+] может приводить к появлению нескольких вариантов [PSI+] на гибридном Sup35. В результате анализа размера прионных полимеров белка Sup35-par после передачи ему W3 варианта [PSI+] в двух проанализированных колониях, содержащих переданный [PSI+], наблюдалась гетерогенность в размере прионных полимеров: в одной колонии клеток, потерявших плазмиду с геном SUP35-cer, наблюдались полимеры меньшего размера, чем в другой (рис. 3). Таким образом, это может говорить, что при прионной передаче возможно образование различных вариантов [PSI+] на белке-реципиенте.

Рис. 3. Гетерогенность размера прионных полимеров Sup35-par после передачи W3 варианта [PSI+]. Показан результат анализа прионных Гибридные белки Sup35 способны кополимеризоваться с прионными полимерами Sup35 S. cerevisiae без передачи им прионного состояния. Гибридные белки Sup35 показали различные уровни кополимеризации с прионными полимерами Sup35 S. cerevisiae, зависящие также от варианта [PSI+] (рис. 4). Так, например, белок Sup35-mik достаточно эффективно кополимеризовался с прионными полимерами W и W2 вариантов [PSI+], но почти не кополимеризовался с прионными полимерами S и W3 вариантов [PSI+]. Несмотря на кополимеризацию, белок Sup35-mik, как мы показали (Табл. 2), не приобретал наследуемой прионной конформации. Белок Sup35par эффективно полимеризовался во всех вариантах [PSI+], кроме W3. Следует учесть, что анализируемые дрожжи с Sup35-par содержали некоторую долю клеток (указанную на рис. 4 как "передача [PSI+]"), в которых Sup35-par приобрел прионное состояние и полимеризовался сам собой с эффективностью близкой к 100%. C учётом этого обстоятельства уровень кополимеризации Sup35-par без приобретения прионного состояния составлял не менее 50% во всех вариантах [PSI+] кроме W3.

Белок Sup35-bay отсутствовал или был едва различим в полимерной фракции у всех вариантов [PSI+]. Однако эффекты экспрессии гена SUP35-bay в клетках с четырьмя вариантами [PSI+] были различны: Sup35-bay дестабилизировал слабые варианты [PSI+], но не действовал на сильный [PSI+].

Рис. 4. Электрофоретический анализ кополимеризации гибридных Sup35 с прионными полимерами четырёх вариантов [PSI+]. Клетки дрожжей с обозначенными вариантами [PSI+] были трансформированы плазмидами с гибридными генами SUP35-3HA. Иммуноблоттинг проводили с антителами против N и M доменов белка Sup35-cer. Под каждым блотом указаны эффективность передачи приона соответствующему гибридному Sup35 и уровень потери исходного [PSI+]. * - анализ лизатов клеток, потерявших плазмиду с геном SUP35-cer.

Это позволяет предполагать, что Sup35-bay не взаимодействовал с полимерами сильного [PSI+], но в минимальном количестве присоединялся к концам полимеров слабых [PSI+]. Интересно отметить, что в клетках с W2 вариантом [PSI+], потеря которого была максимальна, белок Sup35-bay вовсе не обнаруживался в полимерной фракции, а в клетках с W1 и W3 вариантами [PSI+] он присутствовал в прионных полимерах в следовом количестве. Это можно объяснить тем, что Sup35-bay включался в прионные полимеры в виде единичных молекул (W2 [PSI+]), или малых кластеров из нескольких молекул (W1 и W3 [PSI+]).

Белок Sup35-kud ни в одном из изученных вариантов [PSI+] не был способен сколько-нибудь эффективно взаимодействовать с прионными полимерами. Об этом говорит отсутствие белка Sup35-kud в прионной полимерной фракции всех вариантов [PSI+], отсутствие передачи [PSI+] белку Sup35-kud и отсутствие дестабилизации исходного приона белком Sup35-kud.

Молекулярная модель взаимодействия гетерологичного Sup35 с прионной формой Sup35 S. cerevisiae. Одним из важнейших эффектов, обнаруженных в настоящей работе, является дестабилизация прионного состояния гибридными белками Sup35.

Очевидно, что этот эффект может уменьшать уровень прионной передачи, хотя и не является объяснением существования барьера на пути передачи прионного состояния.

Исходя из наблюдаемых типов взаимодействий гибридных белков Sup35 следует ожидать, что присоединение молекул гибридного Sup35 исключает возможность дальнейшего образования прионной укладки Sup35-cer на концах фибрилл. Это может происходить посредством двух механизмов. Более универсальный механизм состоит в том, что молекулы Sup35-cer, присоединяющиеся к неприонному полимеру гибридного Sup35, тоже будут иметь ненаследуемую амилоидную укладку, Это предположение основывается на нашем наблюдении, что такая укладка образуется с подавляющим предпочтением относительно прионной укладки, если взаимодействующие белки различны (Salnikova et al., 2005). В более частном механизме полимеризация может просто не передаваться с гетерологичного Sup35 на Sup35-cer. Это происходит, например, при продукции Sup35-mik в клетках с W1 и W2 вариантами [PSI+] (сценарии 2 и 4 на рис. 5), и проявляется в повышенном уровне растворимого Sup35-cer, который мы наблюдали. Интересно отметить, что первый механизм (образование неприонного амилоида Sup35-cer,) может сильнее вредить поддержанию [PSI+], поскольку количество мономерного Sup35-cer, способного к образованию приона, уменьшается за счёт его укладки в ненаследуемый амилоид (рис. 5, сценарии 1 и 3).

Рис. 5. Молекулярные сценарии взаимодействия гибридного Sup35 с прионными полимерами, предложенные в настоящей работе. Амилоидные полимеры изображены, как последовательность букв, каждая из которых представляет собой одну молекулу Sup35. с — белок Sup35-cer с прионной укладкой, С — белок Sup35-cer с ненаследуемой амилоидной укладкой.

P и M обозначают белки Sup35-par и Sup35-mik с ненаследуемой амилоидной укладкой, соответственно. Аналогично, X — молекула гибридного Sup35-X с ненаследуемой амилоидной укладкой. Для простоты, показан рост прионной фибриллы лишь в одну сторону. Фрагментация полимеров шапероном Hsp104 возможна лишь в области I, содержащей прионную укладку Sup35. Серые буквы в области III отражают отсутствие или пониженную вероятность полимеризации Sup35-cer после гибридного Sup35. В сценарии 5 гибридный Sup35 не кополимеризуется с прионными полимерами Sup35-cer. Соответствие сценариев гибридным Sup35 и вариантам [PSI+] показано в таблице.

Важно отметить, что в обоих механизмах остается возможность поддержания [PSI+], поскольку Hsp104 может фрагментировать блокированные гибридным Sup прионные фибриллы в области исходного прионного полимера Sup35-cer (область I на рис. 5). Но поддержание [PSI+] будет происходить только в том случае, если частота присоединения гибридного Sup35 к прионным полимерам будет невысокой и не превысит частоту фрагментации полимера шапероном Hsp104. Частота фрагментации приблизительно равна обратной величине от среднего размера прионного полимера.

Поэтому для сильных [PSI+] со средней длиной полимеров, равной примерно 20 молекулам (Kryndushkin et al., 2003), вероятность присоединения первой молекулы гибридного Sup35 в сравнении с Sup35-cer (обозначим её как h) должна быть меньше чем 5%, в противном случае [PSI+] будет быстро утрачен.

То, что в изученных случаях уровень дестабилизации [PSI+] не превышал 24%, указывает, что вероятность присоединение гибридного Sup35 к концу прионных фибрилл Sup35-cer была мала и не превышала названный критерий. При этом уровень потери [PSI+] не увеличивался при увеличении количества гибридного белка в полимерной фракции. Например, количество белка Sup35-bay в полимерной фракции в клетках с W2 вариантом [PSI+] ниже, но уровень потери [PSI+] выше, чем в аналогичном случае для W1 варианта. Это, по всей видимости, говорит, что белок Sup35-bay при присоединении к прионным фибриллам W1 варианта формировал кластеры из белка Sup35-bay на концах прионных фибрилл. В W1 и W3 вариантах [PSI+] белок Sup35-mik элиминировал [PSI+] с частотой равной примерно 15% в каждом случае.

Однако количество белка в полимерной фракции W1 варианта было гораздо выше, чем в полимерной фракции W3 варианта. Это говорит о том, что белок Sup35-mik при взаимодействии с прионными полимерами вариантов W1 и W2 образовывал участки из множества последовательных молекул (сценарий 2 на рис. 5), в то время как белок Sup35-mik присоединялся единичными молекулами к концам прионных фибрилл W варианта (сценарий 4 на рис. 5). Поэтому уровень кополимеризации гибридного Sup может отражать как вероятность присоединения гибридного белка к растущей фибрилле, так и количество гибридного белка в кластере.

В некотором противоречии с нашей логикой находится наблюдение, что Sup35-par в клетках с S, W1 и W2 вариантами [PSI+] кополимеризовался весьма эффективно, но вызывал лишь весьма незначительную потерю [PSI+]. Это наблюдение можно объяснить, заметив, что вероятность h присоединения гибридного Sup35 должна быть пропорциональна количеству мономерного гибридного Sup35. Количество свободного Sup35-par в указанных случаях было весьма мало. Поэтому можно предполагать, что переключение полимеризации на белок Sup35-par происходило сравнительно редко, однако затем Sup35-par полимеризовался быстро, в сравнении с другими гибридными белками Sup35, образуя длинные участки, что объясняет наблюдаемый высокий уровень кополимеризации.

Затруднение в переходе полимеризации с гибридного Sup35 на Sup35-cer должно приводить к увеличению количества Sup35-cer в мономерной форме. Подобный эффект действительно наблюдали для белков Sup35-mik в клетках с W1 и W2 вариантами [PSI+], Sup35-bay в клетках с W1 вариантом [PSI+], и Sup35-par в клетках с W3 вариантом [PSI+] (сценарии 2 и 4 на рис. 5). В этих случаях уровень мономерного Sup35cer доходил до 20%, что в 5-10 раз превышает количество мономерного Sup35-cer в исходных клетках [PSI+]. Поскольку количество мономерного Sup35 в клетках [PSI+] обратно пропорционально количеству свободных концов фибрилл, то можно сказать, что взаимодействие гибридного Sup35 с прионными фибриллами уменьшало количество свободных концов фибрилл в 5 раз.

Таким образом, на основании результатов проведённых экспериментов можно предполагать пять молекулярных сценариев взаимодействия гетерологичного Sup35 с прионными полимерами (рис. 5), различающихся тремя параметрами, а именно эффективностью связывания гибридного Sup35 с прионными фибриллами, эффективностью полимеризации гибридного Sup35 после Sup35-cer (в области II), а также эффективностью полимеризации Sup35-cer с ненаследуемой амилоидной укладкой после гибридного Sup35 (в области III).

Участки прионного домена Sup35, ответственные за барьер в передаче прионного состояния. Прионный домен Sup35 S. cerevisiae состоит из двух участков: QNR (аминокислотные остатки 1-40), богатого остатками глутамина и аспарагина, и OPR (41-123), содержащего олигопептидные повторы. Ряд работ позволял предполагать, что барьер в передаче [PSI+] должен определяться областью QNR, хотя имелись и противоположные данные.

Для выявления роли участков QNR и OPR прионного домена Sup35 в межвидовой прионной передаче нами были сконструированы следующие химерные гены SUP35:

SUP35-mik/cer, SUP35-cer/mik, SUP35-bay/cer, SUP35-cer/bay, SUP35-par/cer, SUP35cer/par. Эти гены кодируют белки с QNR и OPR областями разного происхождения, что отражено в их буквенном суффиксе. При этом одна из областей происходит из Sup35 S. cerevisiae. Кроме того, был получен ген SUP35-kudNYQ со вставкой последовательности, кодирующей аминокислоты NYQ. Эта вставка нивелирует "делецию" остатков 12-14, видимую при сравнении с последовательностью белка Sup35-cer (рис.

1).

Мы обнаружили, что отличия в обеих областях, QNR и OPR, отвечают за барьер передачи [PSI+] белку Sup35-bay, хотя лишь область QNR вызывала потерю [PSI+]. Так же, как и в случае белка Sup35-bay, у белка Sup35-par обе области QNR и OPR были вовлечены в поддержание барьера прионной передачи. В белке Sup35-mik только область OPR была ответственна как за барьер передачи прионного состояния, так и за вызванную экспрессией гена SUP35-mik дестабилизацию прионного состояния (рис.

6).

А Б QNR OPR

Рис. 6. А. Эффективность передачи S, W1, W2 и W3 вариантов [PSI+] гибридным и химерным белкам Sup35 (определена методом индуцированной 5-фтороротовой кислотой потери плазмид), а также частота потери [PSI+] при экспрессии химерных и гибридных генов SUP в клетках [PSI+]. В качестве контроля приведены данные для белка Sup35-cer. В настоящей работе было показано, что 5-фтороротовая кислота дестабилизирует слабые варианты [PSI+], что приводит к занижению контрольной (Sup35-cer – Sup35-cer) передачи слабых вариантов [PSI+].

Б. Участки прионных доменов Sup35 S. mikatae, S. kudriavzevii, S. paradoxus и S. bayanus, ответственные за барьер передачи прионного состояния. Штрихованные области указывают на районы гетерологичных прионных доменов, отвечающие за межвидовой прионный барьер.

Неспособность белка Sup35-kud взаимодействовать с прионными полимерами всех изученных вариантов [PSI+] была связана с отсутствием, по сравнению с последовательностью Sup35-cer, трёх последовательных аминокислотных остатков (12-14) в области QNR. Добавление этих остатков в Sup35-kud полностью снимало барьер в передаче прионного состояния (рис.6).

Связь отсутствия кополимеризации белка Sup35-kud с отсутствием трёх аминокислотных остатков в положении 12-14, подтверждает важность ранее выдвинутого принципа о взаимодействия белков «в регистре» при построении амилоидных фибрилл: "делеции" аминокислотных остатков гораздо сильнее нарушают способность белков к взаимодействию, чем их замены. При этом, возможно, делеции в области QNR более весомы. Так, белок Sup35-bay, несущий вставки двух аминокислотных остатков в положениях 40 и 60 и делецию девяти аминокислот в положении 79-87, взаимодействовал с прионным Sup35-cer, в отличие от Sup35-kud с одной делецией в области QNR.

Повышенный уровень прионной передачи белку Sup35-par коррелировал с низким уровнем дестабилизации [PSI+]. Подобная зависимость была обнаружена и для некоторых химерных и мутантных гибридных белков (например, для белка Sup35-kud со вставкой NYQ, белка Sup35-mik/cer). Однако из этой зависимости нашлось одно исключение: белок Sup35-bay/cer во всех вариантах приобретал прионную укладку с достаточно высокой частотой, но также был способен к дестабилизации всех слабых вариантов [PSI+].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы показали существование трех типов взаимодействия гибридных белков Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer: (1) отсутствие взаимодействия, (2) кополимеризация без передачи прионного состояния гетерологичному Sup35 и (3) кополимеризация с передачей приона. Данный ряд коррелирует с возрастанием сходства белков Sup35. Особенно интересен второй тип взаимодействия, показанный нами впервые. Кополимеризация без передачи приона происходит вследствие приобретения гибридными белками ненаследуемой амилоидной укладки вместо прионной. Мы обнаружили важный побочный эффект такого взаимодействия - дестабилизацию и частую потерю исходного приона.

Полученные данные позволяют предполагать существование четырех заметно отличающихся сценариев взаимодействия гетерологичного Sup35 с прионными полимерами Sup35-cer (рис. 5), которые реализуются в зависимости от вида гибридного белка Sup35 и варианта [PSI+].

Предложенные механизмы дестабилизации [PSI+] гибридными Sup35 позволяют предполагать существование вариантов белка Sup35, способных излечивать [PSI+] ещё более эффективно. Подобные аллели могут быть получены путём мутагенеза прионных доменов Sup35, в том числе гетерологичных. Последние имеют то преимущество, что вставки и делеции в белковых последовательностях трудно получить путём случайного мутагенеза ДНК.

Подобным образом могут быть получены и изменённые аллели гена PRNP млекопитающих, кодирующие белки, которые будут излечивать прионное состояние белка PrP или блокировать образование амилоидов. Важно отметить, что подобные случаи уже описаны: в клетках мышиной нейробластомы PrP хомяка и его некоторые аллели блокировали поддержание прионного состояния мышиного PrP (Priola et al., 1995).

ВЫВОДЫ

1. Барьер передачи прионного состояния может существовать даже при эффективной кополимеризации гетерологичного белка Sup35 с прионными полимерами, что связано с образованием ненаследуемой амилоидной укладки гетерологичного Sup35.

2. Кополимеризация гетерологичного белка с прионными полимерами Sup35-cer может вызывать потерю [PSI+], что может быть связано как с блокированием полимеризации гетерологичными белками Sup35, так и с приобретением ненаследуемой амилоидной укладки белком Sup35-cer.

3. Барьер в передаче прионного состояния может определяться аминокислотными отличиями в любой из областей QNR и OPR прионного домена Sup35.

4. Механизмы барьера передачи прионного состояния и индуцированной потери [PSI+] зависят как от последовательности гетерологичного белка, так и от варианта [PSI+].

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Evgenia G. Afanasieva, Vitaly V. Kushnirov, Mick F. Tuite and Michael D. TerAvanesyan, Molecular basis for transmission barrier and interference between closely related prion proteins in yeast. // J. Biol. Chem. – 2011 – V. 286, P. 15773-15780.

2. Афанасьева Е.Г., Кушниров В.В., Тер-Аванесян М.Д., Межвидовые барьеры прионной передачи. // Успехи биологической химии. – 2011 - Т. 51, С. 3-24.

3. E.G. Afanasieva, V. V. Kushnirov, and M.D. Ter-Avanesyan, Mechanisms of prion species barriers in the yeast model.// CNRS Jacques Monod Conference "Protein misfolding and aggregation in ageing and disease". –

Abstract

Book - 5-9 June 4. M.D. Ter-Avanesyan, E.G. Afanasieva and V. V. Kushnirov. Studying the molecular basis for the prion interspecies transmission barrier: a yeast model.// International Conference “Yeast, an evergreen model”– Abstract Book -23-25 September, 2010 – 5. В.Н. Ураков, Е.Г. Афанасьева, В.В. Кушниров и М.Д. Тер-Аванесян. Прионные и неприонные амилоиды дрожжей.// II междисциплинарный микологический форум. Иммунология, аллергология, инфектология – Сборник тезисов - 14- апреля 2010, С. 32.

6. E.G. Afanasieva, V.V. Kushnirov, and M.D. Ter-Avanesyan. Diversity of prion species barriers between closely related yeast proteins.// International Bunsen Discussion Meeting on “Structure of Amyloid Fibrils and Mechanism of Amyloid Formation”. Abstract Book - 8-11 February 2009 – P. 45.

7. E.G. Afanasieva, A.I. Alexandrov, M.D. Ter-Avanesyan and V.V. Kushnirov. Fragmentation of prion polymers in yeast: its determinants and the role in species barrier.// 24th International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology. – Abstract Book - 19-24 July 2009 – P. 63.

8. А.И. Александров, Е.Г. Афанасьева, Е.Е. Соколова, В.В. Кушниров, М.Д. Тер-Аванесян. Прионные амилоиды дрожжей - наследование и межвидовые барьеры.// V съезд ВОГИС. – Сборник тезисов - 21-27 июня 2009, C. 42.



 
Похожие работы:

«Долгополова Анастасия Александровна ФИКСАЦИЯ УГЛЕРОДА, НАКОПЛЕНИЕ КРАХМАЛА, ТРАНСПОРТ САХАРОЗЫ И НЕОРГАНИЧЕКОГО ФОСФАТА И ПЕРВИЧНЫЕ ПРОЦЕССЫ ФОТОСИНТЕЗА Специальность 03.00.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук. МОСКВА 2004 Работа выполнена на кафедре биофизики физического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова. Научный руководитель : доктор физико-математических наук, Кукушкин профессор Александр Константинович...»

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом...»

«Левицкая Наталья Николаевна Критерии и индикаторы для оценки состояния лесов Московской области Специальность 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Диссертационная работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Центр по проблемам экологии и продуктивности лесов РАН Научный руководитель : Черненькова Татьяна Владимировна, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник...»

«БАЛАНОВСКИЙ Олег Павлович ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОФОНДА В ПРОСТРАНСТВЕ И ВРЕМЕНИ: СИНТЕЗ ДАННЫХ О ГЕНОГЕОГРАФИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И Y-ХРОМОСОМЫ 03.02.07 – генетика 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научные консультанты: доктор биологических наук,...»

«ФИРСОВ Сергей Александрович ОПТИМИЗАЦИЯ АГРОЭКОЛОГИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ ДЕРНОВО-ПОДЗОЛИСТЫХ ПОЧВ ТВЕРСКОЙ ОБЛАСТИ НА ОСНОВЕ РЕГИОНАЛЬНОГО МОНИТОРИНГА Специальность 03.02.08. - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2011 год Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте агрохимии Российской академии сельскохозяйственных наук и ФГУ Центре агрохимической службы Тверской Научный консультант академик...»

«Скобанев Алексей Васильевич Ксилотрофные базидиомицеты (Basidiomycota) Пензенской области и накопление тяжелых металлов и мышьяка их базидиомами Специальность 03.02.12. – Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии и экологии ФГОУ ВПО Пензенская ГСХА и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ...»

«Заводовский Петр Геннадьевич АФИЛЛОФОРОИДНЫЕ ГРИБЫ В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ВОДЛОЗЕРЬЯ 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университета Научный руководитель : член-корр. РАН, доктор биологических наук,...»

«Дедюхин Сергей Викторович ЭКОЛОГО-ФАУНИСТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЖЕСТКОКРЫЛЫХ (COLEOPTERA) УДМУРТИИ: РАЗНООБРАЗИЕ, РАСПРОСТРАНЕНИЕ, РАСПРЕДЕЛЕНИЕ Специальность 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ижевск – 2004 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Удмуртский государственный университет Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Зубцовский...»

«ШИБАНОВА Алена Алексеевна РАСТИТЕЛЬНЫЙ ПОКРОВ ПОЙМЫ ВЕРХНЕЙ ОБИ (В ПРЕДЕЛАХ АЛТАЙСКОГО КРАЯ) 03.00.05. – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул – 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Терехина Татьяна Александровна Официальные оппоненты : член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор Седельников...»

«КОРМИЛЬЦЕВА ИННА ПЕТРОВНА ИЗМЕНЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЧЕРНОЗЕМА ВЫЩЕЛОЧЕННОГО ПРИ ВНЕСЕНИИ 2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА 03.02.03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2011 Работа выполнена на кафедре микробиологии биолого-почвенного факультета ФГАОУВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет. Научный руководитель : Доктор биологических наук, профессор Куриненко Борис Михайлович Официальные оппоненты :...»

«ЗАТУЛОВСКИЙ Евгений Аркадьевич ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМОВ ТРАНСПОРТА ЦИСПЛАТИНА В КЛЕТКИ С ПОМОЩЬЮ БЕЛКА CTR1 03.01.04 – биохимия 03.01.02 – биофизика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук САНКТ-ПЕТЕРБУРГ     Работа выполнена в ГОУ ВПО Санкт-Петербургский государственный политехнический университет и в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«КАЛАШНИКОВ ИЛЬЯ НИКОЛАЕВИЧ БИОДЕСТРУКЦИЯ КОМПОЗИТНЫХ МАТЕРИАЛОВ НА ОСНОВЕ ХИТОЗАНА И АКРИЛОВЫХ ПОЛИМЕРОВ, ВЫЗВАННАЯ МИКРОМИЦЕТАМИ И ФАКТОРАМИ КЛИМАТИЧЕСКОГО СТАРЕНИЯ 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2013 Работа выполнена на кафедре экологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования...»

«Китаев Константин Альбертович ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОАДАПТАЦИИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА (LEPTINOTARSA DECEMLINEATA SAY) И ЕГО ЭНТОМОФАГОВ 03.02.07 – генетика 03.02.08– экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2013 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) является инвазивным видом, появившимся в агроэкосистемах вслед за картофелем, и наиболее массовым фитофагом...»

«КОЗИНА Ирина Владимировна МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И НОВЫЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ РОДОВ THERMOANAEROBACTER И CALDANAEROBACTER Специальность 03.00.07-микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН Научный руководитель : доктор биологических наук Е.А. Бонч-Осмоловская Официальные оппоненты : доктор биологических наук профессор...»

«Димеева Лилия Аминовна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ ПУСТЫНЬ ПРИАРАЛЬЯ И ПРИКАСПИЯ 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 1 Работа выполнена в РГП Институт ботаники и фитоинтродукции КН МОН Республики Казахстан Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Курочкина Лидия Яковлевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна доктор географических наук,...»

«ФИЛИППЕНКО Дмитрий Павлович ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ МОЛЛЮСКОВ ЭСТУАРНЫХ ВОДОЕМОВ ЮГО-ВОСТОЧНОЙ ЧАСТИ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ Специальность 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Калининград – 2012 2 Работа выполнена в ФГБОУ ВПО Калининградский государственный технический университет Научный руководитель : доктор биологических наук Науменко Елена Николаевна Официальные оппоненты : Никитина Светлана Михайловна доктор биологических...»

«ПОХИЛЬКО Лидия Олеговна Экологические принципы формирования ассортимента древесных растений в озеленении г. Ростова-на-Дону 03.00.16 – экология АФТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Паршин Витольд Георгиевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Дзыбов...»

«Бутина Наталья Александровна ИЛЬМОВНИКИ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ ФЛОРИСТИЧЕСКОГО И ФИТОЦЕНОТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ, БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА ULMUS. L. 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ-2009 3 Работа выполнена в Забайкальском государственном гуманитарнопедагогическом университете им. Н.Г. Чернышевского доктор биологических наук Научный руководитель : Ольга Александровна Попова...»

«САИДОВ АБДУСАТТОР САМАДОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРЫЗУНОВ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 03.02.04 - зоология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Душанбе – 2011 Работа выполнена в Отделе экологии наземных позвоночных животных Института зоологии и паразитологии им. Е.Н.Павловского Академии наук Республики Таджикистан Научный консультант : академик АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.