WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

ГРИДИНА МАРИЯ МИХАЙЛОВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ РАННИХ СТАДИЙ ОБРАЗОВАНИЯ ГИБРИДНЫХ

КЛЕТОК, ПОЛУЧАЕМЫХ ПРИ СЛИЯНИИ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ

СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ФИБРОБЛАСТОВ

03.02.07 – генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2010

Работа выполнена в лаборатории генетики развития Учреждения Российской академии наук Институт цитологии и генетики сибирского отделения РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Серов О.Л.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, Кикнадзе И.И.

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск доктор биологических наук, Лебедев И.Н.

Учреждение Российской академии медицинских наук НИИ медицинской генетики СО РАМН, г. Томск Ведущее учреждение: Институт общей генетики РАН, г. Москва

Защита диссертации состоится 2010 года на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева 10, тел/факс: (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан "_" 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Развитие начинается с деления-дробления оплодотворенной яйцеклетки – зиготы. Программа развития, заложенная в этой тотипотентной клетке, реализуется в процессе онтогенеза через дифференцировку, в результате которой формируется более 200 типов специализированных клеток, представленных во взрослом организме. Процесс дифференцировки сопровождается потерей первоначальной тотипотентности, которую можно условно градуировать: плюрипотентность, мультипотентность, коммитированность и терминальная детерминация. Важным элементом потери потенциала является ее одновекторность и, в большинстве случаев, необратимость. В нормальном развитии эукариот примеры восстановления дифференцированной клеткой утраченного потенциала чрезвычайно редки. В связи с этим исследователями не раз предпринимались попытки экспериментальным путем восстановить утраченный потенциал соматических клеток.





Одним из способов восстановления потенциала (репрограммирования) генома соматической клетки является ее слияние с эмбриональной стволовой (ЭС) клеткой. В 1996 году было обнаружено, что слияние мышиных ЭС клеток и спленоцитов приводит к формированию гибридных клеток, которые обладают многими свойствами ЭС клеток, в том числе способностью участвовать в формировании химерных животных (Матвеева и др., 1996; Matveeva et al., 1998).

Эти данные нашли подтверждение в целом ряде экспериментов по слиянию ЭС клеток с В- и Т-лифмоцитами (Tada et al., 2001; Kimura et al., 2004), незрелыми нейральными клетками (Do et al., 2004), незрелыми гемопоэтическими клетками (Ying et al., 2003) и фибробластами (Sullivan et al., 2006; Kruglova et al., 2008).

Исследования таких гибридных клеток показали, что в них происходит:

активация генов, неактивных в соматических клетках (таких как Oct4 и Nanog), реактивация неактивной Х-хромосомы, изменения профилей метилирования ДНК и модификаций гистоновых белков (Tada et al., 2001; Kimura et al., 2004; Do et al., 2007; Battulin et al., 2009). Все это является свидетельством репрограммирования, происходящего в геноме соматической клетки после слияния с ЭС клеткой. Изменения профиля экспрессии генов, происходящие в гибридных клетках такого типа, а также приобретение этими клетками плюрипотентных свойств говорит о доминировании генома ЭС клеток над геномом соматических клеток.

Представление о доминировании генома одного партнера по слиянию над другим долгое время было популярным не только для гибридных клеток, получаемых при слиянии ЭС клеток с соматическими клетками, но и для гибридов, получаемых при слиянии двух соматических клеток различной тканевой принадлежности. После слияния двух соматических клеток возможно, используя ингибиторы клеточного деления, оставить клетку на стадии гетерокариона, когда в общей цитоплазме присутствуют два ядра родительских клеток. В таких гетерокарионах, как правило, доминирует партнер с большей по объему цитоплазмой и укороченным клеточным циклом и под его воздействием меняется организация второго ядра и паттерн экспрессии генов на свойственный доминантному ядру. Примерами такого доминирования могут служить гетерокарионы, полученные при слиянии эритроцитов птиц или амфибий с какими-либо растущими и делящимися в культуре клетками млекопитающих (Harris, 1967) или при слиянии кератиноцитов мыши с миобластами мыши (Zhang et al., 2007). Однако недавно появилась работа, в которой показано обоюдное влияние ядер в гетерокарионах между кератиноцитами и мышечными клетками, а не доминирование одного ядра над другим (Palermo et al., 2009).





Таким образом, возникает вопрос – возможно ли альтернативное проявление геномов родительских клеток при слиянии соматических клеток с ЭС клетками или же в данном случае наблюдается строгое доминирование ядер ЭС клеток?

Цели и задачи исследования. Целью данного исследования является изучение динамики становления фенотипа гибридных клеток на ранних стадиях после слияния диплоидных ЭС клеток мыши с диплоидными эмбриональными фибробластами мыши.

Для достижения целей были поставлены следующие задачи:

Модифицировать метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток на ранних стадиях после слияния ЭС клеток и фибробластов.

Провести иммунофлюоресцентный анализ маркеров плюрипотентных ЭС клеток (Oct4 и Nanog), фибробластов (коллагена I типа и фибронектина) и дифференцированных клеток (ламина А/С) в гетерокарионах и гибридных клетках в первые часы (с 4-ого до 20-ого) и дни (с 1-го до 4-го) после слияния ЭС клеток и фибробластов.

Провести анализ профилей метилирования ДНК 5’-регуляторной области гена Oct4 в гибридных клетках через разные интервалы времени после слияния ЭС клеток и фибробластов.

Исследовать состояние Х-хромосом в гетерокарионах и гибридных клетках посредством иммунофлюоресцентного анализа факультативного гетерохроматина с использованием антител против триметилированного лизина в 27-ом положении в гистоне Н3 (H3K27me3), маркирующего неактивную Х-хромосому.

Научная новизна и практическая значимость.

Модифицирован метод идентификации продуктов слияния ЭС клеток и фибробластов, позволяющий с 90% точностью дискриминировать гетерокарионы и гибридные клетки от гомокарионов и гибридных клеток, образовавшихся при слиянии двух родительских клеток одного типа (ЭС клетка-ЭС клетка и фибробласт-фибробласт).

Впервые обнаружено существование двух фенотипически контрастных типов гетерокарионов и гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток с диплоидными фибробластами – одни имеют признаки ЭС клеток, а другие фибробластов.

Впервые показано, что деметилирование ДНК 5’-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена Oct4 в гибридных клетках с фенотипом ЭС клеток происходит в течение первых 4-х дней после слияния, в то же время в гибридных клетках с фибробласто-подобным фенотипом происходит метилирование 5’-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4.

Полученные в ходе данной работы результаты используются при чтении лекций спецкурса «Генетика развития» в Новосибирском государственном университете (НГУ).

Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены в работе следующих конференций и симпозиумов: 3-я международная конференция «Наука для медицины» (Новосибирск, 2007);

симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». (Москва, 2007); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2007); международная научная конференция молодых ученых «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); 4-ая международная конференция сообщества стволовых клеток северной Рейн-Вестфалии (Дюссельдорф, 2007); LXXIII симпозиум по количественной биологии (Cold Spring Harbor, 2008); 1-ый ежегодный международный конгресс по регенеративной медицине и стволовым клеткам (Фошан, 2008); V съезд Вавиловского общество генетиков и селекционеров (Москва, 2009); 5-ый международный конгресс по биотехнологии стволовых клеток (Тегеран, 2009); всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий»

(Санкт-Петербург, 2009).

Материалы диссертации изложены в 3-х статьях, опубликованных в отечественном и международных журналах, входящих в перечень ВАК.

Положение, выносимое на защиту. В клетках, получаемых при слиянии диплоидных ЭС клеток мыши и диплоидных фибробластов мыши, начиная со стадии гетерокариона, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов. В результате чего формируются гибридные клетки, обладающие двумя контрастными фенотипами: ЭС-подобным и фибробласто-подобным.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы. Работа изложена на 120 страницах, проиллюстрирована 27 рисунками и содержит 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали следующие культуры клеток:

эмбриональные стволовые клетки линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученные из ВКМ бластоцисты мыши Mus musculus линии 129/Ola. Клетки этой линии маркированы GFP, устойчивы к пуромицину и ГФРТ- (Pratt et al., 2000), имеют кариотип 2N = 40,XY. Линия была любезно предоставлена доктором Остином Смит (University of Edinburgh).

первичные культуры эмбриональных фибробластов, полученные из 12,5-дневных эмбрионов мышей линии DD/c M. musculus; первичные культуры эмбриональных фибробластов с кариотипом 2N = 40,XХ, полученные из 14,5-дневных эмбрионов линии DD/c M. musculus; первичные культуры эмбриональных фибробластов, полученные из 12,5-дневных эмбрионов мышей Mus caroli.

Культивирование ЭС клеток и гибридных клеток проводили по методу, описанному ранее Матвеевой и др. (Matveeva et al., 1998). Условия культивирования фибробластов и метод слияния клеток описан ранее Кругловой и др. (Круглова и др., 2008). Мечение фибробластов проводили полистироловыми флуоресцентными микросферами (Invitrogen, США) согласно приложенной инструкции.

Иммунофлюоресцентный анализ проводили согласно методу, описанному ранее Кругловой и др. (Kruglova et al., 2010). В анализе использовали следующий набор первичных антител к: Oct4 (1:500; Abcam, Великобритания), Nanog (1:200; Abcam, Великобритания), коллагену I типа (1:1000; Chemicon, США), фибронектину (1:1000; Abcam, Великобритания), ламину A/C (1:150;

Chemicon, США), триметилированному лизину в 27 положении гистона Н (1:500; Molecular Probes). Вторичные антитела конъюгированные с флуорохромом Alexa Fluor 546 к: IgG мыши, (1:300; Molecular Probes, США), IgG кролика (1:300; Molecular Probes, США). Анализ проводили с помощью флуоресцентного микроскопа Axioscope-2 (Carl Zeiss, Германия) и программного обеспечения WinView software (Rooper Scientific Photometrix).

Для дискриминации родительских митохондриальных ДНК (мтДНК) использовали аллель-специфичный полиморфизм мтДНК. Выделение мтДНК из единичных клеток проводили согласно методу, описанному в работе Зукотти и Монка (Zuccotti, Monk, 1995) с описанными в работе модификациями.

Определение нуклеотидной последовательности проводили согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems, Perkin-Elmer Corporation, США) в Межинститутском центре секвенирования ДНК (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН).

Бисульфитную обработку ДНК проводили с использованием реагентов EZ DNA Methylation-Direct Kit (Zymo Research, США) согласно приложенной инструкции. Субклонирование продуктов ПРЦ проводили с использованием набора реактивов pGEM-T Easy Vector System (Promega, США) согласно приложенной инструкции.

В работе использовали штамм E. coli XL10-Gold (Stratagene, США).

Приготовление и трансформацию компетентных клеток E. coli проводили согласно протоколу фирмы Stratagene, прилагаемому к данному штамму. После трансформации клеток E. coli, клонированные фрагменты индивидуальных клонов амплифицировали в ПЦР и затем секвенировали.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Идентификация гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток и фибробластов На первом этапе исследования нами был разработан метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы и сутки после слияния ЭС клеток и фибробластов. Метод основан на использовании прижизненных флуоресцентных меток: «зеленое» свечение цитоплазмы ЭС клеток благодаря экспрессии в них трансгенного GFP и мечение цитоплазмы фибробластов «синими» гранулами. Такое маркирование родительских клеток позволило дискриминировать обе популяции родительских клеток и продукты слияния между ними.

Для оценки точности предложенного способа идентификации гибридных клеток мы провели анализ родительских мтДНК в гибридных клетках.

Последовательности мтДНК мышей линий 129/Ola и DD/c имеют различие в участке гена третьей субъединицы цитохромоксидазы, которое представляет собой замену в положении 9348. Нами была проведена гибридизация ЭС клеток, линии E14Tg2aSc4TP6.3, полученной из бластоцисты мыши 129/Ola, и фибробластов, полученных из эмбрионов мышей DD/c. Через 48 ч после слияния 20 гибридных клеток были отобраны и перенесены в индивидуальные пробирки, для каждой клетки индивидуально проводили ПЦР с использованием праймеров к участку мтДНК, в котором находится полиморфизм между линиями мышей 129/Ola и DD/с. Продукты ПЦР секвенировали и идентифицировали родительские формы мтДНК (рис. 1А, Б, В). Результаты проведенного анализа показали, что из 20 образцов 18 имели четко выраженные сигналы, соответствующие обоим нуклеотидам, что указывает на присутствие в образце обеих родительских форм мтДНК, а в 2 образцах содержалась мтДНК только клеток линии 129/Ola. Кроме того, был проведен дополнительный анализ продуктов рестрикции, выявляющий тот же полиморфизм мтДНК, результаты которого, подтвердили данные, полученные в ходе секвенирования.

Морфология гетерокарионов и гибридных клеток Используя описанный выше способ идентификации гетерокарионов и гибридных клеток, был проведен морфологический анализ популяции клеток, полученной после проведения слияния ЭС клеток и фибробластов. Через 4 ч после слияния можно было выделить два морфологически различающихся типа гетерокарионов: фибробласто-подобные – крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим соотношением и большим количеством отростков;

ядерно-цитоплазматическим соотношением и без выраженных отростков (таблица 1, рис. 2А и Б). Через 45 ч и 69 ч после слияния встречались гетерокарионы только с фибробласто-подобной морфологией (рис. 2В). Первое деление гетерокарионов происходило в период между 8 ч и 45 ч после слияния.

Среди, появившихся через 21 ч после слияния, гибридных клеток 81% имели фибробласто-подобную морфологию (рис. 2Г), и только 19% клеток обладали морфологическими сходствами с ЭС клетками (таблица 1). ЭС-подобных гибридных клеток.

Популяция гибридных клеток через 45 ч и 69 ч после слияния сохраняла свою неоднородность: в ней присутствовали как колонии, образованные плотно прилегающими друг к другу клетками, морфологически сходными с ЭС клетками (рис. 2Д), так и колонии, в которых клетки, сходные с фибробластами, располагались на значительном расстоянии друг от друга (рис. 2Г и Е).

Соотношение этих двух типов колоний было приблизительно 1:1 (таблица 1).

Однако следует подчеркнуть, что формирование клонов гибридных клеток происходило только из клеток с ЭС-подобной морфологией, тогда как, по нашим наблюдениям, фибробластно-подобные гибридные клетки не были способны давать начало стабильным клонам гибридных клеток.

Иммунофлюоресцентный анализ экспрессии белков, маркирующих плюрипотентные и соматические клетки, в гетерокарионах и гибридных Существует ряд генов, экспрессия которых характерна только для плюрипотентных клеток, а их активация в гибридных клетках, полученных при слиянии ЭС клеток и соматических клеток, наряду с подавлением экспрессии тканеспецифичных генов, является признаком, прошедшего в гибридных клетках, репрограммирования. В частности, принято считать экспрессию генов Oct4 и Nanog – маркерами ЭС клеток, присутствие ламина А/С в ядерной ламине – маркером дифференцированных клеток (Constantinescu et al., 2006), а наличие цитоскелета, сформированного коллагеном I типа и фибронектином (Smith et al., 1979), – маркером клеток фибробластного ряда.

Используемый нами набор первичных антител позволял проводить иммунофлюоресцентный анализ Oct4 и коллагена I типа одновременно, поскольку они имеют разную внутриклеточную локализацию: ядерную и цитоплазматическую соответственно. В результате анализа трех независимых гибридизаций ЭС клеток и фибробластов нами установлено, что через 4 ч после проведения слияния 22% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (в одном из ядер присутствовал Oct4, а в цитоплазме – коллаген I типа), 57% гетерокарионов обладали фибробласто-подобным фенотипом (не содержали Oct4 ни в одном из ядер, тогда как их цитоплазма была позитивна по коллагену I типа). Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов (57% и 78% соответственно) обладало «промежуточным» фенотипом (в них не обнаруживался ни Oct4, ни коллаген I типа; рис. 3А). Первые колонии гибридных клеток, состоящие из 2-х клеток, мы обнаруживали через 21 ч после слияния, 77% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом, 20% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом и клетки 3% колоний были негативны по обоим маркерам. Через 45 ч и 69 ч после слияния колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом (47% и 42% соответственно), наряду с колониями клеток, имеющих крупную цитоплазму и негативных по обоим маркерам (32% и 41%), составляли основную часть популяции гибридных клеток, тогда как колоний клеток с фибробласто-подобным фенотипом было меньшинство (10 и 7% через 45 ч и 69 ч после слияния соответственно; рис. 3Б).

Используемый нами набор первых антител позволял проводить одновременно иммунофлюоресцентный анализ Nanog и коллагена I типа. Через 4 ч после слияния 87% гетерокарионов имели фибробласто-подобный фенотип (Nanog отсутствовал в обоих ядрах, а цитоплазма была позитивна по коллагену I типа). Сходная ситуация сохранялась через 8 ч и 21 ч после проведения гибридизации. Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов (64% и 79% соответственно) обладали «промежуточным» фенотипом (большой цитоплазмой и были негативны как по Nanog, так и коллагену I типа; рис. 3В).

Через 21 ч после слияния 81% колоний гибридных клеток состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом, 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом. Через 45 ч после гибридизации в популяции присутствовали примерно в равном соотношении колонии, состоящие из гибридных клеток с ЭС-подобным (36%), фибробласто-подобным (28%) и «промежуточным» фенотипом(30%), а именно: клетки с большой цитоплазмой, в которых не было и Nanog и коллагена I типа. Через 69 ч после слияния колонии, клетки которых обладали фибробласто-подобным фенотипом, встречались лишь в 6% случаев, тогда как возрастало число колоний, клетки которых имели ЭС-подобный фенотип (52%), а число колоний, клетки которых имели «промежуточный» фенотип, существенно не менялось (35%; рис. 3Г).

Ламин А/С является маркером дифференцированных клеток, его экспрессия полностью отсутствует в ЭС клетках (Constantinescu et al., 2006) и в гибридных клетках между ЭС клетками и спленоцитами (Battulin et al., 2009).

Через 4 ч после слияния 88% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в оболочке одного из ядер присутствовал ламин А/С) и 9% гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (клетки имели большую цитоплазму, а оболочки обоих ядер не содержали ламин А/С).

Рис. 1. Секвенограммы фрагмента гена третьей субъединицы цитохромоксидазы ЭС клетки, линии E14Tg2aSc4TP6.3 полученной из бластоцисты мыши линии 129/Ola (А), фибробласта, полученного из эмбриона мыши линии DD/c (Б) и образца, содержащего гибридную клетку (В).

Рис. 2. Морфология гетерокарионов и гибридных клеток через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами (время указано над изображениями). Стрелками указаны флуоросферы. Ядра окрашены DAPI. А и В – гетерокарионы с фибробласто-подобной морфологией; Б – гетерокарион с ЭС-подобной морфологией; Г и Е – гибридные клетки с фибробласто-подобной морфологией; Д – колония ЭС-подобных гибридных клеток.

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным Oct4 «+» для одного ядра, коллаген «+». фенотипом: маленькая цитоплазма, Oct4 «+», Гетерокарины с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, Oct4 «+» для обоих фибробласто-подобным фенотипом: большая Гетерокарионы с фибробласто-подобным Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, Oct4 «-» для "промежуточным" фенотипом: большая обоих ядер, коллаген «+». цитоплазма, Oct4 «-», коллаген «-».

Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления гибридных клеток с Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным Nanog «+» для одного ядра, коллаген «+». фенотипом: маленькая цитоплазма, Nanog Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, Nanog «+» для обоих фибробласто-подобным фенотипом: большая Гетерокарионы с фибробласто-подобным Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, Nanog «-» "промежуточным" фенотипом: большая для обоих ядер, коллаген «+». цитоплазма, Nanog «-», коллаген «-».

Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления гибридных клеток с Рис. 3. Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания: Oct4 и коллагена I типа в гетерокарионах (А) и гибридных клетках (Б), Nanog и коллагена I типа в гетерокарионах (В) и гибридных клетках (Г) через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным ламин A/C «+» для одного ядра. фенотипом: маленькая цитоплазма, ламин A/C Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, ламин A/C «-» для фибробласто-подобным фенотипом: большая Гетерокарионы с фибробласто-подобным Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, ламин A/C "промежуточным" фенотипом.

«+» для обоих ядер.

Гетерокарионы с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, ламин A/C «-» для обоих ядер.

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным фибронектин присутствует в цитоплазме. фенотипом: маленькая цитоплазма, Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, фибронектин фибробласто-подобным фенотипом: большая Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления гибридных клеток с фенотипом: большая цитоплазма, "промежуточным" фенотипом: большая фибронектин отсутствует. цитоплазма, фибронектин отсутствует.

Рис. 4. Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания: ламина А/С в гетерокарионах (А) и гибридных клетках (Б), фибронектина в гетерокарионах (В) и гибридных клетках (Г) через разное время после слияния ЭС клеток с фибробластами.

Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.

Через 21 ч после слияния 48% гетерокарионов обладали фибробласто-подобным фенотипом (большой объем цитоплазмы и ламин А/С присутствует в оболочках обоих ядер), тогда как гетерокарионы с «ожидаемым» фенотипом и «промежуточным» фенотипом встречались редко (26% и 13% соответственно;

рис. 4А). Через 21 ч после слияния 85% колоний гибридных клеток состояли из клеток, обладающих фибробласто-подобным фенотипом, 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом (клетки с маленькой цитоплазмой и без ламина А/С в оболочке ядра). Через 45 ч после слияния колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом и фибробласто-подобным фенотипом составляли большую часть популяции гибридных клеток (38% и 55% соответственно), а клетки с «промежуточным» фенотипом встречались лишь в 7% колоний (рис. 4Б).

Фибронектин, так же как и коллаген I типа, является маркером фибробластов. Через 4 ч после слияния 89% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в цитоплазме гетерокарионов присутствовал фибронектин). Через 21 ч после слияния данный тип гетерокарионов сохранял доминирующую позицию, но несколько увеличивалось число клеток с ЭС-подобным фенотипом (17%, гетерокарионы с маленькой цитоплазмой без фибронектина) и «промежуточным» фенотипом (12%, гетерокарионы с большой вытянутой цитоплазмой, в которых отсутствовал фибронектин). Через 45 ч и 69 ч после слияния большинство гетерокарионов имели «промежуточный»

фенотип (79% и 51%, соответственно), оставшуюся часть популяции гетерокарионов составляли клетки с «ожидаемым» фенотипом (рис. 4В). Через 21 ч после слияния 58% колоний состояли из клеток с «промежуточным»

фенотипом, и 38% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом. Через 69 ч после проведения гибридизации колонии клеток с ЭС-подобным фенотипом (24%), фибробласто-подобным фенотипом (33%) и «промежуточным» фенотипом (43%) были представлены в примерно равных соотношениях в популяции гибридных клеток (рис. 4Г).

Суммируя полученные данные иммунофлюоресцентных анализов экспрессии белков, маркирующих родительские типы клеток, можно сделать следующие заключения: через 4 часа после слияния ЭС клеток и фибробластов маркеры родительских клеток (Oct4/Nanog для ЭС клеток; коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С для фибробластов) одновременно выявляются в небольшом числе гетерокарионов. Среди первых гибридных клеток, появляющихся через 21 ч после слияния, мы обнаружили альтернативные фенотипы сходные либо с ЭС клетками, либо фибробластами, и промежуточные фенотипы по набору маркеров не сходные ни с одним из родительских типов клеток. После образования первых гибридных клеток во всех клетках с ЭС-подобной морфологией происходила экспрессия Oct4 и Nanog и отсутствовали коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С. Такие гибридные клетки формировали колонии, состоящие из плотно прилегающих друг к другу клеток. В отличие от клеток с ЭС-подобной морфологией, среди гибридных клеток с фибробласто-подобной морфологией встречались промежуточные фенотипы.

Анализ профилей метилирования ДНК 5’-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках, фибробластах и клетках гибридного клона Показав наличие экспрессии гена Oct4 в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией и ее отсутствие в гибридных клетках с фибробласто-подобной морфологией, мы направили свое внимание на исследование эпигенетических механизмов регуляции гена Oct4 в гибридных клетках, а именно метилирования его 5’-регуляторной области. Используя метод бисульфитного секвенирования, мы подтвердили, что 5’-регуляторная область гена Oct4 неметилирована в ЭС клетках Mus musculus (1+1%;

проанализированных CpG дуплетов были метилированы), но геперметилирована в фибробластах Mus caroli (42+5%; рис. 5), в которых отсутствует его экспрессия.

Рис. 5. Профили метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в ЭС клетках, фибробластах и гибридных клетках. Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. В скобках указан процент метилированных сайтов + стандартная ошибка.

Поскольку последовательность 5’-регуляторной области гена Oct4 у M. musculus и M. caroli имеет различия, метод бисульфитного секвенирования позволяет отдельно исследовать метилирование аллелей родительских видов в гибридных клетках. Анализ клеток высоко плюрипотентного клона гибридных клеток (любезно предоставленного Васильковой А.А.), полученных при слиянии ЭС клеток M. musculus и фибробластов M. caroli, показал, что оба родительских эпиаллеля Oct4 были деметилированы (рис. 5). Эти результаты согласуются с полученными ранее данными по метилированию 5’-регуляторной области Oct4 в межвидовых гибридных клетках типа M. musculus ЭС клетка-спленоцит M. caroli (Battulin et al., 2009).

Рис. 6. Профили метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 в гибридных клетках через 48, 96 часов и 8 дней после слияния (А, Б и В соответственно). Белыми кружками обозначены неметилированные сайты, черными – метилированные. В скобках указан процент метилированных сайтов + стандартная ошибка.

Анализ профилей метилирования ДНК 5’-регуляторной области Oct4 в гибридных клетках через 48 ч, 96 ч и 8 дней после слияния Анализ профилей метилирования 5’-регуляторной области гена Oct4 на ранних этапах формирования гибридных клеток проводили отдельно для клеток с ЭС-подобной морфологией и фибробласто-пододобной морфологией. Через 48 ч после слияния в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией эпиаллель гена Oct4 ЭС клетки был неметилирован (1+1%, проанализированных CpG дуплетов были метилированы), эпиаллель гена Oct4 фибробласта был заметно гипометилирован (27+4%), по сравнению с уровнем метилирования 5’-регуляторной области Oct4 в исходных фибробластах, но оставался выше, чем в ЭС клетках (рис. 6А). Через 96 ч после слияния в гибридных клетках с ЭС-подобной морфологией уровень метилирования обоих эпиаллелей Oct4 был сопоставим с таковым в ЭС клетках (1+1% для эпиаллеля M. musculus и 7+2% для эпиаллеля M. caroli; рис. 6Б).

В гибридных клетках с фибробласто-подобной морфологией через 48 ч после слияния степень метилирования обоих эпиаллелей была сходной с таковой в родительских клетках: 2+1% для эпиаллеля Oct4 M. musculus и 53+5% – для эпиаллеля Oct4 M. caroli (рис. 6А). Через 96 ч и 8 дней после слияния в таких гибридных клетках метилирование обоих эпиаллелей Oct4 было на уровне, характерном для фибробластов (рис. 6Б, В).

Таким образом, метилирование-деметилирование 5’-регуляторной области гена Oct4, как один из механизмов «закрепления» результатов репрограммирования этого гена в гибридных клетках, реализуется в течение 4-х дней после слияния.

Состояние неактивной Х-хромосомы в гетерокарионах и гибридных Наличие двух активных Х-хромосом (для клеток мыши с кариотипом: 2N = 40,ХХ) является одним из признаков плюрипотентного состояния клеток.

После слияния ЭС клеток (с кариотипом: 2N = 40,ХY) и соматических клеток (2N = 40,ХХ) в гибридных клетках происходит реактивация неактивной Х-хромосомы, что является одним из признаков репрограммирования генома соматической клетки (Matveeva et al., 1998; Tada et al., 2001; Do et al., 2007; Do et al., 2008).

Триметилирование гистона Н3 по лизину в 27 положении (H3K27me3) иммунофлуоресцентного анализа клеток с кариотипом 2N = 40,ХХ с использованием антител против H3K27me3 в ядрах обнаруживают интенсивно окрашенные тельца, соответствующие неактивной Х-хромосоме (Maherali et al., 2007; Silva et al., 2008). Иммунофлюоресцентный анализ H3K27me3, проведенный нами на культуре фибробластов (2N = 40,ХХ), показал, что в интерфазных ядрах 85% клеток мы наблюдали сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме, такого сигнала не было выявлено в ядрах ЭС клеток с кариотипом 2N = 40,ХY (рис. 7А).

Гетерокарионы с "ожидаемым" фенотипом: Колонии гибридных клеток с ЭС-подобным в одном из ядер есть один сигнал, фенотипом: маленькая цитоплазма, нет ни соответствующий неактивной Ххромосоме Гетерокарионы с ЭС-подобным фенотипом: Скопления гибридных клеток с маленькая цитоплазма, нет ни одного сигнала, фибробласто-подобным фенотипом: большая соответствующего неактивной Ххромосоме Гетерокарионы с "промежуточным" Скопления клеток с "промежуточным" фенотипом: большая цитоплазма, нет ни фенотипом большая цитоплазма, нет ни одного сигнала, соответствующего одного сигнала, соответствующего Рис. 7. А – Иммунофлюоресцентное окрашивание H3K27me3 в ЭС клетках с кариотипом: 2N = 40,ХY (слева) и фибробластах 2N = 40,ХХ (справа). Стрелками указан сигнал, соответствующий неактивной Х-хромосоме. Антитела против иммуноглобулинов мечены флуорохромом Alexa Fluor 546, ядра окрашены DAPI.

Б и В – Анализ данных иммунофлюоресцентного окрашивания H3K27me3 в гетерокарионах и гибридных клетках, соответственно, через разное время после слияния ЭС клеток 2N = 40,ХY и фибробластов 2N = 40,ХХ. Доверительные интервалы построены для вероятности р = 0,95.

Мы провели иммунофлюоресцентный анализ гетерокарионов и гибридных клеток, полученных в результате трех независимых гибридизаций ЭС клеток (2N = 40,ХY) и фибробластов (2N = 40,ХХ). Через 4 ч после проведения гибридизации 79% гетерокарионов обладали «ожидаемым» фенотипом (то есть в одном из ядер присутствовало одно интенсивно окрашенное тельце), и 18% гетерокарионов имели «промежуточный» фенотип (клетки с крупной многоотростчатой цитоплазмой, а в ядрах нет ни одного сигнала H3K27me3).

Сходная ситуация сохранялась и через 8 ч после слияния. Через 21 ч после проведения гибридизации доля гетерокарионов с «промежуточным» фенотипом возрастала до 30% и продолжала расти. Через 45 ч и 69 ч после слияния гетерокарионы с «ожидаемым» фенотипом и «промежуточным» фенотипом присутствовали в приблизительно равных соотношениях (рис. 7Б). Через 21 ч после слияния клетки 49% колоний имели «промежуточный» фенотип (крупную многоотростчатую цитоплазму, а в ядрах нет ни одного ярко окрашенного тельца), 15% колоний состояли из клеток с ЭС-подобным фенотипом, а оставшиеся колонии состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом.

Через 45 ч и 69 ч после слияния колонии, состоящие из клеток с ЭС-подобным и «промежуточным» фенотипами, составляли в примерно равном соотношении большинство колоний гибридных клеток, тогда как лишь 20% колоний состояли из клеток с фибробласто-подобным фенотипом (рис. 7В).

Подводя итог проделанной работе, основываясь на результатах трех независимы анализов (анализе экспрессии генов, метилирования ДНК и активации Х-хромосомы) можно говорить, что репрограммирование генома соматической клетки начинается на стадии гетерокариона. Мы наблюдали не доминирование генома менее дифференцированной клетки (в нашем случае ЭС клетки) в составе гибридной клетки, а альтернативное проявление геномов родительских клеток, в виде гетерогенности популяции гетерокарионов и гибридных клеток, среди которых были как ЭС-подобные клетки, так и фибробласто-подобные клетки. Существование гибридных клеток с двумя контрастными морфологиями не является следствием изменения соотношения родительских геномов, однако механизм формирования альтернативных фенотипов не ясен и требует дальнейшего изучения.

ВЫВОДЫ

Модифицирован метод идентификации гетерокарионов и гибридных клеток в первые часы после слияния ЭС клеток и фибробластов, основанный на использовании флуоресцентных маркеров, дискриминирующих родительские типы клеток. Показано, что надежность такой идентификации составляет не менее 90%. Впервые установлено, что через 21 ч после слияния выявляются два морфологически различных типа гибридных клеток: один, имеющий сходство с ЭС клетками, другой – с фибробластами.

Показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, есть экспрессия Oct4 и Nanog – генов, характерных для плюрипотентных клеток, но отсутствуют коллаген I типа, фибронектин и ламин А/С, маркеры, типичные для фибробластов. Сигнал, выявляемый антителами к Н3К27me3, маркирующий неактивную Х-хромосому, не обнаружен в гибридных клетках такого типа.

Установлено, что в течение 96 ч после слияния ЭС клеток M. musculus и фибробластов M. caroli в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с ЭС клетками, происходит деметилирование ДНК 5’-регуляторной области эпиаллеля фибробласта гена Oct4, до уровня характерного для этого района в ЭС клетках.

Впервые показано, что через 21 ч после слияния ЭС клеток и фибробластов в гибридных клетках морфологически сходных с фибробластами отсутствуют Oct4 и Nanog. Для части гибридных клеток такого морфологического типа показана экспрессия коллагена I типа, фибронектина и ламина А/С, а также выявлен сигнал, маркирующий неактивную Х-хромосому.

В течение 96 ч после слияния в гибридных клетках, имеющих морфологическое сходство с фибробластами, происходит метилирование ДНК 5’-регуляторной области эпиаллеля ЭС клеток гена Oct4 до уровня характерного для этого района Oct4 фибробластов.

Впервые показано, что для гибридных клеток, полученных при слиянии диплоидных ЭС клеток и диплоидных фибробластов, наблюдается альтернативное проявление родительских геномов и формируются контрастные типы гибридных клеток: в одном из которых, доминирует геном, привнесенный ЭС клетками, другом – доминирует геном фибробласта.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Гибридные клетки, полученные слиянием эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами, имеют альтернативные родительские фенотипы // Докл. Акад. Наук.

2008. Т. 422. №1. С. 125-127. (Перечень ВАК) 2. Kruglova A.A., Kizilova E.A., Zhelezova A.I., Gridina M.M., Golubitsa A.N., Serov O.L. Embryonic stem cell-fibroblast hybrid cells with near-tetraploid karyotype provide high yield of chimeras // Cell Tissue Res. 2008. V. 334. P. 371-380. (Перечень ВАК) 3. Kruglova A.A., Matveeva N.M., Gridina M.M., Battulin N.R., Karpov A.V., Kiseleva E.V., Morozova K.N., Serov O.L. Dominance of parental genomes in embryonic stem cell/fibroblast hybrid cells depends on the ploidy of the somatic partner // Cell Tissue Res. 2010. DOI:10.1007/s00441-010-0987-3. (Перечень ВАК) Матвеева Н.М., Круглова А.А., Гридина М.М., Кизилова Е.А., Баттулин Н.Р., Пузаков М.В., Серов О.Л. Доминантность и рецессивность родительских геномов в гибридных клетках, полученных слиянием диплоидных эмбриональных стволовых клеток с ди- и тетраплоидными фибробластами // 3rd International Conference Basic Science for Medicine. Новосибирск. 2007. С. 66.

Круглова А.А., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Влияние плоидности соматического партнера на фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии с эмбриональными столовыми клетками // Тезисы международной научной конференции молодых ученых “Проблемы молекулярной и клеточной биологии”. Томск. 10-12 мая.

2007. С. 106-107.

Кизилова Е.А., Круглова А.А., Голубица А.Н., Железова А.И., Гридина М.М., Матвеева Н.М., Серов О.Л. Анализ химеризма генерированного инъекцией в бластоцель гибридных клеток, полученных слиянием эмбриональных стволовых клеток с фибробластами // Симпозиум с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза». Москва. 9-11 октября 2007. С. 74-76.

7. Kruglova A.A., Gridina M.M., Matveeva N.M., Serov O.L. Phenotype and chromosome segregation in hybrid cells generated by fusion embryonic stem cells and tetraploid fibroblasts // IV International Meetings Stem Cells Network North RhineWestphalia. Dsseldorf. Germany. 8-9 October. J. Regenerative Medicine. Nov. 2007. Vol.2.

No. 6. Р.S8.

Круглова А.А., Гридина М.М., Мензоров А.Г., Матвеева Н.М., Серов О.Л.

Фенотип гибридных клеток, полученных при слиянии эмбриональных стволовых клеток и тетраплоидных фибробластов // Цитология. Тезисы докладов. СанктПетербург. 16-19 октября 2007. Т. 49, № 9. С. 762.

9. Gridina M.M., Kruglova A.A., Matveeva N.M., Serov O.L. Alternative dominance of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // Abstracts of papers presented at the LXXIII Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. Control and regulation of stem cell. Cold Spring Harbor, USA. 28 May - 2 June. 2008. P. 10. Gridina M.M., Kruglova A.A., Kizilova E.A., Matveeva N.M., Serov O.L.

Alternative expression of parental genomes in embryonic stem cell-fibroblast cell hybrids // BIT Life Sciences 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine and Stem Cells.

Foshan, China, December 2-4, 2008, P. 105.

Круглова А.А., Матвеева Н.М., Кизилова Е.А., Гридина М.М., Баттулин Н.Р., 11.

Пристяжнюк И.Е., Серов О.Л.. Сходство ранних стадий перепрограммирования фибробластов после их слияния с эмбриональными стволовыми клетками и при индукции в них плюрипотентности путем транзиторной трансфекции векторами экспрессирующими OCT4/SOX2 // V Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. Москва. 21-27 июня 2009. Т. 1. С. 131.

12. Gridina M.M., Serov O.L. Reprogramming of parental genomes in Embryonic stem cell – fibroblast heterokaryons and synkaryons //

Abstract

book of the 5th Royan international on stem cells biology and technology. Tehran. Iran. 23 – 25 September 2009. P.96.

Серов О.Л., Круглова А.А., Матвеева Н.М., Гридина М.М., Кизилова Е.А., 13.

Баттулин Н.Р. Ранние стадии перепрограммирования фибробластов в гетеро- и синкарионах и при индукции в них плюрипотентности с помощью трансфекции векторами экспрессирующими Oct4/Sox2 и Nanog/Lin28 // Тезисы докладов и сообщений, представленных на Всероссийский симпозиум по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (СанктПетербург, 12-14 октября 2009 г.) Цитология, 2009, Т.51, №9. С. 785.



 
Похожие работы:

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«СУСЛОВА Мария Юрьевна РАСПРОСТРАНЕНИЕ И РАЗНООБРАЗИЕ СПОРООБРАЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ 03.00.16 – экология 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ, 2007 Работа выполнена в лаборатории водной микробиологии Лимнологического института СО РАН, г. Иркутск Научный кандидат биологических наук руководитель: ст.н.с. Парфенова Валентина Владимировна Официальные Доктор биологических наук...»

«МОГИЛЕНКО Денис Александрович РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА АПОЛИПОПРОТЕИНА A-I ЧЕЛОВЕКА ПРИ ДЕЙСТВИИ ФАКТОРА НЕКРОЗА ОПУХОЛИ АЛЬФА 03.01.04 – Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург 2010 г. Работа выполнена в Отделе биохимии Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины СевероЗападного отделения РАМН, Санкт-Петербург Научный руководитель : доктор...»

«МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ 03.00.24-микология 03.00.04-биохимия АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2008 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии...»

«СОЛОВЬЕВА ИРИНА ВЛАДЛЕНОВНА МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОРРЕКЦИИ ДИСБИОЗНОЙ МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА 03.02.08 – экология (биология) 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Нижний Новгород 2013 2 Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и...»

«Сорокин Иван Дмитриевич Диазотрофы содовых солончаков Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2008 2 Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук И.К. Кравченко Официальные оппоненты : доктор биологических наук Т.Н. Жилина доктор биологических наук А.Л. Степанов Ведущая организация : Институт биохимии и физиологии...»

«Чирков Сергей Николаевич Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений 03.00.06 – Вирусология 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН. Научный консультант : доктор...»

«Герасимчук Анна Леонидовна СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ В ЭКОСИСТЕМАХ С ЭКСТРЕМАЛЬНЫМИ ЗНАЧЕНИЯМИ рН 03.00.07 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2009 Работа выполнена в Томском государственном университете Научный руководитель : доктор биологических наук, профессор Карначук О. В. Официальные оппоненты : доктор биологических наук, зав. лабораторией Бонч-Осмоловская Е. А. доктор биологических наук, профессор...»

«Зотов Александр Александрович ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДОЛГОНОСИКОВ ПОДСЕМЕЙСТВА LIXINAE (COLEOPTERA, CURCULIONIDAE): ЭКОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в отделе аридной экологии ФГБУН Институт аридных зон Южного научного Центра РАН доктор биологических наук, Научный руководитель : Арзанов Юрий Генрихович Замотайлов Александр...»

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И....»

«Харитонцев Борис Степанович Флорогенез и фитоценогенез на юге Западной Сибири Специальность: 03.00.05 – БОТАНИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2009 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской академии наук Научный консультант – академик РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Горчаковский Павел Леонидович Официальные оппоненты : доктор...»

«КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна ИНДУКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PODOSPORA ANSERINA (RABENH.) NIESSL В ПРОЦЕССЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОГО ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Специальность 03.02.12 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного...»

«Бутина Наталья Александровна ИЛЬМОВНИКИ ВОСТОЧНОГО ЗАБАЙКАЛЬЯ: АНАЛИЗ ФЛОРИСТИЧЕСКОГО И ФИТОЦЕНОТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ, БИОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ВИДОВ РОДА ULMUS. L. 03.00.05 – ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ-2009 3 Работа выполнена в Забайкальском государственном гуманитарнопедагогическом университете им. Н.Г. Чернышевского доктор биологических наук Научный руководитель : Ольга Александровна Попова...»

«Осипов Денис Иванович Характеристика количественного развития и видового разнообразия зоопланктонных сообществ водоёмов с разным уровнем радиоактивного загрязнения Специальность 03.01.01 Радиобиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 2 Работа выполнена в экспериментальном отделе Уральского научно-практического центра радиационной...»

«Лихачева Ольга Викторовна ЛИШАЙНИКИ УСАДЕБНЫХ ПАРКОВ ПСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Псков, 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре альгологии и микологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на кафедре ботаники и экологии растений...»

«Шелковникова Татьяна Александровна Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории нейрохимии физиологически активных веществ и в лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Учреждения Российской академии наук Института...»

«САМСОНОВА ИРИНА ДМИТРИЕВНА МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ СТЕПНОГО ПРИДОНЬЯ Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2014 1 Работа выполнена на кафедре мелиораций земель в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новочеркасская государственная мелиоративная академия Научный консультант : Добрынин Николай Дмитриевич, доктор...»

«Урусов Александр Евгеньевич РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СИСТЕМ ЭКСПРЕССНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Москва 2012 Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук Научные руководители: доктор химических наук, профессор...»

«Заводовский Петр Геннадьевич АФИЛЛОФОРОИДНЫЕ ГРИБЫ В ЛЕСНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ВОДЛОЗЕРЬЯ 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Работа выполнена на кафедре зоологии и экологии эколого-биологического факультета Петрозаводского государственного университета Научный руководитель : член-корр. РАН, доктор биологических наук,...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.