WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ЧУДИНОВА Екатерина Сергеевна

Гемоглобин как индикатор реакционной способности

доноров NO и редуктаза в модельных

NO-генерирующих системах in vitro

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата химических наук

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории химической физики ферментов отдела кинетики химических и биологических процессов Института проблем химической физики РАН, г.Черноголовка, Московская обл.

Научный руководитель: доктор химических наук Л.А. Сырцова

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Н.Н Угарова доктор биологических наук А.Ф. Топунов

Ведущая организация: Институт физиологически активных веществ РАН, г.Черноголовка, Московская обл.

14

Защита состоится _ ноября 2007 г. в часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 при Институте биохимии им. Баха А.Н.

по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2, конференцзал.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан _ октября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета К 002.247. кандидат биологических наук А.Ф. Орловский © Чудинова Е.С., 2007 г.

© Институт проблем химической физики РАН, 2007 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Известно, что монооксид азота (NO) является уникальным биологическим регулятором. В первую очередь его функции связаны с регуляцией тонуса кровеносных сосудов. Определяющей стадией механизма действия NO в этом процессе является координация с гемом гуанилатциклазы. Основная форма хранения монооксида азота в организме – нитрит-ион (NO2–). Нитритредуктазная активность гемоглобина делает его самым распространенным восстановителем нитрита в организме (животных и человека). Метаболизм NO также в значительной мере связан с образованием нитрозилированного по железу комплекса HbNO.





Понимание биохимии монооксида азота позволит прояснить механизмы действия различных лекарственных средств и облегчит возросший в последние годы поиск новых эффективных кардиопрепаратов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научноисследовательских работ Института проблем химической физики РАН при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 06-03-32381а), Программы фундаментальных исследований ОХНМ РАН «Биомолекулярная и медицинская химия» и Программы Президента РФ по поддержке Ведущих научных школ (грант НШ-4525.2006.3).

Цели и задачи работы Основной целью данной работы было исследование возможности участия гемоглобина в восстановлении органических нитратов в условиях, близких к физиологическим, а также изучение возможности его использования как индикатора реакционной способности NO-доноров. Для этого было необходимо разработать методику исследования кинетики образования NO, которая была бы универсальной для всех изучаемых соединений. Работа проводилась с двумя классами NO-доноров, для которых осуществлялось:

1. изучение условий, в которых генерируется монооксид азота;

2. исследование кинетики образования NO, расчет констант скоростей элементарных стадий;

3. сравнение эффективности NО-донирования изучаемыми соединениями.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Разработать универсальную методику изучения кинетики образования монооксида азота.

2. Исследовать NO-донорную способность новых железосерных нитрозильных комплексов в протонных средах.

3. Изучить кинетику образования нитрит-иона в системе «органический нитрат – цистеин (Cys)» и разработать метод оценки потенциальной вазодилататорной активности органических нитратов.

4. Исследовать возможность участия гемоглобина в восстановлении органических нитратов в присутствии тиолов. Определить константы всех изучаемых реакций.

Научная новизна Разработана оригинальная методика исследования кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота. Методика реализована с применением численных методов декомпозиции суммарных спектров поглощения Hb и HbNO на индивидуальные составляющие. Разработанная методика была проверена на новых соединениях различных классов NO-доноров, способных выделять NO самопроизвольно. Более того, с ее помощью удалось не только определить константы выделения NO, сравнив их с константами известных представителей данного класса, но и показать, что процесс выделения NO может быть ассоциативным. Показано, что гемоглобин при больших концентрациях может влиять на процесс NO-донирования этими комплексами, стабилизируя их.

Для NO-доноров, принадлежащих к классу органических нитратов, изучена тройная система «нитрат-цистеин-гемоглобин» на примере 3,3бис(нитроксиметил)оксетана (NMO). Обнаружено взаимодействие гемоглобина с интермедиатом реакции цистеина и органического нитрата – тионитратом цистеина. Это взаимодействие приводит к образованию монооксида азота, что имеет большое значение для метаболизма органических нитратов.





Научно-практическая значимость исследования Разработанная методика может выступать в роли универсального инструмента в биохимии монооксида азота. Это позволит оценивать потенциальную вазодилататорную активность новых синтезированных препаратов еще на ранних стадиях исследований. Большой интерес полученные результаты представляют для исследователей, занимающихся вопросами биохимии монооксида азота, биотрансформации органических нитратов и проблемами толерантности.

Личный вклад автора Автором была разработана и успешно применена в исследованиях методика регистрации кинетики образования монооксида азота. Также в работе представлены результаты исследований, выполненных лично автором по ряду научно-исследовательских проектов, связанных с изучением различных классов NOдоноров. Автор непосредственно участвовал в обосновании и постановке основной части экспериментов, в их проведении и в обобщении результатов исследований. Математическое моделирование и расчет констант реакций в системе «NMO-Cys-Hb» проведены к.ф.-м.н. Психой Б.Л.

Положения, выносимые на защиту 1. Методика изучения кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота, реализованная с применением численных методов декомпозиции суммарных спектров Hb и HbNO на составляющие.

2. Гемоглобин как индикатор безактивационного выделения NO железонитрозильными комплексами в протонных средах.

3. Редуктазная активность гемоглобина, проявляющаяся в отношении интермедиата реакции взаимодействия цистеина с органическим нитратом.

Апробация работы Результаты исследований докладывались и обсуждались на Всероссийских и Международных симпозиумах и конференциях: Всероссийский симпозиум «Современная химическая физика» (Туапсе, 2004 и 2006); Международная конференция «Биотехнологии: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (Смоленск, 2005); Международная школа-конференция «Юность. Наука. Культура. – Физхимия» (Обнинск, 2005); Всероссийская конференция-школа «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» (Юность, 2006); Международная конференция им. Воеводского В.В. «Physics and chemistry of elementary chemical processes» (Черноголовка, 2007), а также на научных семинарах и конкурсах научных работ в ИПХФ РАН.

Публикации По теме диссертации опубликовано 4 печатных работы в рецензируемых российских и международных журналах и 9 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 106-ти страницах, включает введение, литературный обзор, экспериментальную часть, результаты и обсуждения, выводы и список использованной литературы (121 наименование). В качестве иллюстраций использовано 22 рисунка, 6 таблиц и 8 схем.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснованы выбор и актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи исследований, показана их научная новизна и практическая значимость.

Глава 1. Обзор литературы Литературный обзор состоит из трех частей. Первая часть посвящена монооксиду азота. Описаны пути биосинтеза NO, его биологические эффекты. Рассмотрены основные методы детектирования монооксида азота, их преимущества и недостатки. Рассмотрены классы доноров NO.

Вторая часть посвящена органическим нитратам – самым известным вазодилататорам. Рассмотрены возможные пути биотрансформации органических нитратов: в результате взаимодействия с тиолами и под действием фермента митохондриальной альдегиддегидрогеназы (mtALDH), КФ 1.2.1.3. Затронута проблема толерантности.

В третьей части идет речь о гемоглобине и его ферментативных свойствах. Подробно рассмотрено взаимодействие гемоглобина с тринитроглицерином (GTN). Особое внимание уделено конформационным состояниям белка и их роли в функционировании гемоглобина как нитритредуктазы. Изложены представления о возникшей в последнее десятилетие гипотезе, что гемоглобин в составе эритроцитов может являться одним из важнейших элементов системы биологической трансформации доноров NO и транспортировки монооксида азота внутри организма.

Глава 2. Материалы и методы В этой главе представлена экспериментальная часть исследований. Описаны материалы, используемые в работе; гемоглобин выделяли из донорской крови человека по известной методике. Все эксперименты проводились в атмосфере азота, для того, чтобы избежать окисления NO и оксигенации Hb кислородом воздуха. Подробно описаны техника работы в атмосфере азота и методика получения раствора дезоксигемоглобина. Описаны методики изучения кинетики исследуемых реакций. Для регистрации спектров поглощения использовали спектрофотометр «Specord M-40» (Carl Zeiss, Йена, Германия), снабженный компьютерным интерфейсом для численной регистрации спектров.

Глава 3. Гемоглобин как индикатор реакционной способности доноров NO Эта глава состоит из двух частей, в которых описаны соответственно: (1) разработка методики детектирования образования NO с помощью Hb и (2) использование этой методики для изучения кинетики образования монооксида азота из железонитрозильных комплексов в протонных средах.

Разработка методики определения монооксида азота Известно, что Hb при взаимодействии с NO образует комплекс HbNO.

При этом образующийся продукт имеет характерный спектр поглощения. Пик поглощения Hb (max = 556 нм; = 12.5 ммоль-1·л·см-1) при образовании HbNO А (отн. ед) 0. 0., нм Известно, что константа равновесия реакции комплексообразоРис. 1. Вид спектров Hb и HbNO, полувания NO с гемами Hb имеет величенных экспериментально. [Hb] = [HbNO] использовать Hb в качестве «ловушки» NO.

Как видно из рисунка 1, в процессе преобразования Hb в HbNO происходит перекрывание спектров. В связи с этим концентрацию HbNO оценивали путем декомпозиции экспериментальных спектров поглощения на составляющие (Hb и HbNO), используя метод наименьших квадратов. Расчет проводился в диапазоне длин волн 450-650 нм по двумстам экспериментальным точкам. При наличии в реакционной системе metHb (о чём свидетельствует поглощения при max = 631 нм) подобным образом проводили декомпозицию спектра на три составляющих.

Спектрофотометрический метод с использованием гемоглобина для определения NO является более универсальным по сравнению с основными (электрохимический, метод электронного парамагнитного резонанса, хемилюминесцентный) методами, применяемыми для этой цели. Достоинствами спектрофотометрического метода являются высокая селективность и чувствительность;

возможность проведения длительных кинетических измерений.

Помимо всего перечисленного, выбор Hb для анализа эффективности доноров NO представляет также и научный интерес, поскольку метаболизм NO в организме в значительной мере связан с образованием нитрозилированного по железу комплекса Hb в эритроцитах.

Использование гемоглобина в качестве индикатора NO-донорной способности железонитрозильных комплексов в протонных средах.

Разработанную методику интересно было испытать в исследованиях с такими NO-донорами, которые самостоятельно выделяют NO без использования дополнительных активаторов. Такими соединениями являются, например, железонитрозильные комплексы. Ряд соединений этого класса был синтезирован сотрудниками лаборатории С.М. Алдошина (ИПХФ РАН) и любезно представлен Рис. 2. Изменение разностных 0, спектров поглощения во времени при взаимодействии комплекса 4 0, изобестические точки. Условия – растворитель 0.05 М фосфатный 0, буфер pH 7.0, содержащий 3.3 % DMSO, температура 25 °С.

нам для работы. Для исследования кинетики образования NO, генерируемого железонитрозильными комплексами (1-7) (Таблицы 1 и 2), регистрировали изменение спектров поглощения реакционных систем, содержащих Hb и изучаемый комплекс (рис. 2). Поскольку все сера-нитрозильные комплексы железа поглощают в видимой области, регистрировали разностные спектры поглощения буфера и опытной системы с гемоглобином, содержавших соответствующий комплекс в одинаковой концентрации. Компьютерная регистрация спектров и обработка полученных данных проводилась, как описано выше.

На рисунке 2 приведены изменения разностных спектров поглощения во времени при взаимодействии Hb с комплексом 4.В аналогичных условиях было исследовано взаимодействие комплексов 1-3, 5-7 c Hb. При этом во всех случаях наблюдалось уменьшение оптической плотности в области максимума спектра поглощения Hb при 556 нм и нарастание при 545 и 575 нм, что свидетельствует об образовании комплекса HbNO. Регистрацию заканчивали после того, как спектр переставал меняться. Данные по кинетике образования HbNO для комплекса 4 приведены на рисунке 3.

[HbNO], мкмольл Оказалось, все кинетические зависимости, полученные для 1-7, хорошо описываются в рамках формализма реакций первого порядка.

Изучаемый процесс можно описать двумя последовательными реакциями – распад железонитрозильного комплекса с выделением NO и образование HbNO:

Поскольку скорость взаимодействия Hb c NO близка к диффузионной (kII = 1.02·108 моль-1·л·с-1), то для данной схемы реакций выполняется условие kb k (kb=kII·[Hb]). При этом справедливо описание кинетики накопления HbNO в системе уравнением:

Как видно из таблицы 1, величина kb на пять порядков превышает полученные в эксперименте константы скорости образования HbNO, поэтому погрешность этого приближения составит ~ 0.01%.

Таким образом, HbNO образуется с такой же скоростью, с какой NO выделяется в раствор, а Hb выступает в роли «ловушки» монооксида азота. Используя уравнение (1), были получены эффективные константы скорости первого порядка (k) изученных реакций для комплексов 1-6. Полученные данные приведены в таблице 1, для комплекса 7 – в таблице 2, строка 1.

Таблица 1. Эффективные константы скорости первого порядка (k) взаимодействия комплексов 1-6 с Hb*.

*Экспериментальные условия как в подписи к рисунку 2. Концентрация комплексов 1-6 была равна 2·10-4 моль·л-1, концентрация Hb (6-7.5)·10-6 моль·л-1.

Было проверено, отличаются ли скорости выделения NO-групп комплекса 7 в раствор при распаде изучаемых комплексов. Для этого была использована функция (2), описывающая кинетику протекания параллельных процессов.

Оказалось, что k1 = k2, при этом они равны константе, получаемой при использовании функции (1). Это означает, что NO-группы в комплексе 7 в таких условиях выделяются с одинаковыми скоростями.

Но на скорость реакции также может влиять эффект взаимодействия комплексов с белковой глобулой Hb, что будет приводить к изменению микроокружения сера-нитрозильного комплекса и, в конечном счете, к изменению скорости NO-донирования. Поэтому в работе было исследовано влияние концентрации Hb и соотношения [NO-донор]/[Hb] на константу скорости выделения NO в раствор комплексом 7 (Таблица 2).

Таблица 2. Константы скорости выделения NO в раствор (k) комплексом 7 и NONOатом* Условия экспериментов как подписи к рисунку 2.

Была определена эффективная константа скорости реакции первого порядка для комплекса 7 при концентрации Hb 2·10-5 моль·л-1 и соотношении [NOдонор]/[Hb] = 10 (таблица 2, строка 2). При 4-кратном уменьшении концентрации комплекса 7 в системе константа скорости реакции уменьшается (Таблица 2, строка 3). Анализ кинетики показал, что наблюдается два параллельных процесса выделения NO в раствор, происходящих по первому порядку. Один из них совпадает с описанным выше, а второй – A (отн. ед) идет на порядок медленнее (Таблица 2, 0. строка 3).

При 4-кратном повышении кон- 0. (рис. 4). Из-за недостаточного изменения поглощения в области перекрывания 0. деления NO не удается. Рис. 4. Изменение разностных спекПо-видимому, наблюдаемая ста- тров поглощения при взаимодействии билизация комплекса может быть объ- комплекса 7 с Hb. [комплекс] = 2· яснена частичной абсорбцией комплек- моль·л, [Hb] = 8·10 моль·л. Время са 7 макромолекулой гемоглобина. Это уменьшает его контакты с водной фазой, замедляя выделение NO.

В исследуемых комплексах железо имеет степень окисления (1+) и, поэтому, нельзя ожидать, что Hb будет выступать как восстановитель в реакциях образования NO. Действительно, образования метгемоглобина при взаимодействии Hb с железонитрозильными комплексами не наблюдалось. Более вероятным является выделение NO в результате взаимного окисления-восстановления нитрозильных групп изучаемых комплексов в протонных средах:

L NO L NO

L NO L NO

Различия в величинах констант k (Таблица 1 и 2) обусловлены природой лигандов, входящих в их состав, и типом связывания лигандов с атомами железа.

Для сравнения с комплексами 1-7 также были исследованы известные NO-доноры: красная соль Русина Na2[Fe2S2(NO)4]8H2O, нитропруссид натрия Na2[Fe(CN)5NO]·2H2O (SNP) и диэтилентриамин, относящийся к классу NONOатов.

Рис. 5. Изменение разностных спектров На рисунке 2 в разностных поглощения во времени при взаимодейстспектрах для комплекса 4 четко вии SNP (2·10-4 моль·л-1) с Hb (7,2·10- моль·л-1). Время регистрации в минутах видны изобестические точки при приведено на рисунке. Условия как в под- 551, 570 и 595 нм (аналогично для свидетельствует о том, что в суммарный спектр вносят вклад только Hb и HbNO.

В случае SNP (Рис. 5) видно искажение изобестических точек. Это говорит о том, что в процессе реакции образуется некоторое количество продукта взаимодействия Hb с SNP, вносящего вклад в спектр поглощения в области 450-650 нм.

Для NONOата изменение спектров поглощения Hb, указывающее на образование HbNO, происходило медленнее, чем для комплексов 1-7. Константа скорости реакции при одинаковых концентрациях реагентов оказалась на порядок ниже, чем для комплекса 7.

Известно, что красная соль Русина и SNP (в отличие от NONOата) требуют дополнительной активации (например, восстановительной). Но в нашем случае Hb не мог выступать как восстановитель, так как в ходе реакции метгемоглобин не образовывался.

Таким образом, разработанная методика регистрации кинетики образования NO была проверена на новых соединениях класса железонитрозильных комплексов, способных выделять NO самопроизвольно. С помощью этого метода удалось определить константы выделения NO, сравнив их с константами известных представителей данного класса, и показать, что выделение NO может происходить в нескольких параллельных процессах.

Также показано, что при больших концентрациях гемоглобина возможна стабилизация железонитрозильных комплексов и замедление их гидролиза. Этот эффект позволяет предположить пролонгированный механизм действия таких препаратов in vivo, несмотря на то, что самопроизвольное выделение NO в безбелковой среде такими комплексами происходит достаточно быстро.

Глава 4. Гемоглобин как редуктаза в реакциях с органическими нитратами Эта глава также состоит из двух частей, которые посвящены, соответственно: (1) кинетике образования нитрит-иона в системе «нитратвосстановитель» и (2) кинетике образования монооксида азота в системе «нитрат-цистеин-гемоглобин».

Кинетика образования нитрит-иона в системе «нитрат-восстановитель»

Известно, что скорость образования нитрит-иона из органических нитратов коррелирует с их вазодилататорной активностью. Основываясь на этом, был предложен метод анализа скорости образования нитрит-иона из органических нитратов, позволяющий судить об их эффективности как потенциальных вазодилататоров.

Для этого было изучено образование нитрит-иона из NMO в присутствии природных восстановителей – цистеина, глутатиона, аскорбата и NADH. Скорость накопления NO2– дала ряд 0.36; 0.11; 0.10; 0.04 мкмоль·л-1·мин-1, соответственно. Таким образом, лучшим восстановителем является цистеин – аналог тиолового кофактора и активного центра mtALDH.

На примере NMO была изучена кинетика накопления NO2– в реакции с Cys при различных концентрациях реагентов (см. рис. 6, точки). Концентрацию нитрит-иона определяли по реакции Грисса.

Методом ТСХ установлено, что через 40 ч при взаимодействии NMO с Cys обнаруживается лишь NOO (3-гидроксиметил(3-нитроксиметил)оксетан) – продукт восстановления одной нитроэфирной группы NMO (Rf=0).

Опыты, проведенные при различных значениях рН, показали, что при рН 8.5 скорость накопления NO2– ~ в 30 раз выше по сравнению с рН 7.0, а при рН 6.0 реакция практически не идёт. Поскольку pK SH-группы Cys равно 8.2, то наблюдаемая зависимость от pH свидетельствует о том, что восстановителем является тиолат-ион (R’S–).

На модельной системе «нитрат-цистеин» было проведено сравнение эффективностей нескольких органических нитратов. Активность падала в ряду GTN MPDD NMO DMPD DIBD NKR*. Величина частичного положительного заряда на атоме азота при O–N связи в нитроэфирах зависит от индукционного эффекта остальной части молекулы. А поскольку R’S– является нуклеофилом, то снижение активности в ряду вышеперечисленных соединений связано, скорее всего, с количеством нитрогрупп и пространственной структурой молекулы.

Реакция NMO с цистеином может проходить по одному из двух механизмов – либо в одну стадию как тримолекулярная (уравнение 4), либо как последовательность двух бимолекулярных реакций (уравнения 5, 6) Кинетическое моделирование показало, что в первом случае совпадения экспериментальных данных (точки) и расчетных кривых не наблюдается (рис. 6а), а во втором – наблюдается полное соответствие (рис. 6b). Таким образом, уста _ MPDD – 2-оксиметил-2-оксипропандиол-1,3-динитрат, DMPD – динитрат 2-метилпропандиола-1,3, DIBD – динитрат изобутендиола, NKR – N-[2-гидроксиэтил] никотинамид (никорандил). Все органические нитраты (кроме GTN) предоставлены сотрудниками лаб. Корепина А.Г. ИПХФ РАН.

новлено, что процесс образования нитрит-иона из органических нитратов – процесс двустадийный.

Рис. 6. Кинетика накопления нитрит-иона в системе NMO-Cys. Точки – экспериментальные данные, линии – теоретически рассчитанные для одностадийного (а) и двустадийного (b) механизма. (1) [NMO] = 3·10-3 моль·л-1, [Cys] = 10-2 моль·л-1;

(2) [NMO] = 3·10-3 моль·л-1, [Cys] = 5·10-3 моль·л-1; (3) [NMO] = 1.5·10-3 моль·л-1, [Cys] 510-3 моль·л-1; (4) [NMO] = 1.5·10-3 моль·л-1, [Cys] = 10-3 моль·л-1.

Для нахождения констант скорости реакций была составлена система дифференциальных кинетических уравнений, соответствующая схеме реакций (5-6), при постоянстве pH = 7.0 и с учетом равновесия K[RSH] = [RS-][H+]. Путем численного решения полученной системы уравнений при начальных условиях ([RONO2](0) = [RONO2]0; [RSNO2](0) = [NO2-] = 0; начальные концентрации [R’SH](0) и [R’S](0) находятся из уравнений равновесия и материального баланса: [RSH](0) + [RS](0) = [RSH]0) строили расчетную зависимость F(k 1, k 2 ) = ([ NO 2 ](jэксп) [ NO 2 ](jрасч) ) 2, [NO2]j(расч) – экспериментальные и расчетные значения [NO2] в момент времени tj. Полученные значения констант скорости k1 и k2 приведены в таблице 3.

Кинетика образования монооксида азота в системе «нитрат-цистеинвосстановитель»

Рис. 7. Изменение спектров поглощения при взаимодействии NMO (3·10-3 тиола и Hb, образовывать NO. Измемоль·л-1) с Hb (17.4·10-6) моль·л-1 в при- нение спектров поглощения реакционсутствии Cys (10-2 моль·л-1). Первый ной системы, содержащей Hb, NMO и спектр записан в начальный момент, втоCys представлено на рис. 7. Спектры рой – через 15 мин, остальные – с интервалом 60 мин. Условия как в подписи к были обработаны, как описано выше.

рисунку 2.

Поскольку Hb восстанавливает нитрит-ион до NO, было проанализировано, соответствует ли количество монооксида азота, образовавшегося в тройной системе, тому количеству NO2 –, который образуется при взаимодействии NMO с цистеином. И можно ли описать процесс образования NO в системе Hb-NMOCys реакциями (3, 5-9) Hb + NO k HbNO, metHb + RSH k Hb + RS + H +.

Так же, как и в случае двойной системы, было проведено исследование обратной задачи и определение констант скорости второго порядка по экспериментальным данным для тройных систем. При этом рассматривалась последовательность шести реакций (3, 5-9). Константы скорости реакций второго порядка k1 и k2 определили для двойной системы NMO-Cys, как описано выше; k3 и k были найдены из независимых экспериментов: исследования кинетики взаимодействия Hb с нитритом натрия и восстановления metHb под действием Cys.

При анализе реакций также принималось во внимание, что Hb существует в двух конформациях – T и R, которые имеют различные RedOx-потенциалы и обладают различной реакционной способностью. Взаимодействие Hb, который находится в T-конформации, с нитрит-ионом (а также с алкилнитритами), проходит под аллостерическим контролем – так как взаимодействие NO с гемом переводит всю молекулу Hb в более реакционноспособную R-конформацию. Поэтому скорость реакции возрастает по мере увеличения глубины реакции.

В связи с этим выражение для константы скорости k3 было записано в виHb]t вия Hb c NO2 –, определяющая весь ход реакции; [Hb]0 – начальная концентрация Hb; [Hb]t – текущая концентрация свободного Hb; k3.0 и k3.1 – константы скорости реакции на первом и на втором этапе. Это выражение обеспечивает линейный рост константы k3 с глубиной протекания процесса и содержит два параметра k3.0 и k3.1, которые были оценены из независимого эксперимента по кинетике взаимодействия Hb с NaNO2. Полученные значения k3.0 и k3.1 приведены в таблице 3.

Таблица 3. Константы скоростей второго порядка реакций (5-9).

Математические расчеты показали, что всю совокупность экспериментальных данных (рис. 8) нельзя описать только пятью константами k1 – k5. Оказалось, что наблюдаемая в эксперименте скорость образования HbNO в тройной системе превышает рассчитанную, если считать, что HbNO образуется только путем взаимодействия Hb с тем NO2 –, который нарабатывается в двойной системе NMO-Cys. Для объяснения этого эффекта возможны три варианта.

1. Cys увеличивает скорость взаимодействия Hb с NO2 –. Проверяя эту возможность, мы исследовали взаимодействие NO2 – c Hb в присутствии Cys, и оказалось, что константа скорости реакции при этом не увеличилась. Следовательно, первый вариант отпадает.

2. В двойной системе NMO-Cys происходит восстановление NO2 – в NO. Для проверки второй возможности был проведен опыт с предварительной инкубацией NMO с Cys в обычных условиях работы (описаны в подписи к рис. 2) и затем прибавили Hb (кривая 3, рис. 8). Сразу после прибавления Hb был записан спектр поглощения реакционной системы и HbNO не был обнаружен. Его концентрация нарастала постепенно. При этом скорость образования HbNO была выше, чем в таком же опыте без предварительной инкубации (кривая 1, рис. 8) и соизмерима с k3. Это свидетельствует о том, что в процессе инкубации наработался нитрит-ион, который затем был восстановлен гемоглобином. Таким образом, и второй вариант отпадает.

3. Cys обеспечивает другой путь взаимодействия NMO с Hb. Для выяснения возможности этого варианта мы решили включить в последовательность реакций (5-9) реакцию (10) восстановление гемоглобином интермедиата (тионитрата Cys – RS-NO2), который образуется из NMO и Cys в реакции (5).

Также как и для двойной системы, была составлена система дифференциальных уравнений, соответствующая полной схеме реакций (k1 – k6), с учетом равновесия K[RSH] = [RS-][H+], постоянства pH системы ([H+] = const) и квазистационарности процесса по [NO]. Система решалась численными методами с учетом начальных условий: [RONO2](0) = [RONO2]0; [RSNO2](0) = [NO2-] = [metHb](0) = 0; [Hb](0) = [Hb]0; начальные концентрации [R’SH](0) и [R’S](0) не совпадают с их исходными значениями [R’SH]0 и с нулем и находятся из условий равновесия (3) и уравнения материального баланса в начальный момент времени: [RSH](0) + [RS](0) = [RSH]0. Численное решение системы уравнений позволяет рассчитать экспериментально измеряемую величину [HbNO](t) из Значение неизвестной константы скорости реакции k6 находили из услоnj число опытов, nj – число точек в j-м опыте, pij – весовые коэффициенты, [HbNO]i(эксп) и [HbNO]i(расч) – экспериментальные и расчетные значения концентрации [HbNO], соответственно. В результате обработки экспериментальных данных (рис. 8) было получено среднее значение констант скоростей второго порядка реакций (5-9) (Таблица 3) и хорошее соответствие расчётных кривых экспериментальным точкам на значительном участке зависимости. Далее реакция в эксперименте идёт с большей скоростью, что характерно для реакций Hb, проходящих под аллостерическим контролем.

Предполагается, что тионитрат претерпевает так называемую тионитратную перегруппировку и находится в равновесии с сульфенил- или сульфинилнитритом:

Вполне возможно, что у Hb проявляется повышенная реакционная способность именно к сульфенилнитриту, поскольку это соединение является структурным аналогом алкилнитритов. Хотя Hb и не реагирует с нитроэфирами – алкилнитратами, известно, что он проявляет высокую реакционную способность по отношению к алкилнитритам. Константа скорости реакции для разных алкилнитритов с образованием NO составляет от 14.5 до 1420 моль-1·лс-1, что значительно больше k3t (Таблица 3) для взаимодействия Hb с NO2 –. Схематично предполагаемый процесс восстановления NMO в Рис. 9. Предполагаемая схема восстацистеина – промежуточного продукта новления органических нитратов с участием гемоглобина и цистеина.

Такое взаимодействие обеспечивает восстановление, по-видимому, любого нитроэфира в присутствии тиола. Это позволяет объяснить абсолютную необходимость тиолов для биотрансформации нитратов и развитие толерантности в терапии сердечно-сосудистых заболеваний.

ВЫВОДЫ

1. Разработана оригинальная методика изучения кинетики реакций, протекающих с образованием монооксида азота, основанная на спектрофотометрической регистрации спектра поглощения комплекса HbNO.

2. Определены константы скоростей распада семи новых железонитрозильных комплексов с выделением монооксида азота. Показано, что эти комплексы являются NO-донорами, выделяющими NO за счет гидролиза в протонной среде.

Установлено, что константы скоростей генерирования NO для изученных комплексов на два порядка выше, чем у NO-доноров сравнения. Показано, что при больших концентрациях гемоглобина возможна стабилизация комплексов и замедление процесса их гидролиза.

3. Проведено сравнение природных восстановителей – цистеина, глутатиона, аскорбата и NADH по скорости образования ими нитрит-иона из органического нитрата на примере NМО. Установлено, что лучшим восстановителем является цистеин.

4. Исследована кинетика образования NO2– из органических нитратов на примере NMO. Установлено, что реакция проходит в две стадии через интермедиат тионитрат цистеина. Определены константы скоростей обеих стадий. Показано, что восстановителем является тиолат-ион цистеина. Сделан вывод о том, что снижение активности в ряду GTN MPDD NMO DMPD DIBD NKR связано с количеством нитрогрупп и пространственной структурой молекулы.

5. Определены константы скорости взаимодействия гемоглобина с нитритионом и метгемоглобина с цистеином. Обнаружена новая редуктазная активность Hb, проявляющаяся в отношении тионитрата цистеина – промежуточного продукта реакции NMO и цистеина. Путем моделирования кинетики реакции системой уравнений, описывающей равновесие между всеми реагирующими компонентами системы, определены константы всех протекающих процессов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Sanina N.A., Syrtsova L.A., Shkondina N.I., Rudneva T.N., Malkova* E.S., Bazanov T.A., Kotelnikov A.I., Aldoshin S.M. Reaction of sulfur-nitrosyl iron complexes of «g=2,03» family with hemoglobin (Hb): Kinetics of Hb-NO formation in aqueous solutions // Nitric Oxide: Biology and Chemistry, 2007, Vol. 16, No. 2, pp: 181-188.

2. Сырцова Л.А., Психа Б.Л., Малкова* Е.С., Шкондина Н.И., Котельников А.И.

Экспресс-метод оценки потенциальной вазодилататорной активности органических нитратов // Прикладная биохимия и микробиология, том 43, № 3, 2007, с. 354-357.

3. Сырцова Л.А., Котельников А.И., Психа Б.Л., Малкова* Е.С., Н.И. Шкондина, Гайнуллина Е.И. Восстановление нитроэфиров – доноров NO – гемоглобином с участием цистеина // Изв. АН Сер. Хим., 2007, № 4, с. 725-731.

4. Санина Н.А., Сырцова Л.А., Шкондина Н.И., Малкова* Е.С., Котельников А.И., Алдошин С.М. Стабилизация гемоглобином тетранитрозильного биядерного комплекса железа с пиридин-2-тиолом в водных растворах // Изв. АН Сер. Хим., 2007, № 4, с. 732-736.

5. Малкова* Е.С., Сырцова Л.А., Котельников А.И., Королев А.М. Новые свойства миоглобина как фермента. Тезисы докл. XVI Всероссийского Симпозиума «Современная химическая физика», Туапсе, 2004, Стр. 184-185.

_ * фамилия Малкова изменена на Чудинову на основании свидетельства о браке II-ИК № 639138.

6. Malkova* E.S., Shkondina N.I., Syrtsova L.A., Sanina N.A., Rudneva T.N., Aldoshin S.M., Kotelnikov A.I. Use of myoglobin and hemoglobin for search of effective medical preparations. Third Moscow International congress «Biotechnology: state of the art and prospects of development», 2005. Congress Proceedings. Part 1. p. 135.

7. Котельников А.И., Санина Н.А., Сырцова Л.А., Руднева Т.Н., Малкова* Е.С., Алдошин С.М. Реакции органических и неорганических доноров монооксида азота с гемоглобином: кинетика образования HbNO. Сб. трудов 4-ой национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» Смоленск, 2005, Стр. 47-48.

8. Малкова* Е.С., Сырцова Л.А., Шкондина Н.И., Котельников А.И. Изучение NO-донирующей способности органических нитроэфиров в новой модельной системе. Тезисы докл. Международной школы-конференции «Юность. Наука. Культура. – Физхимия», Обнинск, 2005, Стр. 183-185.

9. Сырцова Л.А., Малкова* Е.С., Психа Б.Л., Шкондина Н.И., Котельников А.И.

Восстановление нитроэфиров – доноров NO гемоглобином с участием цистеина через интермедиат нитритотиол. Тезисы докл. 1-ой Всероссийской конференциишколы «Высокореакционные интермедиаты химических реакций» Юность, 2006, Стр. 40.

10. Малкова* Е.С., Сырцова Л.А., Шкондина Н.И., Котельников А.И. Модельные системы для подбора лекарственных препаратов на основе органических нитроэфиров. Альманах клинической медицины, Т. XII. II Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине», 2006, Стр. 121.

11. Шкондина Н.И., Санина Н.А., Сырцова Л.А., Малкова* Е.С., Котельников А.И., Алдошин С.М. Гемоглобин как ловушка NO в реакциях гидролиза нитрозильных [1Fe-S] И [2Fe-2S]-комплексов. Тезисы докл. XVIII Всероссийского симпозиума «Современная химическая физика» Туапсе, 2006, Стр. 283.

12. Малкова* Е.С., Психа Б.Л., Сырцова Л.А., Шкондина Н.И., Котельников А.И.

Механизм реакции между органическими нитратами и сульфгидрильными соединениями. Тезисы докл. XVIII Всероссийского симпозиума «Современная химическая физика» Туапсе, 2006, Стр. 275.

13. Syrtsova L.A., Kotelnikov A.I., Psikha B.L., Malkova* E.S., Shkondina N.I., Gainullina E.I. Kinetic modeling of reaction of nitroesters biotransformation with participation of hemoglobin. Book of abstracts of VII Voevodsky conference «Physics and chemistry of elementary chemical processes» Chernogolovka, 2007, pp. 278-279.



 
Похожие работы:

«Заводовский Петр Геннадьевич АФИЛЛОФОРОИДНЫЕ ГРИБЫ В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ВОДЛОЗЕРЬЯ 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университета Научный руководитель : член-корр. РАН, доктор биологических наук,...»

«ЛЕВЧЕНКО Тимофей Викторович ФАУНА И ЭКОЛОГИЯ ПЧЕЛ (HYMENOPTERA: APOIDEA) МОСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.05 – энтомология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена на кафедре энтомологии Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Чернышев Владимир Борисович доктор биологических наук Песенко Юрий Андреевич...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«Димитриев Юрий Олегович СОВРЕМЕННОЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ФЛОРЫ УРБАНИЗИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ (НА ПРИМЕРЕ ГОРОДА УЛЬЯНОВСКА) 03.02.01 – Ботаника 03.02.08 – Экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Сыктывкар – 2011 2 Работа выполнена на кафедре ботаники ГОУ ВПО Ульяновский государственный педагогический университет имени И.Н. Ульянова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Масленников Андрей...»

«ЧЕПИНОГА Виктор Владимирович ФЛОРА БАССЕЙНОВ РЕК ИЯ И ОКА (В ПРЕДЕЛАХ ИРКУТСКОЙ ОБЛАСТИ) 03.00.05. - ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Иркутск, 2000 2 Работа выполнена на кафедре ботаники и генетики Иркутского государственного университета. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент А. М. Зарубин Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор, Л.И. Малышев кандидат биологических наук, М.Г....»

«Иванищева Елизавета Александровна ЛАНДШАФТНО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКОГО КАРКАСА СЕВЕРО-ЗАПАДА ВОЛОГОДСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.08. – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Владимир – 2013 Работа выполнена в лаборатории моделирования экосистем Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения Российской академии наук Научный руководитель...»

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом...»

«Смирнов Иван Алексеевич Модельные ассоциации на основе базидиальных грибов и фототрофных микроорганизмов Специальность 03.00.24 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный...»

«Красникова Мария Сергеевна ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ TAS3, КОДИРУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ta-siРНК У НЕЦВЕТКОВЫХ НАЗЕМНЫХ РАСТЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ У НЕКОТОРЫХ ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ 03.01.03 - молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«Пархоменко Василий Михайлович БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ И СТРУКТУРА ЦЕНОПОПУЛЯЦИЙ ЗВЕРОБОЯ ПРОДЫРЯВЛЕННОГО (HYPERICUM PERFORATUM L.) В УСЛОВИЯХ САРАТОВСКОЙ ОБЛАСТИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Саратов – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского на кафедре...»

«ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2010 Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : доктор биологических наук,...»

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И....»

«СЕРЕГИН Алексей Петрович РОД ALLIUM L. (ALLIACEAE) ВО ФЛОРЕ ВОСТОЧНОЙ ЕВРОПЫ 03.00.05 – ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2007 1 Работа выполнена на кафедре геоботаники Биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Ю.Е. Алексеев...»

«Зотов Александр Александрович ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДОЛГОНОСИКОВ ПОДСЕМЕЙСТВА LIXINAE (COLEOPTERA, CURCULIONIDAE): ЭКОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в отделе аридной экологии ФГБУН Институт аридных зон Южного научного Центра РАН доктор биологических наук, Научный руководитель : Арзанов Юрий Генрихович Замотайлов Александр...»

«Китаев Константин Альбертович ПОПУЛЯЦИОННО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОАДАПТАЦИИ КОЛОРАДСКОГО ЖУКА (LEPTINOTARSA DECEMLINEATA SAY) И ЕГО ЭНТОМОФАГОВ 03.02.07 – генетика 03.02.08– экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Уфа 2013 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Колорадский жук (Leptinotarsa decemlineata Say) является инвазивным видом, появившимся в агроэкосистемах вслед за картофелем, и наиболее массовым фитофагом...»

«Гапочка Михаил Германович ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫХ ПОЛЕЙ МИЛЛИМЕТРОВОГО ДИАПАЗОНА С БИОЛОГИЧЕСКИМИ ОБЪЕКТАМИ Специальность 03.02.08 – экология (биология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2013. 1 Работа выполнена на кафедре гидробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московский государственный...»

«ЗОЛОТАРЁВ Дмитрий Александрович ХОРТОБИОНТНЫЕ ПОЛУЖЕСТКОКРЫЛЫЕ (INSECTA: HEMIPTERA=HETEROPTERA) АНТРОПОГЕННО ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ТЕРРИТОРИЙ (на примере г. Кемерово) Специальность 03.00.08 Зоология Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Томск 2005 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии ГОУ ВПО Кемеровский государственный университет. Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Н. И. Еремеева Официальные оппоненты...»

«БАЛАНОВСКИЙ Олег Павлович ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОФОНДА В ПРОСТРАНСТВЕ И ВРЕМЕНИ: СИНТЕЗ ДАННЫХ О ГЕНОГЕОГРАФИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И Y-ХРОМОСОМЫ 03.02.07 – генетика 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научные консультанты: доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.