WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

им. М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

МАТВЕЕВА Анжелика Рафиковна

СЕКРЕТИРУЕМЫЕ ПРОТЕАЗЫ НЕКОТОРЫХ

МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И

ХАРАКТЕРИСТИКА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ И

ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ

03.00.24-микология 03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии биологического факультета и в отделе функциональной биохимии биополимеров Научно-исследовательского института физикохимической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук Дунаевский Яков Ефимович кандидат биологических наук Белякова Галина Алексеевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Феофилова Елена Петровна доктор химических наук, в.н.с.

Руденская Галина Николаевна

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИФ РАСХН)

Защита диссертации состоится 2008 года в 15:30 на заседании диссертационного совета Д 501.001.46 при Биологическом факультете МГУ имени. М.В. Ломоносова по адресу:

119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, Биологический факультет (аудитория М-1) Т/факс: (495) 939-39-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета, М.А. Гусаковская кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Протеолитические ферменты играют исключительно важную роль в регуляции различных биологических процессов на молекулярном, клеточном, тканевом и межорганном уровнях. В фундаментальных исследованиях они используются для изучения первичной структуры белков и пептидов, кинетики и специфичности ферментативных реакций, строения активных центров. В коммерческих целях применяются в легкой и пищевой промышленности, в медицине и фармакологии (Мосолов, 1971; Rao et al., 1998).





Среди внеклеточных протеолитических ферментов микроорганизмов особое место занимают протеиназы, обладающие высокой фибринолитической и антикоагулянтной активностью, что предполагает их высокий терапевтический эффект при лечении тромбоэмболии (Батомункуева, Егоров, 2001; Peng et al., 2005). С участием грибных протеаз можно разрабатывать различные способы рециклизации отходов, оберегая окружающую среду. Изза высокой ферментативной активности ферменты микроорганизмов предпочтительнее при разложении природных соединений (Мюллер, Лёффлер, 1995).

Возрастающий интерес к секретируемым протеазам грибов обусловлен также их участием в разнообразных формах патогенеза (St. Leger, 1995; Rhodes, 1995; Larcher et al., 1996). Ферменты могут участвовать в грибной инвазии, растворяя участки кутикулы насекомых, состоящей на 70% из белка (Ferron, 1978). Клинические исследования больных кератитом, вызываемым грибами, как Aspergillus fumigatus, Candida albicans, Fusarium solani, Penicillium citreo-viride, показали, что в роговице глаза, в тканях, сыворотке испытуемых увеличивается как количество грибного мицелия, так и количество металлопротеиназ ММР- и ММР-9 (Dong et al., 2005; Rohini et al., 2007). Следует также отметить работы по изучению роли секретируемых протеаз Aspergillus fumigatus в патогенезе аспергиллеза человека в которых было показано, что штаммы, продуцирующие сериновую протеиназу субтилизинового типа, более патогенны для животных, чем непродуцирующие штаммы (Павлюкова и др., 1998). Однако функциональная роль протеиназ в этом процессе до конца не выяснена. Предполагается, что протеазы могут участвовать в комплексе с другими ферментами в проникновении патогена внутрь растения-хозяина и обеспечивать его питание (Мосолов, Валуева, 2006), либо быть ответственными за регуляцию других ферментов, синтезируемых организмом. Возможно, грибные протеазы непосредственно участвуют в патогенном процессе через взаимодействие со «сторожевым» белком или продуктом гена устойчивости (Biezen, Jones, 1999; Дьяков, 2005).

Цель работы: Сравнительное изучение физико-химичских, биохимических и функциональных свойств внеклеточных протеаз некоторых мицелиальных грибов.

1. Сравнение спектров внеклеточных протеаз на примере различающихся по патогенности мицелиальных грибов родов Fusarium Link и Colletotrichum Corda 2. Выделение и очистка секретируемых протеаз данных грибов 3. Характеристика наиболее представленных (основных) протеаз Fusarium и Colletotrichum Научная новизна и практическая значимость. Проведена работа по подбору жидких сред с целью наибольшего выхода внеклеточной протеолитической активности ферментов у различных мицелиальных грибов. При погруженном культивировании видов Fusarium и Colletotrichum на средах с различными добавками показано, что сусло и казеин в большей степени индуцируют секрецию внеклеточных протеаз.





Впервые из культуральной жидкости гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc выделена сериновая протеиназа субтилизинового типа. Разработан метод получения данного фермента. В результате ряда последовательных стадий внеклеточная протеиназа C.

gloeosporioides была очищена до гомогенного состояния, исследованы её физикохимические свойства, а также влияние белковых ингибиторов растительного и животного происхождения на очищенный препарат секретируемой протеиназы.

Впервые проведено сравнение уровня патогенности с внеклеточной протеолитической активностью у 15 изолятов Fusarium, принадлежащих к 4 видам. Показано, что у сильных фитопатогенов преобладает трипсиноподобная активность.

Выделены и идентифицированы протеазы, секретируемые Fusarium oxysporum Schlecht.

Показано, что они относятся к сериновым протеазам семейств субтилизина и химотрипсина.

Были охарактеризованы некоторые их физико-химические свойства.

Полученные данные могут найти практическое применение в разработке новых методов защиты растений от фитопатогенов, для диагностики патогенных микроорганизмов и получения растений, трансформированных генами ингибиторов протеаз, с повышенной устойчивостью к патогенам.

Апробация работы. Основные положения изложены на Международной конференции «Грибы в природных и антропогенных экосистемах» (Санкт-Петербург, 2005 г.); I (IX) Международной конференции молодых ботаников (Санкт-Петербург, 2006 г.); VI Международном симпозиуме "Химия протеолитических ферментов" (Москва 2007 г.); XV Международном конгрессе европейских микологов (Санкт-Петербург, 2007 г), а также заседаниях кафедры микологии и альгологии Биологического факультета МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов, методов и результатов работы, выводов. Диссертация изложена на страницах, содержит иллюстраций (рисунки, таблицы). Список литературы включает _ источника.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты исследования 1. Штамм гриба C. gloeosporioides полученный из коллекции культур Института экспериментальной ботаники имени В.Ф. Купревича НАН Беларуси.

2. Грибы рода Fusarium предоставлены ВНИИ фитопатологии. Всего было изучено изолятов: 8 возбудителей корневой гнили пшеницы F. sporotrichioides Sherb. (изоляты КР-98КЖ-99-06), F. culmorum (W.G.Sm.) Sacc. (изоляты Бр-04-53, Бр-03-19), F.oxysporum (изоляты КЗ-1701-12, Вор-04-12), F. heterosporum Nees & T. Nees (изоляты М-03-36, Вор-04возбудителя корневой гнили ячменя F. culmorum (изоляты См-8-06, Рг-14-06, Бу-1-06);

4 возбудителя фузариоза колоса ржи: F. culmorum (слабо и сильнопатогенный штаммы с V и IV морфолого-культуральными типами колоний соответственно), F. heterosporum (с I морфолого-культуральным типом колоний) и F. sporotrichioides (с I морфологокультуральным типом колоний).

Методы исследования Поверхностное культивирование проводили на агаризованных средах: сусло-агаре, картофельно-морковном агаре, голодном агаре, стандартной среде Чапека, модифицированной среде Чапека, куда вместо неорганического источника азота добавляли казеин в 1 % концентрации.

Погруженное культивирование проводили на жидких средах: 7,5% сусле, среде Чапека и модифицированной среде Чапека с добавлением казеина, желатины или гидролизата казеина в конечной концентрации 1%. Для получения кривых роста мицелий отбирали через определенные промежутки времени и отфильтровывали на водоструйном насосе на воронке Бюхнера. Затем мицелий высушивали при температуре 85оС до постоянной массы и взвешивали. В качестве источника секретируемых протеолитических ферментов использовали культуральную жидкость качалочной культуры.

Препараты с мицелием просматривали на световом микроскопе и микроскопе Zeiss Axioskop 40 FL c цифровой камерой Axiocam MRc. Фотографии обрабатывали в программе Axiovision 3.1.

Определения патогенности гриба изучали 2 способами по влиянию споровой суспензии на проростки 5 сортов ржи, 5 сортов пшеницы и 3 сортов ячменя. Первый способ - метод Овсянкиной и Коваленко (2004 г.). Во втором случае зерна помещали по 30 штук на полоски влажной фильтровальной бумаги и инокулировали споровой суспензией гриба, затем зараженные семена накрывали полиэтиленовой пленкой и заворачивали вместе с фильтровальной бумагой в рулоны. Рулоны помещали в сосуды с дистиллированной водой на 10 дней. За контроль принимали семена, не обработанные споровой суспензией гриба.

Секретируемые протеолитические активности определяли с помощью метода Эрлангера с соавторами (Erlanger et al., 1961), используя 20мM синтетические паранитроанилидные субстраты: Bz-Arg-pNa, Ac-Leu-pNa, Cp-Phe-pNa, Glp-Phe-pNa, Z-Ala-PheArg-pNa, ABZ-Ala-Ala-Leu-pNa, Glp-Ala-Ala-Leu-pNa, Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNa, L-Tyr-pNa, L-Leu-pNa., а также с помощью метода тринитрофенилирования ( Habeeb, 1966). За единицу ферментативной активности принимали такое количество фермента в культуральной жидкости, которое при гидролизе субстрата в указанных условиях инкубации вызывает увеличение оптической плотности раствора на 0,01.

Общую активность определяли в единицах ферментативной активности (ед.).

Активность на мицелий - в единицах активности на сухой вес мицелия (ед./г сух. мицелия).

Удельную активность в единицах активности на г белка (ед./г белка).

Для определения оптимума рН и рН стабильности использовали 0,2 М буферы в диапазоне рН от 3,3 до 12,2.

Температурный оптимум фермента определяли, измеряя активность фермента при температурах от 4оС до 80оС.

Ионообменную хроматографию проводили на DEAE Sephadex A-50 (batch-процедура) и на колонке Mono Q (FPLC), уравновешенной 0,01М фосфатным буфером рН 7.0 при скорости 1 мл/мин.

Фракционирование и определение молекулярной массы протеиназы проводили методом гель-фильтрации на колонках Superose-12 HR 10/30 и Superdex-75 10/30 (FPLC).

В работе использовали следующие ингибиторы: этилендиаминтетраацетат Nа (ЭДТА), o-фенантролин, йодацетамид, Е-64, фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), N-тозил-Lлизин-хлорметилкетон (ТЛХК), N-тозил-L-фенилаланин-хлорметилкетон (ТФХК), а также различные белковые ингибиторы.

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях.

Изучение роста колоний Fusarium и C. gloeosporioides на твердых средах. С целью описания морфологии колоний и характера роста культур, грибы выращивали на различных твердых средах.

Как видно из рис. 1 наилучший рост на твердых средах на 6 день культивирования наблюдался на сусло-агаре и картофельно-морковном агаре.

Рис.1 Диаметр колоний изолятов Fusarium на различных твердых средах на 6 день культивирования.

с - сусло-агар, кма - картофельно-морковный агар, мч - модифицированная среда Чапека, ч среда Чапека, га – голодный агар происходило образование большого количества репродуктивных структур: макро- и микроконидий, а так же хламидоспор (рис. 2).

Рис. 2. Мицелий, макроконидии (а) и хламидоспоры (б) ржаной формы F.heterosporum, выращенной на среде сусло-агар.

На модифицированной среде Чапека рост колонии был несколько замедлен по сравнению со стандартной средой Чапека, что связано с использованием различных источников азота в этих средах. В первом случае - это органический источник – казеин, для его использования в своем метаболизме грибу требуется выработка специфических ферментов, в частности, протеаз, соответственно и рост мицелия происходит медленнее. Во втором - минеральный – нитрат натрия, он более доступен и быстрее метаболизируется.

Диаметр колонии на голодном агаре превышал в большинстве случаев рост на стандартной и модифицированной средах Чапека. Сам по себе голодный агар является средой с минимальным содержанием питательных веществ, и из-за их недостатка гифы распространялись на большую длину, но были тонкие, бесцветные, на них отсутствовали репродуктивные структуры, плотность колоний также была очень низкая.

Рост колоний гриба C. gloeosporioides происходит гораздо медленнее, чем Fusarium, они заполняют полностью чашки Петри к 15-17 дню культивирования (рис. 3). Наиболее хороший и быстрый рост наблюдали на сусле. На обеих средах Чапека колонии образовывали плотный подушковидный воздушный мицелий серо-белого цвета. На среде Чапека с добавлением казеина в отличие от Fusarium, C. gloeosporioides рос быстрее, чем на стандартном Чапеке, достигая 65 мм в диаметре на 15 день. При микроскопировании наблюдалось много спор и темноокрашенных, иногда утолщенных гиф (рис. 4).

диаметр колонии, мм Рис. 3. Кривая роста C. gloeosporioides на твердых средах.

с – сусло-агар, мч – модифицированная среда Чапека c казеином, ч – среда Чапека, га – голодный агар Рис. 4 Конидии (а) и темноокрашенные гифы (б) C. gloeosporioides, на модифицированной среде Чапека Изучение роста колоний Fusarium и C. gloeosporioides при погруженном культивировании.

С целью подбора среды для наилучшего выхода внеклеточной протеолитической активности и изучения характера роста грибов, их культивировали в различных жидких средах.

В случае с Fusarium рост массы мицелия на сусле по сравнению с модифицированной средой Чапека был в большинстве случаев более значимым (рис. 5). Однако у всех изолятов вида F.oxysporum и у 3-х изолятов F.culmorum масса сухого мицелия на модифицированной среде Чапека превышала таковую на сусле. Следует отметить, что у всех исследуемых изолятов наличие белковых добавок в среде стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной средой Чапека. В культуре достаточно быстро образовывались многочисленные мелкие пеллеты, что свидетельствовало о хорошем развитии гриба.

Масса сухого мицелия,г Рис. 5. Масса мицелия 4-х видов Fusarium, выращенных в погруженной культуре в течение дней.

с - сусло, мч - модифицированная среда Чапека, гк - модифицированная среда Чапека с гидролизатом казеина, ж - модифицированная среда Чапека с желатиной, ч - среда Чапека Изменение массы сухого мицелия C. gloeosporioides на 15 сутки культивирования на 3х различных средах отражено на рис. 6. Как видно из рисунка, наилучший рост биомассы наблюдался на модифицированной среде Чапека, затем на сусле и стандартной среде Чапека Рис. 6. Масса мицелия C. gloeosporioides на 15 день культивирования в погруженной культуре.

Из полученных результатов видно, что, как на твердой среде, так и при глубинном культивировании, модифицированная среда Чапека с казеином, как и сусло, была оптимальна для роста грибов. Следует отметить, что среда Чапека с казеином весьма удобна в исследовательских работах, так как позволяет четко контролировать влияние отдельных компонентов среды на рост гриба и секрецию внеклеточных ферментов.

ферменты мицелиальных грибов многообразны и относятся к разным группам. Для их обнаружения в культуральной жидкости использовали как белковые (азоказеин), так и (неспецифическую) протеолитическую активность. При поиске специфических активностей были использованы специальные амино- и эндопептидазные субстраты. Среди наиболее представленных эндопептидаз в спектрах внеклеточных ферментов различных видов мицелиальных грибов можно выделить две протеиназы, а именно: активную по субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa и активную по субстрату Bz-Arg-pNa. На основании физикохимических свойств, субстратной специфичности и данных ингибиторного анализа эти протеолитической активности у изолятов Fusarium на разных жидких средах по субстратам Glp-Ala-Ala-Leu-pNa и Bz-Arg-pNa приведено на рисунках 7 и 8.

Активность ед./г сух миц.

Рис. 7. Активность внеклеточных протеиназ у разных изолятов Fusarium по Glp-Ala-Ala-LeupNa рассчитанная на г сухого мицелия.

с - сусло, мч - модифицированная среда Чапека, гк - модифицированная среда Чапека с гидролизатом казеина, ж - модифицированная среда Чапека с желатиной, ч - среда Чапека Рис. 8. Активность внеклеточных протеиназ у разных изолятов Fusarium по Bz-Arg-pNa, рассчитанная на г сухого мицелия.

с - сусло, мч - модифицированная среда Чапека, гк - модифицированная среда Чапека с гидролизатом казеина, ж - модифицированная среда Чапека с желатиной, ч - среда Чапека Как видно из обоих рисунков, наилучший выход протеаз у всех изученных изолятов наблюдался на сусле и модифицированной среде Чапека с казеином.

У C. gloeosporioides заметной активности по Bz-Arg-pNa выявлено не было, однако по субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa секреция на модифицированной среде Чапека превышала таковую на сусле (рис. 9).

Рис. 9. Активность внеклеточных протеиназ C. gloeosporioides по субстрату Glp-Ala-Ala-LeupNa Следует отметить, что у всех исследуемых изолятов наличие белковых добавок в среде не только стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной средой Чапека, но и увеличивало уровень секреции ферментов. Сусло, являясь поликомпонентной средой, не позволяет определить влияние отдельных ее составляющих на секрецию протеолитических ферментов. Поэтому для дальнейшей работы по изучению секреции протеаз в основном использовалась модифицированная среда Чапека.

Сравнение патогенности грибов и уровня внеклеточной протеолитической активности. При сравнении сапротрофных видов мицелиальных грибов с фитопатогенными была выявлена характерная особенность – появление у фитопатогенов дополнительно к субтилизиноподобной новой трипсиноподобной активности, отсутствующей у сапротрофов (Дунаевский, 1996). Характерным различием между двумя этими протеолитическими активностями было их отношение к наличию в среде белкового субстрата. Если появление трипсиноподобной протеиназы в культуральной жидкости индуцировалось присутствием в среде белка, причем в довольно больших количествах (1%), то заметный базовый уровень активности субтилизиноподобной протеиназы в среде часто определялся и в отсутствие белкового субстрата. Возможно, что субтилизиноподобная протеиназа, появляясь первой, обеспечивает условия, необходимые для последующего действия трипсиноподобной протеиназы, в частности, облегчает ее проникновение в растительную ткань. На основании анализа спектров внеклеточных протеаз мицелиальных грибов, различающихся типом питания можно высказать предположение о связи трипсиноподобной протеиназы с патогенным процессом.

Для выяснения вопроса о существовании связи между степенью патогенности гриба и уровнем активности секретируемой трипсиноподобной протеиназы, проводили сравнение разных видов Fusarium, различающихся степенью патогенности. У F. sporotrichioides и F.

heterosporum, ржаной и пшеничной форм, была обнаружена четкая корреляция активности с патогенностью, т.е. более патогенный F. sporotrichioides давал заметно большую внеклеточную трипсиноподобную активность, чем менее патогенный вид F. heterosporum (рис. 10). Эта тенденция сохранялась при расчете активности на сухой вес мицелия, что, возможно, указывает на целенаправленный синтез и секрецию внеклеточной трипсиноподобной протеиназы у видов с более высоким уровнем патогенности.

Активность, ед.

Рис. 10. Сравнение активностей по Bz-Arg-pNa у двух видов Fusarium, различающихся степенью патогенности.

ч - среда Чапека, мч - модифицированная среда Чапека с казеином Похожие результаты были получены в ходе предварительных исследований на 2-х изолятах F. culmorum (слабо- и сильнопатогенном ), выращенных на картофельно-морковном превышала таковую у слабого патогена.

Рис. 11. Активность, рассчитанная на г сухого мицелия внеклеточных протеиназ по Bz-ArgpNa 2-х изолятов F.culmorum, выращенных на картофельно-морковном агаре.

Однако эта тенденция не всегда сохранялась. Два изолята F. oxysporum из возбудителей корневой гнили пшеницы оказались наиболее хорошими продуцентами трипсиноподобной активности, но при этом не самыми сильными патогенами (рис. 12).

Активность ед./г сух.миц Активность, ед./г сух.миц.

Рис.12. а-б. Активность, рассчитанная на г сухого мицелия, внеклеточных протеаз пшеничных изолятов Fusarium по Bz-Arg-pNa на модифицированной среде Чапека с казеином.

патогенности (количество проросших семян и время их прорастания, длина корней проростков) объективно оценивают её у отдельных видов грибов. Так, если сравнение патогенности ржаной формы двух вышеуказанных видов F. sporotrichioides и F.

heterosporum, выявило полное совпадение результатов в 2-х тест-системах, то сравнение патогенности пшеничных форм Fusarium показало незначительные различия между видами при тестировании прорастания семян и заметную разницу при измерении длины корней проростков. Возможно, что используемое в наших исследованиях определение патогенности не связано напрямую с величиной внеклеточной активности протеиназ, и следует подобрать более удобную и показательную тест-систему.

внеклеточной трипсиноподобной протеиназы является наличие живой ткани растенийхозяев. Эта активность присутствовала у вешенки устричной P.ostreatus, способной развиваться на живых деревьях, но практически полностью отсутствовала у вешенки легочной P. pulmonarius (Fr.) Quel., живущей на отмершей древесине (Барсукова и др., 1989).

Выделение, очистка и характеристика свойств наиболее представленных ферментов изученных грибов. Предварительное исследование показало, что среди разнообразных протеаз C. gloeosporioides в значительном количестве секретировался фермент, активный по синтетическому субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa. Инфекция C. gloeosporioides представляет собой многофакторный процесс и одним из факторов, определяющим его патогенность, могут быть гидролазы, секретируемые грибом и обеспечивающие его проникновение в ткани растений-хозяев. Одна из таких гидролаз внеклеточная протеиназа C. gloeosporioides была очищена в 203 раза с выходом 5% (табл. 1).

Таблица 1. Последовательная очистка протеиназы C. gloeosporioides.

после осаждения сульфатом аммония DEAE Sephadex A- (batch-процедура) ячейке Amicon хроматография на Mono Q Типичная хромотограмма очистки протеиназы C. gloeosporioides на колонке Mono Q представлена на рисунке 13, фракции 23-26, соответствующие интересующему нас ферменту, были собраны и использованы для дальнейшего анализа.

Чистоту выделенного фермента оценивали с помощью электрофореза в ПААГ* в неденатурирующих и денатурирующих условиях, а также постэлектрофоретическим определением его активности на желатине, сополимеризованной с ПААГ. Во всех случаях очищенная фракция давала только одну полосу, подвижность которой при электрофорезе в ПААГ в денатурирующих условиях совпадала с полосой активности исследуемого *полиакриламидный гель фермента, определяемой непосредственно в геле после завершения электрофореза (рис. 14).

Молекулярная масса протеиназы составляла 54 кДа.

Поглощение, 280 нм Рис 13. Профиль элюции внеклеточной протеиназы C. Gloeosporioides, активной по по субстрату Glp-Ala-Ala-Leu-pNa, при ионообменной хроматографии на Mono Q. 1 - белок A280, 2 - активность, 3 - концентрация NaCl.

Рис. 14. Электрофореграммы очищенной внеклеточной протеиназы C.gloeosporioides.

Стрелками показаны полосы исследуемого фермента.

1 - зимограмма в ПААГ, содержавшем 0,026% желатины 2 - ПААГ в присутствии додецилсульфата Na 3 - белки-маркеры 4 - ПААГ в отсутствие додецилсульфата Na Исследованные свойства очищенного фермента, такие как субстратная специфичность, восприимчивость к действию белковых ингибиторов, а также проведенный ингибиторный анализ позволили заключить, что выделенная протеиназа относится к сериновым протеиназам семейства субтилизинов.

Очищенный фермент активно гидролизовал разнообразные белки, среди которых следует отметить белки клеточной стенки растений маша и пшеницы (табл.3). Гидролиз белков клеточной стенки позволяет грибу решить двуединую задачу: обеспечить свое питание азотистыми соединениями и облегчить проникновение грибных гиф в клетки растения-хозяина.

Таблица 3. Гидролиз белковых субстратов очищенной протеиназой С.gloeosporioides Белковые субстраты Активность, ед. Удельная активность, У С.gloeosporioides активность по Bz-Arg-pNa имела небольшую величину, тогда как F.oxysporum секретировал ее в достаточно больших количествах.

С целью сравнения наиболее представленных протеаз секретируемых данными видами проводили частичную очистку и характеристику ферментов из F.oxysporum Вор-04-12.

Посредством гель-фильтрации удалось разделить трипсиноподобную (активную по Bz-ArgpNa) и субтилизиноподобную (активную по Glp-Ala-Ala-Leu-pNa) активности. Измерив объем выхода исследуемых протеиназ и используя полученную калибровочную кривую, определили, что исследуемые ферменты имеют молекулярную массу 28 кДа и 630 кДа. Из данных ингибиторного анализа видно, что активность протеиназы, определяемой по Glp-AlaAla-Leu-pNa, ингибируется практически полностью только ФМСФ и слабо ингибируется ЕПротеаза, активная по субстрату Bz-Arg-pNa, ингибируется как ФМСФ, так и ТЛФК (табл.4).

Таблица 4. Ингибиторный анализ протеаз из F.oxysporum Вор-04-12.

цистеиновых протеиназ На основании данных субстратной специфичности и ингибиторного анализа можно сделать вывод, что оба исследуемых фермента относятся к классу сериновых протеаз, а именно: фермент массой 28 кДа является трипсиноподобной протеиназой, а протеаза массой 630 кДа – субтилизиноподобной протеазой.

Довольно заметное ингибирование субтилизиноподобного фермента ингибитором цистеиновых протеиназ и небольшая активация ферментов активатором SH-групп дитиотреитолом (34%) могут указывать либо на присутствие SH-групп вблизи активного центра, модификация которых в некоторой степени влияет на активность, либо на присутствие в полученных препаратах небольшой примеси цистеиновой протеиназы.

Изученные протеазы, как и в случае с ферментом C. gloeosporioides, гидролизовали различные белки (желатин, азоказеин), а также белковые фракции однодольных и двудольных растений: альбумины и глобулины пшеницы, ржи, гречихи и белки клеточных стенок маша и пшеницы.

Некоторые общие свойства полученных протеиназ приведены в таблице 5. Следует обратить внимание на необычайно большую молекулярную массу субтилизиноподобного фермента, что, в целом, не характерно для внеклеточных протеиназ. Возможно, такая большая молекулярная масса объясняется агрегацией исследуемого фермента с каким-либо компонентом среды в процессе культивирования и выделения.

Таблица 5. Сравнение свойств протеаз, полученных из F.oxysporum и C. gloeosporioides масса, кДа стабильность, °C Выделенные ферменты обладают достаточно широким диапазоном рН стабильности их оптимум рН находится в щелочной области. Все протеазы стабильны до 550. Некоторые различия в физико-химических свойствах дополняют четкие различия в активном центре и субстратной специфичности, обнаруженные у главных внеклеточных протеиназ изученных грибов.

Таким образом, проведенные исследования показали, что в присутствии белка в среде культивирования у грибов наблюдаются синтез и секреция довольно стабильных, узко специализированных сериновых протеиназ. В большинстве случаев - это протеиназы субтилизиноподобного и трипсиноподобного типов, причем в паре сильный патоген - слабый патоген величина трипсиноподобной активности может являеться показателем степени патогенности гриба. На основании полученных и литературных данных, можно предположить, что трипсиноподобные протеиназы, представленные в значительных количествах только у фитопатогенов, могут играть определенную роль в патогенном процессе у грибов, в то время как субтилизиноподобные ферменты, характерные для большинства видов грибов, используются при решении более общих задач, например, обеспечение гриба доступными азотистыми соединениями.

ВЫВОДЫ

1. Как для Fusarium, так и для C. gloeosporioides наличие белковых добавок в твердых и жидких средах не только стимулировало накопление биомассы по сравнению со стандартной средой Чапека, но и увеличивало уровень секреции ферментов.

2. Идентифицирована и очищена до гомогенного состояния основная протеиназа грибавозбудителя антракноза C. gloeosporioides. Степень очистки составляет 203 раза и 3. Исследованы физико-химические свойства и субстратная специфичность данной протеиназы. Исследуемая протеиназа относится к сериновым протеазам и принадлежит семейству субтилизина.

4. Выделены и охарактеризованы секретируемые ферменты из F.oxysporum. Эти ферменты относятся к сериновым протеазам семейств химотрипсина и субтилизина.

5. Обнаружено, что уровень продукции внеклеточных протеиназ Fusarium зависит от степени патогенности гриба. У сильных фитопатогенов Fusarium значительно преобладает трипсиноподобная активность. Специфичность её действия, время появления и наличие могут указывать на её особую роль в процессе патогенеза.

1. Матвеева А. Р. Изучение влияния различных углеводов на секрецию внеклеточных протеолитических ферментов гриба Alternaria alternata (Fr.) Keissler // Микология и альгология – 2004. Материалы юбилейной конференции, посвященной 85-летию кафедры микологии и альгологии МГУ им. М.В. Ломоносова. – Москва, 2004, с. 91-92.

2. Домаш В.И., Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., Цыбина Т.А., Матвеева А.Р., Шарпио Т.П., Забрейко С.А., Сосновская Т.Ф. Белковые ингибиторы протеиназ и устойчивость растений к стрессовым условиям // Сахаровские чтения 2004 года: экологические проблемы ХXI века. Материалы международной научной конференции (21-22 мая).Минск, 2004, с.59-61.

3. Belozersky M.A., Matveeva A.R., Belyakova G.A., Tsybina T.A., Dunaevsky Ya.E., Proteases and their inhibitors as a model system to study plant-pathogen interactions // Acta Physiol.

Plant. The 14th FESPB Congress Book of abstracts (23-27 august) - Cracow, Poland, 2004, 4. Матвеева А.Р., Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Белозерский М.А. Выделение и характеристика главной внеклеточной протеиназы гриба Colletotrichum gloeosporioides // Грибы в природных и антропогенных экосистемах. Труды международной конференции, посвященной 100-летию начала работы профессора А.С. Бондарцева в БИН им. В.Л.

Комарова РАН (24-28 апреля). - СПб, 2005, т.1, - с. 393-395.

5. Матвеева А.Р., Дунаевский Я. Е., Белякова Г. А., Белозерский М.А. Щелочная внеклеточная протеиназа мицелиального гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc // Материалы I ( IX ) международной конференции молодых ботаников в СанктПетербурге (21-26 мая 2006). – СПб. Издательство ГЭТУ, 2006, - с. 296.

6. Дунаевский Я.Е., Дун Чжан, Матвеева А.Р., Белякова Г.А., Белозерский М.А.

Деградация белковых субстратов ксилотрофными базидиомицетами // Микробиология.

2006, Том 75, № 1, с. 46-51.

7. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Матвеева А.Р., Фатхуллина Г.Н., Белозерский М.А Секретируемые протеиназы мицелиальных грибов как молекулярные маркеры фитопатогенности // Материалы VI симпозиума "Химия протеолитических ферментов"(23-25 апреля) - Москва, 2007, с. 28.

8. Матвеева А.Р., Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Домаш В.И., Белозерский М.А.

Характеристика внеклеточной протеиназы гриба Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Penz & Sacc // Материалы VI симпозиума "Химия протеолитических ферментов"(23- апреля) - Москва, 2007, с.73.

9. Дунаевский Я.Е., Матвеева А.Р., Белякова Г. А., Домаш В.И., Белозерский М.А.

Внеклеточная щелочная протеаза Colletotrichum gloeosporioides // Биохимия, 2007, Vol.

72, No. 3, p. 424–431.

10. Matveeva A.R., Fatkhullina G.N., Dunaevsky Ya.E., Belyakova G.A. Belozersky M.A. The connection between secreted proteolytic activity and pathogenicity of fingi // XV Congress of European Mycologists. Saint Petersburg, Russia, September 16-21, 2007. Abstracts. – St Petersburg: TREEART LLC, 2007, - p. 259-260.

11. Дунаевский Я.Е., Белякова Г.А., Матвеева А.Р., Домаш В.И., Белозерский М.А.

Ингибиторы протеиназ растений в условиях стресса. // Материалы V международной научной конференции (28-30 ноября) – Минск. ИООО «Право и экономика», 2007, с. 61.

12. Дунаевский Я.Е., Матвеева А.Р., Фатхуллина Г.Н., Белякова Г.А., Белозерский М.А Внеклеточные протеиназы мицелиальных грибов как участники процесса патогенеза // Биоорг.химия, 2008, 34, 3 ( в печати).



 
Похожие работы:

«Зотов Александр Александрович ПРЕИМАГИНАЛЬНЫЕ СТАДИИ ДОЛГОНОСИКОВ ПОДСЕМЕЙСТВА LIXINAE (COLEOPTERA, CURCULIONIDAE): ЭКОЛОГИЯ И МОРФОЛОГИЯ 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Ростов-на-Дону - 2013 2 Работа выполнена в отделе аридной экологии ФГБУН Институт аридных зон Южного научного Центра РАН доктор биологических наук, Научный руководитель : Арзанов Юрий Генрихович Замотайлов Александр...»

«КУДРЯВЦЕВА Ольга Александровна ИНДУКЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ PODOSPORA ANSERINA (RABENH.) NIESSL В ПРОЦЕССЕ ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОГО ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Специальность 03.02.12 – микология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2011 Работа выполнена на кафедре микологии и альгологии Биологического факультета Московского государственного...»

«Потапенко Наталья Христофоровна АДАПТАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ ШЕЛКОВИЦЫ В УСЛОВИЯХ КЛИМАТИЧЕСКОГО СТРЕССА (НА ПРИМЕРЕ НИЖЕГОРОДСКОГО ПОВОЛЖЬЯ) Специальность: 03.02.08 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Нижний Новгород 2011 Работа выполнена на базе Ботанического сада Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского Научный...»

«Калмыкова Ольга Геннадьевна ЗАКОНОМЕРНОСТИ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПНОЙ РАСТИТЕЛЬНОСТИ БУРТИНСКОЙ СТЕПИ (ГОСЗАПОВЕДНИК ОРЕНБУРГСКИЙ) 03.00.16 – Экология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Санкт-Петербург – 2008 Работа выполнена в лаборатории биогеографии и мониторинга биоразнообразия Института степи Уральского отделения Российской академии наук Научный руководитель : доктор биологических наук Сафронова Ирина Николаевна Официальные...»

«ЯРЛЫЧЕНКО СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА КОМПОСТИРОВАНИЕ ОРГАНИЧЕСКОЙ ФРАКЦИИ ТВЕРДЫХ БЫТОВЫХ ОТХОДОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ДОБАВОК 03.00.07-03 – Микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ – 2008 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии факультета экологии и географии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования Казанский государственный университет им. В.И....»

«Бедарева Ольга Михайловна ЭКОСИСТЕМЫ СРЕДНИХ ПУСТЫНЬ КАЗАХСТАНА И ИХ ИНВЕНТАРИЗАЦИЯ МЕТОДАМИ ДИСТАНЦИОННОГО ЗОНДИРОВАНИЯ 03.00.16 – экология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук Калининград 2009 2 Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Калининградский государственный технический университет Научные консультанты: академик Национальной Академии Наук Республики...»

«Шелковникова Татьяна Александровна Клеточные и трансгенные модели патологической агрегации белков, вовлеченных в патогенез нейродегенеративных заболеваний Специальность 03.01.04 – биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2011 Работа выполнена в лаборатории нейрохимии физиологически активных веществ и в лаборатории генетического моделирования нейродегенеративных процессов Учреждения Российской академии наук Института...»

«Духовная Наталья Игоревна ПОКАЗАТЕЛИ РАЗВИТИЯ ФИТОПЛАНКТОННЫХ СООБЩЕСТВ В ВОДОЕМАХ С РАЗНЫМ УРОВНЕМ РАДИОАКТИВНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 03.01.01 – Радиобиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва-2011 2 Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Уральский научно-практический центр радиационной медицины Федерального медикобиологического агентства Российской Федерации, г. Челябинск Научный руководитель доктор...»

«Легонькова Ольга Александровна БИОТЕХНОЛОГИЯ УТИЛИЗАЦИИ ОРГАНИЧЕСКИХ ОТХОДОВ ПУТЕМ СОЗДАНИЯ ГИБРИДНЫХ КОМПОЗИТОВ 03.00.23 - Биотехнология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук Москва 2009 Работа выполнена в проблемной лаборатории полимеров Московского Государственного университета прикладной биотехнологии и на кафедре микробиологии Российского Государственного Аграрного Университета МСХА им. К.А.Тимирязева. Научный консультант - академик...»

«Тюрин Владимир Анатольевич МАРАЛ (CERVUS ELAPHUS SIBIRICUS SEVERTZOV, 1873) В ВОСТОЧНОМ САЯНЕ (РАСПРОСТРАНЕНИЕ, ЭКОЛОГИЯ, ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ) 03.02.08 – экология (биологические наук и) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Улан-Удэ – 2014 Работа выполнена на кафедре прикладной экологии и ресурсоведения Федерального государственного автономного образовательного учреждения высшего профессионального образования Сибирский...»

«САМСОНОВА ИРИНА ДМИТРИЕВНА МЕДОНОСНЫЕ РЕСУРСЫ СТЕПНОГО ПРИДОНЬЯ Специальность 03.02.14 – биологические ресурсы Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2014 1 Работа выполнена на кафедре мелиораций земель в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Новочеркасская государственная мелиоративная академия Научный консультант : Добрынин Николай Дмитриевич, доктор...»

«Красникова Мария Сергеевна ИЗУЧЕНИЕ РАЗНООБРАЗИЯ И ЭВОЛЮЦИИ ГЕНОВ TAS3, КОДИРУЮЩИХ ПРЕДШЕСТВЕННИКИ ta-siРНК У НЕЦВЕТКОВЫХ НАЗЕМНЫХ РАСТЕНИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ЭКСПРЕССИИ У НЕКОТОРЫХ ПОКРЫТОСЕМЕННЫХ 03.01.03 - молекулярная биология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2013 Работа выполнена в отделе эволюционной биохимии НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского Федерального государственного бюджетного...»

«ЭБЕЛЬ Александр Леонович ФЛОРА СЕВЕРО-ЗАПАДНОЙ ЧАСТИ АЛТАЕ-САЯНСКОЙ ПРОВИНЦИИ: СОСТАВ, СТРУКТУРА, ПРОИСХОЖДЕНИЕ, АНТРОПОГЕННАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ 03.02.01 – Ботаника Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Томск 2011 Работа выполнена на кафедре ботаники ФГБОУ ВПО Национальный исследовательский Томский государственный университет Научный консультант : доктор биологических наук, профессор Ревушкин Александр Сергеевич Официальные оппоненты :...»

«Баландина Алевтина Власовна МИКРОБНАЯ РЕМЕДИАЦИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЕННЫХ АГРОДЕРНОВО-КАРБОНАТНЫХ ПОЧВ И ТЕХНОГЕННЫХ ПОВЕРХНОСТНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ В ПОДЗОНЕ ЮЖНОЙ ТАЙГИ 03.02.08 – экология (биология) Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь - 2013 Работа выполнена на кафедре физиологии растений и микроорганизмов в ФГБОУ ВПО Пермский государственный национальный исследовательский университет и на кафедре микробиологии ГБОУ ВПО Пермская...»

«Зиннер Надежда Сергеевна БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ HEDYSARUM ALPINUM L. И HEDYSARUM THEINUM KRASNOB. ПРИ ИНТРОДУКЦИИ В УСЛОВИЯХ ЛЕСНОЙ ЗОНЫ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ Специальность 03.02.01 – Ботаника АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Томск 2011 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении Национальный исследовательский Томский государственный университет на кафедре агрономии и в Сибирском ботаническом...»

«КУЗНЕЦОВА ЛЮБОВЬ ЛЕОНИДОВНА НАСЛЕДОВАНИЕ ПРИЗНАКА РОЗОВАЯ ОКРАСКА ВЕНЧИКА У КРУПНОПЛОДНОЙ ЗЕМЛЯНИКИ FRAGARIA ANANASSA DUCH. 03.02.07 – генетика АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Новосибирск 2012 Работа выполнена в лаборатории популяционной генетики растений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск. Научный руководитель : кандидат биологических наук Батурин...»

«ЛИНЬКОВА ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА ДЕСТРУКЦИЯ АМИНОАРОМАТИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ АНАЭРОБНЫМИ МИКРОБНЫМИ СООБЩЕСТВАМИ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва, 2011 г. Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Нетрусов Александр...»

«Лихачева Ольга Викторовна ЛИШАЙНИКИ УСАДЕБНЫХ ПАРКОВ ПСКОВСКОЙ ОБЛАСТИ Специальность 03.02.12 – микология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Псков, 2010 Диссертационная работа выполнена на кафедре альгологии и микологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и на кафедре ботаники и экологии растений...»

«Харитонцев Борис Степанович Флорогенез и фитоценогенез на юге Западной Сибири Специальность: 03.00.05 – БОТАНИКА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Екатеринбург – 2009 Работа выполнена в Институте экологии растений и животных Уральского отделения Российской академии наук Научный консультант – академик РАН, заслуженный деятель науки РФ, доктор биологических наук, профессор Горчаковский Павел Леонидович Официальные оппоненты : доктор...»

«Кляйн Ольга Ивановна ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БАЗИДИАЛЬНЫХ ГРИБОВ С ГУМИНОВЫМИ ВЕЩЕСТВАМИ 03.01.04 Биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук МОСКВА – 2013 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук и Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова...»






 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.