WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

На правах рукописи

Урусов Александр Евгеньевич

РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

СИСТЕМ ЭКСПРЕССНОГО ИММУНОХИМИЧЕСКОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИКОТОКСИНОВ

специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2012

Работа выполнена в лаборатории иммунобиохимии Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Дзантиев Борис Борисович кандидат биологических наук Жердев Анатолий Виталиевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Ярополов Александр Иванович доктор химических наук, профессор Сахаров Иван Юрьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук

Защита состоится 29 марта 2012 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.247.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н.Баха Российской академии наук по адресу:

119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, стр. 1.

Автореферат разослан « 28 » февраля 2012 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Микотоксины – низкомолекулярные вторичные метаболиты плесневых грибов, которые обладают высокой токсичностью и при попадании в продукты питания и корма могут причинять значительный вред здоровью человека и сельскохозяйственных животных. Мониторинг содержания микотоксинов на всех стадиях производства, транспортировки и хранения является необходимой и сложной задачей. Традиционные физикохимические методы анализа, хотя и обеспечивают высокую чувствительность, сопряжены с использованием дорогого стационарного оборудования и длительными процедурами пробоподготовки. В связи с этим крайне актуально создание иммунохимических методов определения микотоксинов, сочетающих экспрессность, низкую стоимость и простоту применения. Однако, так как допустимый уровень содержания этих соединений в пищевых продуктах крайне низок, известные иммунохимические методы их определения не всегда удовлетворяют практическим требованиям.





В связи с этим данное исследование направлено на разработку новых подходов с использованием конъюгатов антител и наночастиц коллоидного золота для создания двух высокочувствительных и экспрессных систем определения микотоксинов – иммунохроматографического анализа и иммуносенсорного анализа на основе эффекта поверхностного плазмонного резонанса.

Несмотря на широкое применение конъюгатов антител с коллоидным золотом в аналитических целях, вопросы, связанные с влиянием состава конъюгатов и реакционной способности антител в них на характеристики иммуноаналитических систем, остаются малоизученными. Проведенное в работе исследование этих взаимосвязей позволяет направленно оптимизировать тест-системы с применением коллоидного золота и расширить возможности их использования для детектирования как микотоксинов, так и других биологически активных соединений.

Используемые сокращения: антиАТ – антивидовые антитела, АФВ1 – афлатоксин В1, БСА – бычий сывороточный альбумин, ИФА – иммуноферментный анализ, ИХА – иммунохроматографический анализ, КЗ – коллоидное золото, опт.ед. – оптическая единица, ОТА – охратоксин А, отн.ед. – относительная единица, ППР – поверхностный плазмонный резонанс, ФБС – 50 мМ K-фосфатный буфер, рН 7,4, содержащий 0,1 М NaCl, ФБСТ – ФБС, содержащий 0,05% детергента Тритон Х-100, HEPES-В – 10 мM HEPES буфер, pH 7,4, содержащий 0,15 M NaCl и 0,005% детергента Твин-20, OD – оптическая плотность, RU – резонансная единица.

Цель и задачи работы. Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействий нативных и иммобилизованных на коллоидном золоте антител с микотоксинами для разработки универсальных подходов, позволяющих снизить пределы обнаружения иммуноаналитических систем.

Достижение поставленной цели включало решение следующих задач:

• изучить взаимосвязь между составом и свойствами конъюгатов антител с коллоидным золотом;

• разработать и охарактеризовать методы усиления сигнала в проточных аналитических системах;

• провести сравнительную оценку пределов обнаружения микотоксинов в различных форматах иммуноанализа;

• апробировать разработанные тест-системы для анализа растительных проб, содержащих микотоксины.

Научная новизна. Проведено изучение и сопоставление реакционной способности свободных и конъюгированных с коллоидным золотом антител.

Получены сравнительные характеристики пределов обнаружения иммуносенсорного анализа при использовании свободных антител и разных способов введения наночастиц коллоидного золота в качестве маркера иммунных комплексов.





Предложена схема усиления регистрируемого сигнала и снижения предела обнаружения в иммунохроматографическом анализе, основанная на использовании конъюгата антивидовых антител с коллоидным золотом.

Практическая значимость работы. Достигнуто десятикратное снижение пределов обнаружения микотоксинов в иммунохроматографическом и иммуносенсорном анализе благодаря применению немеченых специфических антител в сочетании с конъюгатом антивидовые антитела – коллоидное золото.

Показано, что данная комплектация тест-систем позволяет существенно уменьшить расход дорогостоящих специфических антител.

Разработаны методы высокочувствительного и экспрессного определения охратоксина А и афлатоксина В1 на основе иммунохроматографии и иммуносенсорного анализа с регистрацией поверхностного плазмонного резонанса.

Связь работы с государственными программами. Работа поддержана ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы» и «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на следующих научных мероприятиях: V и VI международные конгрессы «Биотехнология: Состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011), международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва – Пущино, 2009), конференция «Экотоксикология–2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии»

(Тула – Пущино, 2009), IV международный симпозиум «Recent advances in food analysis» (Прага, Чехия, 2009), междисциплинарный микологический форум (Москва, 2010), международная конференция «Mycotoxin reduction – Global solutions» (Кейптаун, ЮАР, 2011), VIII всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика–2011» (Архангельск, 2011), международная конференция «Strategies to reduce the impact of mycotoxins in Latin America in a global context» (Мендоза, Аргентина, 2011).

Решением Ученого Совета Института биохимии им. А.Н. Баха РАН в 2009 г. соискатель удостоен стипендии имени чл.-корр. РАН В.Л. Кретовича.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, публикация в которых рекомендуется ВАК, и 10 тезисов в материалах отечественных и международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (4 главы) и списка литературы (255 наименований). Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, содержит рисунок и 14 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Моноклональные антитела против охратоксина А (ОТА) получены во Всероссийском научном центре молекулярной диагностики и лечения, против афлатоксина В1 (АФВ1) – в ООО «Тест-Пущино» (Россия). Поликлональные антитела козы против иммуноглобулинов мыши (антивидовые антитела, антиАТ) производства «Arista Biologicals» (США). Меченные пероксидазной меткой поликлональные антитела против иммуноглобулинов мыши производства НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН. Конъюгаты ОТА–БСА, АФВ1–пероксидаза, растительные экстракты с нулевым содержанием микотоксинов получены в ООО «Тест-Пущино». Конъюгаты АФВ1– БСА и стрептавидин–полипероксидаза производства «Sigma–Aldrich» (США).

Для изготовления иммунохроматографических тест-систем использовали мембраны производства «Advanced Microdevices» (Индия) и «Millipore» (США).

Проведение иммуноферментного анализа (ИФА). В лунках микропланшета в 50 мМ K-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,1 М NaCl (ФБС), иммобилизовали конъюгат микотоксин–белок. После отмывки вносили пробы – разведения ОТА, АФB1 в ФБСТ (ФБС, содержащем 0,05% детергента Тритон Х-100) или смеси растительных экстрактов с ФБСТ (с конечным 25%-ным содержанием метанола), а затем добавляли нативные или биотинилированные антитела против соответствующего микотоксина. После инкубации и отмывки в лунки вносили раствор конъюгата антивидовые антитела– пероксидаза или стрептавидин–полипероксидаза. По завершении инкубации микропланшет отмывали, вносили раствор субстрата (3,3',5,5'тетраметилбензидин + Н2О2) и проводили детекцию оптической плотности (OD450) с использованием микропланшетного фотометра Zenyth 3100 («Anthos Labtec Instruments», Австрия). Полученные зависимости OD450 от концентрации микотоксина в пробе аппроксимировали четырехпараметрической сигмоидной функцией, используя программу «Origin» 7.5 («OriginLab», США).

Получение коллоидного золота (КЗ) проводили по методу Френса (Frens, 1973), для чего 0,01% водный раствор HAuCl4 нагревали до кипения, а затем при активном перемешивании добавляли цитрат натрия до концентрации 0,015%. Смесь кипятили в течение 15 мин, затем охлаждали и хранили при 4–6 °С.

Получение флоккуляционной кривой. Готовили ряд разведений антител с концентрациями в диапазоне от 880 до 0,44 мкг/мл. По 20 мкл этих растворов добавляли в лунки микропланшета к 200 мкл раствора КЗ (OD520=1).

После инкубации в течение 10 мин при комнатной температуре в каждую лунку вносили по 20 мкл 10%-ного раствора NaCl, через 10 мин измеряли OD и строили ее зависимость от концентрации антител.

Иммобилизация антител на КЗ. Раствор КЗ (OD520=1) доводили карбонатом калия до pH 8,5, после чего последовательно добавляли растворы антител и БСА в 10 мМ трис-буфере, pH 8,5. После инкубации в течение 15 мин проводили очистку полученного конъюгата от неадсорбировавшихся антител трехкратным центрифугированием при 15.000 g в течение 20 мин.

Определение количества антител, иммобилизованных на КЗ. Препараты надосадочной жидкости, полученные после каждого осаждения конъюгатов (см. «Иммобилизация антител на КЗ»), и свободные антитела в известной концентрации вносили в лунки микропланшета с предварительно иммобилизованным конъюгатом микотоксин–белок. После инкубации и отмывки добавляли антивидовые антитела, меченные пероксидазой. По оптической плотности продукта реакции связавшегося фермента строили градуировочную зависимость для свободных антител, проводили расчет для препаратов надосадочной жидкости и, исходя из материального баланса, определяли количество антител, иммобилизованных на КЗ.

Иммуноанализ с использованием проточной сенсорной системы Biacore X («Biacore AB», Швеция). Конъюгат ОТА–БСА ковалентно иммобилизовали на поверхности чипа СМ5, после чего для реализации трех схем иммуноанализа в ячейку вводили: 1) смесь ОТА и свободных специфических антител; 2) смесь ОТА и конъюгированных с КЗ специфических антител; 3) смесь ОТА и свободных специфических антител, а затем конъюгат антивидовых антител с КЗ. Полученную зависимость сигнала прибора в резонансных единицах (RU) от концентрации ОТА аппроксимировали так же, как для ИФА.

Чип регенерировали обработкой 100 мМ глициновым буфером, pH 2,0.

Изготовление иммунохроматографических тест-полосок. На нитроцеллюлозные рабочие мембраны («Advanced Microdevices», Индия;

«Millipore», США), с помощью диспенсера IsoFlow («Imagene Technology», США) наносили конъюгат микотоксина с белком (аналитическая зона) и антивидовые антитела (контрольная зона). Конъюгат специфические антитела–КЗ наносили на стеклянные мембраны («Millipore», США). Мембраны высушивали в течение суток при комнатной температуре и склеивали. Полученные из мембран с нанесенными иммунореагентами и впитывающих мембран поликомпозитные листы нарезали на тест-полоски на резаке Index Cutter- («A-Point Technologies», США) и с добавлением силикагеля хранили при комнатной температуре в герметичных пакетах из ламинированной фольги.

Иммунохроматографический анализ (ИХА) проводили при комнатной температуре. Разведения ОТА или АФВ1 вносили в ФБСТ или в экстракты кукурузы, ореха и ячменя смесью метанол : вода (70% : 30%), разбавленные ФБС (с 0,1% Тритона Х-100) в два раза. В лунку микропланшета добавляли 200 мкл полученного раствора и погружали в нее тест-полоску в вертикальном положении. Через 10 мин тест-полоску извлекали, помещали на горизонтальную поверхность и сканировали (через 5 мин) на сканере Lide 90 («Canon») с разрешением 600 dpi, не используя режимы контрастирования и цветокоррекции. Цифровую обработку изображений осуществляли с помощью программы TotalLab («Nonlinear Dynamics», Великобритания). Полученную зависимость интенсивности окрашивания в аналитической зоне тест-полоски от концентрации микотоксина аппроксимировали так же, как для ИФА.

Проведение ИХА по схеме с усилением регистрируемого сигнала.

Для анализа готовили тест-полоски с иммобилизованным конъюгатом АФВ1– белок в аналитической зоне, но не содержащие конъюгата коллоидного золота и мембраны для его нанесения. В лунке микропланшета смешивали (1:1) растворы специфических антител и АФВ1 в ФБСТ, погружали в нее тест-полоску в вертикальном положении и инкубировали в течение 5 мин. После этого проводили отмывку, пропуская вдоль тест-полоски рабочий буфер (ФБС с добавлением 0,25% Тритона Х-100), а затем на 15 мин погружали тест-полоску в раствор конъюгата антиАТ–КЗ. Проводили повторную отмывку рабочим буфером и сканирование тест-полоски. Обработку результатов анализа выполняли, как описано выше (см. «Иммунохроматографический анализ (ИХА)»).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведение ИФА в равновесном и кинетическом режимах Для тестирования иммунохимических свойств исходных реагентов и получения референсных значений пределов обнаружения был использован метод микропланшетного ИФА. Было проанализировано 20 клонов антител против охратоксина А и афлатоксина В1 и отобраны препараты, дающие минимальные пределы обнаружения.

Установленные характеристики ИФА (см. табл. 1) получены в равновесном режиме, требующем инкубации иммунореагентов в течение не менее чем 60 мин на каждой стадии и общей продолжительности анализа 2,5 часа. Изучение кинетики гетерогенных иммунохимических реакций, применение биотина с мостиковым участком из 14 атомов углерода и конъюгата стрептавидин– полипероксидаза дало возможность сократить продолжительности стадий до 5–10 мин, что позволило реализовать кинетический ИФА АФВ1 и ОТА без ухудшения чувствительности и точности определения (среднеквадратичное отклонение детектируемых концентраций 6–7%).

Так как микотоксины должны контролироваться в экстрактах с высоким содержанием органических растворителей, то данный метод был апробирован в присутствии растительных экстрактов с содержанием метанола 25%.

Результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1. Аналитические характеристики иммуноферментного определения микотоксинов в равновесном и кинетическом режимах Время опре- Предел обна- Время опре- Предел обнаделения, мин ружения, нг/мл деления, мин ружения, нг/мл Полученные результаты свидетельствуют о возможности применения данных схем анализа для определения микотоксинов и о пригодности антител для дальнейшего использования при решении поставленных в работе задач.

Исследование иммунохимических взаимодействий с использованием оптического сенсора Biacore X Среди биосенсорных систем особое место занимают устройства, основанные на эффекте поверхностного плазмонного резонанса (ППР). Иммобилизованный иммунореагент, взаимодействующий с перемещающимися в потоке соединениями, определяет сходство данных биосенсоров с иммунохроматографическими тест-полосками и делает их удобными инструментами для изучения иммунохимических взаимодействий.

Для реализации иммуноанализа в ячейке биосенсорной системы Biacore Х на поверхности чипа был иммобилизован конъюгат ОТА–БСА. Полученный при этом сигнал составил 15.000 резонансных единиц (RU), что соответствует связыванию 15 нг конъюгата на 1 мм2 поверхности чипа и свидетельствует об эффективной иммобилизации конъюгата. Были измерены равновесные константы диссоциации для 10 клонов антител против ОТА, составившие от 1,110-7 до 6,210-8 М. Кинетические константы диссоциации варьировали от 1,310-4 до 6,110-5 с-1.

В оптимальных условиях, установленных с учетом этих данных, было реализовано конкурентное взаимодействие антител со свободным ОТА. Получена зависимость отклика оптического детектора (в единицах RU) от концентрации ОТА (рис. 1).

Рис. 1. Градуировочная кривая иммунохимического определения охратоксина А с использованием системы Biacore X. Здесь и далее пунктирной линией показан уровень сигнала при отсутствии антигена в пробе Предел обнаружения ОТА составил 0,4 нг/мл, что существенно ниже этого параметра как для равновесного, так и для кинетического ИФА (4 и 1 нг/мл соответственно, см. табл. 1) с теми же реагентами. В рабочем диапазоне анализа (1–15 нг/мл) среднеквадратичное отклонение амплитуды сигнала не превышало 7%. Продолжительность одного измерения, включая регенерацию, – 12 мин.

Синтез конъюгатов специфических антител с коллоидным золотом Золотые наночастицы были получены методом Френса и охарактеризованы с использованием просвечивающей электронной микроскопии. Средний диаметр частиц (n=182) составил 27±5 нм, среднее соотношение осей – 1,2±0,2, т.е. форма частиц близка к сферической. С использованием этого препарата КЗ был синтезирован ряд конъюгатов с антителами против охратоксина А и афлатоксина В1, отличавшихся соотношением КЗ–антитело.

Был проведен расчет количества антител, необходимого для формирования монослоя на поверхности золотой частицы. Площадь частицы диаметром 27 нм составляет около 2300 нм2. Площадь, занимаемая одним антителом, в зависимости от конформации и ориентации при сорбции, – от до 120 нм2. Эти данные близки к значениям, измеренным для пленок Ленгмюра-Блоджета, – 80 нм2 (Dubrovsky et al., 1993). Таким образом, для образования монослоя необходимо иммобилизовать от 20 до 50 молекул антител на одной частице КЗ, что соответствует 1.1–2.8 мкг иммуноглобулинов на 1 мл суспензии КЗ (OD520=1).

Характеристика состава и свойств конъюгатов антитела – КЗ Традиционно процесс иммобилизации антител на КЗ характеризуют флоккуляционной кривой, в которой наблюдаемая в присутствии избытка соли агрегация должна отражать наличие поверхности частиц КЗ, не защищенной иммобилизованным белком (Horisberger et al., 1975; Hermanson, 2008). Проведенные эксперименты показали, что для антител против АФВ1 и ОТА выход флоккуляционных кривых на плато происходит при более высоком содержании антител по сравнению с данными расчетов в предыдущем разделе – 7–8 мкг на 1 мл суспензии КЗ (рис. 2).

Оставаясь в рамках интерпретации флоккуляционной кривой как характеристики, отражающей формирование защитного монослоя антител на поверхности коллоидной частицы, в качестве причины полученного результата можно предложить существенно более низкую степень связывания антител с КЗ (вследствие невысокой константы реакции, определяющей обратимость этого процесса).

Рис. 2. Флоккуляционные кривые, полученные при взаимодействии с КЗ антител против ОТА (1) и АФВ1 (2) Для проверки этого предположения была осуществлена экспериментальная оценка количества иммобилизовавшихся на КЗ молекул иммуноглобулинов. Данную величину определяли, исходя из содержания несвязавшихся с коллоидом антител, отделяемых от конъюгата при центрифугировании и количественно измеряемых методом ИФА.

Сорбировано, % Рис. 3. Зависимость процента (А) и количества (Б) сорбировавшихся на КЗ антител от общего количества антител против АФВ1, использованных при синтезе Установлено, что антитела против АФВ1, добавленные в количестве до 10 мкг на 1 мл коллоидной суспензии, сорбируются на КЗ практически полностью (доля несвязавшихся антител – менее 10%). При внесении бльших концентраций антител процент их связывания падает, однако вплоть до соотношения 23 мкг антител на 1 мл коллоидной суспензии количество связавшихся антител продолжает расти, не достигая насыщения. Зависимость степени связывания от количества добавленных антител против АФВ1 представлена на рис. 3. Аналогичные измерения для антител против ОТА показали снижение степени связывания в интервале от 3 мкг до 11 мкг и отсутствие насыщения вплоть до 80 мкг антител на 1 мл КЗ.

Итак, формирование монослоя антител на поверхности частиц КЗ происходит при более низких концентрациях (до 3 мкг/мл), чем могло бы ожидаться, исходя из флоккуляционных кривых (7–8 мкг/мл, см. рис. 2). Использование же бльших количеств антител при синтезе конъюгатов с КЗ должно приводить к формированию полислойных структур сорбированных белковых молекул.

С учетом этого представляется оправданной сравнительная оценка используемых в иммуноанализе конъюгатов антитело–КЗ по реакционной способности и определение взаимосвязи этой характеристики с составом конъюгата.

Характеристика иммунохимических свойств конъюгатов антитело– КЗ, основанная на определении эквивалентного количества свободных антител В качестве меры реакционной способности конъюгата мы рассматривали количество свободных антител, проявляющих те же связывающие свойства при взаимодействии со свободным антигеном, что и конъюгат.

Для экспериментального сравнения свободных антител и конъюгата антитело–КЗ была разработана схема «двойного конкурентного взаимодействия» (рис. 4). В лунки микропланшета с иммобилизованными специфическими антителами вносили раствор микотоксина (АФВ1) и добавляли либо исследуемый конъюгат коллоидного золота, либо свободные антитела (см. рис. 4, Б). Микотоксин связывается с антителами, иммобилизованными на полистироле и находящимися в растворе, в пропорции, отражающей реакционную способность конъюгата или свободных антител. Увеличение содержания антител в растворе или рост их реакционной способности приводит к меньшему связыванию микотоксина на поверхности лунок микропланшета, и наоборот.

После данной инкубации микропланшет отмывали от несвязавшихся компонентов, вносили в лунки конъюгат микотоксина с ферментной меткой (пероксидазой) (см. рис. 4, В) и, после инкубации и отмывки, по оптической плотности продукта каталитической реакции связавшегося фермента регистрировали количество образовавшихся меченых иммунных комплексов (см. рис. 4, Г).

Рис. 4. Схема оценки реакционной способности антител, находящихся на поверхности золотой частицы (А–Г – стадии проведения тестирования; 1 – специфические антитела, 2 – поверхность микропланшета, 3 – антиген, 4 – КЗ, 5 – ферментная метка) Сравнение полученных концентрационных зависимостей для свободных антител и конъюгатов антитело–КЗ позволило охарактеризовать конъюгаты разного состава эквивалентным количеством свободных антител, обладающим такой же реакционной способностью. Полученные значения были сопоставлены с общим количеством иммуноглобулинов в составе конъюгата. Результаты этих расчетов представлены на рис. 5.

Антитела на 1 мл КЗ, молекул Рис. 5. Характеристика реакционной способности антител на поверхности частицы КЗ (А – эквивалентные реакционноспособные антитела как процент от числа иммобилизованных антител, Б – количество эквивалентных реакционноспособных антител на одну частицу КЗ) Следует учитывать, что более низкая реакционная способность иммобилизованных на КЗ антител по сравнению со свободными антителами может в существенной степени быть связана с диффузионными ограничениями при взаимодействии с антигеном на поверхности КЗ. Поэтому наблюдаемое отличие лишь частично может быть нивелировано за счет режимов иммобилизации, уменьшающих конформационные перестройки или обеспечивающих направленное ориентирование антител.

Рис. 5 отражает отличия процессов иммобилизации антител против АФВ на КЗ при разных соотношениях реагентов. Если для синтеза используется менее 6 мкг антител на 1 мл КЗ, сорбция происходит почти полностью (более 98%, см. рис. 3), но реакционная способность полученного конъюгата низкая.

Отметим, что для препарата, полученного при соотношении 6 мкг антител на 1 мл КЗ, исходя из расчетных данных, первый слой сорбируемых на КЗ антител заполнен. При использовании более 6 мкг антител на 1 мл КЗ происходит спад степени связывания и в то же время резкий рост реакционной способности конъюгата, достигающей максимума при 10–12 мкг иммуноглобулинов, вносимых при синтезе на 1 мл КЗ. Антитела, вносимые в еще бльших количествах, продолжают сорбироваться на КЗ, но это не приводит к получению конъюгата с большей реакционной способностью (рис. 5, Б).

Сравнение конъюгатов антител с КЗ в иммунохроматографическом анализе Хотя с увеличением количества антител в комплексе с КЗ возрастает реакционная способность конъюгата, при проведении конкурентного иммуноанализа (необходимого для детектирования микотоксинов и других низкомолекулярных антигенов) состав конъюгатов с высокой реакционной способностью не позволяет обеспечить минимальный предел обнаружения антигена.

Это связано с тем, что при большем содержании антител в конъюгате требуется большее количество антигена, чтобы обеспечить ингибирование связывания конъюгата в аналитической зоне.

Для выбора конъюгата антитело–КЗ с оптимальными аналитическими характеристиками были экспериментально сопоставлены препараты с разным содержанием антител против АФВ1 (рис. 6).

Для конъюгатов с наибольшим содержанием антител (15 и 23 мкг на 1 мл КЗ при синтезе) предел обнаружения достигает максимума, а интенсивность окрашивания полосы в аналитической зоне начинает снижаться. С другой стороны, минимальное количество антител (4,5 мкг на 1 мл КЗ при синтезе) позволяет уменьшить предел обнаружения до 0,1 нг/мл АФВ1, но из-за резкого снижения интенсивности окрашивания визуальная детекция становится малодостоверной.

Оптимальным по интенсивности окрашивания и величине предела обнаружения АФВ1 (0,3 нг/мл) является конъюгат, полученный при иммобилизации 7 мкг антител на 1 мл суспензии КЗ.

Антитела, мкг/мл Рис. 6. Интенсивность окрашивания в аналитической зоне (А) и визуальный предел обнаружения (Б) при использовании конъюгатов антитело–КЗ разного состава в иммунохроматографическом определении АФВ1. По оси ординат указано количество антител на 1 мл суспензии КЗ при синтезе. (Здесь и далее I – интенсивность окрашивания аналитической зоны) Разработка иммунохроматографической тест-системы Важнейшим компонентом иммунохроматографической тест-системы является рабочая мембрана, на которой в ходе анализа происходит формирование детектируемых иммунных комплексов. В работе сопоставлены 11 видов нитроцеллюлозных мембран, отличающихся по скорости продольного движения жидкости и сорбционной способности. На рис. 7 представлены результаты сравнения этих мембран для детектирования афлатоксина В1.

В качестве оптимальной выбрана мембрана MDI CNPC 15, характеризующаяся максимальной интенсивностью образующихся полос, низким пределом обнаружения и отсутствием фонового окрашивания тест-полоски вне зон специфического связывания конъюгата.

MDI CNPC Рис. 7. Влияние рабочей мембраны на характеристики иммунохроматографического определения АФВ Аналогичные сравнительные исследования проведены для иммунохроматографического определения ОТА. В этом случае выбрана мембрана Millipore HF 240.

Изучено также влияние остальных компонентов мультимембранного композита на характеристики анализа. Установлено, что наиболее существенный вклад в степень связывания конъюгата и величину предела обнаружения вносит природа впитывающей мембраны, непосредственно контактирующей с тестируемой пробой. Для определения афлатоксина В1 показана оптимальность использования мембраны Millipore G041, а для охратоксина А – мембраны MDI GFB-R7.

На рис. 8 представлены результаты определения афлатоксина В1 в буферном растворе (ФБСТ) с использованием тест-полосок в предложенной оптимальной комплектации. Предел обнаружения составил 2 нг/мл при визуальной детекции (появление окрашивания в аналитической зоне) и 0,08 нг/мл при приборной регистрации (достоверное уменьшение интенсивности окрашивания по сравнению с пробой, не содержащей АФВ1). Для тест-системы на ОТА данные величины равнялись 100 и 1 нг/мл, соответственно.

Поскольку максимально допустимое содержание в разных видах продуктов питания, кормов и сырья составляет для АФВ1 от 0,15 до 5 нг/мг, а для ОТА – от 0,5 до 10 нг/мг, достигнутые величины пределов обнаружения свидетельствуют о пригодности тест-систем для контроля превышения предельных уровней контаминации данными микотоксинами.

АФВ1, нг/мл Рис. 8. Вид аналитических зон тест-полосок для иммунохроматографического определения АФВ1 (А) и градуировочная кривая, полученная в результате видеоцифровой обработки (Б) Однако матрикс проб может оказать существенное влияние на аналитические характеристики тест-систем. Поэтому на следующем этапе работ была проведена характеристика возможности тестирования растительных экстрактов с использованием разработанных тест-систем.

Апробация иммунохроматографических тест-систем для определения микотоксинов в растительных экстрактах Так как микотоксины чаще всего контаминируют твердые растительные продукты, то для их детекции необходима экстракция контролируемого соединения. С учетом особенностей растворимости микотоксинов для этой цели в большинстве случаев используется смесь вода : метанол (Trucksess et al., 2002), из чего следует необходимость подтвердить работоспособность иммуноаналитических систем в таких смесях. Было охарактеризовано определение с помощью полученных тест-полосок микотоксинов в смесях вода : метанол разного состава. В качестве оптимальной выбрана смесь, в которой присутствие 35% (по объему) метанола не оказывало влияния на результаты анализа и при этом не требовало значительного разбавления пробы.

С учетом условий экстракции микотоксинов предложены методики применения иммунохроматографических тест-полосок для анализа экстрактов различных сельскохозяйственных культур. На рис. 9, 10 представлены результаты, полученные для ОТА и АФВ1, соответственно.

ОТА, нг/мл Рис. 9. Вид иммунохроматографических тест-полосок при анализе экстрактов кукурузы с разной концентрацией ОТА (А) и концентрационная зависимость интенсивности окрашивания, полученная в результате видеоцифровой обработки (Б). а – аналитическая зона, к – контрольная зона Рис. 10. Градуировочные кривые иммунохроматографического определения афлатоксина B1 в растительных экстрактах (1 – ячмень, 2 – орехи) Нижняя граница концентраций ОТА, выявляемых в экстрактах кукурузы по исчезновению окраски в аналитической зоне (рис. 9, А), составляет нг/мл, в то время как при видеоцифровой регистрации предел обнаружения, определяемый по снижению интенсивности окрашивания на достоверную величину по отношению к окрашиванию в отсутствии микотоксина (рис. 9, Б), равен 2 нг/мл. Время анализа – 10 мин.

При определении афлатоксина В1 в экстрактах ячменя и орехов предел обнаружения составил 10 нг/мл при визуальном определении и 0,2 нг/мл при приборной регистрации. Время анализа – 10 мин.

Согласно установленным в РФ нормативам предельно допустимое содержание АФВ1 в продуктах питания составляет 5 мкг/кг (за исключением детского питания). Разработанная тест-система обеспечивает данный предел обнаружения при приборной регистрации сигнала (1,2 мкг/кг с учетом разбавления пробы во время анализа). Она может быть использована для предварительного скрининга большого количества образцов без дополнительной трудоемкой пробоподготовки, которая необходима при проведении жидкостной хроматографии, широко применяемой сегодня для анализа микотоксинов.

Усиление сигнала коллоидным золотом в иммуносенсорном анализе Для оптимизации условий проведения иммуноанализа в работе предложено использовать на стадии конкурентного взаимодействия немеченые специфические антитела, а высокочувствительное выявление образовавшихся иммунных комплексов проводить с применением конъюгатов антивидовых антител с коллоидным золотом. Эффективность данного подхода показана как для иммуносенсорного, так и для иммунохроматографического анализа.

В проточной системе иммуносенсорного анализа ОТА с регистрацией ППР были сопоставлены значения, полученные ранее при использовании свободных специфических антител (см. раздел «Исследование иммунохимических взаимодействий с использованием оптического сенсора Biacore Х»), и результаты применения двух схем усиления сигнала с использованием конъюгатов специфических (рис. 11, А) и антивидовых (рис. 11, Б–В) антител с КЗ.

При изучении закономерностей первой схемы усиления было необходимо определить оптимальный конъюгат специфических антител с КЗ, для чего через ячейку сенсора Biacore Х с иммобилизованным конъюгатом ОТА–БСА пропускали растворы конъюгатов специфические антитела – КЗ разного состава, стандартизированные по концентрации КЗ (А520 = 0,25). На рис. представлены полученные значения отклика сенсора на введение свободных иммуноглобулинов (кривая 1) и их конъюгатов (кривая 2).

Рис. 11. Схемы проведения конкурентного иммуносенсорного анализа. ОТА:

A – анализ с усилением конъюгатом КЗ – специфические антитела, Б – анализ без усиления, Б–В – анализ с усилением конъюгатом антиАТ–КЗ. 1 – БСА, 2 – OTA, 3 – специфические антитела, 4 – частица КЗ, 5 – антивидовые антитела Рис. 12. Зависимость сигнала ППР сенсора от количества внесенных свободных антител (1), от количества антител, конъюгированных с КЗ (2), и степень усиления – отношение сигналов для кривых 1 и 2 (3) Как видно из вычисленного отношения сенсорных сигналов (см. рис. 12, кривая 3), во всех случаях использование конъюгата коллоидного золота вызывает рост сигнала. Учитывая, что связывание с одной коллоидной частицей большого числа антител существенно снижает их реакционную способность по сравнению со свободными антителами, следует рассматривать данный эффект прежде всего как проявление плазмонных свойств коллоидного золота. Максимальное усиление сигнала для коллоидного конъюгата по отношению к свободным антителам составляет около 3 и наблюдается при концентрациях антител 0,7–1 мкг/мл.

Конъюгаты также были охарактеризованы в конкурентной схеме иммуноанализа. Несмотря на рост амплитуды сигнала, пределы обнаружения ОТА составили от 30 до 100 нг/мл, что на 2 порядка хуже по сравнению с форматом анализа, основанным на использовании свободных антител (0,4 нг/мл – см. рис. 1). Этот факт подтверждает изложенную выше интерпретацию недостатков конъюгатов КЗ с большим числом антител при проведении конкурентного иммуноанализа. Значительное число антител на поверхности КЗ доступно для связывания свободного антигена – как до, так и после образования комплекса с иммобилизованным антигеном. Соответственно для ингибирования связывания конъюгата с поверхностью чипа необходимы бльшие количества антигена, чем при использовании нативных антител.

Использование конъюгата антиАТ–КЗ (см. рис. 11, Б–В) позволило повысить сигнал сенсора в 10 раз; полученный коэффициент усиления близок к аналогичному показателю в других работах (Pieper-Furst et al., 2004; Mitchell et al., 2009). Это дало возможность снизить концентрацию свободных специфических антител с 200 до 3 нг/мл. Предел обнаружения ОТА при таких условиях – 40 пг/мл (рис. 13), что в 10 раз лучше, чем при регистрации взаимодействия с немечеными антителами (см. рис. 1). При этом время анализа увеличивается на 15 мин и составляет (вместе со стадией регенерации чипа) 25 мин.

Достигнутый предел обнаружения значительно ниже предельно допустимых концентраций ОТА в пищевой продукции и кормах, установленных законодательными нормами РФ (0,5–10 мкг/кг), что обуславливает практический интерес к данному подходу.

Рис. 13. Градуировочная кривая иммуносенсорного определения ОТА с использованием усиления сигнала конъюгатом антиАТ–КЗ Иммунохроматографический анализ с разделением стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера Разделение стадий конкурентного взаимодействия и выявления комплексов с использованием конъюгата антивидовые антитела – КЗ было реализовано также в иммунохроматографическом анализе. В данном формате анализа тестируемая проба инкубируется 2 мин с раствором свободных специфических антител. Затем в реакционную смесь погружается тест-полоска. После короткой инкубации (5 мин) фронт жидкости доходит до аналитической зоны, где несвязавшиеся антитела, количество которых зависит от количества антигена в пробе, взаимодействуют с иммобилизованным микотоксином. Затем через тест-полоску пропускают раствор конъюгата КЗ с антивидовыми антителами, который связывается со специфическими антителами в аналитической зоне, давая окрашенную полосу. Если в пробе присутствует антиген в концентрации выше пороговой, он на первой стадии связывается со специфическими антителами, не давая им возможности образовать комплекс с иммобилизованным антигеном и исключая образование окрашенной полосы при взаимодействии с мечеными антивидовыми антителами.

В качестве рабочей выбрана мембрана Millipore HF135, которая при внесении дополнительных детергентов и стабилизаторов обеспечивает высокую скорость и четкую локализацию окрашенного маркера в аналитической зоне.

Рис. 14. Схема конкурентного иммунохроматографического анализа с непрямым мечением специфических антител (1 – БСА, 2 – микотоксин, 3 – специфические антитела, 4 – коллоидное золото, 5 – антивидовые антитела, 6 – рабочая мембрана, 7 – впитывающая мембрана) После оптимизации условий описанная схема была реализована для определения афлатоксина В1. Изображения тест-полосок для разных концентраций АФВ1 и результаты обработки данных представлены на рис. 15.

АФВ1, пг/мл Рис. 15. Внешний вид аналитических зон тест-полосок для иммунохроматографического определения АФВ1 с использованием конъюгата антивидовых антител с КЗ (А) и градуировочная кривая, полученная в результате видеоцифровой обработки (Б) При визуальном детектировании исчезновение окрашивания полосы в аналитической зоне вызывают концентрации АФВ1 начиная со 100 пг/мл, а приборная регистрация характеризуется пределом обнаружения 30 пг/мл.

По сравнению с традиционной схемой иммунохроматографического анализа (см. рис. 8) введение коллоидного золота в конъюгате с антивидовыми антителами позволяет снизить предел обнаружения в 10 раз.

Другим преимуществом данного подхода является сокращение расхода специфических антител, существенно более дорогих, чем антивидовые антитела. Предлагаемый формат анализа дает возможность снизить их количество, необходимое для проведения одного анализа, в 50 раз (с 100 до 2 нг).

Кроме того, в отличие от меченых специфических антител, конъюгат коллоидного золота с антивидовыми антителами является универсальным реагентом, который может быть применен в данной схеме анализа для иммунодетекции различных соединений.

ВЫВОДЫ

1. Предложен метод характеристики иммунохимических свойств конъюгатов антитела – коллоидное золото, основанный на определении эквивалентного количества свободных антител. Установлен характер зависимости реакционной способности синтезируемых конъюгатов от количества специфических иммуноглобулинов.

2. Разработан высокочувствительный метод определения микотоксинов в иммуносенсорной системе с оптической регистрацией поверхностного плазмонного резонанса с использованием конъюгатов антивидовые антитела – коллоидное золото. Показано существенное усиление сигнала и снижение предела обнаружения до 40 пг/мл по сравнению с регистрацией взаимодействия с немечеными специфическими антителами.

3. Определены условия проведения иммунохроматографического анализа для контроля содержания микотоксинов в пробах с высоким содержанием органического растворителя (до 35% метанола). Пределы обнаружения в растительных экстрактах при визуальной детекции результатов составляют нг/мл для афлатоксина В1 и 50 нг/мл для охратоксина А, а при видеоцифровой регистрации – 0,2 и 2 нг/мл, соответственно.

4. Предложен новый метод иммунохроматографического анализа, основанный на разделении стадий специфического взаимодействия и введения коллоидного маркера. Предел обнаружения афлатоксина В1 данным методом составляет 100 пг/мл, что в 10 раз ниже по сравнению с традиционным форматом анализа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические методы анализа микотоксинов (обзор). – Прикладная биохимия и микробиология.

2010, т. 46, № 3, сс. 276–290.

2. Urusov A.E., Kostenko S.N., Sveshnikov P.G., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Ochratoxin A immunoassay with surface plasmon resonance registration: Lowering limit of detection by the use of colloidal gold immunoconjugates. – Sensors and Actuators. B: Chemical. 2011, v. 156, № 1, pp. 343–349.

3. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Свешников П.Г., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Определение охратоксина А иммунохроматографическим методом. – Журнал аналитической химии. 2011, т. 66, № 8, сс. 884–890.

Материалы конференций:

4. Дзантиев Б.Б., Жердев А.В., Бызова Н.А., Урусов А.Е. Экспрессные иммунотесты для контроля токсичных контаминант в воде и продуктах питания. – Материалы V Московского международного конгресса «Биотехнология:

Состояние и перспективы развития». 16–20 марта 2009 г., Москва, ч. 2, с. 21.

5. Бызова Н.А., Жердев А.В., Урусов А.Е., Зверева Е.А., Дзантиев Б.Б.

Иммунохроматографические системы для экспрессной детекции биологически активных соединений. – Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А. Овчинникова. 28 сентября – 1 октября 2009 г., Москва – Пущино. Сборник тезисов, т. 1, с. 152.

6. Костенко С.Н., Урусов А.Е., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохимические экспресс-методы определения охратоксина А. – Всероссийская конференция «Экотоксикология-2009. Современные биоаналитические системы, методы и технологии». 26–30 октября 2009 г., Пущино – Тула. Сборник статей, сс. 93–96.

7. Dzantiev B., Byzova N., Urusov A., Zherdev A. Express immunochromatographic assays for the control of toxic contaminants in foodstuffs. – 4th International Symposium on Recent Advances in Food Analysis (RAFA–2009). November 4–6, 2009, Prague, Czech Republic. Book of Abstracts, p. 438.

8. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Иммунохроматографическое определение охратоксина А. – Тезисы Междисциплинарного микологического форума. 14–15 апреля 2010 г., Москва. – В журн. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010, № 1, с. 211.

9. Урусов А.Е., Костенко С.Н., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б. Экспрессметод определения охратоксина А с использованием оптического сенсора Biacore. – Тезисы Междисциплинарного микологического форума. 14–15 апреля 2010 г., Москва. – В журн. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2010, № 1, сс. 211–212.

10. Урусов А.Е., Жердев Б.Б., Возняк М.В., Гришаева А.О., Дзантиев Б.Б.

Разработка систем быстрого иммунохимического определения микотоксинов.

– Материалы VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 21–25 марта 2011 г., Москва, ч. 2, с. 114.

11. Urusov A.E., Kostenko S.N., Zherdev A.V., Dzantiev B.B. Application of surface plasmon resonance immunosensor and gold nanoparticles enhancement for detection of ochratoxin A. – Abstracts of the Conference «Mycotoxin reduction – Global solutions». April 4–6, 2011, Cape Town, South Africa, pp. 72–73.

12. Бызова Н.А., Урусов А.Е., Зверева Е.А., Жердев А.В., Дзантиев Б.Б.

Иммунохроматография – экспрессный метод детекции низкомолекулярных загрязнителей окружающей среды. Тезисы докладов VIII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика–2011». июня – 2 июля 2011 г., Архангельск, с. 86.

13. Dzantiev B.B., Urusov A.E., Voznyak V.M., Zherdev A.V. Approaches for lowering the limit of detection for rapid immunoassays of mycotoxins. – Abstracts of the Conference «Strategies to reduce the impact of mycotoxins in Latin America in a global context». November 15–18, 2011, Mendoza, Argentina, p. 98.



 
Похожие работы:

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом...»

«Холодов Владимир Алексеевич АДСОРБЦИЯ И ТОКСИЧНОСТЬ ГЕРБИЦИДА АЦЕТОХЛОРА В ПОЧВАХ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ 03.00.27-почвоведение 03.00.16-экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА - 2003 4 Работа выполнена на кафедре Общего земледелия факультета Почвоведения Московского Государственного университета им. М.В. Ломоносова Научные руководители: кандидат биологических наук, доцент Г.Ф. Лебедева доктор химических наук И.В. Перминова...»

«Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва –2010 2 Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный консультант : доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей...»

«Духовная Наталья Игоревна ПОКАЗАТЕЛИ РАЗВИТИЯ ФИТОПЛАНКТОННЫХ СООБЩЕСТВ В ВОДОЕМАХ С РАЗНЫМ УРОВНЕМ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.01.01 – Радиобиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Уральский научно-практический центр радиационной медицины Федерального медикобиологического агентства Российской Федерации, г. Челябинск доктор биологических наук...»

«БАЛАНОВСКИЙ Олег Павлович ИЗМЕНЧИВОСТЬ ГЕНОФОНДА В ПРОСТРАНСТВЕ И ВРЕМЕНИ: СИНТЕЗ ДАННЫХ О ГЕНОГЕОГРАФИИ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК И Y-ХРОМОСОМЫ 03.02.07 – генетика 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук. Научные консультанты: доктор биологических наук,...»

«Сорокин Иван Дмитриевич Диазотрофы содовых солончаков Специальность 03.00.07 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2008 2 Работа выполнена в Институте микробиологии им. С.Н.Виноградского РАН Научный руководитель : кандидат биологических наук И.К. Кравченко Официальные оппоненты : доктор биологических наук Т.Н. Жилина доктор биологических наук А.Л. Степанов Ведущая организация : Институт биохимии и физиологии...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Скобанев Алексей Васильевич Ксилотрофные базидиомицеты (Basidiomycota) Пензенской области и накопление тяжелых металлов и мышьяка их базидиомами Специальность 03.02.12. – Микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 1 Диссертационная работа выполнена на кафедре биологии и экологии ФГОУ ВПО Пензенская ГСХА и в Региональном Центре государственного экологического контроля и мониторинга по Пензенской области ФГУ...»

«Новикова Любовь Александровна СТРУКТУРА И ДИНАМИКА ТРАВЯНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ ЛЕСОСТЕПНОЙ ЗОНЫ НА ЗАПАДНЫХ СКЛОНАХ ПРИВОЛЖСКОЙ ВОЗВЫШЕННОСТИ И ПУТИ ЕЕ ОПТИМИЗАЦИИ 03.02.01 – ботаника Автореферат диссертации на соискание учной степени доктора биологических наук Саратов – 2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Пензенском государственном педагогическом университете имени В.Г. Белинского...»

«ОВСЯНИКОВ Никита Гордеевич ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННЫХ ПРОЦЕССОВ ХИЩНЫХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ АРКТИКИ 03.02.04 – зоология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в Федеральном бюджетном государственном учреждении “Государственный природный заповедник Остров Врангеля” Официальные оппоненты : доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник каф. Высшей нервной деятельности Биологического...»

«Бедарева Ольга Михайловна ЭКОСИСТЕМЫ СРЕДНИХ ПУСТЫНЬ КАЗАХСТАНА И ИХ ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ МЕТОДАМИ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Калининград 2009 2 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научные консультанты: академик Национальной Академии Наук Республики...»

«3 МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М. В. Ломоносова _ ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ НА ПРАВАХ РУКОПИСИ Куликова Наталья Александровна СВЯЗЫВАЮЩАЯ СПОСОБНОСТЬ И ДЕТОКСИЦИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА ГУМУСОВЫХ КИСЛОТ ПО ОТНОШЕНИЮ К АТРАЗИНУ 03.00.27 –ПОЧВОВЕДЕНИЕ АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва- Работа выполнена на кафедре общего земледелия факультета почвоведения Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова. Научные...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«МЯЗИН Владимир Александрович РАЗРАБОТКА СПОСОБОВ ПОВЫШЕНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ КОЛЬСКОГО СЕВЕРА ПРИ ЗАГРЯЗНЕНИИ НЕФТЕПРОДУКТАМИ (В УСЛОВИЯХ МОДЕЛЬНОГО ЭКСПЕРИМЕНТА) 03.02.08 – экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Петрозаводск – 2014 2 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте проблем промышленной экологии Севера Кольского научного центра Российской академии наук Научный...»

«ПРОКОФЬЕВА Мария Юрьевна ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИСКУССТВЕННЫХ СЕМЯН В ТЕХНОЛОГИИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ IN VITRO КОРНЕЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ РАСТЕНИЙ 03.01.05 – физиология и биохимия растений АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2012 Работа выполнена в группе специализированного метаболизма корней Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, г. Москва....»

«ПОХИЛЬКО Лидия Олеговна Экологические принципы формирования ассортимента древесных растений в озеленении г. Ростова-на-Дону 03.00.16 – экология АФТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2009 2 Работа выполнена на кафедре ботаники Южного федерального университета Научный руководитель : кандидат биологических наук, доцент Паршин Витольд Георгиевич Официальные оппоненты : доктор биологических наук, профессор Дзыбов...»

«САИДОВ АБДУСАТТОР САМАДОВИЧ РАСПРОСТРАНЕНИЕ, СИСТЕМАТИКА, ЭКОЛОГИЯ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ГРЫЗУНОВ ТАДЖИКИСТАНА Специальность: 03.02.04 - зоология АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук Душанбе – 2011 Работа выполнена в Отделе экологии наземных позвоночных животных Института зоологии и паразитологии им. Е.Н.Павловского Академии наук Республики Таджикистан Научный консультант : академик АН Республики Таджикистан, доктор биологических наук,...»

«Харитонцев Борис Степанович Флорогенез и фитоценогенез на юге Западной Сибири Специальность: 03.00.05 – БОТАНИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2009 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской академии наук Научный консультант – академик РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Горчаковский Павел Леонидович Официальные оппоненты : доктор...»

«Чирков Сергей Николаевич Иммунохимическая и молекулярная диагностика вирусных инфекций растений 03.00.06 – Вирусология 03.00.23 – Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва 2009 Работа выполнена на кафедре вирусологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоноcова и в лаборатории вирусологии Института микробиологии имени С.Н.Виноградского РАН. Научный консультант : доктор...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.