WWW.DISS.SELUK.RU

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

 

на правах рукописи

ЧЕРЕПКОВА Оксана Анатольевна

ШАПЕРОНОПОДОБНАЯ АКТИВНОСТЬ

ФАКТОРА ИНГИБИРОВАНИЯ МИГРАЦИИ МАКРОФАГОВ

Специальность 03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Института биохимии им. А.Н. Баха РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Б.Я. Гурвиц

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.С. Шишкин доктор биологических наук Н.П. Шарова

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии РАН им. В.А. Энгельгардта

Защита состоится 25 апреля 2006 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 002.247.01 по присуждению ученой степени кандидата наук в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_»_2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Молекулярные шапероны обладают способностью защищать белки, утратившие нативную конформацию при стрессорных воздействиях различного характера. Эта способность проявляется при взаимодействии шаперонов с гидрофобными участками развернутых или неправильно свернутых белков, что препятствует связыванию этих белков между собой и последующей агрегации и приводит, в конечном итоге, к сохранению их нативного состояния.

При температурах, превышающих физиологический уровень, в клетках наблюдается активация синтеза молекулярных шаперонов, известных как белки теплового шока (heat shock proteins, HSP). Некоторые из них (HSP70, GroEL) способствуют рефолдингу белков, подвергнутых тепловому повреждению, к нативному состоянию, в то время как другие (-кристаллин, малые HSP) только тормозят агрегацию белков и стабилизируют их структуру. Белковые агрегаты могут подвергаться солюбилизации и рефолдингу с образованием биологически активной конформации под действием системы шаперонов, входящих в состав мультишаперонной сети. В эту сеть часто вовлекаются ферменты фолдинга (пептидил-пролил-цис-транс изомераза и протеиндисульфидизомераза), различные шапероноподобные белки и пептиды [Puig et al., 1997; Sharma et al., 2000; Manna et al., 2001; Bhattacharyya et al., 2003].





В связи с многообразием и широким спектром действия шаперонов в различных компартментах клетки интерес к ним не ослабевает и список вновь открываемых шапероноподобных белков неуклонно растет. Однако, несмотря на огромное число экспериментов, направленных на изучение защитной роли шаперонов при денатурации и агрегации белков в условиях стресса, молекулярные механизмы действия шаперонов остаются невыясненными.

Все известные в настоящее время шапероны обладают общими свойствами: они имеют гидрофобные домены, экспонированные на поверхности их молекулярных структур, способные узнавать и связывать определенные интермедиаты фолдинга белковых субстратов. Однако структурнофункциональные особенности, необходимые для характеристики белка как шаперона, не вполне ясны.

В этой связи большой интерес вызывает исследование шапероноподобных свойств термостабильных гидрофобных белков, проявляющих способность к образованию амфипатической вторичной структуры. Одним из таких белков является фактор ингибирования миграции макрофагов (macrophage migration inhibitory factor, MIF), принадлежащий к семейству цитокинов. Около 40 лет назад MIF был идентифицирован как фактор, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, по его способности тормозить миграцию макрофагов in vitro [Bloom and Bennet, 1966]. В последующие годы было показано, что низкомолекулярный высококонсервативный белок MIF (12,5 кДа) широко распространен в биологических объектах разной степени сложности (от бактерий до млекопитающих), его наибольшее количество обнаружено в макрофагах и в различных отделах мозга. Далее MIF был вновь «открыт» как медиатор системного ответа организма на стресс [Bucala, 1996; Donn and Ray, 2004], однако, его участие в биохимических механизмах формирования защитных реакций организма при тепловом шоке ранее не исследовалось, хотя структурно-функциональные характеристики MIF аналогичны многим шапероноподобным белкам.

Целью настоящей работы является изучение шапероноподобных свойств MIF в тест-системе in vitro, основанной на исследовании кинетики тепловой агрегации модельных белковых субстратов. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Выделить MIF из мозга быка в гомогенном состоянии и изучить его физико-химические и ферментативные свойства.

2. Исследовать влияние MIF на кинетику тепловой агрегации белковых субстратов – малатдегидрогеназы (MDH) из сердца свиньи, гликогенфосфорилазы b (Ph b) из скелетных мышц кролика и дрожжевой алкогольдегидрогеназы (ADH) при различных температурах (41–48oC) и концентрациях белков.





3. Исследовать возможность реактивации частично денатурированных белковых субстратов под влиянием MIF.

4. Проанализировать изменения олигомерного состояния белковых субстратов и MIF при тепловом воздействии.

Научная новизна и практическая ценность работы. Наряду с традиционными представлениями о защите клеток от теплового повреждения с помощью системы, включающей шапероны и ферменты фолдинга, рассмотрена возможность существования пути регуляции, опосредуемого биологическими эффектами низкомолекулярных термостабильных гидрофобных белков, имеющих амфипатическую вторичную структуру.

Показано, что MIF, выделенный из мозга быка с использованием нового оригинального метода, обладает шапероноподобными свойствами. Это подтверждается следующими экспериментальными результатами:

агрегации белковых субстратов под действием MIF;

• обнаружено защитное действие MIF в процессе термоинактивации частично денатурированных MDH и Ph b;

• показано, что в зависимости от экспериментальных условий MIF может как тормозить, так и ускорять агрегацию белков. При температуре, близкой к физиологическому уровню (41,5оС), наблюдается образование легко растворимых агрегатов и стабилизация олигомерной структуры субстрата, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия. Таким образом, в этих условиях MIF может играть шапероноподобную роль;

• анализ состояния агрегатов с помощью электрофореза в ПААГ в неденатурирующих условиях показывает, что защитное действие MIF проявляется в торможении роста агрегатов субстратного белка.

Полученные данные позволяют существенно расширить представления о шапероноподобных белках, а также о механизмах регуляции их шаперонной активности. Наличие в молекуле шаперона гидрофильных сайтов способствует лучшему растворению гетероагрегатов, образующихся при тепловом стрессе.

Большой интерес к изучению механизмов действия молекулярных шаперонов вызван не только проблемами, связанными с процессами агрегации при получении рекомбинантных белков, но и с необходимостью разработки эффективных средств защиты клеток в условиях развития патологических состояний в результате нарушения конформации белков. Это направление исследований представляется также весьма перспективным в выявлении защитных реакций организма при температурах среды, близких к физиологически допустимому уровню (41–43оС), что может иметь большое значение в биологии и медицине.

Обладая выраженной стабильностью и способностью к образованию амфифильной вторичной структуры, стресс-индуцируемый белок, MIF, в сочетании с другими белками с аналогичными свойствами может войти в семейство конститутивно экспрессируемых «малых шаперонов», участвующих в адаптации организма к стрессу, на начальных этапах его развития.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века” (Пущино, 2003); на 19-ой конференции Международного нейрохимического общества, ISN (Гонконг, 2003); на III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004); на Международном симпозиуме “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки” (Тюмень, 2005), на FEBS конгрессе (Будапешт, 2005).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано печатных работ, в том числе 5 статей в ведущих российских и зарубежных журналах.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

включаетроллд наименования, в том числе на иностранных языках.

Иллюстративный материал содержит рисунков и таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение MIF из мозга быка. Разработан метод выделения MIF в гомогенном состоянии, включающий гомогенизацию ткани мозга, нагревание гомогената (58оС, 20 мин), высаливание сульфатом аммония, гель-фильтрацию на колонке с Toyopearl HW-55.

Электрофорез. Электрофорез хроматографически очищенных фракций белка проводили в 12%-ном ПААГ в присутствии Ds-Na или в градиентном 5ПААГ в неденатурирующих условиях. Белок проявляли нитратом серебра.

активность MIF определяли по скорости образования енол-изомера из кетоизомера п-гидроксифенилпирувата, использованного в качестве субстрата [Knox et al., 1957]. Измеряли увеличение абсорбции при 330 нм при комнатной температуре, используя спектрофотометр Beckman DU-650 (США).

Выделение гликогенфосфорилазы b (Ph b). Ph b выделяли по методу Юниса [Yunis et al., 1962]. Выход белка составлял 0,5 мг на 1 г сырой ткани.

Концентрацию фосфорилазы b определяли спектрофотометрически, используя коэффициент поглощения 13,2 для 1%-го раствора белка при 280 нм [Soman et al., 1983].

Определение шаперонной активности. Использовали тест–систему, основанную на подавлении тепловой агрегации модельных белковых субстратов. Агрегацию MDH и ADH в 20 мМ Tris–HCl буфере, pH 7,0 и Ph b в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие и в присутствии различных концентраций MIF измеряли на спектрофотометре Beckman DU-650 по изменению кажущегося оптического поглощения при нм.

Пробы, полученные после тепловой агрегации, центрифугировали ( g, 20 мин). В случае Ph b осадки растворяли как в 4 М мочевине, так и в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА; в случае MDH и ADH осадки растворяли в 20 мМ Tris–HCl буфере, pH 7,0. Полученные образцы анализировались с помощью электрофореза в ПААГ в нативных и денатурирующих условиях.

Для расчета молярных стехиометрических соотношений (MIF :

субстратный белок) использовали значения молекулярных масс субъединиц MDH, Ph b, ADH и MIF – 35, 97, 40 и 12 кДа соответственно.

Эксклюзионная хроматография в системе FPLC. Использовали ACTA FPLC систему (Amersham Biosciences, Pharmacia) на Superdex 10/300 347 GL колонке. Образцы MDH инкубировали при 40,5оC в течение 30 минут, центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут, затем наносили на колонку.

Скорость элюции – 0,5 мл/мин. Профиль элюции детектировали при 280 нм.

Ферментативная активность субстратов. Исследование активности Ph b в отсутствие и в присутствии MIF проводили при 30оС в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА. Значения кажущегося поглощения раствора, содержащего 0,25 М гликоген, 0,1 мкМ Ph b и 1 мМ 5’-АМР, регистрировали при 340 нм. Реакцию инициировали добавлением -D-глюкозо-1-фосфата ( мМ). Термоинактивацию Ph b при 42оС в термостате определяли по степени фосфоролиза гликогена. Аликвоты отбирали через определенные интервалы времени.

Активность MDH измеряли по поглощению при 340 нм в 100 мМ Tris– HCl буфере, pH 7,0, содержащем 0,5 мМ оксалоацетат и 0,28 мМ NADH, после инкубации субстрата при 39оС. Аликвоты отбирали из раствора через определенные промежутки времени и измеряли ферментативную активность MDH по степени превращения оксалоацетата в малат.

Концентрацию белка определяли по методу Bradford [Bradford, 1976].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение MIF из мозга быка. Был разработан простой оригинальный метод выделения MIF из мозга быка. Фракции, содержащие MIF, определяли по таутомеразной активности. Выход белка составлял 0,5 мг/мл на 1 г сырой ткани.

MIF выделялся в гомогенном состоянии. При электрофорезе в ПААГ в присутствии Ds-Na проявлялась единственная полоса, соответствующая кажущейся молекулярной массе 12 кДа (Рис. 1, дорожка 3). Анализ элюции MIF показал, что его выход в гомогенном состоянии является результатом сорбции Использование буфера, содержащего 0,2 M KCl и/или 2 мМ -меркаптоэтанола (-ME), приводило к потере гомогенности (Рис. 1, дорожки 1 и 2).

электрофореза проводили иммуноблоттинг с использованием PVDF мембраны (данные не показаны). Пятно, проявляющее иммунореактивность, вырезали и подвергали микросеквенированию. В соответствии с банком данных белковых структур полученная N-концевая последовательность (29 шагов) оказалась идентичной структуре MIF мозга теленка: NH2-PMFVVNTNVP RASVPDGLLS ELTQQLAQA.

С целью определения молекулярной массы нативного белка проводили электрофорез в неденатурирующих условиях (Рис. 2). Оказалось, что фракции MIF представляют собой смесь изоформ с различными молекулярными массами от 12 до 480 кДа (12, 48, 60, 120, 168 и 480 кДа - 1, 4, 5, 10, 14, субъединиц соответственно).

При повышении температуры до 52 – 60оС его активность резко падает, однако, сохраняет целостность своей вторичной структуры (данные не приведены).

Рис. 3. Таутомеразная активность MIF в отсутствие (А) и в присутствии (Б) 2 мМ -МЕ при различных температурах. По оси абсцисс отложено время инкубации, по оси ординат – отношение кажущегося оптического поглощения при 330 нм при повышенной температуре (А) к значению А при 25оС (Ао).

На основании анализа структурно-функциональных свойств стрессиндуцируемого белка, MIF, было предположено, что он может проявлять шапероноподобные свойства в условиях теплового стресса.

Шапероноподобная активность. Использовали тест–систему, основанную на подавлении тепловой агрегации модельных белковых субстратов: MDH и Ph b. Агрегация белков в присутствии MIF снижалась по мере увеличения его концентрации (Рис. 4).

MIF проявляет значительный эффект даже при субстехиометрических концентрациях (Рис. 4 А, кривая 2, соотношение MIF : MDH составляет 0,2 : 1).

Полное торможение агрегации MDH наблюдалось при соотношении MIF :

MDH – 1 : 1 (Рис. 4 А, кривая 5), а в случае Ph b – при молярном соотношении MIF : Ph b – 2 : 1 (Рис. 4 Б, кривая 4). Было показано, что торможение агрегации MDH также наблюдается при добавлении в среду 2 мМ -МЕ (данные не представлены). Это свидетельствует о том, что действие MIF на агрегацию субстрата не опосредовано образованием S-S-связей.

При использовании в аналогичных условиях бычьего сывороточного альбумина вместо MIF, эффект торможения агрегации не наблюдался (Рис.

4 В).

Добавление MIF в конечной концентрации 10 мкг/мл через 12 минут после начала агрегации MDH приводило к ее полному торможению (Рис. 4 Г, кривая 3). Полученные результаты показывают, что MIF может связываться с частично развернутой молекулой субстрата. Эта способность присуща многим шаперонам.

Для более детального выявления молекулярного механизма действия MIF пробы центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут и исследовали состояния агрегатов в осадках и супернатантах.

Осадки, растворенные в 4 М мочевине (в случае Ph b), или в 20 мМ TrisHCl буфере, рН 7,0 (в случае MDH), подвергали электрофорезу в присутствии Ds-Na (Рис. 5 А).

0, 0, 0, 0, 0, Рис. 4. Кинетика тепловой агрегации белковых субстратов. А. Агрегация MDH (26 мкг/мл) при 40оС в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0, в отсутствие (1) и в присутствии MIF в концентрациях 1,5 мкг/мл (2), 3 мкг/мл (3), 6 мкг/мл (4) и 10 мкг/мл (5). А360 – кажущееся оптическое поглощение при 360 нм. Б. Агрегация Ph b (130 мкг/мл) при 42оС в 80 мМ Hepes буфере, рН 6,8, содержащем 0,2 мМ ЭДТА, в отсутствие (1) и в присутствии MIF в концентрациях 1,8 мкг/мл (2), 25,2 мкг/мл (3) и 34 мкг/мл (4). В. Агрегация MDH (26 мкг/мл) в отсутствие (1) и в присутствии бычьего сывороточного альбумина в концентрациях мкг/мл (2) и 20 мкг/мл (3). Г. Агрегация MDH (26 мкг/мл) в отсутствие MIF (1), измеренная в трех различных кюветах при 40оС в 20 мМ Tris-HCl буфере, рН 7,0. Через 12 минут после начала агрегации был добавлен MIF в конечных концентрациях 3 мкг/мл (2) и 10 мкг/мл (3).

Анализ электрофореграмм показал, что по мере увеличения концентрации MIF количество белка в осадках уменьшается, что согласуется с кривыми агрегации. Это свидетельствует о том, что MIF обладает шапероноподобными свойствами. В случае Ph b на конечной стадии агрегации наблюдается образование гетероагрегатов: Ph b и комплекса Ph b с MIF (Рис. 5 А). Последнее наблюдалось и для MDH в случае больших концентраций MIF (данные не показаны).

полученного на конечной стадии тепловой агрегации, в отсутствие MIF (Рис. Б, дорожка 1) обнаружена одна полоса с кажущейся молекулярной массой кДа. Это свидетельствует о том, что MDH во время агрегации не распадается на мономеры, а агрегирует в виде димера. С помощью электрофореза в неденатурирующих условиях осадка MDH, полученного после агрегации в присутствии MIF и растворенного в 20 мМ Tris-HCl, pH 7,0, показано, что электрофореграммах, соответствующих кривой агрегации 2 (Рис. 4 А) остается такой же, как в случае контроля (кривая 1). Растворимость осадка в присутствии MIF улучшается, что также подтверждает его шапероноподобную активность.

Рис. 5. SDS-электрофорез в 12% ПААГ солюбилизированных агрегатов. А. Ph b ( мкг/мл) инкубировали при 42оС в течение 100 минут в отсутствие (дорожка 1) и в присутствии MIF в концентрации 25,2 мкг/мл (дорожка 2). MDH (26 мкг/мл) инкубировали при 40оС в течение 30 минут в отсутствие (дорожка 3) и в присутствии MIF в концентрациях 1,5; 3; 6 и 10 мкг/мл (дорожки 4, 5, 6 и 7 соответственно); маркеры молекулярных масс (кДа) (дорожка 8). Б. Нативный электрофорез в 10% ПААГ растворенных осадков после агрегации MDH (26 мкг/мл) в отсутствие MIF (дорожка 1), маркер молекулярной массы (67 кДа) (дорожка 2).

Для подтверждения того, что в присутствии MIF растворимость денатурированного белка увеличивается, был проведен следующий эксперимент. К осадкам MDH, полученным на конечной стадии тепловой Электрофорез полученных проб в неденатурирующих условиях показал, что по мере увеличения концентрации MIF растворимость осадка MDH увеличивается (Рис. 6). Наибольшая растворимость осадка MDH (26 мкг/мл) была показана при концентрации MIF 30 мкг/мл.

Полученные результаты могут быть обусловлены способностью MIF к экспонированные наружу гидрофильные сайты MIF обеспечивают лучшую растворимость образовавшихся агрегатов.

Для определения олигомерного состояния денатурированного белкового субстрата и его предполагаемого комплекса с MIF была проведена эксклюзионная хроматография MDH в отсутствие и в присутствии MIF с использованием системы FPLC (Рис. 7). Образцы нагревали в течение 30 минут при 40,5оС (Рис. 4 А, кривые 1 и 4), затем центрифугировали при 10000 g в течение 20 минут и наносили на колонку. При анализе образца, не содержащего MIF, на хроматограмме наблюдалось значительное уменьшение количества белка (Рис. 7 А, пунктирная линия). При хроматографии MIF-содержащего образца наблюдалось смещение пика влево по отношению к пику MDH (Рис. А), соответствующему 70 кДа (Рис. 7 Б.) Эти данные в сочетании с результатами электрофореза показывают, что MIF образует комплекс с MDH.

A280, mAU произведение Alim•k, являющееся критерием оценки начальной скорости агрегации (Курганов, 2002).

Рис. 8. Графики зависимости константы скорости 1-ого порядка (k) (А) и произведения предельного кажущегося оптического поглощения при t на константу скорости 1-ого порядка (Alim•k) (Б) от концентрации MIF (мкг/мл) в случае тепловой агрегации MDH ( мкг/мл) при 40,5оС.

При увеличении концентрации MIF значения k и Alim•k уменьшаются (Рис. 8).

Исследование изменения биологической активности субстратов в процессе агрегации. Были проведены эксперименты по исследованию падения биологической активности белковых субстратов в процессе агрегации и после снятия денатурирующего воздействия в отсутствие и в присутствии MIF.

Рис. 9. Кинетика тепловой инактивации MDH (26 мкг/мл) при 39оС в отсутствие (А) и в присутствии MIF в концентрации 50 мкг/мл (Б) (сплошная кривая). Восстановление активности фермента при 25оС показано пунктирными линиями при тепловой инактивации в течение 5, 10 и 30 минут (кривые 1, 2 и 3 соответственно). По оси абсцисс – время инкубации.

По оси ординат – относительная скорость ферментативной реакции (V/Vо); Vо – значение V в отсутствие MIF.

Было показано, что при инкубации MDH (26 мкг/мл) в течение 5 – минут активность этого субстратного белка в отсутствие MIF (Рис. 9 А) падает в большей степени, чем в его присутствии (Рис. 9 Б). После снятия теплового стресса активность MDH восстанавливается в незначительной степени, а в присутствии MIF реактивация фермента в некоторых случаях достигает 100%.

Аналогичные результаты были получены и для Ph b при 42оС и 44оС (данные не показаны).

подтверждают шапероноподобные свойства MIF. Показана его способность не восстанавливать их ферментативную активность.

Усиление агрегации белков в присутствии MIF. Исследовали агрегацию присутствии MIF в различных концентрациях (Рис. 10).

Рис. 10. Кинетические кривые агрегации ADH (70 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии MIF в концентрациях 3,3 (2); 4,7 (3) и 10,8 (4) мкг/мл, зарегистрированные по увеличению оптического поглощения при 360 нм при 44oC в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0 (А). Кинетические кривые агрегации Ph b (130 мкг/мл) в отсутствие (1) или в присутствии MIF в концентрациях 10,8 (2), 28,8 (3) и 46,8 (4) мкг/мл при 48oC в 80 мМ Hepes буфере, pH 6,8, содержащем 0,2 мM ЭДТА (Б).

Показано значительное ускорение агрегации субстратов и увеличение предельного значения кажущегося поглощения при 360 нм при t (Аlim) при субстехиометрических молярных соотношениях MIF : ADH (0,15 : 1) (кривая 2) и (0,2 : 1) (кривая 3). При соотношении (0,5 : 1) величина Аlim возрастает более, чем в 4 раза (кривая 4) (Рис. 10 А).

сокращение лаг-периода процесса агрегации, продолжительность которого в отсутствие MIF составляет около 4,5 минуты (кривая 1) (Рис. 10 А).

При субстехиометрических соотношениях MIF : Ph b (0,3 : 1) (кривая 2) и (0,8 : 1) (кривая 3) наблюдается значительный активирующий эффект MIF, а при увеличении концентрации MIF до уровня соотношения MIF : Ph b (1,5 : 1) (кривая 4) величина Аlim возрастает в 3,5 раза (Рис. 10 Б).

Полученные результаты отличаются высокой воспроизводимостью в большом числе экспериментов (для ADH n=9; для Ph b n=7). Важно также отметить, что в отсутствие белковых субстратов MIF не агрегирует даже при концентрациях, на порядок превышающих те, которые были использованы в указанных экспериментах, а также при инкубации при температуре 60оС в течение 240 мин.

Кроме того, характер кинетики агрегации ADH, проведенной в отсутствие и в присутствии 20 мМ -ME (Рис. 11), и результат влияния на данный процесс MIF принципиально не отличались. В этой связи можно полагать, что действие MIF на агрегацию субстрата не опосредовано образованием S-S-связей.

A 0, 0, 0, 0, 0, Для первичного анализа состояния агрегатов после окончания процесса агрегации пробы центрифугировали, осадки солюбилизировали в 20 мМ Тris-HCl буфере, pH 7,0, содержащем 4 М мочевину (см. материалы и методы), и подвергали электрофорезу в денатурирующих условиях (Рис. 12).

0,2 мM ЭДТА, в отсутствие (дорожка 2), или в присутствии 46,8 мкг/мл MIF (дорожка 3).

Осадки суспензий ADH (70 мкг/мл) после инкубации при 44oC в течение 40 мин в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 7,0, в отсутствие (дорожка 5), или в присутствии 10,8 мкг/мл MIF (дорожка 6). Маркеры молекулярных масс (дорожка 7).

Анализ электрофореграммы показывает, что содержание в осадке Ph b (мономер, кажущаяся молекулярная масса 97 кДа) в присутствии MIF существенно возрастает (дорожка 3) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2). То же наблюдается при инкубации ADH при 44оС в экспериментов является обнаружение гетероагрегатов, содержащих как субстратный белок, так и MIF (мономер, 12 кДа) (дорожки 3 и 6).

Результаты электрофореза в ПААГ при неденатурирующих условиях супернатантов проб (10 000 g, 20 мин) после окончания процесса агрегации Ph b и ADH коррелируют с результатами электрофореза в присутствии Ds-Na, приведенными на Рис. 12. В супернатанте проб, инкубированных при повышенных температурах в присутствии MIF, содержание Ph b, или ADH значительно меньше по сравнению с аналогичными пробами, не содержащими MIF, в которых процесс агрегации субстратных белков происходил менее интенсивно (рисунок не приведен).

Полученные данные демонстрируют значительное ускорение агрегации кажущегося поглощения при 360 нм в присутствии MIF.

Для выявления влияния MIF на процесс агрегации белков при температурах, близких к физиологичекому уровню, была проведена серия экспериментов по исследованию кинетики агрегации белков при 41,5оС в отсутствие или в присутствии MIF. На примере агрегации ADH (Рис. 13) было также продемонстрировано ускорение агрегации в присутствии MIF при субстехиометрическом молярном соотношении MIF : ADH (0,6 : 1).

A 0, 0, 0, 0, растворимыми в Tris-HCl буфере, не содержащем мочевины.

Анализ нативного электрофореза в ПААГ проб ADH, инкубированных при 41,5оС в отсутствие или в присутствии MIF в течение 20 минут (Рис. 14), показал, что супернатант содержит димер и тетрамер ADH (кажущиеся молекулярные массы 80 и 160 кДа соответственно), причем в присутствии MIF (дорожка 3) содержание этих олигомеров меньше, чем в его отсутствие (дорожка 1).

В растворенном осадке в отсутствие MIF наблюдаются слабо выраженное пятно, соответствующее тетрамеру ADH, и высокомолекулярные олигомеры, едва проникающие в гель (дорожка 2). В присутствии MIF (дорожка 4) в осадке обнаруживаются довольно яркие полосы, которые могут соответствовать димеру и тетрамеру ADH, а также высокомолекулярные олигомеры и полоса MIF (кажущаяся молекулярная масса 12 кДа), что свидетельствует об образовании гетероолигомеров, содержащих как ADH, так и MIF.

В этом случае высокомолекулярные олигомеры располагаются в области более низких молекулярных масс (дорожка 4) по сравнению с пробой, не содержащей MIF (дорожка 2).

На основании анализа результатов последнего эксперимента можно сделать важный вывод о том, что при тепловом стрессе в диапазоне температур, близких к физиологическим, несмотря на ускорение агрегации субстратных белков в присутствии MIF, образующиеся агрегаты оказываются легко растворимыми. Это может означать, что после снятия денатурирующего воздействия повышается вероятность ренатурации белка к нативному состоянию. В этом смысле в начале развития процесса агрегации MIF обратимо связывается с частично денатурированным белком, стабилизируя его структуру и, возможно, концентрирует субстрат в агрегированном состоянии. Однако, в конечном итоге, в случае снятия теплового стресса и возврата системы к нормальному состоянию, MIF может играть шапероноподобную роль.

Была исследована активность ADH в супернатантах и осадках, солюбилизированных в 20 мМ Tris-HCl буфере, pH 6,8, а также определено содержание белка в этих фракциях. Падение активности ADH в супернатантах после агрегации коррелировало со снижением в них содержания белка.

Анализ кинетических кривых показал высокую степень кооперативности процесса агрегации лабильных белковых субстратов в присутствии MIF.

Особенно ярко это проявляется при агрегации ADH при температуре, близкой к физиологическому уровню (Рис. 13). Сигмоидная кривая агрегации в сравнительно коротком промежутке времени (около 15 минут) демонстрирует субстехиометрическом диапазоне концентраций.

протеиндисульфидизомераза и триггер-фактор (пептидил-пролил-цис-транс изомераза), являющиеся катализаторами фолдинга, а также HSP47 при определенных условиях ускоряют агрегацию субстратных белков.

Для решения вопроса о том, как MIF может функционировать в многокомпонентной шаперонной сети совместно с другими шаперонами требуются дальнейшие исследования.

ВЫВОДЫ

ингибирования миграции макрофагов из мозга быка, основанный, главным образом, на эксклюзионной хроматографии на полимере TSK Toyopearl HW-55.

2. Показано, что фактор ингибирования миграции макрофагов представляет собой смесь гомоолигомерных форм с кажущимися молекулярными массами 12, 48, 60, 120, 168 и 480 кДа.

3. Обнаружено, что фактор ингибирования миграции макрофагов обладает малатдегидрогеназы из сердца свиньи) в диапазоне температур 40–42оС и различных концентрациях белков.

4. Продемонстрировано защитное действие фактора ингибирования миграции макрофагов в процессе термоинактивации частично денатурированных малатдегидрогеназы и гликогенфосфорилазы b, проявляющееся как в торможении падения ферментативной активности при тепловом воздействии, так и в ускорении реактивации ферментов после снятия теплового стресса.

5. Показано образование гетероагрегатов, содержащих белковый субстрат и фактор ингибирования миграции макрофагов. Фактор ингибирования миграции макрофагов проявляет шаперонную активность в форме мономера.

алкогольдегидрогеназы в диапазоне температур 40–44оС обнаружено значительное ускорение агрегации белков в присутствии фактора ингибирования миграции макрофагов. При температурах, близких к физиологическому уровню, наблюдается стабилизация олигомерной структуры субстрата, торможение роста агрегатов и повышение их растворимости, что может способствовать ренатурации белка к нативному состоянию после снятия денатурирующего воздействия.

7. Выявленные свойства стресс-индуцируемого белка, фактора ингибирования миграции макрофагов, могут свидетельствовать о его защитной роли в условиях теплового стресса.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ.

1. Cherepkova O.A., Gurvits B.Ya. (2004) Macrophage migration inhibitory factor (MIF): identification of the 30 kDa MIF–related protein in bovine brain.

Neurochem. Research. V. 29. No. 7. P. 1391-1396.

2. Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Gurvits B.Ya. (2005) Charge Heterogeneity of Bovine Brain Macrophage Migration Inhibitory Factor.

Neurochem. Research. V. 30. No. 1. P. 151-158.

ингибирования миграции макрофагов; выделение из мозга быка.

Биохимия. Т. 71. № 1. С. 90-96.

4. Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Eronina T.B., Gurvits B.Ya. (2006) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor. Intern. J.

Biochem. Cell Biol. V. 38. No. 1. P. 43-55.

5. Черепкова О.А., Лютова Е.М., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я. (2006) Ускорение агрегации белков в условиях теплового стресса под влиянием фактора ингибирования миграции макрофагов. Биохимия. Т. 71. № 2. С.

182-189.

1. Черепкова О.А., Гурвиц Б.Я. (2003) Выделение и изучение свойств термостабильного белка мозга – фактора ингибирования миграции макрофагов. 7-ая Пущинская школа – конференция молодых ученых “Биология – наука ХХI века”. Тез. докл. C. 389.

2. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Klesov R.V. (2003) The brain pool of immunologically active heat-stable proteins in relation to adaptation to heatshock and other kinds of stress. J. Neurochem. V. 87. Suppl. 1. P. 152. P15-03.

3. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Eronina T.B. (2003) Chaperone-like activity of macrophage migration inhibitory factor from bovine brain. J.

Neurochem. V. 88. Suppl. 1. P. 60. P23-4.

4. Черепкова О.А., Еронина Т.Б., Чеботарева Н.А., Гурвиц Б.Я. (2004) Термостабильный белок мозга (фактор ингибирования миграции макрофагов) в роли шаперона. III съезд биофизиков. Тез. докл. С. 122-123.

I. 106.

5. Черепкова О.А, Лютова Е.М., Еронина Т.Б., Гурвиц Б.Я. (2005) Иммунологически активный белок – фактор ингибирования миграции макрофагов; шаперонная и антишаперонная активности. Международный симпозиум “Молекулярные механизмы регуляции функции клетки”.

Сборник тезисов. Тюмень. С. 5.

6. Gurvits B.Ya., Cherepkova O.A., Lyutova E.M., Eronina T.B. (2005) The macrophage migration inhibitory factor exhibits chaperone and anti-chaperone activities. FEBS J. V. 272. Suppl. 1. P. 353.



 





 
© 2013 www.diss.seluk.ru - «Бесплатная электронная библиотека - Авторефераты, Диссертации, Монографии, Методички, учебные программы»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.