WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ИНДЖГИЯ ЕКАТЕРИНА ЮРЬЕВНА

ЭЛЕКТРОКАТАЛИТИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЭТАНОЛА ФЕРМЕНТНЫМИ

СИСТЕМАМИ БАКТЕРИЙ GLUCONOBACTER OXYDANS В ПРИСУТСТВИИ

МЕДИАТОРОВ ФЕРРОЦЕНОВОГО РЯДА

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА – 2010

Работа выполнена на кафедре химии естественно-научного факультета Тульского государственного университета.

кандидат химических наук, доцент

Научный руководитель:

Алферов Валерий Анатольевич доктор химических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Кизим Николай Федорович доктор технических наук, профессор Ашихмина Тамара Яковлевна Белгородский государственный

Ведущая организация:

университет

Защита диссертации состоится «27» декабря 2010 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д 212.120.01 при Московской Государственной Академии тонкой химической технологии имени М.В.Ломоносова по адресу 119571 Москва, пр. Вернадского 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119571 Москва, пр. Вернадского 86. С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайте www.mitht.ru Автореферат разослан « » ноября 2010 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник А.И. Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Перспективным направлением биотехнологии является разработка электрохимических биосенсоров и экологически чистых источников электроэнергии (биотопливных элементов). При разработке таких систем широко используется способность некоторых соединений с обратимыми окислительновосстановительными свойствами (медиаторов электронного транспорта) к быстрому переносу на электрод электронов, генерируемых ферментами или ферментными системами целых клеток микроорганизмов в процессе окисления субстратов.





Использование целых клеток микроорганизмов в качестве биокатализаторов по сравнению с ферментами имеет ряд преимуществ: микроорганизмы дешевле очищенных ферментов, что позволяет создавать недорогие приборы для экологического контроля и мониторинга биотехнологических процессов;

микроорганизмы обладают каталитической активностью по отношению ко многим субстратам, что является преимуществом при экспресс-определении степени загрязнения водных объектов органическими соединениями (индекса биохимического потребления кислорода (БПК)); биосенсоры на основе целых клеток во многих случаях характеризуются повышенным сроком эксплуатации.

Способность микроорганизмов взаимодействовать с медиаторами электронного транспорта определяется доступностью ферментных систем для этих соединений. Известно, что уксуснокислые бактерии Gluconobacter имеют мембранную локализацию основных ферментов катаболизма углеводов и спиртов – PQQ-зависимых альдоз - и алкогольдегидрогеназ, что облегчает их взаимодействие с медиаторами электронного транспорта. Кроме того, различные штаммы бактерий Gluconobacter oxydans широко используются в качестве биокатализаторов во многих биотехнологических процессах получения пищевых и биологически активных соединений. Биохимической особенностью штамма Gluconobacter oxydans subsp.

industrius ВКМ B-1280 является эффективное окисление этилового спирта, что можно использовать при разработке биосенсоров для экспресс-определения содержания этанола в биотехнологических средах.

Наиболее перспективными медиаторами при разработке биосенсоров являются соединения ферроценового ряда. Пара ферроцен – катион ферроцения представляет собой высоко обратимую окислительно-восстановительную систему.

Ферроцены в сочетании с биокатализаторами на основе ферментов широко используют при разработке электрохимических биосенсоров, в то же время взаимодействие ферроценов с биокатализаторами на основе бактерий мало изучено.

Представляется актуальным исследование закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp.

industrius ВКМ B-1280 в сравнении с выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.

Работа выполнялась в рамках проектов РНП.2.1.1.7789 (2006-2008 г.; ВП «Развитие научного потенциала высшей школы»), ФЦП «Научные и научнопедагогические кадры инновационной России» (2009-2013г.), госконтракт № 02.740.11.0296, госконтракт № П 551, РФФИ 09-03-97528 (2009 г.). Автор работы является лауреатом стипендии Президента РФ на 2009/2010 учебный год, а также победителем конкурса Программы «Участник молодежного научноинновационного конкурса», реализуемой Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере в 2009 г. (г. Казань), госконтракт № p/10122.

Выявление закономерностей электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 и выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда как основы при разработке медиаторных биосенсоров.





Для реализации поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• Охарактеризовать биокаталитические свойства бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 и ферментных фракций спектрофотометрическим методом.

• Провести анализ кинетических параметров электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий Gluconobacter oxydans subsp.

industrius ВКМ B-1280 в присутствии медиаторов ферроценового ряда в рамках модели двухсубстратной ферментативной реакции, протекающей по механизму «пинг-понг».

• Определить эффективность медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в реакциях электрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ Bи выявить влияние заместителей ферроцена на медиаторные свойства соединений.

• Разработать макет медиаторного биосенсора. Определить рабочие параметры функционирования (рН, концентрация солей буферного раствора, концентрация медиатора, масса биокатализатора на электроде) биосенсоров на основе медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.

• Выявить спектр окисляемых субстратов мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 в присутствии медиаторов ферроценового ряда. Апробировать разработанный макет биосенсорного анализатора.

Научная новизна Впервые проведен сравнительный анализ процессов электрокаталитического окисления этанола целыми клетками Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ Bи выделенной из них мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда.

Установлено, что окисление в биоэлектрокаталитических системах «этанол – мембранная фракция или целые клетки бактерий Gluconobacter oxydans – медиаторы ферроценового ряда – электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг», что обусловлено функционированием мембранлокализованных ферментов. Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах.

Установлено, что мембранная фракция бактерий является более эффективным катализатором в системах окисления этанола в присутствии медиаторов ферроценого ряда.

Впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в электрокаталитических системах окисления этанола на основе целых клеток уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 и мембранной фракции этих бактерий, которые увеличиваются в ряду: 1,1’-ферроцендикарбоновая кислотаэтилферроцен1,1’диметилферроценферроцен1,1’-ферроцендиметанолферроценмонокарбоновая кислота. Показано, что эффективность медиаторов – производных ферроцена, зависит от электронных эффектов заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электроноакцепторные заместители увеличивают индекс эффективности медиатора, а электронодонорные - уменьшают.

Впервые показана возможность применения медиаторного биосенсора на основе биокатализатора - мембранной фракции бактерий для определения индекса БПК в отходах бродильных производств.

Практическая значимость работы Выявленные в работе закономерности функционирования медиаторных биосенсоров на основе бактерий Gluconobacter oxydans и мембранной фракции бактерий могут быть использованы в качестве научной основы при разработке электрохимических биосенсоров для экологического контроля и мониторинга биотехнологических процессов.

Разработан макет биосенсорного анализатора на основе мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 и медиатора ферроцена для экспресс-определения индекса БПК отходов бродильных производств. Полученные результаты показывают возможность применения действующего макета биосенсорного анализатора как прототипа опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

Результаты работы внедрены в учебный процесс: поставлены две новые лабораторные работы «Определение рабочих параметров функционирования микробного медиаторного биосенсора» и «Определение индекса БПК отходов спиртового производства с помощью биосенсора на основе ферроцена и мембранной фракции бактерий Gluconobacter oxydans» по курсам «Биосенсоры» и «Биотехнология защиты окружающей среды» для студентов специальностей Химия и 240901 Биотехнология.

Апробация работы и публикации Результаты работы докладывались на Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» в 2007 г. и 2010 г. (диплом, медаль конкурса); Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии», (Пущино) в 2006 г. (диплом лауреата конкурса) и 2009 г.; Международной школеконференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва-Пущино), 2008 г. (диплом победителя); 2-ой Биотехнологической выставке-ярмарке «РосБиоТех - 2008 г.» (Москва), 2008 г. (диплом, медаль выставки);

Международной конференции «Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)» (Москва), 2007 г.; Международном конгрессе по аналитическим наукам «ICAS-2006» (Москва), 2006 г.; IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Томск), 2006 г.

По теме диссертации опубликовано 6 статей, 10 сообщений в тезисной форме и в виде материалов конференций.

Структура и объем работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, анализа результатов исследований, выводов и списка использованной литературы. Работа изложена на 131 странице, содержит рисунок и 11 таблиц. Список литературы включает 146 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении дана общая характеристика диссертационной работы, изложены актуальность темы, научная новизна и практическая значимость работы, сформулированы цель и задачи исследования.

Глава 1. В первой главе дается анализ научно-технической литературы, посвященной медиаторному биоэлектрокатализу, применению бактерий Gluconobacter oxydans и выделенных из них ферментов в биосенсорах, а также изложены особенности строения и метаболизма бактерий Gluconobacter oxydans.

Глава 2. Во второй главе дано описание материалов и методов исследования.

Объектом исследования являлись уксуснокислые бактерии Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ B-1280 (Всероссийская коллекция микроорганизмов УРАН Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина).

Периодическое культивирование бактерий проводили аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объёмом 500 мл при температуре 28оС в среде следующего состава: сорбит – 200 г/дм3, дрожжевой экстракт – 20 г/дм3, дистиллированная вода – 100 см3. Контроль чистоты культуры осуществляли методом высева бактерий на агаризованную среду.

Ферментные препараты из бактерий Gluconobacter oxydans sbsp. industrius ВКМ B-1280 (далее G. oxydans) получали путем разрушения биомассы бактерий на ультразвуковом диспергаторе УЗД11-0,1/22 и последовательным центрифугированием.

Спектрофотометрические измерения удельной активности и кинетических параметров биокатализаторов при окислении глюкозы и этанола проводили с использованием спектрофотометра СФ103 в кинетическом режиме при длине волны 600 нм. В качестве редокс-красителей использовали 2,6-дихлорфенолиндофенол совместно с феназинметасульфатом, концентрации которых в измерительной кювете составляли 0,15 мМ и 0,75 мМ соответственно.

В работе применяли высокочувствительный электрохимический метод регистрации окислительной активности биологического материала с помощью медиаторных биосенсоров. Медиаторный биосенсор представлял собой двухэлектродную систему, в которой электродом сравнения служил хлорсеребряный электрод, а рабочим электродом – графитово-пастовый электрод (площадь поверхности 7,1 мм2). Суспензию биоматериала наносили на поверхность рабочего электрода и фиксировали диализной мембраной (Sigma, предел пропускания 14 кДа). Используемые в работе медиаторы ферроценового ряда входили в состав графитовой пасты, из которой формировали рабочий электрод.

Электрохимические измерения проводили с помощью гальванопотенциостата IPC2000 («Кронас», Москва), интегрированного с компьютером. Диапазон регистрируемых токов 1 нА – 10 мА. Компьютерная программа регистрации данных IPC2000 разработана для операционной системы Windows-XP. Амперометрические измерения проводили в цитратно-фосфатном буферном растворе при непрерывном перемешивании при помощи магнитной мешалки (300 об/мин). Обработку данных проводили с помощью программ «Microsoft Excel» и «SigmaPlot 9.0».

Определение индекса БПК5 стандартным методом разбавления проводили согласно действующим в РФ нормативным документам (ПНД Ф 14. 1:2:3:4.1 23-97), согласно которым содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определяется иодометрическим методом Винклера.

Глава 3. В третьей главе приведены основные результаты работы и их обсуждение.

Характеристика биокаталитических свойств бактерий G. oxydans и ферментных фракций Известно, что уксуснокислые бактерии содержат преимущественно мембранлокализованные PQQ-глюкоздегидрогеназу (КФ 1.1.5.2) и алкогольдегидрогеназу (КФ 1.1.5.5). Свойства ферментных препаратов, как потенциальных биокатализаторов в распознающих элементах электрохимических биосенсоров, можно охарактеризовать с помощью кинетических параметров окисления субстратов. Удельную активность и кинетические параметры биокатализаторов при окислении глюкозы и этанола определяли спектрофотометрическим методом с использованием стандартной системы редокскрасителей (таблица 1).

Кинетические параметры окисления этанола и глюкозы целыми клетками бактерий G.oxydans и выделенными ферментными фракциями Клетки бактерий 0,75±0,05 1,68±0,08 0,51 ± 0,04 1,33 ±0, Цитоплазматическая Удельная активность ферментов цитоплазматической фракции по отношению к глюкозе в 4,6 раза выше, чем по отношению к этанолу. Удельная активность ферментов мембранной фракции по отношению к этанолу в 5,8 раз выше, чем по отношению к глюкозе. Таким образом, мембранная фракция более эффективно окисляет этанол, а цитоплазматическая глюкозу. Сравнение значений констант Михаэлиса биокатализаторов на основе ферментных фракций позволяет заключить, что при одинаковой концентрации субстратов скорость окисления этанола мембранной фракцией выше, чем скорость окисления глюкозы, а скорость окисления глюкозы ферментами цитоплазматической фракции выше, чем скорость окисления этанола.

Таким образом, перспективным биокатализатором окисления этанола является мембранная фракция бактерий G. oxydans.

Анализ кинетических параметров электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий G. oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда Для изучения биоэлектрокаталитического окисления этанола в присутствии медиаторов электронного транспорта использовали лабораторную модель медиаторного биосенсора кюветного типа (рис. 1).

Рис. 1. Внешний вид лабораторной модели медиаторного биосенсора кюветного типа Принцип функционирования медиаторного биосенсора заключается в том, что в процессе окисления субстратов ферментными системами бактерий распознающего элемента увеличивается концентрация восстановленной формы медиатора, которая в дальнейшем окисляется на электроде при наложении соответствующего потенциала, что вызывает прохождение тока через внешнюю нагрузку (рис. 2).

В качестве медиаторов электронного транспорта при электрокаталитическом окислении этанола бактериями G. oxydans и выделенной из них мембранной фракцией использовали соединения ферроценового ряда (таблица 2). Используемые соединения содержат различные заместители в циклопентадиенильных кольцах ферроцена как электроноакцепторные (карбоксильная, гидроксиметильная группы), так и электронодонорные (метильная, этильная группы). Электронные эффекты заместителей определяют рабочие потенциалы редокс-соединений и могут оказывать влияние на медиаторные свойства соединений.

Применяемые в исследовании медиаторы электронного транспорта Рабочий потенциал медиаторов подбирали экспериментально путем снятия зависимости величины ответа сенсора от налагаемого на систему потенциала. За рабочий принимали потенциал, при котором ответ биосенсора был максимальным.

Отклики медиаторных биосенсоров получали в виде зависимости силы тока от времени при соответствующем рабочем потенциале для каждого медиатора.

Протекающий в системе ток пропорционален скорости ферментативной реакции:

I=n·F·v, где n – количество электронов, F – число Фарадея, v – скорость реакции. За ответ сенсора принимали амплитуду силы тока I – разность между базовой и стационарной величинами тока (в дальнейшем рассмотрении I тождественно I).

Рис. 3. Типичный вид откликов биосенсоров на основе бактерий G. oxydans и выделенной из них мембранной фракции на этанол в присутствии ферроцена На рисунке 3 показаны отклики биосенсоров на основе бактерий G. oxydans и выделенной из них мембранной фракции на этанол в присутствии ферроцена. Через некоторое время после добавления этанола ток достигал стационарного значения.

Похожие ответы наблюдали для биосенсоров на основе электродов, модифицированных 1,1'-диметилферроценом, этилферроценом, 1,1'ферроцендиметанолом, ферроценмонокарбоновой и 1,1'-ферроцендикарбоновой кислотами. Следует отметить, что отклик биосенсора на основе мембранной фракции развивается быстрее (в течение 20 секунд), чем у биосенсора на основе целых клеток бактерий (в течение 120 секунд). Кроме того, ответы сенсора на основе мембранной фракции бактерий по абсолютной величине больше, чем микробного сенсора.

Для сравнительной оценки эффективности биоэлектрокаталитического окисления этанола в присутствии соединений ферроценового ряда использовали ранее предложенную модель, где окисление глюкозы суспензированными и иммобилизованными целыми клетками бактерий в присутствии медиаторов переноса электронов рассматривается как двухсубстратная ферментативная реакция, протекающая по механизму «пинг-понг». Предположили, что окисление этанола при использовании в качестве биокатализатора целых бактерий и мембранной фракции будет протекать по аналогичной схеме:

где S и P – субстрат и продукт; Moк и Mв – окисленная и восстановленная форма медиатора внутри бактериальной клетки соответственно; Eoк и Eв – фермент, локализованный в мембране бактериальной клетки в окисленной и восстановленной форме, соответственно; k1, k-1, k2, k3, k-3 и k4 – константы скоростей соответствующих стадий реакции.

При использовании амперометрического метода для регистрации процессов окисления в схему реакции к уравнениям (1) и (2) добавляется еще одна стадия – регенерация медиатора на электроде:

Константы скорости электрохимической регенерации медиатора в большинстве случаев велики по сравнению с константами скорости ферментативной реакции, поэтому стадия окисления восстановленной формы медиатора на электроде не лимитирует скорость процесса биоэлектрокаталитического окисления субстратов.

Таким образом, общее уравнение для тока электрокаталитического окисления этанола ферментными системами бактерий, основанное на механизме «пинг-понг», запишется в виде:

где KS и KM – эффективные константы Михаэлиса для этанола и медиатора соответственно, учитывающие распределение субстрата и медиатора между внутренней средой клетки и раствором.

Исходя из предложенной модели, процесс электрокаталического окисления субстрата ферментными системами бактерий можно охарактеризовать тремя параметрами: максимальной силой тока Imax, эффективными константами Михаэлиса для этанола и медиатора KS и KM:

где [E]–концентрация ферментов in vivo на единицу площади поверхности электрода.

где KS,p и KM,p – константы распределения субстрата и медиатора соответственно между внутренней средой клетки и внешним раствором.

Параметры электрокаталитического окисления этанола в присутствии медиаторов электронного транспорта можно рассчитать, используя уравнения типа Михаэлиса-Ментен (9) - (10), полученные из уравнения (4) при условии избытка медиатора или этанола в системе:

Для биосенсоров на основе мембранной фракции и целых клеток бактерий G.

oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда получены зависимости ответов от содержания медиатора в графитовой пасте рабочего электрода (в условиях избытка этанола) и от концентрации этанола (в условиях избытка медиатора) (рис. 4-5). Зависимости генерируемого в биосенсорной системе тока окисления этанола мембранной фракцией в присутствии медиаторов электронного транспорта аналогичны зависимостям, полученным при использовании в качестве биокатализаторов целых клеток бактерий.

Ответ биосенсора, мкА Рис. 4. Зависимость ответов медиаторных биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans от концентрации этанола в условиях избытка медиатора (а - 1,1'-ферроцендиметанола, ферроценмонокарбоновой Ответ биосенсора, мкА Рис. 5. Зависимость ответов медиаторных биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans от концентрации медиатора (а этилферроцена, 1,1’-диметилферроцена; б – ферроцена, 1,1'-ферроцендиметанола, ферроценмонокарбоновой и 1,1'-ферроцендикарбоновой кислот) в условиях избытка этанола (50 мМ) Из полученных зависимостей по уравнениям (9), (10) рассчитали параметры биоэлектрокаталитического окисления этанола: максимальную силу тока Imax, эффективные константы Михаэлиса для этанола KS и для медиатора KM (таблицы 3, 4).

Параметры электрокаталитического окисления этанола целыми клетками бактерий G. oxydans в присутствии медиаторов переноса электронов диметилМедиатор ферроцен дикарбоноМедиатор кислота ферроценМедиатор Параметры электрокаталитического окисления этанола мембранной фракцией бактерий G. oxydans в присутствии медиаторов переноса электронов этилферро- 50 мМ диметилфе ферроцен ферроценМедиатор ферроцен- Этанол монокарбо- 50 мМ кислота 1,3 ммоль/г дикарбоноМедиатор, кислота Значения максимальной силы тока Imax для биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий больше значений Imax для биосенсоров на основе целых клеток.

Возможно, это связано с тем, что при использовании мембранной фракции бактерий количество доступных для субстрата и медиатора активных центров ферментов на единицу поверхности электрода значительно увеличивается по сравнению с использованием целых клеток.

Из уравнений (5-8) следует, что отношение Imax/KS характеризует бимолекулярное взаимодействие фермента с этанолом и не зависит от используемого медиатора (11), а отношение Imax/KM – характеризует взаимодействие медиатора с ферментом и дает индекс эффективности медиатора электронного транспорта (12).

Величины Imax/KS для медиаторов ферроценового ряда совпадают в пределах погрешности (таблицы 3, 4), что подтверждает принятую модель. Однако, при использовании в качестве биокатализатора мембранной фракции значения Imax/KS в 3-4 раза выше, чем при использовании целых клеток бактерий. Это свидетельствует о том, что применение в качестве биокатализатора мембранной фракции дегидрогеназ по сравнению с целыми клетками бактерий позволяет более эффективно проводить биоэлектрокаталитический процесс окисления этанола.

Сравнивая индексы эффективности Imax/KM, можно заключить, что эффективность медиаторов при окислении этанола как для биосенсоров на основе мембранной фракции, так и на основе целых клеток бактерий G. oxydans увеличивается в ряду: 1,1'-ферроцендикарбоновая кислотаэтилферроцен1,1'диметилферроценферроцен1,1'-ферроцендиметанолферроценмонокарбоновая кислота. Таким образом, наиболее эффективным медиатором является ферроценмонокарбоновая кислота. Однако, в случае ферментов в составе мембранной фракции их взаимодействие с медиаторами на поверхности электрода намного эффективнее, чем в случае использования ферментов в составе целых клеток, о чем свидетельствует увеличение индекса эффективности в несколько раз.

Стоит отметить, что полученные индексы эффективности для медиаторов независимо от используемого биокатализатора связаны с электронными эффектами заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электроноакцепторные заместители (карбоксильная, гидроксиметильная группы) увеличивают индекс эффективности, а электронодонорные (метильная, этильная группы) заместители, напротив, уменьшают эффективность. Однако 1,1'-ферроцендикарбоновая кислота не подчиняется этому правилу, что может быть связано с гидрофильностью этого соединения и затруднением диффузии медиатора через гидрофобные мембраны биоматериала к активным центрам ферментов.

Таким образом, показано, что взаимодействие в системе «бактериальные клетки G. oxydans / выделенная мембранная фракция – этанол – медиатор – электрод» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Процесс биоэлектрокаталитического окисления этанола более эффективно протекает при использовании в качестве медиатора ферроценмонокарбоновой кислоты. В качестве биокатализатора предпочтительно использование мембранной фракции бактерий. Дальнейшие исследования проводили с использованием медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий.

Выбор рабочих параметров функционирования медиаторного биосенсора Для разработки макета медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans необходимо подобрать условия, при которых генерируемый сенсором ток будет максимальным. Выявлены зависимости ответов медиаторных биосенсоров от рН среды, массы биоматериала на электроде, концентрации солей буферного раствора, а также определена долговременная и операционная стабильность медиаторных биосенсоров. На основе полученных зависимостей определены рабочие параметры медиаторных биосенсоров, представленные в таблице 5.

Рабочие параметры и стабильность медиаторных биосенсоров на основе этилферроцен диметилферроцен диметанол ферроценмонокарбоновая кислота 1,1'ферроцендикарбоновая кислота * операционную стабильность характеризовали относительным стандартным отклонением для 15 измерений, % ** За время стабильной работы биосенсора принимали время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 70% от начальной.

Наибольшее время стабильной работы получено для биосенсора на основе ферроцена. В то время как биосенсор на основе ферроценмонокарбоновой кислоты (самого эффективного медиатора) был нестабилен. Это связано со значительным снижением концентрации медиатора электронного транспорта за счет высокой растворимости ферроценмонокарбоновой кислоты.

Субстратная специфичность мембранной фракции бактерий G. oxydans в присутствии медиаторов электронного транспорта Важной характеристикой любого анализа является его селективность. В случае биосенсорного анализа селективность определяется преимущественно субстратной специфичностью биоматериала, используемого для формирования рецепторного элемента сенсора. При биоэлектрокаталитическом окислении субстратов селективность сенсора может также зависеть от используемого медиатора.

Субстратная специфичность мембранной фракции бактерий G. oxydans определена в присутствии медиаторов ферроценового ряда при биоэлектрокаталитическом окислении субстратов (рис. 6). Наибольшие токи медиаторный биосенсор генерировал при окислении глюкозы ферментами мембранной фракции бактерий. Высокие ответы биосенсора наблюдали при биоэлектрокаталитическом окислении одноатомных спиртов нормального строения:

1-пропанола, 1-бутанола, этанола (за исключением метанола). При окислении ферментами мембранной фракции спиртов разветвленного строения ответы биосенсора были значительно ниже. Важно отметить, что при использовании медиаторов ферроценового ряда с различными заместителями профиль субстратной специфичности мембранной фракции меняется незначительно.

Относительный ответ биосенсора, % бактерий G. oxydans в присутствии медиаторов электронного транспорта (за Полученная в работе субстратная специфичность биокатализатора на основе мембранной фракции бактерий хорошо согласуется с субстратной специфичностью целых клеток G. oxydans в присутствии медиатора ферроцена (рис. 7). Это позволяет предположить, что в биосенсорах на основе целых клеток бактерий с медиатором электронного транспорта взаимодействуют преимущественно мембранлокализованные ферменты.

При использовании мембранной фракции ответы биосенсора на спирты становятся соизмеримыми с ответами на глюкозу, в отличие от клеток, при использовании которых ответ на глюкозу и другие углеводы выше ответов на спирты (рис. 7). Возможно, это связано с тем, что активные центры алкогольдегидрогеназ становятся более доступными для медиатора после их выделения в виде мембранной фракции.

Относительный ответ биосенсора, % Рис. 7. Профиль субстратной специфичности бактерий G. oxydans и выделенной из них мембранной фракции в присутствии ферроцена как медиатора электронного транспорта (за 100% приняли ответ биосенсора на глюкозу) Медиаторные биосенсоры на основе мембранной фракции бактерий G.

oxydans благодаря своей биохимической активности по отношению к целому ряду углеводов и спиртов могут быть использованы для определения содержания легкоокисляемых соединений в водных объектах, например, индекса БПК.

Экcпресс-определение индекса БПК медиаторным биосенсором на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans Индекс БПК является важной характеристикой степени загрязненности воды легкоокисляемыми органическими веществами. Одной из важных задач в экологии является контроль БПК сточных вод бродильных производств, в том числе спиртовых производств. Сточные воды спиртовых заводов характеризуются высоким содержанием органических соединений, выброс которых приводит к эутрофикации водоемов и дальнейшей гибели естественных экосистем.

Традиционная методика определения БПК является продолжительной процедурой (от 5 до 20 суток) со сложной пробоподготовкой. Альтернативой являются экспрессные методы определения БПК с использованием биосенсорных анализаторов, например: клеточных биосенсоров на основе кислородного электрода Кларка, принцип функционирования которых основан на измерении скорости дыхания микроорганизмов вблизи поверхности преобразователя. Для того, чтобы на значение БПК, определяемого с помощью микробного дыхания, не влияло количество растворенного кислорода в образце, предложено использовать медиаторные БПК-биосенсоры. Следует отметить, что в медиаторных микробных сенсорах генерируются токи в 100 – 1000 раз большие, чем при использовании кислородного электрода, что обеспечивает возможность дальнейшей миниатюризации биосенсоров (создания микросенсоров).

При разработке макета БПК-биосенсора на основе мембранной фракции бактерий в качестве медиатора электронного транспорта выбрали ферроцен, так как это соединение позволяет разрабатывать воспроизводимый и чувствительный биосенсор для определения БПК сточных вод бродильных производств. Важно, что для регистрации токов биоэлектрокаталитического окисления использован гальванопотенциостат серии IPC, который зарегистрирован в Государственном реестре средств измерений и допущен к применению в Российской Федерации. Это обеспечивает возможность продвижения разработанного биосенсора на Российский рынок БПК-анализаторов.

Для построения градуировочной зависимости ответа биосенсора от концентрации определяемого соединения использовалась смесь глюкозы и глутаминовой кислоты - стандарта для определения индекса БПК (рис. 8).

Линейный диапазон градуировочной зависимости ответов сенсора от концентрации глюкозо-глутаматной смеси составил 0,05-0,65 г/дм3, что соответствует значениям БПК5 34 - 440 мг/дм3.

Рис. 8. Зависимость ответов биосенсора от значений индекса БПК (медиатор – ферроцен, биокатализатор – мембранная фракция бактерий) В качестве образцов для определения индекса БПК5 с помощью медиаторного биосенсора использовали отходы спиртового производства (ржаную барду), а также полупродукты брожения пшеничной и ржаной муки, имитирующие состав сточных вод бродильных производств (таблица 6).

Значения индексов БПК5 образцов, полученные с помощью медиаторного биосенсора и стандартным методом разбавления 1 Бродильная смесь на основе добавления 1-го фермента амилазы 2 Бродильная смесь на основе добавления 2-го фермента 3 Бродильная смесь на основе 4 Бродильная смесь на основе добавления глюкоамилазы и 5 Бродильная смесь на основе Полученные результаты определения индекса БПК5 с помощью биосенсора согласуются с данными, полученными стандартным методом разбавления.

Таким образом, разработанный макет медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans и медиатора ферроцена можно использовать для определения индекса БПК стоков бродильных производств.

• На основе анализа кинетических параметров (удельной активности, констант Михаэлиса) биокатализаторов – бактерий G. oxydans и выделенных из них ферментных фракций, выявили, что перспективным биокатализатором окисления этанола является мембранная фракция бактерий G. oxydans.

• Впервые показано, что взаимодействие в системе «бактериальные клетки G.

oxydans / выделенная мембранная фракция – этанол – медиаторы ферроценового ряда» можно рассматривать как двухсубстратную ферментативную реакцию, протекающую по механизму «пинг-понг». Эта модель позволяет провести количественную оценку эффективности медиаторов электронного транспорта и биокатализаторов в медиаторных биосенсорах.

• Впервые определены индексы эффективности медиаторов электронного транспорта ферроценового ряда в электрокаталитических системах окисления этанола на основе целых клеток уксуснокислых бактерий Gluconobacter oxydans subsp. industrius ВКМ B-1280 и мембранной фракции этих бактерий, которые увеличиваются в ряду: 1,1’-ферроцендикарбоновая кислотаэтилферроцен1,1’диметилферроценферроцен1,1’-ферроцендиметанолферроценмонокарбоновая кислота.

• Установлено, что эффективность медиаторов независимо от используемого биокатализатора связана с электронными эффектами заместителей в циклопентадиенильных кольцах ферроцена: электроноакцепторные заместители увеличивают индекс эффективности, а электронодонорные заместители уменьшают.

• Показано, что применение в качестве биокатализатора мембранной фракции дегидрогеназ по сравнению с целыми клетками бактерий позволяет более эффективно проводить биоэлектрокаталитические процессы.

• Определены рабочие параметры функционирования биосенсоров на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans (рН 6,5; концентрация солей буферного раствора – 0,18 моль/ дм3; масса биокатализатора на электроде – мкг; содержание медиатора – 1,1-1,6 ммоль/г), которые следует использовать при создании опытных образцов приборов для серийного освоения и применения.

• Разработанный макет медиаторного биосенсора на основе мембранной фракции бактерий G. oxydans применили для оценки индекса БПК5 отходов спиртового производства, имитирующих состав сточных вод. Разработанный макет биосенсора позволяет получать данные с высокой корреляцией к стандартному методу.

Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1) Понаморева О.Н., Инджгия Е.Ю., Алферов В.А., Решетилов А.Н.

Эффективность биоэлектрокаталитического окисления этанола целыми клетками и мембранной фракцией бактерий Gluconobacter oxydans в присутствии медиаторов ферроценового ряда // Электрохимия. 2010. Т.

2) Чигринова (Инджгия) E.Ю., Иськив Е.Н., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Влияние электронных заместителей в молекулах ферроценов на их медиаторные свойства в биосенсорных системах на основе бактерий Gluconobacter oxydans // Известия Тульского государственного университета Сер. Химия. Тула. 2008. Вып. 2. С. 238-245.

3) Чигринова (Инджгия) Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные биосенсоры на основе производных ферроцена и бензохинона, применяемых в качестве медиаторов // Сенсорные системы. 2007. Т. 21. № 3. С. 262-268.

4) Babkina E., Chigrinova (Indzhgiya) E., Ponamoreva O., Alferov V., Reshetilov A. Bioelectrocatalytic oxidation of glucose by immobilized bacteria Gluconobacter oxydans. Evaluation of water-insoluble mediator efficiency // Electroanalysis. 2006. Vol. 18. № 19-20. P. 2023–2029.

5) Чигринова (Инджгия) Е.Ю., Бабкина Е.Е., Алферов В.А.

Безреагентный медиаторный биосенсор на основе бактерий Gluconobacter oxydans для определения БПК сточных вод // Известия Тульского государственного университета. Сер. Химия. Тула. 2006.

6) Arlyapov V.A., Chigrinova (Indzhgiya) E. Yu., Ponamoreva O.N., Reshetilov A. N. Express detection of BOD in wastewaters of starchprocessing industry // Starch science and technology. Editor: G.E. Zaikov.

Nova Science Publishers. 2008. Р. 43 – 50.

7) Понаморева О.Н., Бабкина Е.Е., Чигринова (Инджгия) Е.Ю., Алферов В.А., Решетилов А.Н. Микробные медиаторные биосенсоры. // Сборник трудов Международной научной конференции «Фундаментальные основы инженерных наук». 2006. Т. 2. С. 96-102.

8) Chigrinova (Indzhgiya) E.Yu., Babkina E.E., Ponamoreva O.N., Alferov V.A., Reshetilov A.N. Parameters of microbial sensor with ferrocenes and quinines as mediators // Book of Abstracts. International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006. Moscow. 2006. V. 1. P. 292.

9) Чигринова (Инджгия) Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н., Алферов В.А. Эффективность функционирования медиаторов электронного транспорта в биосенсорах на основе Gluconobacter oxydans // Материалы IV Международной научной конференции «Химия, химическая технология и биотехнология на рубеже тысячелетий». 2006. Томск. Том 10) Чигринова (Инджгия) Е.Ю. Система «бактериальные клетки– медиаторы электронного транспорта-графитовый электрод» как основа безреагентных микробных биосенсоров // Cборник статей Российской школы-конференци молодых ученых «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». Пущино. 2006. С.

62-64.

11) Чигринова (Инджгия) Е.Ю., Бабкина Е.Е., Понаморева О.Н.

Биоэлектрокаталитическое окисление субстратов бактериями Gluconobacter oxydans // Материалы четвертого московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». Москва. 2007. Т. 2. С. 269.

12) Sergey V. Alferov, Ekaterina U. Chigrinova (Indzhgiya), Liudmila G. Tomashevskaia, Elena E. Babkina, Olga N. Ponamoreva, Anatoly N.

Reshetilov. Biosensor Approach to assessment of efficiency of mediators for their application in microbial biofuel cells // the International Conference «Molecular and nanoscale systems for energy conversion (MEC-2007)».

Moscow. 2007. P. 37-43.

13) Чигринова (Инджгия) Е.Ю. Эффективность медиаторов электронного транспорта биоэлектрокаталического окисления этанола бактериями Gluconobacter oxydans в биосенсорах и биотопливных элементах // Сборник трудов Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». Москва-Пущино. 2008.

С. 183-184.

биосенсорного анализатора БПК // Сборник тезисов докладов Х Международной конференции молодых ученых «Пищевые технологии и биотехнологии». Казань. 2009. С. 260-262.

15) Панченко Е.А., Чигринова (Инджгия) Е.Ю., Понаморева О.Н.

Биосенсор на основе мембранной фракции ферментов бактерий Gluconobacter oxydans и медиаторов ферроценового ряда // Cборник «Экотоксикология: современные биоаналитические системы, методы и технологии». Пущино-Тула. 2009. С.66-67.

16) Инджгия Е.Ю., Понаморева О.Н., Решетилов А.Н. Медиаторный биосенсор на основе мембранной фракции ферментов бактерий Gluconobacter oxydans для экспресс-определения БПК сточных вод // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов». Москва.

2010. С. 437-438.



 
Похожие работы:

«Горобцова Ольга Николаевна Экологическая оценка уровня загрязнения почв и растительности 3,4-бенз(а)пиреном в зоне влияния Новочеркасской ГРЭС 03.00. 27 – почвоведение 03.00.16 - экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону 2007 2 Работа выполнена на кафедре агроэкологии и физиологии растений Донского государственного аграрного университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Назаренко Ольга...»

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом...»

«Димеева Лилия Аминовна ДИНАМИКА РАСТИТЕЛЬНОСТИ ПУСТЫНЬ ПРИАРАЛЬЯ И ПРИКАСПИЯ 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2011 1 Работа выполнена в РГП Институт ботаники и фитоинтродукции КН МОН Республики Казахстан Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Курочкина Лидия Яковлевна Официальные оппоненты : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна доктор географических наук,...»

«ГЫНИНОВА АЮР БАЗАРОВНА ПОЧВЫ ДЕЛЬТЫ р. СЕЛЕНГИ (ГЕНЕЗИС, ГЕОГРАФИЯ, ГЕОХИМИЯ) 03.02.13 – почвоведение АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Улан-Удэ 2010 Работа выполнена в лаборатории географии и экологии почв Института общей и экспериментальной биологии СО РАН. Научный консультант : Член-корреспондент РАН, профессор Шоба С.А. Официальные оппоненты : доктор сельскохозяйственных наук, профессор Чимитдоржиева Г.Д. доктор биологических...»

«НАЙДАНОВ Булат Борисович ФЛОРА И РАСТИТЕЛЬНОСТЬ ЗАСОЛЕННЫХ МЕСТООБИТАНИЙ ЮГО-ЗАПАДНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск – 2011 Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Аненхонов Олег Арнольдович Официальные оппоненты : доктор биологических наук, старший научный сотрудник Королюк Андрей...»

«Петров Виктор Юрьевич Орнитокомплексы лесных экосистем ложбин древнего стока Приобского плато 03.00.16 – экология Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук Барнаул - 2010 Работа выполнена в лаборатории зоологии ГОУ ВПО Алтайский государственный университет Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ирисова Надежда Леонидовна Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Псарёв Александр Михайлович, кандидат...»

«Кекишева Юлия Евгеньевна Разнообразие сообществ еловых лесов западной части подзоны средней тайги Архангельской области 03.02.08 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2010 Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Поморском государственном университете им. М. В. Ломоносова Научный руководитель доктор сельскохозяйственных наук, профессор Наквасина...»

«АНЬКОВА Татьяна Владимировна ФЛОРА УЛЬБИНСКОГО ХРЕБТА (РУДНЫЙ АЛТАЙ) 03.00.05 — “Ботаника” АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск — 2007 Работа выполнена в Центральном сибирском ботаническом саду СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель – кандидат биологических наук, с.н.с. Шауло Дмитрий Николаевич. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор с.н.с. Малышев Леонид Иванович; кандидат биологических наук,...»

«Розломий Наталья Геннадьевна Зелёная зона г. Уссурийска Приморского края (состояние естественных и искусственных насаждений, оптимизация рекреационного лесопользования) 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Владивосток 2010 2 Работа выполнена в Институте лесного и лесопаркового хозяйства Федерального государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Приморская...»

«Горовцов Андрей Владимирович ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ СТРУКТУРА БАКТЕРИОЦЕНОЗОВ УРБОПОЧВ Г. РОСТОВА-НА-ДОНУ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону – 2013 2 Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии ФГАОУ ВПО Южный федеральный университет доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Внуков Валерий Валентинович Официальные оппоненты : Киреева Валерия Васильевна,...»

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«Качалов Иван Юрьевич ЛАНДШАФТНО-ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФИТОРАЗНООБРАЗИЯ ЛУГОВ В БАССЕЙНЕ НИЖНЕГО ТЕЧЕНИЯ Р. ВЯТКА Специальность 03.00.16 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Казань – 2006 Работа выполнена на кафедре общей экологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет имени В. И. Ульянова-Ленина Научный руководитель : доктор...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«ПРОВОРОВ НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ Эволюция микробно-растительных симбиозов: филогенетические, популяционно-генетические и селекционные аспекты Специальность 03.00.15 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации, представленной в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук Санкт-Петербург 2009 Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт...»

«СОЛОВЬЕВА ИРИНА ВЛАДЛЕНОВНА МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗНОЙ МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА 03.02.08 – экология (биология) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Нижний Новгород 2013 2 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И....»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенском государственном педагогическом университете имени В.Г. Белинского...»

«Токарь Ольга Егоровна ВОДНЫЕ МАКРОФИТЫ РЕКИ ИШИМ И ПОЙМЕННЫХ ОЗЕР (флора, растительность и фитоиндикация экологического состояния экотопов) 03.00.05 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Омск – 2005 Диссертация выполнена на кафедре ботаники и основ сельского хозяйства Омского государственного педагогического университета Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Борис Федорович Свириденко Официальные...»

«Краснопевцева Виктория Михайловна ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВЕСЕННИХ ЭФЕМЕРОИДОВ - РЕЛИКТОВЫХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ХРЕБТА ХАМАР-ДАБАН (ЮЖНОЕ ПРИБАЙКАЛЬЕ) 03.00.05. – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ 2007 Работа выполнена в Байкальском государственном биосферном природном заповеднике. доктор биологических наук, профессор Научный руководитель : Намзалов Бимба-Цырен Батомункуевич доктор биологических наук,...»

«Алексеева Анна Юрьевна ВЛИЯНИЕ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ДНК НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЭНДОТЕЛИЯ 03.02.07 – Генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2013 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной биологии Федерального государственного бюджетного учреждения Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научный руководитель : Вейко Наталья Николаевна доктор биологических наук Официальные...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.